Summary
Nous présentons ici un protocole de séquençage de nouvelle génération pour le séquençage d’ARNr 16 s qui permet l’identification et la caractérisation des communautés microbiennes dans les vecteurs. Cette méthode implique l’extraction ADN, l’amplification et codes à barres d’échantillons par PCR, séquençage sur une cellule d’écoulement et la bioinformatique pour faire correspondre les données sur les séquences d’information phylogénétique.
Abstract
Ces dernières décennies, maladies à transmission vectorielle ont réapparu et a progressé à inquiétante, entraînant une morbidité et mortalité dans le monde entier. Des vaccins efficaces et accessibles font défaut pour la majorité de ces maladies, ce qui a nécessité l’élaboration de stratégies d’atténuation nouvelle maladie. À cette fin, une avenue prometteuse de lutte contre les maladies consiste à cibler le microbiome du vecteur, la communauté de microbes vivant dans le vecteur. Le microbiome vecteur joue un rôle central dans la dynamique de l’agent pathogène, et manipulations de la microbiome ont conduit pour vecteur réduit la transmission pathogène ou d’abondance à une poignée de maladies à transmission vectorielle. Cependant, traduisant ces constatations dans les applications de contrôle de la maladie nécessite une compréhension approfondie de l’écologie microbienne de vecteur, historiquement limité par la technologie insuffisante dans ce domaine. L’avènement des approches de séquençage de nouvelle génération a permis un séquençage rapid et hautement parallèle des diverses communautés microbiennes. Ciblant le gène de l’ARNr 16 s hautement conservée a facilité les caractérisations des microbes présents dans les vecteurs sous diverses conditions expérimentales et écologiques. Cette technique implique l’amplification du gène de l’ARNr 16 s, échantillon barcoding par PCR, échantillons de chargement sur une cellule d’écoulement pour le séquençage, et bioinformatique s’approche pour faire correspondre les données de séquences avec information phylogénétique. Espèces ou identification de genre-niveau pour un grand nombre de répétitions en général peut être atteint que grâce à cette approche, contournant ainsi les défis de détection faible résolution et de la sortie de la culture traditionnelle, microscopie ou coloration histologique techniques. Par conséquent, cette méthode est bien adaptée pour caractériser le vecteur de microbes dans des conditions diverses, mais ne peut actuellement fournir des informations sur la fonction microbienne, l’emplacement au sein du vecteur, ou la réponse au traitement antibiotique. Dans l’ensemble, le séquençage de prochaine génération 16 s est une technique puissante pour mieux comprendre l’identité et le rôle des microbes vecteurs dans la dynamique de la maladie.
Introduction
La résurgence et la propagation de maladies à transmission vectorielle dans les dernières décennies posent une menace sérieuse pour la santé humaine et de la faune mondiale. Des vaccins efficaces font défaut pour la majorité de ces maladies, et contrôle efforts sont entravés par la complexité biologique des vecteurs et des interactions hôte-vecteur. Comprendre le rôle des interactions microbiennes dans un vecteur de transmission d’agents pathogènes peut prévoir l’élaboration de stratégies novatrices qui contourner ces difficultés. En particulier, les interactions entre associés à vecteur microbienne commensaux, symbiotes et les agents pathogènes, dénommés le microbiome, peuvent avoir des conséquences importantes pour la transmission d’agents pathogènes. Des preuves accablantes maintenant prend en charge cette affirmation, avec des exemples démontrant un lien entre le vecteur microbiome et la compétence pour des maladies comme le paludisme, le virus Zika et maladie de Lyme1,2,3. Cependant, traduisant ces constatations dans les stratégies de contrôle des maladies exige une compréhension beaucoup plus détaillée de la structure, fonction et l’origine du vecteur microbiomes. Identification et caractérisation de la communauté microbienne de vecteur sous diverses conditions expérimentales et écologiques constituent une voie importante vers l’avant dans ce domaine.
Une procédure d’identification des résidents microbiennes d’un vecteur pathogène est fournie ici en utilisant la Western Mouette tique, Ixodes pacificus, une espèce de vecteur de l’agent pathogène de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi. Alors que les tiques hébergent plus de types de pathogènes humains que n’importe quel autre arthropode, relativement on connaît l’écologie Biologie et de la communauté des tiques microbiomes4. Il est évident que les tiques abritent une grande diversité des virus, bactéries, champignons et protozoaires incluent des commensaux, endosymbiontes et résidents microbienne transitoire5,4. Travail préalable a démontré de fortes variations dans les microbiomes Ixodes associées à la géographie, espèce, sexe, stade de vie et la farine de sang source6,7,8. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces variations restent inconnues et garantissent plus d’enquêtes sur l’origine et l’assemblage de ces communautés microbiennes. Les tiques peuvent acquérir des microbes grâce à une transmission verticale, contact avec les hôtes et l’absorption de l’environnement par les stigmates et bouche pore anal9. Compréhension des facteurs façonner la formation initiale et le développement de la tique microbiome, plus précisément la contribution relative de la transmission verticale et environnementale, est importante pour comprendre les modèles naturels et les variations en tique microbiome diversité et comment ces communautés interagissent au cours de la transmission d’agents pathogènes, avec des applications possibles pour contrôler la maladie ou un vecteur.
