Summary
Qui presentiamo un protocollo di sequenziamento di nuova generazione per rRNA 16S che consente l'identificazione e la caratterizzazione delle comunità microbiche all'interno di vettori. Questo metodo prevede l'estrazione di DNA, amplificazione e codici a barre dei campioni mediante PCR, sequenziamento su una cella di flusso e la bioinformatica per abbinare i dati di sequenza filogenetica informazioni.
Abstract
Negli ultimi decenni, malattie trasmesse da vettori sono riemerse e ampliato a tassi, causando una notevole morbilità e mortalità in tutto il mondo in modo allarmante. Per la maggior parte di queste malattie, che richiedono lo sviluppo di strategie di mitigazione del romanzo malattia stanno difettando di vaccini efficaci e ampiamente disponibili. A tal fine, una strada promettente di controllo della malattia coinvolge il microbioma vettoriale, la comunità di microbi che abitano il vettore di targeting. Il microbioma vettore svolge un ruolo fondamentale nelle dinamiche di agente patogeno, e manipolazioni del microbioma hanno portato a vector ridotta trasmissione di abbondanza o di agenti patogeni per una manciata di malattie trasmesse da vettori. Tuttavia, tradurre questi risultati in applicazioni di controllo di malattia richiede una conoscenza approfondita dell'ecologia microbica di vettore, storicamente limitato dalla tecnologia insufficiente in questo campo. L'avvento di approcci di sequenziamento di nuova generazione ha permesso sequenza rapida, altamente parallelo di diverse comunità microbiche. Gene del rRNA 16S altamente conservata di targeting ha facilitato caratterizzazioni di microbi presenti all'interno di vettori sotto diverse condizioni ecologiche e sperimentale. Questa tecnica comporta l'amplificazione del gene del rRNA 16S, codici a barre campione tramite PCR, caricamento campioni su una cella di flusso per il sequenziamento, e bioinformatica si avvicina per abbinare i dati di sequenza con informazioni filogenetiche. Specie o identificazione a livello di genere per un numero elevato di repliche in genere può essere raggiunto attraverso questo approccio, aggirando così le sfide di rilevamento basso, ad alta risoluzione e uscita da coltura tradizionale, microscopia o macchiatura istologica tecniche. Pertanto, questo metodo è particolarmente adatto per la caratterizzazione di microbi di vettore in condizioni diverse, ma attualmente non può fornire informazioni sulla funzione microbica, posizione all'interno del vettore, o risposta al trattamento antibiotico. Nel complesso, la generazione 16S è una tecnica potente per comprendere meglio l'identità e il ruolo dei microbi di vettore nelle dinamiche di malattia.
Introduction
La rinascita e la diffusione di malattie trasmesse da vettori negli ultimi decenni una minaccia seria alla salute globale di umani e animali selvatici. Vaccini efficaci sono carenti per la maggior parte di queste malattie, e gli sforzi di controllo sono ostacolati dalla natura biologica complessa di vettori e interazioni ospite-vettore. Comprensione del ruolo delle interazioni microbiche all'interno di un vettore nella trasmissione dell'agente patogeno può consentire lo sviluppo di nuove strategie che eludere queste sfide. In particolare, interazioni tra vettore associato microbiche commensali, simbionti e patogeni, indicati come il microbioma, possono avere conseguenze importanti per la trasmissione di agenti patogeni. Prove schiaccianti ora supporta questa asserzione, con esempi che dimostrano un collegamento tra il vettore microbiome e competenza per malattie come la malaria, virus di Zika e malattia di Lyme1,2,3. Tuttavia, tradurre questi risultati in strategie per il controllo della malattia richiede una comprensione molto più dettagliata della struttura, funzione e origine del vettore microbiomi. Identificazione e caratterizzazione della comunità microbica vettoriale sotto diverse condizioni ecologiche e sperimentali costituiscono un importante percorso in avanti in questo campo.
Qui è disponibile una procedura per identificare i residenti microbici di un vettore patogeno utilizzando il Western battito nero-fornito di gambe, pacificus di Ixodes, una specie di vettore dell'agente patogeno la malattia di Lyme Borrelia burgdorferi. Mentre le zecche del porto più tipi di agenti patogeni umani rispetto a qualsiasi altri artropodi, relativamente piccolo è conosciuto circa l'ecologia biologia e comunità di tick microbiomi4. È evidente che le zecche harbor una gamma diversificata di virus, batteri, funghi e protozoi sono commensali, endosimbionti e residenti microbica transitoria5,4. Lavoro precedente ha dimostrato forti variazioni in Ixodes microbiomi associati di geografia, specie, sesso, fase di vita e di farine di sangue fonte6,7,8. Tuttavia, i meccanismi alla base di questa variazione rimangono sconosciuti e garantiscono che più dettagliate indagini sull'origine e l'assemblaggio di queste comunità microbiche. Le zecche possono acquisire i microbi attraverso trasmissione verticale, contatto con padroni di casa e l'assorbimento dall'ambiente attraverso gli spiracoli, bocca e poro anale9. Comprendere i fattori che determinano la formazione iniziale e lo sviluppo del microbioma tick, in particolare il contributo relativo di trasmissione verticale e ambientale, è importante per comprendere i modelli naturali e le variazioni in segno di graduazione microbioma diversità e come queste comunità interagiscono durante la trasmissione di agenti patogeni, con possibili applicazioni per controllo di malattia o vettoriale.
