Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Tickande mikrobiomet karakterisering av nästa generations 16S rRNA amplikon sekvensering

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/58239

Summary

Här presenterar vi ett nästa generations sekvensering protokoll för 16S rRNA sekvensering som möjliggör identifiering och karakterisering av mikrobiella samhällen inom vektorer. Denna metod innebär DNA extraktion, amplifiering och streckkodning av prover genom PCR, sekvensering på en flöde cell och bioinformatik att matcha sekvensdata till fylogenetiska information.

Abstract

Under de senaste decennierna har vektorburna sjukdomar återuppstått och expanderade i alarmerande priser, orsakar betydande sjuklighet och dödlighet i hela världen. Effektiv och allmänt tillgängliga vacciner saknas för en majoritet av dessa sjukdomar, vilket nödvändiggör utvecklingen av romanen sjukdom begränsningsstrategier. I detta syfte innebär en lovande aveny för sjukdomsbekämpning inriktning den vektor microbiom, gemenskapen av mikrober som lever i vektorn. Den vektor mikrobiomet spelar en nyckelroll i patogen dynamics och manipulationer av mikrobiomet har lett till minskad vektor överflöd eller patogen överföring för en handfull vektorburna sjukdomar. Att översätta dessa fynd till sjukdom kontroll program kräver dock en grundlig förståelse av vektor mikrobiell ekologi, historiskt begränsat av otillräcklig teknik på detta område. Tillkomsten av nästa generations sekvensering metoder har möjliggjort snabb, mycket parallella sekvensering av olika mikrobiella samhällen. Inriktning starkt konservativa 16S rRNA genen har underlättat karakteriseringar av mikrober inom vektorer under varierande ekologiska och experimentella villkor. Denna teknik innebär förstärkning av 16S rRNA-genen, prov streckkodning via PCR, lastning prover på en flöde cell för sekvensering, och bioinformatik närmar sig för att matcha sekvens med fylogenetiska information. Art eller släkte-nivå identifiering för ett stort antal replikat kan vanligtvis uppnås genom detta tillvägagångssätt, således kringgå utmaningar låg upptäckten, upplösning och utdata från traditionell odling, mikroskopi eller histologiska färgning tekniker. Därför, denna metod lämpar sig väl för kännetecknar vektor mikrober under olika villkor men för närvarande inte kan ge information om mikrobiell funktion, läge inom vektor eller svar på behandling med antibiotika. Övergripande, 16S nästa generations sekvensering är en kraftfull teknik för att bättre förstå identitet och roll som vektor mikrober i sjukdom dynamics.

Introduction

Till återkomsten och spridning av vektorburna sjukdomar under de senaste decennierna utgör ett allvarligt hot för globala mänskliga och djurliv hälsa. Effektiva vacciner saknas för en majoritet av dessa sjukdomar, och arbetet med kontrollen hindras av komplexa biologiska karaktär vektorer och vektor-värd-interaktioner. Förstå rollen som mikrobiella interaktioner inom en vektor i patogener överföring kan tillåta för utvecklingen av nya strategier som kringgå dessa utmaningar. I synnerhet ha interaktioner mellan vektor-associerade mikrobiell förknippas, symbionter och patogener, kallad microbiom, betydande konsekvenser för patogener överföring. Överväldigande bevis nu stöder detta påstående, med exempel som visar ett samband mellan den vektor mikrobiomet och kompetens för sjukdomar såsom malaria, zikavirus och Borrelia1,2,3. Att översätta dessa fynd i strategier för förebyggande och kontroll kräver dock en långt mer detaljerad förståelse av struktur, funktion och beskärningen av vektor microbiomes. Identifiering och karakterisering av vektor mikrobiell gemenskapen enligt olika ekologiska och experimentella villkor utgör en viktig väg framåt i fältet.