Puissantes techniques moléculaires, comme le séquençage de nouvelle génération, maintenant existent pour identifier les communautés microbiennes et peuvent être utilisés pour caractériser le vecteur microbiomes sous diverses conditions environnementales ou expérimentales. Avant l’avènement de ces approches de séquençage haut débit, l’identification des microbes s’est appuyé principalement sur la microscopie et la culture. Alors que la microscopie est une technique rapide et facile, les méthodes morphologiques pour identifier les microbes sont intrinsèquement subjectif et grossier et limitée par la faible sensibilité et détection10. Méthodes axées sur la culture sont largement utilisés pour l’identification microbienne et peuvent être utilisés pour déterminer la susceptibilité des microbes aux traitements de drogue11. Toutefois, cette méthode souffre également d’une sensibilité faible, car on estime que moins de 2 % des microbes environnementales peuvent être cultivées en laboratoire réglé à12. Méthodes de coloration histologiques ont été également employés pour détecter et localiser des microbes spécifiques au sein de vecteurs, activer les enquêtes sur les différentes distributions de taxons au sein de la tique et étudier les hypothèses sur les interactions microbiennes. Cependant, il faut une connaissance préalable de l’identité microbienne pour sélectionner les taches appropriées, rendant cette approche inadaptée pour l’identification et la caractérisation microbienne. En outre, la coloration histologique est un processus laborieux très gourmandes en temps et ne s’adapte pas bien pour les grands échantillons. Approches moléculaires traditionnels tels que Sanger séquençage sont limités de la même façon dans la détection de diverses communautés microbiennes et leur sensibilité.
Séquençage de nouvelle génération permet l’identification rapide des microbes d’un grand nombre d’échantillons. La présence de gènes marqueurs standard et permet davantage de bases de données référence meilleure résolution taxonomique, souvent au niveau du genre ou espèce. Petite sous-unité ribosomal RNA sont fréquemment utilisés pour atteindre cet objectif, avec 16 s rRNA étant le plus commun en raison de la présence de régions conservées et variables à l’intérieur du gène, permettant la création d’amorces universelles avec des amplicons uniques pour chaque bactérien espèces de13,14. Ce rapport décrit en détail une procédure d’identification des taxons dans le microbiome tique par séquençage de nouvelle génération l’ARNr 16 s. En particulier, ce protocole met l’accent sur les étapes de préparation d’échantillons pour le séquençage. Plus généralisée des détails sur le séquençage et bioinformatique étapes vous sont présentés, qu’il y a une variété de plateformes de séquençage et de programmes d’analyse actuellement disponibles, chacun avec une abondante documentation existante. La faisabilité globale de cette approche nouvelle génération séquençage est démontrée en l’appliquant à une enquête de l’Assemblée de la communauté microbienne dans un vecteur clé de la maladie.
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Protocol
1. Cochez Collection et stérilisation en Surface
- Frais virés tiques en faisant glisser un chiffon2 blanc de 1 m sur un habitat associées aux tiques, enlever les tiques attaché à l’espèce hôte, ou l’élevage des tiques dans le lab15,16. Utilisez des pinces fines pour manipuler les tiques et les stocker à-80 ° C.
- Placer les tiques dans les tubes PCR individuels et d’éliminer les contaminants de surface au Vortex pendant 15 s successivement avec 500 μL de peroxyde d’hydrogène (H2O2), éthanol à 70 % et FD2O.
- Placer les tiques dans un nouveau tube PCR et laissez-les sécher à l’air.
- Dans ce tube, mécaniquement perturber les tissus tique en écrasant les tiques avec un mortier et un pilon (utilisé dans cette étude), à l’aide de petites perles dans un batteur de perle, ou couper la tique avec un scalpel.
2. Purification d’ADN
- Purifier l’ADN contre les tiques individuels, en suivant les instructions fournies dans un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce. Éluer pour un volume final de 100 μL.
Remarque : Reportez-vous à la Figure 1 pour un aperçu des étapes 2.2-2.8. Méthodes d’extraction alternatif incluent phénol-chloroforme extraction17,18, éthanol précipitation19ou extraction avec un chélateur de matière20,21. - Confirmer le succès purification d’ADN à l’aide d’un fluorimètre ou un spectrophotomètre. Pour fluorométrie, utiliser 10 μL de la matrice d’ADN dans un test d’ADN double-brin μL 190. Le rendement attendu est de 0,1 à 1,0 ng/μL22. Pour spectrophotométrie, utiliser 1 μL de la matrice d’ADN dans une quantification d’acides nucléiques. Le ratio A260/280 prévues est environ 1,823.