Potenti tecniche molecolari, come ad esempio il sequenziamento di nuova generazione, ora esistono per identificare le comunità microbiche e possono essere impiegati per caratterizzare vettoriale microbiomi sotto diverse condizioni ambientali o sperimentale. Prima dell'avvento di questi approcci di sequenziamento ad alte prestazioni, l'identificazione di microbi invocata principalmente la microscopia e la cultura. Mentre la microscopia è una tecnica rapida e facile, i metodi morfologici per l'identificazione di microbi sono inerentemente soggettivo e grossolana e limitato dalla bassa sensibilità e rilevamento di10. Metodi basati sulla cultura sono ampiamente utilizzati per identificazione microbica e possono essere utilizzati per determinare la suscettibilità dei microbi al farmaco trattamenti11. Tuttavia, questo metodo soffre anche di bassa sensibilità, come è stato stimato che meno del 2% dei microbi ambientali possono essere coltivato in un laboratorio impostazione12. Approcci di macchiatura istologici sono stati impiegati anche per rilevare e localizzare i microbi specifici all'interno di vettori, attivare indagini di varie distribuzioni di taxa all'interno il segno di spunta e studiare ipotesi circa le interazioni microbiche. Tuttavia, previa conoscenza dell'identità microbica è necessaria per la selezione le macchie appropriate, rendendo questo approccio inadatte per l'identificazione e caratterizzazione microbica. Inoltre, macchiatura istologica è un processo laborioso ad alta intensità di tempo e non si adatta bene per campioni di grandi dimensioni. Approcci molecolari tradizionali quali Sanger sequenziamento similmente sono limitati nella loro sensibilità e l'individuazione delle diverse comunità microbiche.
Sequenziamento di nuova generazione consente la rapida identificazione di microbi da un gran numero di campioni. La presenza di geni marcatori standard e consente maggiori database di riferimento enhanced risoluzione tassonomica, spesso a livello di genere o specie. Piccola unità secondaria ribosomal RNA sono frequentemente usati per raggiungere questo obiettivo, con 16S rRNA è il più comune a causa della presenza delle regioni conservate e variabile all'interno del gene, che permette la creazione di primers universali con ampliconi univoco per ogni batterico specie13,14. Questo rapporto dettaglia una procedura per l'identificazione dei taxa nel microbioma tick tramite sequenziamento del 16S rRNA generazione. In particolare, questo protocollo sottolinea i passaggi coinvolti nella preparazione dei campioni per il sequenziamento. Più generalizzata, dettagli sul sequenziamento e bioinformatica passaggi sono forniti, così come ci sono una varietà di piattaforme di sequenziamento e analisi programmi attualmente disponibili, ciascuno con ampia documentazione esistente. La fattibilità complessiva di questo approccio di sequenziamento di nuova generazione è dimostrata applicandolo ad un'indagine dell'Assemblea della comunità microbica all'interno di un vettore di malattia chiave.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Selezionare raccolta e sterilizzazione superficiale
- Raccogliere le zecche trascinando un 1m2 bianco panno sopra un habitat tick-collegata, rimuovere le zecche collegato a specie ospite o allevamento le zecche in laboratorio15,16. Utilizzare una pinzetta per manipolare le zecche e conservarli a-80 ° C.
- Posizionare le zecche dei singoli tubi di PCR e rimuovere contaminanti di superficie nel Vortex per 15 s successivamente con 500 μL di perossido di idrogeno (H2O2), etanolo al 70% e ddH2O.
- Inserire i segni di graduazione in un nuovo tubo PCR e lasciarli asciugare all'aria.
- In questo tubo, meccanicamente distruggere tessuti tick schiacciando le zecche con un mortaio e pestello (utilizzato in questo studio), utilizzando piccole perle in un battitore di tallone, o il segno di spunta di taglio con un bisturi.
2. purificazione DNA
- Purificare il DNA da singole zecche, seguendo le istruzioni fornite in un kit di estrazione di DNA disponibile in commercio. Eluire per un volume finale di 100 μL.
Nota: Fare riferimento alla Figura 1 per una panoramica dei passaggi 2.2-2.8. Metodi di estrazione alternativi includono fenolo-cloroformio estrazione17,18, etanolo precipitazioni19o estrazione con un chelante del materiale20,21. - Confermare il successo purificazione del DNA usando un fluorimetro o spettrofotometro. Per fluorimetria, utilizzare 10 μL della mascherina del DNA in un dosaggio di DNA double-stranded μL 190. Il rendimento atteso è 0.1-1.0 ng/μL22. Per spettrofotometria, utilizzare 1 μL della mascherina del DNA in una quantificazione degli acidi nucleici. Il rapporto A260/280 previsto è di circa 1,823.