Ett förfarande för att identifiera mikrobiell invånarna av en patogen vektor finns här genom att utnyttja västra Tretåig fästingen, Ixodes pacificus, en vector art av patogenen som Borrelia Borrelia burgdorferi. Medan fästingar hamnområde fler typer av mänskliga patogener än alla andra leddjur, är relativt lite känt om biologi och gemenskapens ekologi tick microbiomes4. Det är uppenbart att fästingar hyser en mångfald av virus, bakterier, svampar och protozoer som inkluderar förknippas, endosymbionts och övergående mikrobiell invånare5,4. Tidigare arbete har visat starka variationer i Ixodes microbiomes associerade med geografi, arter, sex, liv scenen och blodmjöl källa6,7,8. Men mekanismerna bakom denna variation är fortfarande okända och garanterar mer detaljerade undersökningar av ursprung och montering av dessa mikrobiella samhällen. Fästingar kan förvärva mikrober genom vertikal överföring, kontakt med värdar och upptag från miljön genom den externa, mun och anal pore9. Förstå de faktorer som formar inledande bildandet och utvecklingen av den tickande mikrobiomet, är specifikt relativa bidrag av vertikala miljö, viktigt för att förstå naturliga mönster och variationer i tick mikrobiomet mångfald och hur dessa samhällen interagerar under patogener överföring, med möjliga tillämpningar till sjukdom eller vector kontroll.

Kraftfulla molekylära tekniker, till exempel nästa generations sekvensering, nu finns för att identifiera mikrobiella samhällen och kan användas för att karaktärisera vektor microbiomes skiftande miljö eller experimentella villkor. Före tillkomsten av dessa hög genomströmning sekvensering strategier åberopade identifiering av mikrober främst mikroskopi och kultur. Medan mikroskopi är en snabb och enkel teknik, är morfologiska metoder för att identifiera mikrober till sin natur subjektiv och grova och begränsad av låg känslighet och upptäckt10. Kultur-baserade metoder används i huvudsak för mikrobiell identifikation och kan användas för att fastställa känslighet av mikrober för läkemedel behandlingar11. Men lider denna metod också låg känslighet, som det har uppskattats att färre än 2% av miljömässiga mikrober kan vara odlade i ett laboratorium ställa12. Histologiska färgning metoder har också använts för att identifiera och lokalisera specifika mikrober inom vektorer, aktivera utredningar av olika taxa distributioner inom fästingen och studera hypoteser om mikrobiella interaktioner. Förkunskaper i mikrobiell identitet krävs dock för att välja lämpliga fläckar, att göra detta tillvägagångssätt illa lämpade för mikrobiell karakterisering och identifiering. Dessutom histologiska färgning är en mycket tidskrävande och mödosam process och skalar inte bra för stora urvalsstorlekar. Traditionella molekylära metoder såsom Sanger sekvensering begränsas på samma sätt i sin känslighet och detektion av olika mikrobiella samhällen.

Nästa generations sekvensering möjliggör snabb identifiering av mikrober från ett stort antal prover. Förekomsten av standard markörgener och referens databaser ytterligare möjliggör förbättrad taxonomisk upplösning, ofta till släkte eller art. Liten subunit ribosomalt RNA används ofta för att uppnå detta mål, med 16S rRNA är den vanligaste på grund av bevarade och variabla regioner inom genen, vilket möjliggör skapandet av universella primers med unika amplikoner för varje bakteriella arter13,14. Denna rapport beskriver en procedur för att identifiera taxa i den tickande mikrobiomet genom 16S rRNA nästa generations sekvensering. Detta protokoll betonar i synnerhet de olika stegen i att förbereda prover för sekvensering. Mer generell information om sekvensering och bioinformatik steg finns, eftersom det finns en mängd sekvensering plattformar och analysprogram tillgängliga, var och en med omfattande befintlig dokumentation. Övergripande genomförbarheten av denna nästa generations sekvensering metod demonstreras genom att tillämpa det på en utredning av mikrobiell gemenskapens församling inom en viktig sjukdom vektor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kryssa för insamling och ytan sterilisering

  1. Samla fästingar genom att dra en 1 m2 vit trasa över en fästing-associerade livsmiljö, att ta bort fästingar bifogas värdart eller uppfödning fästingar i lab15,16. Använd fina pincett att manipulera fästingar och lagra dem vid-80 ° C.
  2. Placera fästingar i de enskilda PCR-rör och ta bort surface föroreningar genom vortexa för 15 s successivt med 500 μL av väteperoxid (H2O2), 70% etanol och ddH2O.
  3. Placera fästingar i en ny PCR-röret och låt dem lufttorka.
  4. I detta rör, mekaniskt störa tick vävnader genom att krossa fästingar med en mortel och stöt (används i denna studie), med små pärlor i en pärla drevkarl, eller skär fästingen isär med en skalpell.