- Dans le cas contraire, procéder immédiatement à une amplification, stocker les échantillons à-20 ° C.
3. Amplification des gènes ARNr 16 s
- Mettre en place l’amplicon PCR dans une réaction de 27,5 μL contenant : 5 μL de chaque amorce à 1 μM ; 12,5 μl du mélange PCR disponible dans le commerce ; et 5 μL d’ADN extrait de tiques individuels à une concentration de 5 ng/μL.
Remarque : Utilisez les amorces suivantes pour l’amplification de la région hypervariable V3-V4 le 16 s rRNA gene13:
5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3',
--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3' 5' - Déplacer les tubes à un thermocycleur programmé pour : une dénaturation initiale à 95 ° C pendant 3 min ; 25 cycles de 1) 95 ° C pendant 30 s, 2) 57 ° C pendant 30 s, 3) 72 ° C pendant 30 s ; une extension finale à 72 ° C pendant 5 min ; et une dernière prise à 10 ° C.
- Une fois que la PCR est fait, visualiser le produit PCR en chargeant 4-6 μL/échantillon sur un gel d’agarose de 1,5 %. Recherchez une bande à 460 bp pour confirmer l’amplification.
Remarque : Produit Amplicon PCR peut ne pas apparaître sur le gel si la concentration de l’échantillon est trop faible (< 10 ng). Présence de dimère de l’apprêt est commun dans des échantillons de faible concentration. Si les autres bandes non ciblés sont présentes, ajuster la température de recuit ou diminuer le nombre de cycles. - Dans le cas contraire, procéder immédiatement à la purification, stocker les échantillons à 4 ° C.
4. Purification d’Amplicon 16 s
- À l’aide d’un nouveau tube PCR pour chaque échantillon, allient le produit PCR ddH2O pour obtenir le total 60 μL. Pour les échantillons avec de faibles concentrations d’ADN, effectuer amplicon PCR en trois exemplaires pour réduire le biais de l’amplification et de mettre en commun les échantillons à se concentrer.
- Apporter perles paramagnétiques à température ambiante et vortex qu'eux bien avant l’utilisation.
- Ajouter 48 μL de perles paramagnétiques à 60 μl de l’échantillon et incuber pendant 5 min. Place les tubes sur un support magnétique pendant 5 min jusqu'à ce que la solution devient clairement. Retirez le surnageant.
NOTE : Cette concentration perle vise l’élimination des dimères d’amorce (< 60 bp). Si nécessaire, ajuster la concentration en perle pour supprimer les autres bandes non spécifiques. - Avec tubes sur support magnétique, ajouter 500 μl de fraîchement préparés 80 % EtOH. Immédiatement après l’ajout d’EtOH à tous les tubes, distribuer le liquide. Ne pas enlever les perles. Répétez l’EtOH ajout et la suppression une fois de plus.
- Sécher les échantillons pour enlever l’excès EtOH en laissant les tubes ouverts sur la grille magnétique pendant 5 min, ou jusqu'à ce que les petites fissures sont visibles dans les perles.
- Ajouter 20 μL de tampon TE et incuber les échantillons au large de l’aimant, à température ambiante, pendant 5-10 min.
- Placer les tubes sur l’aimant. Une fois que les perles et les liquides sont séparés, transférer le surnageant dans un tube frais pour obtenir le produit PCR nettoyé.
- (Facultatif) Visualiser le produit pour confirmer la purification de l’amplicon réussie en chargeant 4-6 μL/échantillon sur un gel de 1,5 %. Le groupe bp 460 doit être visible, et il ne devrait y avoir aucun dimère d’amorce.
- Si ne pas procéder immédiatement à l’index de PCR, stocker les échantillons 4 ° C.
5. exemple de codes à barres et Purification
- Affecter d’amorces unique à chaque échantillon en sélectionnant les amorces soit avant ou arrière, ou les deux, à partir d’un kit d’index de bibliothèque disponibles dans le commerce.
Remarque : Unique d’étiquetage des échantillons permet la différenciation après séquençage. Kits fournissent généralement assez amorces pour séquencer 96-384 échantillons. - Joignez le doubles amorces ou indices, aux échantillons en effectuant des PCR dans une réaction de 25 μL contenant 2,5 μL de chaque amorce (N7xx et S5xx), 12,5 μL de commercialement disponible mélange maître du PCR, 5 μL de ddH2O et 2,5 μl de produit nettoyé amplicon.
- Déplacer les tubes à un thermocycleur programmé pour : une dénaturation initiale à 95 ° C pendant 3 min ; 8-14 cycles 1) 95 ° C pendant 30 s, 2) 55 ° C pendant 30 s, 3) 72 ° C pendant 30 s ; une extension finale à 72 ° C pendant 5 min ; et une dernière prise à 10 ° C.
- Une fois que la PCR est fait, visualiser le produit PCR en chargeant 4-6 μL/échantillon sur un gel d’agarose de 1,5 %. Recherchez une bande à 550 bp pour confirmer l’amplification.