- In caso contrario procedere immediatamente all'amplificazione, conservare i campioni a-20 ° C.
3. amplificazione del Gene del rRNA 16S
- Impostare l'amplicone PCR in una reazione di 27,5 μL contenente: 5 μL di ogni primer 1 μm; 12.5 μL di miscela di PCR commercialmente disponibile; e 5 μL di DNA Estratto da singole zecche ad una concentrazione di 5 ng/μL.
Nota: Utilizzare i seguenti primer per l'amplificazione della regione ipervariabile V3-V4 del 16S rRNA gene13:
5' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3',
5' - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3' - Spostare i tubi in un termociclatore programmato per: una denaturazione iniziale a 95 ° C per 3 min; 25 cicli di 1) 95 ° C per 30 s, 2) 57 ° C per 30 s, 3) 72 ° C per 30 s; un'estensione finale a 72 ° C per 5 min; e una stretta finale a 10 ° C.
- Una volta fatto la PCR, è possibile visualizzare il prodotto PCR caricando μL di 4-6/campione su un gel di agarosio al 1.5%. Cercare una band a 460 bp per confermare l'amplificazione.
Nota: Amplicone PCR prodotto potrebbe non essere visibile sul gel se la concentrazione del campione è troppo bassa (< 10 ng). Presenza di dimero di primer è comune nei campioni a bassa concentrazione. Se le altre bande non bersaglio sono presenti, regolare la temperatura di ricottura o diminuire il numero di cicli. - In caso contrario procedere immediatamente alla purificazione, conservare i campioni a 4 ° C.
4. 16S amplicone purificazione
- Usando un nuovo tubo PCR per ogni campione, combinare il prodotto PCR con ddH2O ottenere 60 μL totale. Per campioni con basse concentrazioni di DNA, è possibile eseguire amplicone PCR in triplice copia per ridurre i pregiudizi di amplificazione e i campioni di concentrare della piscina.
- Portare paramagnetici perline a temperatura ambiente e agitare che bene prima dell'uso.
- Aggiungere 48 μL di perline paramagnetici a 60 μL del campione e incubare per 5 min posto i tubi su un rack magnetico per 5 minuti fino a quando la soluzione diventa chiaro. Eliminare il surnatante.
Nota: Questa concentrazione di perlina rivolge la rimozione di dimeri dell'iniettore (< 60 bp). Se necessario, regolare la concentrazione di tallone per rimuovere altre bande non specifiche. - Con tubi su rack magnetico, aggiungere 500 μL di preparate 80% EtOH. Immediatamente dopo l'aggiunta di EtOH a tutte le provette, dispensare il liquido. Non rimuovere le perline. Ripetere l'EtOH aggiunta e la rimozione una volta di più.
- Asciugare i campioni per rimuovere l'eccesso EtOH lasciando i tubi aperti sul rack magnetico per 5 minuti, o fino a piccole crepe sono visibili nelle perle.
- Aggiungere 20 μL di buffer di TE e incubare i campioni fuori il magnete, a temperatura ambiente per 5-10 min.
- Posizionare i tubi indietro sul magnete. Una volta che le perline e i liquidi sono separati, è possibile trasferire il surnatante in una nuova provetta per ottenere il prodotto PCR pulito.
- (Opzionale) Visualizzare il prodotto per confermare il successo amplicone purificazione caricando μL di 4-6/campione su un gel di 1,5%. La band di bp 460 dovrebbe essere visibile, e non ci dovrebbe essere nessun dimero di primer.
- Se non procedere immediatamente all'indice PCR, conservare i campioni 4 ° C.
5. codici a barre e purificazione del campione
- Assegnare combinazioni di primer univoco a ciascun campione selezionando primer avanti o indietro, o entrambi, da un kit di indice di libreria disponibili in commercio.
Nota: In modo univoco etichettatura campioni permette differenziazione dopo la sequenziazione. Kit in genere forniscono abbastanza primer per 96-384 campioni di sequenza. - Allegare il primer dual o indici, ai campioni eseguendo PCR in una reazione di 25 μL contenente 2,5 µ l di ciascun primer (N7xx e S5xx), 12,5 μL di mix master di PCR commercialmente disponibili, 5 μL di ddH2O e 2,5 µ l di prodotto pulito amplicon.
- Spostare i tubi in un termociclatore programmato per: una denaturazione iniziale a 95 ° C per 3 min; 8-14 cicli di 1) 95 ° C per 30 s, 2) 55 ° C per 30 s, 3) 72 ° C per 30 s; un'estensione finale a 72 ° C per 5 min; e una stretta finale a 10 ° C.