2. DNA-rening

  1. Rena DNA från enskilda fästingar, följa instruktionerna som anges i ett kommersiellt tillgängliga DNA extraktion kit. Eluera för en slutlig volym av 100 μL.
    Obs: Se figur 1 för en översikt över steg 2.2-2.8. Alternativa extraktionsmetoder inkluderar fenol-kloroform utvinning17,18, etanol nederbörd19eller extraktion med en kelaterande materiella20,21.
  2. Bekräfta lyckad DNA-rening med fluorometer eller spektrofotometer. För fluorometry, använda 10 μL av DNA mall i en 190 μl dubbelsträngat DNA-analys. Den förväntade avkastningen är 0,1-1,0 ng/μl22. För spektrofotometri, använda 1 μL av DNA mall i en nukleinsyra kvantifiering. Den beräknade A260/280-förhållandet är cirka 1,823.
  3. Om inte förfarandet omedelbart till förstärkning, lagra proverna vid-20 ° C.

3. 16S rRNA genen förstärkning

  1. Ställa in ospädd PCR i en 27,5 μL reaktion som innehåller: 5 μL av varje grundfärg på 1 μM. 12.5 μl av kommersiellt tillgängliga PCR-mix; och 5 μL av DNA extraheras från enskilda fästingar vid en koncentration av 5 ng/μl.
    Obs: Använd följande grundfärger för förstärkning av regionen hypervariabel V3-V4 av 16S rRNA-genen13:
    5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3',
    5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3'
  2. Flytta rören till en termocykler programmerad för: en inledande denaturering vid 95 ° C i 3 min. 25 cykler av 1) 95 ° C under 30 s, 2) 57 ° C i 30 s, 3) 72 ° C under 30 s; en sista förlängning vid 72 ° C för 5 min; och en sista håll vid 10 ° C.
  3. När PCR är gjort lastning 4-6 μL/prov på en 1,5% agarosgel visualisera PCR-produkten. Leta efter ett band på 460 bp att bekräfta förstärkning.
    Obs: Amplicon PCR produkten kanske inte syns på gel om koncentrationen i provet för låg (< 10 ng). Primer dimer närvaro är vanligt i låg koncentration prover. Om det finns andra icke-målorganismer band justera glödgning temperaturen eller minska antalet cykler.
  4. Om inte fortsätter omedelbart till rening, lagra proverna vid 4 ° C.

4. 16S amplikon rening

  1. Med en ny PCR-tub för varje prov, kombinera PCR-produkten med ddH2O att få 60 μl totalt. För prover med låga DNA koncentrationer, utföra Restriktionsenzymanalys PCR i tre exemplar att minska förstärkning bias och pool proverna att koncentrera.
  2. Ta paramagnetiska pärlor till rumstemperatur och vortex dem väl före användning.
  3. Tillsätt 48 μl av paramagnetiska pärlor till 60 μl av provet och inkubera i 5 min. plats rören på en magnetisk rack för 5 min tills lösningen blir klar. Ta bort supernatanten.
    Obs: Denna pärla koncentration mål avlägsnande av primer dimerer (< 60 bp). Om det behövs, justera pärla koncentration för att ta bort andra icke-specifika banding.
  4. Med rör på magnetiska rack, tillsätt 500 μL av nylagade 80% EtOH. Omedelbart efter att lägga EtOH alla rör, pipett ut vätskan. Ta inte bort pärlorna. Upprepa för EtOH tillägg och borttagning ännu en gång.
  5. Lufttorka proverna för att ta bort överflödig EtOH genom att lämna rören öppna på magnetiska racket i 5 min, eller tills små sprickor syns i pärlorna.
  6. Tillsätt 20 μL av TE buffert och inkubera proverna av magneten, vid rumstemperatur, för 5-10 min.
  7. Placera rören tillbaka på magneten. När de pärlor och vätska separeras, överför supernatanten till en färsk tube att erhålla rengjorda PCR-produkten.
  8. (Valfritt) Visualisera produkten för att bekräfta lyckad amplikon rening genom laddar 4-6 μL/prov på en 1,5% gel. 460 bp bandet ska vara synlig, och det bör ingen primer dimer.
  9. Om inte går omedelbart till index PCR, lagra proverna 4 ° C.