NOTE : Utiliser les résultats de visualisation pour informer des conditions cyclisme indice d’amplification. Réduire le nombre de cycle pour atténuer les liaisons non spécifiques ou augmenter le nombre de cycle pour obtenir des bandes visibles pour chaque échantillon. - Répéter la procédure de nettoyage répertoriée à l’étape 4. Pour éviter la dilution lors du nettoyage, effectuez des index PCR en double exemplaire et poule produit ici.
- Dans le cas contraire, procéder immédiatement à la quantification de la bibliothèque et la normalisation, stocker les échantillons à 4 ° C.
6. normalisation et la Quantification de la bibliothèque
- Estimation de la concentration de chaque produit avec code à barres purifiée, de l’étape 5.5 à l’aide d’un fluorimètre ou spectrophotomètre (Voir l’étape 2.2). Diluer les échantillons dans un tampon TE pour obtenir des concentrations d’environ 13:00.
NOTE : Quantification de la bibliothèque est nécessaire pour atteindre l’échantillon concentration recommandée pour la plate-forme de séquençage de chargement. Quantification de la bibliothèque est obtenue par le biais de qPCR, mais estimer la concentration de l’échantillon avant qPCR enregistre des réactifs et temps. La concentration de 13:00 est recommandée pour maximiser la précision de dosage de la bibliothèque, car il s’agit de la concentration moyenne des normes qPCR fourni dans le kit de quantification24. - Effectuer qPCR dans une réaction de 10 μL contenant 6,0 μL de qPCR mélange principal (à partir de kit de quantification de bibliothèque), 2,0 μL de ddH2O et 2,0 μl de l’échantillon ou de la norme. Exécuter chaque échantillon et standard en triple exemplaire pour une plus grande exactitude et précision. Exécuter chaque échantillon à trois ou plusieurs niveaux de dilution (e.g., 12:01, 1 pm et 22:00 pour des concentrations estimées de départ) afin d’assurer une quantification précise.
NOTE : Des informations détaillées sur les normes et les amorces fournies variera selon le kit de quantification utilisé et sont disponibles dans les fiches techniques de produits. Se référer à la Table des matières pour le kit de quantification utilisé dans cette étude. - Déplacer la plaque de qPCR ou tubes à un appareil de PCR en temps réel, programmé pour : une dénaturation initiale de 95 ° C pendant 5 min ; 35 cycles de 1) 95 ° C pour 30 s et 2) 60 ° C pendant 45 s ; et une étape de dissociation de 1) 95 ° C pendant 15 s, 2) 60 ° C pendant 30 s et 3) 95 ° C pendant 15 s.
- Calculer la moyenne à partir de concentration pour chaque échantillon, en utilisant les valeurs de quantification obtenues à partir des résultats de qPCR et les niveaux de dilution d’échantillon utilisés.
NOTE : par exemple, une concentration moyenne de 14:00 pour un échantillon dilué 1/100 000 donne une concentration de départ originale de 200 nM. Si aucun des niveaux de dilution pour un échantillon donné relève de la gamme des courbes standards, résultats de quantification ne soient pas exactes ; dans ce cas, régler les niveaux de dilution et de réexécuter qPCR. - Diluer chaque échantillon barcoded purifiée, à 4 nM dans un tampon TE basé sur les concentrations moyennes calculé à l’étape 7,5.
NOTE : par exemple, pour une concentration de l’échantillon moyen de 200 nM, diluer l’échantillon 01:50 dans TE mettre en mémoire tampon pour atteindre une concentration de nM 4. La concentration de l’échantillon précis variera selon le kit de séquençage de système et réactif utilisé. Consultez le guide de l’utilisateur système de séquencement pour la concentration recommandée. - Créer la bibliothèque combinée en ajoutant des quantités égales (en général 5 à 10 μL) de toutes les bibliothèques individuelles dans un seul tube.
Remarque : comme tous les échantillons doivent être à une concentration de nM 4, ajout de volumes égaux réalise une concentration égale de tous les échantillons dans la bibliothèque de mise en commun. - Répétez les étapes 6.2-6,4 sur la bibliothèque combinée pour confirmer la concentration nM 4.
- Calculer la concentration de bibliothèque combinée et diluer ou reconstituer la bibliothèque finale, regroupée en utilisant un tampon Tris que nécessaire pour atteindre 4 nM.
- Dans le cas contraire, procéder immédiatement au chargement de l’échantillon, stocker les échantillons à-20 ° C. Effectuer le séquençage exécuté peu après quantification pour minimiser la perte ou changement dans la concentration d’ADN au cours du stockage.
7. Bibliothèque dénaturation et Dilution et séquençage exécuter (effectuer le jour même)
- Dénaturer la bibliothèque combinée de 4 nM de l’étape 6,9 avec NaOH.