- Una volta fatto la PCR, è possibile visualizzare il prodotto PCR caricando μL di 4-6/campione su un gel di agarosio al 1.5%. Cercare una band a 550 bp per confermare l'amplificazione.
Nota: Utilizzare i risultati di visualizzazione per informare condizioni ciclismo Indice PCR. Abbassare il numero di cicli di mitigare il legame non specifico o aumentare il numero di cicli per ottenere bande visibili per ogni campione. - Ripetere la procedura di pulizia elencata nel passaggio 4. Per evitare la diluizione durante la pulizia, eseguire Indice PCR in duplicato e piscina il prodotto qui.
- In caso contrario procedere immediatamente alla quantificazione di biblioteca e normalizzazione, conservare i campioni a 4 ° C.
6. normalizzazione e quantificazione biblioteca
- Stimare la concentrazione di ogni prodotto purificato, con codice a barre dal passaggio 5.5 utilizzando un fluorimetro o spettrofotometro (Vedi punto 2.2). Diluire i campioni in buffer di TE per ottenere concentrazioni di circa 13.
Nota: La quantificazione di libreria è necessaria per raggiungere il concentrazione raccomandata per la piattaforma di sequenziamento di carico del campione. Quantificazione di biblioteca è raggiunta attraverso qPCR, ma stimare la concentrazione del campione prima della qPCR di risparmiare tempo e reagenti. La concentrazione di 13 è consigliata per massimizzare la precisione di quantificazione di libreria, come questo è la concentrazione media degli standard qPCR fornito nella quantificazione kit24. - Eseguire qPCR in una reazione di 10 μL contenente 6.0 μL di mix master qPCR (dal kit di quantificazione di biblioteca), 2.0 μL di ddH2O e 2.0 μL di campione o standard. Eseguire ogni campione e standard in triplice copia per una maggiore accuratezza e precisione. Eseguire ogni campione a tre o più livelli di diluizione (ad es., 12:01, 1 pm e 22 per le concentrazioni di partenza stimate) per garantire la quantificazione accurata.
Nota: Informazioni dettagliate sui primer fornito e le norme variano a seconda del kit di quantificazione utilizzato e sono disponibili nella scheda tecnica prodotti. Fare riferimento alla Tabella materiali per il kit di quantificazione utilizzato in questo studio. - Spostare la piastra qPCR o tubi a uno strumento PCR in tempo reale programmato per: una denaturazione iniziale di 95 ° C per 5 min; 35 cicli di 1) 95 ° C per 30 s e 2) 60 ° C per 45 s; e un passo di dissociazione di 1) 95 ° C per 15 s, 2) 60 ° C per 30 s e 3) 95 ° C per 15 s.
- Calcolare la media a partire di concentrazione per ciascun campione, utilizzando i valori di quantificazione ottenuti dai risultati qPCR e i livelli di diluizione del campione utilizzati.
Nota: per esempio, una concentrazione media di 14 per un campione diluito 1: 100 000 produce una concentrazione di partenza originale di 200 nM. Se nessuno dei livelli di diluizione per un dato campione cade all'interno della gamma delle curve standard, quantificazione risultati potrebbero non essere accurati; in questo caso, regolare i livelli di diluizione e ri-eseguire qPCR. - Diluire ogni campione purificato, con codice a barre a 4 nM nel buffer di TE, basato sulle concentrazioni media calcolato nel passaggio 7.5.
Nota: ad esempio, per una concentrazione di campione medio di 200 nM, diluire il campione 01:50 in TE buffer per raggiungere una concentrazione di 4 nM. La concentrazione del campione precisi variano in base del kit di sequenziamento sistema e reagente utilizzato. Consultare la Guida utente sistema di sequenziamento per la concentrazione consigliata. - Creare la libreria combinata aggiungendo volumi uguali (in genere 5-10 µ l) di tutte le singole librerie in un unico tubo.
Nota: come tutti i campioni dovrebbero essere ad una concentrazione di nM 4, aggiungendo volumi uguali raggiunge una concentrazione uguale di tutti i campioni nella libreria in pool. - Ripetere i passaggi da 6.2-6.4 sulla libreria combinata per confermare la concentrazione di nM 4.
- Calcolare la concentrazione di libreria combinata e diluire o ri-costituiscono la libreria finale, pool utilizzando tampone Tris come necessario per ottenere 4 nM.
- In caso contrario procedere immediatamente al caricamento del campione, conservare i campioni a-20 ° C. Eseguire il sequenziamento eseguito poco dopo la quantificazione per ridurre al minimo perdite o modifiche alla concentrazione di DNA durante la conservazione.
7. Biblioteca denaturazione e diluizione e il sequenziamento eseguire (eseguire nello stesso giorno)
- Denaturare la libreria combinata di 4 nM dal punto 6.9 con NaOH.