5. prova streckkodning och rening

  1. Tilldela varje prov unik primer kombinationer genom att välja antingen framåt eller bakåt primers, eller båda, från ett kommersiellt tillgängliga bibliotek index kit.
    Obs: Unikt märkning prover möjliggör differentiering efter sekvensering. Kits ger normalt tillräckligt primers för att sekvensera 96-384 prover.
  2. Bifoga den dubbla primers, eller index, till exempel av utför PCR i en 25 μL reaktion som innehåller 2,5 μl av varje primer (N7xx och S5xx), 12,5 μl av kommersiellt tillgängliga PCR master mix, 5 μL av ddH2O och 2,5 μl av rengjorda amplikon produkt.
  3. Flytta rören till en termocykler programmerad för: en inledande denaturering vid 95 ° C i 3 min. 8-14 cykler av 1) 95 ° C under 30 s, 2) 55 ° C för 30 s, 3) 72 ° C under 30 s; en sista förlängning vid 72 ° C för 5 min; och en sista håll vid 10 ° C.
  4. När PCR är gjort lastning 4-6 μL/prov på en 1,5% agarosgel visualisera PCR-produkten. Leta efter ett band på 550 bp att bekräfta förstärkning.
    Obs: Använd visualisering resultaten för att informera index PCR cykling villkor. Sänka antalet cykler att minska icke-specifik bindning eller öka antalet cykler för att få synliga band för varje prov.
  5. Upprepa förfarandet sanering som anges i steg 4. För att undvika utspädning under saneringen, utföra index PCR i två exemplar och poolen produkten här.
  6. Om inte fortsätter omedelbart till biblioteket kvantifiering och normalisering, lagra proverna vid 4 ° C.

6. bibliotek kvantifiering och normalisering

  1. Beräkna koncentrationen av varje renat, barcoded produkt från steg 5,5 med fluorometer eller spektrofotometer (se steg 2.2). Späd ut proverna i TE buffert att få koncentrationer av ungefärligt 1 pM.
    Obs: Biblioteket kvantifiering är nödvändigt för att uppnå provet lastning koncentration som rekommenderas för sekvensering plattformen. Bibliotek kvantifiering uppnås genom qPCR, men uppskattningen prov koncentrationen före qPCR sparar tid och reagenser. 1 pM koncentrationen rekommenderas att maximera noggrannheten i biblioteket kvantifiering, eftersom detta är den genomsnittliga koncentrationen av de qPCR normer som anges i den kvantifiering kit24.
  2. Utföra qPCR i en 10 μL reaktion innehållande 6,0 μL av qPCR master mix (från biblioteket kvantifiering kit) och 2.0 μL av ddH2O 2.0 μL prov eller standard. Kör varje prov och standard i tre exemplar för större noggrannhet och precision. Kör varje prov på tre eller fler utspädning nivåer (t.ex., 0.1 pm 1 pm och 10 pm för beräknad start koncentrationer) att säkerställa exakt kvantifiering.
    Obs: Detaljerad information om de medföljande primers och standarder varierar beroende på kvantifiering kit används och finns i det tekniska databladet för produkter. Se Tabell för material för kvantifiering kit används i denna studie.
  3. Flytta qPCR plåt eller rör till en realtids PCR-instrumentet programmerad för: en inledande denaturering av 95 ° C i 5 min; 35 cykler av 1) 95 ° C för 30 s och 2) 60 ° C för 45 s; och en dissociation steg 1) 95 ° c i 15 s, 2) 60 ° C under 30 s, och 3) 95 ° C under 15 s.
  4. Beräkna den genomsnittliga koncentrationen för varje prov, använder de kvantifiering värden som erhålls från qPCR resultaten och de prov spädningssteg används.
    Obs: till exempel en genomsnittlig koncentration på 2 pM för ett prov spätt 1:100,000 ger en ursprungliga start koncentration på 200 nM. Om ingen utspädning nivåer för ett givet prov faller inom spänna av standard kurvorna, kan kvantifiering resultat inte vara korrekt; i vilket fall, justera utspädning nivåer och åter utföra qPCR.
  5. Späd varje renat, barcoded prov till 4 nM i TE buffert, baserat på de genomsnittliga koncentrationerna som beräknades i steg 7,5.
    Obs: till exempel för ett genomsnittsprov koncentration av 200 nM, späd provet 1:50 i TE buffert för att uppnå en 4 nM-koncentration. Den exakta prov koncentrationen varierar beroende på sekvensering system och reagens kit används. Se användarhandboken sekvensering system för den rekommendera koncentrationen.
  6. Skapa det kombinerade biblioteket genom att lägga till lika stora volymer (vanligtvis 5-10 μL) av alla enskilda bibliotek till ett enda rör.
    Obs: som alla prover ska vara på en 4 nM koncentration, att lägga till lika stora volymer uppnår en lika koncentration av alla prover i sammanslagna biblioteket.
  7. Upprepa steg 6,2-6,4 på kombinerade biblioteket att bekräfta 4 nM koncentrationen.
  8. Beräkna koncentrationen kombinerade bibliotek och späd eller åter utgör den slutliga, poolade bibliotek med Tris buffert som behövs för att uppnå 4 nM.
  9. Om inte fortsätter omedelbart till exempel lastning, lagra proverna vid-20 ° C. Utföra den sekvensering strax efter kvantifiering att minimera förlust eller ändringar till DNA-koncentration under lagring.