Remarque : Ces étapes de préparation de bibliothèque final différent pour chaque système de séquençage. Consultez le guide d’utilisateur système séquençage des protocoles plus détaillées et à jour. Nouveaux utilisateurs aura probablement besoin de recevoir une formation sur l’utilisation de la plate-forme de séquençage ou peuvent envoyer leurs bibliothèques vers une installation de séquençage de noyau. - Diluer la bibliothèque dénaturée à la concentration de chargement désirée à l’aide de la mémoire tampon fournie dans le kit de réactifs de séquençage (Table des matières).
Remarque : Les concentrations de chargement optimale varient par système séquentiel et, généralement, vont de 1 à 250 h25. - Dénaturer et diluer le contrôle de séquençage.
NOTE : Ajout d’un contrôle de séquençage corrige les problèmes de séquençage dus aux bibliothèques de faible diversité. Dénaturer le contrôle de séquence à l’aide de NaOH et diluer à la même concentration que la bibliothèque. - Combiner la bibliothèque et le contrôle de séquençage.
NOTE : Le rapport de contrôle de séquençage à Bibliothèque combinée dépendra de la diversité de la bibliothèque et le système séquentiel utilisé, mais il est généralement de 1:1,26. - Charger la bibliothèque combinée et le mélange de contrôle de séquençage vers la cellule de flux de séquençage.
8. analyse de la séquence de l’Amplicon
- Évaluer le succès global de la course en examinant l’Etendue de la course sur l’environnement informatique de nuage correspondant au système de séquençage utilisé.
Remarque : La métrique d’exécution, tels que le nombre de lectures de séquençage, variera selon séquençage kit de plate-forme et du réactif utilisé. Les valeurs cibles pour des systèmes communs de séquençage sont énumérés au tableau 1. - Télécharger les données de séquençage brutes et désiré de bio-informatique, logiciels libres, Insights quantitatives en écologie microbienne (QIIME)27 ou Mothur28.
NOTE : Les QIIME et Mothur sont open source et gratuit à télécharger. Des instructions détaillées sur l’utilisation de ces programmes peuvent être consultées en ligne et sont suffisamment détaillées pour les utilisateurs novices. Les étapes suivantes fournissent une vue d’ensemble d’un pipeline de bioinformatique mené en QIIME. Familiarité avec python n’est pas nécessaire mais permet de faciliter la réalisation des scripts suivants - Créer et valider le fichier de mappage à l’aide du script de « validate_mapping_file.py » dans QIIME.
Remarque : Le fichier de mappage contient toutes les métadonnées nécessaires pour effectuer l’analyse des données, y compris échant, séquences d’amorces amplicon et description de l’échantillon. L’étape de validation vérifie que toutes les données nécessaires ont été entrées dans le format approprié. - Démultiplexer et filtrer les séquences en utilisant le script « split_libraries.py » (Figure 1).
NOTE : Ce script affecte barcoded lectures aux échantillons basés sur les combinaisons d’amorces index et ID d’échantillon d’entrée dans le fichier de mappage. Il effectue également plusieurs qualité de filtrage des mesures de contrôle de séquençage d’erreur en fonction définie par l’utilisateur les seuils pour le niveau de qualité minimum, longueur de la séquence et éboutage. - Affecter des unités taxonomiques opérationnelles (UTO) aux séquences en utilisant le script « pick_open_references_otus.py ».
Remarque : Dans cette étape, les séquences sont groupés contre une collection de séquence de référence basée sur un seuil d’identité (habituellement 97 %). Les lectures qui ne correspondent pas à la collection de séquences de référence sont regroupés contre l’autre. De novo et fermé-référence Uto cueillette options sont également disponibles, mais la cueillette libre-référence est recommandée par les développeurs de QIIME. - Normaliser la table OTU en utilisant le script « alpha_rarefaction.py » ou « normalize_table.py ».
Remarque : Cette étape corrige la variation dans les montants de la colonne ou la séquence totale lectures par exemple, résulter de technologies de séquençage moderne. Normalisation peut être effectuée à l’aide de raréfaction traditionnelle, ou par le biais de méthodes alternatives telles que la somme cumulée mise à l’échelle. - Effectuer plusieurs diversité alpha, bêta-diversité et l’analyse de la composition taxinomique diversité à la fois en utilisant le script « core_diversity_analysis.py ».
Remarque : Par ailleurs, ces analyses peuvent être exécutées séparément en utilisant les scripts individuels (par exemple, "alpha_diversity.py »).