Nota: Questa procedura di preparazione finale biblioteca variano per ogni sistema di sequenziamento. Consultare la Guida utente sistema di sequenziamento per protocolli più dettagliati e aggiornati. Nuovi utenti saranno probabilmente bisogno di essere addestrati sull'utilizzo della piattaforma di sequenziamento o possono inviare loro librerie ad un impianto di sequenziamento di nucleo. - Diluire la libreria denaturata alla concentrazione di caricamento desiderato utilizzando il buffer fornito il kit di reagenti di sequenziamento (Tabella materiali).
Nota: Le concentrazioni di carico ottimale variano da sistema di sequenziamento e in genere vanno da 1-250 pM25. - Denaturare e diluire il controllo di sequenziamento.
Nota: L'aggiunta di un controllo di sequenziamento corregge problemi di sequenza derivanti dalle librerie di bassa diversità. Denaturare il controllo di sequenza usando NaOH e diluire alla stessa concentrazione della libreria. - Combinare la biblioteca e il controllo di sequenziamento.
Nota: Il rapporto del controllo di sequenziamento per libreria combinata dipenderà la biblioteca diversità e sequenziazione utilizzato, ma è in genere 1:126. - Caricare la libreria combinata e la sequenziazione controllo miscela nella cella di flusso di sequenziamento.
8. degli ampliconi analisi
- Valutare il successo globale dell'esecuzione esaminando le metriche di esecuzione sull'ambiente di cloud computing corrispondente al sistema di sequenziamento utilizzato.
Nota: Le metriche di esecuzione, ad esempio il numero di letture di sequenziamento, variano in base il sequenziamento kit piattaforma e reagente utilizzato. I valori di destinazione per i sistemi di ordinamento comuni sono elencati nella tabella 1. - Scaricare i dati di sequenziamento crudo e bioinformatica desiderato software open source, intuizioni quantitativa di ecologia microbica (QIIME)27 o Mothur28.
Nota: Entrambi QIIME e Mothur sono open source e gratuito da scaricare. Istruzioni dettagliate sull'utilizzo di questi programmi si possono trovare online e sono sufficientemente dettagliate per gli utenti inesperti. La procedura riportata di seguito fornita un'ampia panoramica di una pipeline di bioinformatica condotta in QIIME. Familiarità con python non è necessaria ma faciliterà l'attuazione dei seguenti script - Creare e convalidare il file di mapping utilizzando lo script "validate_mapping_file.py" nel QIIME.
Nota: Il file di mapping contiene tutti i metadati necessari per eseguire analisi di dati, tra cui ID campione, amplicone sequenze dell'iniettore e descrizione del campione. Il passaggio di convalida controlla che tutti i dati necessari sono stati immessi nel formato corretto. - Demultiplex e filtrare sequenze utilizzando lo script "split_libraries.py" (Figura 1).
Nota: Questo script assegna letture con codice a barre per i campioni in base alle combinazioni di primer indice e ID campione in ingresso nel file di mapping. Esegue anche diverse qualità passi al controllo per la sequenziazione di errore basato su cut-off definito dall'utente per il Punteggio di qualità minima, lunghezze di sequenza e fine-taglio di filtraggio. - Assegnare unità tassonomica operative (OTUs) a sequenze utilizzando lo script "pick_open_references_otus.py".
Nota: In questo passaggio, le sequenze sono raggruppate contro un insieme di sequenza di riferimento basato su una soglia di identità (in genere 97%). Letture che non corrispondono la collezione di sequenza di riferimento sono ragruppate uno contro l'altro. Sono inoltre disponibili de novo e chiuso-riferimento OTU opzioni di prelievo, ma Apri-riferimento picking è consigliato dagli sviluppatori di QIIME. - Normalizzare la tabella OTU utilizzando lo script "alpha_rarefaction.py" o "normalize_table.py".
Nota: Questo passaggio corregge per variazione in somme di colonna o sequenza totale legge per campione, che derivano da tecnologie di sequenziamento moderno. Normalizzazione può essere eseguita utilizzando tradizionali rarefazione, o attraverso metodi alternativi come lo scaling somma cumulativa. - Eseguire diversi alfa-diversità, beta-diversità e analisi di diversità di composizione tassonomica contemporaneamente utilizzando lo script "core_diversity_analysis.py".