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Representative Results
Un total de 42 tiques de trois œufs distincts embrayages et deux périodes d’exposition environnementale, 0 et 2 semaines dans le sol, ont été traitées pour l’ordonnancement de microbiome. Chaque groupe de traitement, considéré comme une seule fois d’embrayage et de l’exposition, contenue 6-8 échantillons tique de répliquer. Ces extraits de tique transformés ont été chargées dans un séquenceur de nouvelle génération et a donné 12,885,713 jumelé-fin lectures en passant le filtre. Inclus dans cette course étaient 3 témoins négatifs de l’étape d’extraction, ce qui donne un total de 211 214 lectures (inclus dans le compte précédent). Outre métriques qualité exécution ainsi que les valeurs optimales pour chaque indicateur sont détaillés dans le tableau 2. Courbes de raréfaction, qui concernent nombre de OTUs par exemple, a indiqué qu’une profondeur de séquençage, ou le numéro de séquence unique lit par exemple, de 2 129 lectures serait suffisante pour capturer correctement la diversité de la communauté microbienne (effort de séquençage La figure 2). Niveaux de raréfaction varieront selon le type d’échantillon et doivent être déterminées individuellement pour chaque séquençage exécuter. Après le raffinement de cette profondeur, 1 714 OTUs ont été identifiés dans l’ensemble de tous les échantillons avec une moyenne de 93,3 OTUs ± 4,3 par échantillon. Afin d’éviter une analyse en aval découlant de matrices creuses et pour éliminer les contaminants potentiels, tous OTUs introuvables dans au moins un échantillon à l’abondance ≥ 1 % des questions ont été regroupées dans une catégorie générale rare. De plus, le package decontam dans R a été utilisé pour identifier l’OTUs surreprésentés dans les témoins négatifs par rapport à des échantillons réels et ces OTUs ont été retirés de l’analyse en aval.
Communauté écologie analyses ont été effectuées à l’aide du flux de travail QIIME la diversité des analyses afin de démontrer les types de diversité alpha, diversité bêta et taxonomie composition diversité sortie générée à l’aide d’un tuyau simple bio-informatique. Par exemple, pondérées et non pondérées Unifrac coordonnées principales analyses ont été réalisées avec le script « core_diversity_analyses.py », et ils ont révélé le regroupement spatial des tiques larves selon l’identité de l’embrayage (Figure 3). Boîtes de OTU compte à différentes reprises ont été générés aussi par le biais de ce script, l’exposition environnementale démontrant les différences microbiome richesse en espèces au fil du temps (Figure 4). Ces analyses de diversité alpha et bêta sont effectuées selon les catégories définies par l’utilisateur répertoriés dans le fichier de mappage, mais les chiffres et statistiques sur l’information taxonomique générale sont également générés pour tous les échantillons (Figure 5).
Figure 1 : Flux de séquençage Microbiome. Principales étapes du workflow microbiome séquençage sont affichés avec des appels pour les étapes d’analyse bibliothèque préparation et séquençage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Courbes de raréfaction pour séquence comptent normalisation. Courbes de raréfaction, indiqués pour chaque cohorte de tiques, concernent observées OTU comtes effort d’échantillonnage. Barres d’erreur sont présents en raison des échantillons présents dans chaque couvée, et ils indiquent un écart. Une profondeur de séquençage doit être sélectionnée à ou au-delà du point où la courbe devienne stable pour capturer correctement toute la gamme des OTUs. Ici, une profondeur de séquençage de 2 000 lectures semble appropriée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Principal de coordonner l’analyse par embrayage. Non pondéré analyse en coordonnées principales (PCoA) Unifrac montre la variation dans la composition de microbiome entre tiques larves différentes griffes, ainsi que d’adultes. Chaque point de données désigne une tique individuelle. Ce chiffre est automatiquement généré par le script « core_diversity_analyses.py » de QIIME. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Boîtes de diversité alpha par durée d’exposition. Boîtes représentant OTU compte pour l’exposition environnementale groupes voir la variation dans la diversité microbienne au fil du temps. Ce chiffre est automatiquement généré par le script « core_diversity_analyses.py » de QIIME. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Identification microbienne au niveau du phylum pour embrayage un. Composition de microbiome pour des échantillons individuels tique d’embrayage un apparaît au niveau de l’embranchement. Cette figure, ainsi que des informations résumées à des niveaux taxonomiques inférieurs, est généré automatiquement par le script « core_diversity_analyses.py » de QIIME. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Métrique | Définition | Nos résultats (MiSeq V3) | Optimal pour MiSeq V3 | Optimal pour le Mode rapide HiSeq | |
| Lit PF | Nombre de lectures en passant le filtre de la chasteté de séquençage. Une lecture passe le filtre si pas supérieure à 1 appel de base a une valeur de chasteté inférieure à 0,6 dans les 25 premiers cycles | 12,885,713 | 14 millions | 600 millions | |
| Taux d’erreur | Pourcentage de paires de base appelé incorrectement lors d’un cycle, issu des lectures alignés au contrôle PhiX | 3.28 ±0, 10 | * Dépend des valeurs des autres paramètres | * Dépend des valeurs des autres paramètres | |
| % ≥Q30 | Pourcentage de bases avec un Q score ≥ 30, ce qui indique une précision de base appel de 99,9 % | 68,94 | > 70 % | > 80 % | |
| Cluster PF (%) | Pourcentage des grappes en passant le filtre de la chasteté. | ±0.81 85.61 | 90 % | 90 % | |
| Densité | Densité de clusters sur la cellule - une métrique clé pour la qualité des données et de sortie | 552 ± 35 cluster/mm ^ 2 | 1200-1400 cluster/mm ^ 2 | 850-1000 cluster/mm ^ 2 | |
Tableau 1 : Principaux paramètres de performance pour la sortie de la NGS. Les valeurs de données et la cible utilisateur signalée selon le kit de séquençage de plate-forme et réactif utilisé dans cette étude (Table des matières) et un ajout de contrôle de séquençage de 25 %.