Nota: In alternativa, queste analisi possono essere eseguite separatamente utilizzando i singoli script (per esempio, "alpha_diversity.py").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un totale di 42 tick dall'uovo separato tre frizioni e due periodi di esposizione ambientale, 0 e 2 settimane nel terreno, sono stati elaborati per il microbioma sequenziamento. Ciascun gruppo di trattamento, considerato una sola volta di frizione e l'esposizione, contenuta 6-8 tick campioni replicati. Questi estratti di graduazione trasformati sono stati caricati su un sequencer di prossima generazione e ha reso 12,885,713 fine accoppiato letture passando il filtro. Incluso in questa esecuzione erano 3 controlli negativi dalla fase di estrazione, producendo un totale di 211.214 letture (incluso nel conteggio precedente). Ulteriori metriche di qualità gestito insieme a valori ottimali per ogni metrica sono dettagliati nella tabella 2. Curve di rarefazione, che riguardano numero di OTUs per esempio, indicato che una profondità di sequenziamento, o un numero di sequenza unica legge per campione, di 2.129 letture sarebbe sufficiente per catturare adeguatamente la diversità delle comunità microbiche (sforzo di sequenziamento Figura 2). Livelli di rarefazione variano in basati al tipo di campione e devono essere determinati individualmente per ogni sequenza di esecuzione. Dopo rarefazione a questa profondità, 1.714 OTUs sono stati identificati attraverso tutti i campioni con una media di 93,3 ± 4.3 OTUs per campione. Per evitare analisi a valle problemi derivanti da matrici sparse e per rimuovere i contaminanti potenziali, OTUs tutti non trovato in almeno un campione ad abbondanza ≥ 1% sono stati riuniti in una rara categoria generale. Inoltre, il pacchetto di decontam in R è stato utilizzato per identificare OTUs sovrarappresentate in controlli negativi rispetto a campioni reali, e questi OTUs sono stati rimossi da analisi a valle.
Comunità ecologia analisi sono state eseguite utilizzando il flusso di lavoro di analisi QIIME diversità per illustrare i tipi di diversità alfa, beta diversità e output di diversità di composizione Tassonomia generato tramite una pipeline di bioinformatica semplice. Ad esempio, analisi Unifrac coordinate principali ponderate e non ponderate sono state prodotte utilizzando lo script "core_diversity_analyses.py", e hanno rivelato spatial clustering di larvale zecche basate sull'identità di frizione (Figura 3). BoxPlot di OTU conta variando l'esposizione ambientale a volte inoltre sono stati generati tramite questo script, che dimostra le differenze di ricchezza di specie microbiome nel tempo (Figura 4). Queste analisi di diversità di alfa e beta vengono eseguite in base alle categorie definite dall'utente elencati nel file di mapping, ma cifre e statistiche su generalità tassonomici vengono generate anche per tutti i campioni (Figura 5).
Figura 1 : Flusso di lavoro di Microbiome sequenziamento. Passaggi principali del flusso di lavoro microbiome sequenziamento vengono visualizzati con call-out per i passaggi di analisi libreria preparazione e sequenziamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Curve di rarefazione per sequenza contano normalizzazione. Curve di rarefazione, indicate per ogni gruppo di segni di graduazione, riguardano osservati OTU conteggi sforzo di campionamento. Barre di errore sono presenti a causa di campioni replicati presenti all'interno di ogni frizione e denotano una deviazione standard. Una profondità di sequenziamento deve essere selezionata o oltre il punto dove la curva diventa stabile per catturare adeguatamente la diversità completa di OTUs. Qui, una profondità di sequenziamento di 2.000 letture appare appropriata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Principal coordinare analisi di frizione. Non ponderata Unifrac analisi delle coordinate principali (PCoA) Mostra la variazione nella composizione del microbioma tra larvale zecche dalle grinfie diversi e da adulti. Ogni punto dati denota una zecca individuo. Questa cifra viene generata automaticamente tramite lo script "core_diversity_analyses.py" QIIME. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Alfa diversità BoxPlot dal tempo di esposizione. BoxPlot raffigurante OTU conta per esposizione ambientale gruppi Visualizza variazione diversità microbica nel corso del tempo. Questa cifra viene generata automaticamente tramite lo script "core_diversity_analyses.py" QIIME. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Identificazione microbica phylum-livello per frizione uno. Microbioma composizione per campioni singoli tick da frizione uno è indicata a livello di phylum. Questa figura, così come informazioni di riepilogo a più bassi livelli tassonomici, viene generato automaticamente tramite lo script "core_diversity_analyses.py" QIIME. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Metrica | Definizione | I nostri risultati (MiSeq V3) | Ottimale per MiSeq V3 | Ottimale per la modalità HiSeq Rapid | |
| Legge PF | Numero di sequenza legge passando il filtro di castità. Una lettura passa il filtro se non più di 1 chiamata base ha un valore di castità sotto 0.6 nei primi 25 cicli | 12,885,713 | 14 milioni | 600 milioni | |
| Tasso di errore | Percentuale di coppie di basi chiamato in modo non corretto durante un ciclo, basato su letture allineato al controllo PhiX | 3,28 ± 0,10 | * Dipende dai valori di altre metriche | * Dipende dai valori di altre metriche | |
| % ≥Q30 | Percentuale di basi con un Q Punteggio ≥ 30, che indica una precisione di base chiamata del 99,9% | 68,94 | > 70% | > 80% | |
| Cluster di PF (%) | Percentuale di cluster passando il filtro di castità. | ±0.81 85.61 | 90% | 90% | |
| Densità | Densità di cluster su flowcell - una metrica fondamentale per la qualità dei dati e output | 552 ± 35 cluster/mm ^ 2 | 1200-1400 cluster/mm ^ 2 | 850-1000 cluster/mm ^ 2 | |
Tabella 1: Chiave di parametri di prestazione per l'output NGS. I valori utente dati e destinazione segnalato basato sul kit di piattaforma e reagente di sequenziamento utilizzato in questo studio (Tabella materiali) e un'aggiunta di controllo sequenza di 25%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prossima generazione sequenziamento del 16S rRNA è diventato un approccio standard per identificazione microbica e attivato lo studio di come vettore microbiomi influenzano la trasmissione dell'agente patogeno. Il protocollo descritto qui dettagli l'uso di questo metodo per indagare l'Assemblea della comunità microbica in I. pacificus, una specie vettore per la malattia di Lyme; Tuttavia, può essere applicato facilmente per studiare altre specie del battito o specie artropodi vettori.