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Discussion
Nouvelle génération séquençage des ARNr 16 s est devenu une approche normalisée pour identification microbienne et a permis l’étude d’incidence vecteur microbiomes et de transmission d’agents pathogènes. Le protocole décrit ici en détail l’utilisation de cette méthode pour étudier l’Assemblée de la communauté microbienne dans I. pacificus, une espèce de vecteur de la maladie de Lyme ; Toutefois, il peut facilement être appliqué à l’étude des autres espèces de tiques ou arthropode vecteur.
En effet, séquençage des ARNr 16 s pour l’analyse de microbiome a été utilisé largement pour étudier les microbiomes de vecteurs, y compris les moustiques, les psylles et les mouches tsé-tsé29,30,31. Autres méthodes disponibles pour identification microbienne au sein de vecteurs comprennent la microscopie, culture et coloration histologique. Ces méthodes peuvent être plus appropriés que le séquençage si l’objectif est d’identifier et décrire un microbe roman (examen microscopique), évaluer l’effet des médicaments antimicrobiens (culture) ou localiser des microbes spécifiques et connus dans le vecteur (coloration histologique). Cependant, ces méthodes souffrent d’évolutivité, de détection et faible spécificité et sont donc moins appropriés pour identifier la communauté pleine de microbes dans un vecteur ou caractérisant le microbiome vecteur sous des variables expérimental et écologique conditions. À l’inverse, haut débit séquençage du gène de l’ARNr 16 s permet l’identification des bactéries de faible abondance et non cultivables, fournit la haute résolution et détection étant donné les bases de données de référence complet et peut fournir en fonction de réplication élevée sur les besoins de couverture.
Alors que le séquençage des ARNr 16 s est maintenant largement utilisé pour l’identification microbienne, cette technique n’est pas sans limites. Principalement, la contamination microbienne peut obscurcir d’interpréter les résultats du séquençage et confondre la signification biologique de32. En outre, compte tenu de l’utilisation des amorces universelles de bactéries et de sensibilité à faible à partir de concentrations qui sont inhérentes au séquençage des ARNr 16 s, une contamination microbienne est commune32. Sources de contamination sont réactifs PCR, trousses d’extraction d’ADN, des surfaces de laboratoire et la peau et les vêtements de chercheurs33,34,35. Les effets des contaminants microbiens peuvent être minimisés en travaillant dans un environnement stérile, à l’aide de témoins négatifs et les répétitions techniques, et conserver une trace de tous les kits et réactifs utilisé36.
En plus de la contamination microbienne, sortie de séquençage de faible qualité peut considérablement gêner la facilité d’utilisation des données de séquençage microbiome. Qualité des données peut être évaluée par un certain nombre de paramètres exécution, y compris le nombre de lectures en passant le filtre, le pourcentage de lectures au-dessus un Q-score (mesure de la probabilité d’erreur dans la base d’appel) de 30 et la densité de cluster. Valeurs pour ces paramètres varient en fonction du nombre d’échantillons, le système séquentiel, la cartouche de réactif et le pourcentage de séquençage de contrôle utilisé, mais les valeurs optimales basées sur les conditions de course sont disponibles en ligne. En particulier, la densité de cluster, le nombre de grappes de bibliothèque sur un plan donné de la cellule de flux avant séquençage, est un paramètre clé pour optimiser le rendement et la qualité des données. Aussi bien sur et sous-clustering peuvent réduire la production de données et entraîner échantillons étant exclus de l’analyse en raison de la couverture insuffisante. Densité de cluster pauvre reflète souvent la quantification bibliothèque inexactes ; ainsi, il faut faire bon ADN nettoyage, quantification de chaque échantillon et quantification de la bibliothèque entière.
En supposant que le rendement et la qualité élevée des données soient atteints, des approches divergentes dans l’analyse de données utilisé pour relever les défis statistiques de grands ensembles de données posent une autre limite de cette approche. Par exemple, plusieurs méthodes existent pour variation adresse des chefs d’accusation lus entre les échantillons. Raréfaction, qui implique l’échantillonnage lectures pour parvenir à une profondeur de séquençage de l’égalité entre tous les échantillons, est fréquemment utilisée mais a fait l’objet de critique récemment pour perdre de grandes quantités de données et la sélection subjective de profondeur minimale séquençage37 ,38,,39. Somme cumulée mise à l’échelle (CSS), qui continue la séquence tous les lit mais pèse eux basé sur la somme cumulée des chefs d’accusation dans un centile donné, a été conçu comme une technique alternative. Cependant, CSS n'a pas été largement adoptée en raison de sa relative nouveauté et l’utilitaire confirmé de raréfaction de normalisation avant des analyses de présence/absence.