Infatti, del rRNA 16S per microbiome analisi è stato utilizzato ampiamente per studiare la microbiomi di vettori come zanzare, psille e mosche tse-tse29,30,31. Altri metodi disponibili per identificazione microbica all'interno di vettori comprendono la microscopia, coltura e macchiatura istologica. Questi metodi possono essere più appropriati di sequenziazione se l'obiettivo è quello di identificare e descrivere un romanzo microbo (microscopia), valutare l'effetto di farmaci antimicrobici (cultura) o localizzare i microbi specifici e noti all'interno del vettore (colorazione istologica). Tuttavia, questi metodi soffrono di bassa specificità, rilevamento e scalabilità e quindi sono meno appropriati per identificare la comunità piena di microbi all'interno di un vettore o che caratterizzano il microbioma vettoriale sotto diverse ecologico e sperimentale condizioni. Al contrario, high throughput sequenziamento del gene del rRNA 16S consente l'identificazione di batteri non coltivabili e di basso-abbondanza, fornisce rilevamento dato i database di riferimento completo e ad alta risoluzione e in grado di fornire alta replica a seconda sulle esigenze di copertura.
Mentre del rRNA 16S è ora ampiamente usato per identificazione microbica, questa tecnica non è senza limitazioni. Principalmente, la contaminazione microbica può oscurare l'interpretazione dei risultati di sequenziamento e confondere il significato biologico32. Inoltre, dato l'uso di universal primer batterica e sensibilità a basse concentrazioni che sono inerenti a rRNA 16S, contaminazione microbica è comune32. Fonti di contaminazione includono reagenti PCR, kit di estrazione del DNA, superfici di laboratorio e la pelle e abbigliamento di ricercatori33,34,35. Gli effetti di contaminanti microbici possono essere minimizzati lavorando in un ambiente sterile, utilizzando controlli negativi e replicati tecnici, e mantenere un record di tutti i kit e i reagenti usati36.
Oltre alla contaminazione microbica, uscita di sequenziamento di bassa qualità può notevolmente ostacolare l'utilizzabilità dei dati di sequenziamento microbioma. Qualità dei dati può essere valutata da un numero di metriche di esecuzione tra cui il numero di letture passando il filtro, la percentuale di letture sopra un Q-Punteggio (una misura della probabilità prevista di errore in base-chiamare) di 30 e densità di cluster. I valori per questi parametri variano in base al numero di campioni eseguiti, il sistema di sequenziamento, la cartuccia di reagente e la percentuale di sequenziamento di controllo utilizzato, ma valori ottimali in base alle condizioni di esecuzione sono disponibili online. In particolare, la densità di cluster, il numero di cluster di libreria su un determinato piano di cella di flusso prima del sequenziamento, è un parametro fondamentale per ottimizzare la resa e la qualità dei dati. Sia sopra che sotto di clustering può ridurre la produzione di dati e comportare campioni essendo esclusi dall'analisi a causa di insufficiente copertura. Densità di cluster poveri riflette spesso quantificazione biblioteca inesatti; così, si dovrebbe prestare attenzione per eseguire la corretta pulizia del DNA, quantificazione del singolo campione e quantificazione di tutta la libreria.
Supponendo che rendimento ed elevata qualità dei dati sono raggiunti, approcci divergenti nell'analisi di dati utilizzato per superare sfide statistiche del DataSet di grandi dimensioni rappresentano un'altra limitazione di questo approccio. Ad esempio, esistono metodi più alla variazione di indirizzo in lettura conta tra i campioni. Rarefazione, che coinvolge sub-campionamento letture per garantire una profondità di sequenziamento uguale tra tutti i campioni, è frequente, ma è stato oggetto di critica recentemente per lo spreco di grandi quantità di dati e la selezione soggettiva di profondità minima sequenziamento37 ,38,39. Somma cumulativa ridimensionamento (CSS), che mantiene tutte le sequenza legge ma pesa loro in base alla somma cumulativa di conti all'interno di un determinato percentile, è stato sviluppato come una tecnica alternativa. Tuttavia, CSS non è stato ampiamente adottato a causa della sua relativa novità e l'utilità confermata di rarefazione per normalizzazione prima dell'analisi di presenza/assenza.
Inoltre, mancano procedure di analisi di dati standard per la gestione sequenza letture in controlli negativi e distinguere questi da abbondanza bassa letture. Come accennato, sequenziamento controlli negativi generati dalla fase di estrazione del DNA è raccomandato per contribuire a differenziare i residenti del microbioma vettoriale da contaminanti microbici durante l'analisi. Ancora, un approccio standard e statisticamente rigoroso per identificazione e filtraggio sospetta contaminanti è carente. Un approccio comune è quello di rimuovere OTUs presente in controlli negativi da tutti i campioni. Tuttavia, questo metodo può essere eccessivamente conservatrice poiché molti di questi microbi probabilmente provengono da campioni reali piuttosto che kit reagenti40. Un'altra tecnica comune coinvolge raggruppamento microbi presenti presso < 1% in una categoria "rara" sotto l'ipotesi che i contaminanti microbici sono rari in campioni reali8,41. Tuttavia, questo metodo può rimuovere i microbi vettoriale che sono presenti alle abbondanze basse, particolarmente quando il microbioma è dominato da un endosimbionte come visto in pacificus I. e I. holocyclus7,42. In questi casi, rilevando i microbi rari richiederebbe sequenziamento più profondo, lo sviluppo di primer che inibiscono l'amplificazione dell'endosimbionte durante l'amplicone PCR42, o rimozione informaticamente l'endosimbionte durante l'analisi di sequenza 7. scegliendo tra i vari metodi all'indirizzo raro e contaminante OTUs crea l'opportunità per la soggettività e la polarizzazione in microbiome l'analisi dei dati, che possono limitare la possibilità di confrontare i risultati tra gli studi.
La scelta del database di riferimento, necessari per l'assegnazione di tassonomia e filogenetiche informazioni di sequenza letture, presenta un'altra opportunità per divergenza e soggettività. Mentre il compito di relazionarsi con letture di sequenza da una regione del gene variabile un genoma di padre identificato è intrinsecamente difficile, un database di riferimento affidabile è fondamentale per accurata assegnazione filogenetica. Più database sono emerse per affrontare questa sfida, come SILVA43, Greengenes44, RDP45e46di NCBI. SILVA è la più grande delle tassonomie 16S-basato, ma SILVA, come pure RDP, fornisce solo informazioni tassonomiche fino al livello di genere. Greengenes fornisce informazioni a livello di specie ed è inclusa nei pacchetti di analisi metagenomica come QIIME, ma non è stato aggiornato in oltre quattro anni. NCBI, mentre non è una fonte primaria per informazioni tassonomiche, fornisce classificazioni giornaliere aggiornate da sequenze inviati dall'utente, ma è guidato. Mentre la selezione tra i database in genere dipende dalle esigenze degli utenti per quanto riguarda la risoluzione, copertura e valuta, ha un impatto significativo sulla filogenetica assegnazione e dell'analisi a valle47,48. Consenso tra gli investigatori per quanto riguarda il database di riferimento da utilizzare è dunque imperativo per evitare ulteriori pregiudizi nelle analisi.
Approcci standard per queste sfide di elaborazione dei dati probabilmente emergerà come del rRNA 16S diventa una tecnica sempre più comune. Continuare riduzioni di tempi e costi di sequenziamento saranno ulteriormente diffondere questo metodo. L'aumento dell'utilizzo di questa tecnologia permetterà più profonde indagini la composizione e l'ecologia di vettore microbiomi in condizioni diverse. Come la conoscenza della biologia microbiome vettoriale è ancora nella sua infanzia, questi tipi di studi descrittivi sono un primo passo fondamentale precedenti tentativi di sfruttare il microbioma come mezzo di controllo di vettore. Tuttavia, per capire veramente il ruolo del microbioma nella trasmissione di agenti patogeni, identificazione microbica deve essere accoppiato con la conoscenza del ruolo funzionale di questi microbi. Sequenziamento di RNA e approcci di trascrittomica, che coinvolgono la mappatura e la quantificazione di espressione genica, abilitare inferenze sul ruolo funzionale dei microbi ma richiedono sequenziamento profondo e completamente assemblato genomi di specie bersaglio. Eludere queste sfide, strumenti computazionali per predire la composizione funzionale da rRNA 16S dati di sequenziamento sono stati recentemente sviluppati ma non sono ampiamente adottati ancora49. Lo sviluppo di tali strumenti, come pure la teoria ecologica, collegamento microbica identità e il ruolo funzionale all'interno di vettori aumenterà l'utilità dei dati di sequenziamento di rRNA 16S negli studi microbiome vettoriale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation concede a A.S. (DEB n. 1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
- Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