Procédures d’analyse de données standard ne manquent également pour la manipulation des lectures de séquence chez les témoins négatifs et distinguer ces de faible abondance lectures. Comme mentionné, séquençage des témoins négatifs générés par l’étape d’extraction de l’ADN est recommandé pour permettre de différencier les résidents microbiome vrai vecteur de contaminants microbiens pendant l’analyse. Pourtant, une approche standard et statistiquement rigoureuse permettant d’identifier et de filtrer les contaminants suspectés fait défaut. Une approche courante consiste à retirer tous les échantillons de OTUs présents dans les témoins négatifs. Cependant, cette méthode peut être trop prudente, étant donné que beaucoup de ces microbes susceptibles proviennent des échantillons réels plutôt que réactifs de kit40. Une autre technique courante consiste à groupement microbes présents à < 1 % dans une catégorie « rare » dans l’hypothèse que les contaminants microbiens sont rares dans des échantillons réels8,41. Toutefois, cette méthode peut supprimer les microbes true vector qui sont présents en faible abondance, particulièrement lorsque le microbiome est dominé par un endosymbiote, comme on le voit en I. pacificus et I. est7,42. Dans ces cas, détecter les microbes rares nécessiterait plus profond séquencement, développer des amorces qui inhibent l’amplification de l’endosymbiote durant l’amplicon PCR42ou la suppression par le calcul de l’endosymbiote au cours de l’analyse de la séquence 7. choisir parmi les différentes méthodes d’adresse rare et contaminant OTUs crée l’occasion de la subjectivité et de partialité dans l’analyse de données microbiome, qui pourrait limiter la possibilité de comparer les résultats entre les études.
Le choix de la base de référence, nécessaire à l’attribution de la taxonomie et phylogénétiques informations de séquence lectures, présente une autre occasion de divergence et de la subjectivité. Alors que la tâche sur les lectures de séquence provenant d’une région variable gène un génome parent identifié est intrinsèquement difficile, une base de données de référence fiables est crucial pour affectation phylogénétique précise. Plusieurs bases de données sont apparues pour relever ce défi, comme SILVA43, Greengenes44,45de la RDP et NCBI46. SILVA est le plus grand des taxonomies axée sur les 16 s, mais SILVA, ainsi que RDP, fournit seulement des informations taxonomiques jusqu’au niveau du genre. Greengenes fournit des informations de niveau de l’espèce et est inclus dans les paquets analyse métagénomique comme QIIME, mais il n’a pas été mis à jour en plus de quatre ans. NCBI, tandis que pas une source primaire d’information taxonomique, fournit des classifications mise à jour quotidiennes des séquences soumis par l’utilisateur, mais il est uncurated. Alors que la sélection parmi les bases de données dépend en général les besoins des utilisateurs au sujet de la résolution, la couverture et monnaie, il a un impact significatif sur l’affectation de phylogénétique et analyse en aval47,48. Consensus parmi les chercheurs au sujet de quelle base de données de référence à utiliser est donc impératif pour éviter les biais supplémentaire dans les analyses.
Les approches standards à ces défis du traitement des données émergera probablement comme le séquençage des ARNr 16 s devient une technique de plus en plus courante. Réduction continue dans le temps et les coûts de séquençage va populariser davantage cette méthode. L’utilisation accrue de cette technologie permettra aux enquêtes plus profonds sur la composition et l’écologie du vecteur microbiomes dans des conditions diverses. Connaissance de la biologie de microbiome vecteur étant encore à ses balbutiements, ces types d’études descriptives sont une première étape cruciale qui précède les tentatives d’exploiter le microbiome comme moyen de lutte antivectorielle. Toutefois, pour vraiment comprendre le rôle du microbiome dans la transmission d’agents pathogènes, identification microbienne doit être couplée avec la connaissance du rôle fonctionnel de ces microbes. Séquençage de RNA et approches transcriptomiques, qui impliquent une cartographie et quantification de l’expression génique, permettent des déductions dans le rôle fonctionnel des microbes mais nécessitent le séquençage en profondeur et entièrement assemblé des génomes d’espèces cibles. Contourner ces défis, les outils informatiques pour prédire la composition fonctionnelle de l’ARNr 16 s données de séquençage ont récemment été mis au point, mais ne sont pas largement adoptées encore49. Le développement de ces outils, ainsi que la théorie écologique, qui relie l’identité microbienne et le rôle fonctionnel dans les vecteurs augmentera l’utilité des données du séquençage d’ARNr 16 s dans les études de microbiome vector.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par National Science Foundation accorde à A.S. (# DEB 1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
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