7. bibliotek denaturering och utspädning och sekvensering kör (utföra samma dag)

  1. Denature 4 nM kombinerade biblioteket från steg 6,9 med NaOH.
    Obs: Dessa slutliga bibliotek förberedelsesteg variera för varje sekvensering system. Se användarhandboken sekvensering system för mer detaljerad och uppdaterad protokoll. Nya användare kommer sannolikt att behöva utbildas på användningen av sekvensering plattformen eller kan skicka sina bibliotek till en core sekvensering facility.
  2. Späd denaturerat biblioteket i önskad lastning koncentrationen använda bufferten i sekvensering reagens kit (Tabell för material).
    Obs: Optimal lastning koncentrationer variera av sekvensering system och vanligtvis sträcker sig från 1-250 pM25.
  3. Denaturering och späd kontrollen sekvensering.
    Obs: Lägga till en sekvensering kontroll korrigerar för sekvensering problem som härrör från låga mångfald bibliotek. Denaturera sekvensering kontroll med hjälp av NaOH och späd till samma koncentration som biblioteket.
  4. Kombinera de bibliotek och sekvensering kontroll.
    Obs: Förhållandet mellan sekvensering kontroll till kombinerade bibliotek kommer att bero på biblioteket mångfalden och sekvensering system används, men det är vanligtvis 1:126.
  5. Ladda kombinerade bibliotek och sekvensering kontroll blandningen på cellen sekvensering flöde.

8. amplikon Sequence Analysis

  1. Bedöma den totala framgången för körningen genom att undersöka kör mätvärden på cloud computing miljön motsvarande sekvensering systemet används.
    Obs: Kör mätvärden, såsom antal sekvensering läsningar, varierar beroende på sekvensering plattform och reagens kit används. Målvärden för vanliga sekvensering system listas i tabell 1.
  2. Ladda ned raw sekvensering data och önskad bioinformatik öppen källkod, kvantitativa insikter i mikrobiell ekologi (QIIME)27 eller Mothur28.
    Obs: Både QIIME och Mothur är öppen källkod och gratis att ladda ner. Detaljerade instruktioner om hur du använder dessa program kan hittas på nätet och är tillräckligt detaljerade för förstagångsanvändare. Stegen nedan ger en bred översikt över en bioinformatik pipeline utfördes i QIIME. Förtrogenhet med python är inte nödvändigt men underlättar genomförandet av följande skript
  3. Skapa och validera mappningsfilen använder skriptet ”validate_mapping_file.py” i QIIME.
    Obs: Mappningsfilen innehåller alla metadata som krävs för att utföra dataanalys, inklusive prov-ID, amplikon primer sekvenser och prov beskrivning. Valideringsstegen kontrollerar att alla nödvändiga uppgifter har förts in i rätt format.
  4. Multiplex och filtrera sekvenser med hjälp av skriptet ”split_libraries.py” (figur 1).
    Obs: Detta skript tilldelar barcoded läser prover baserat på de index primer och prov IDs ingång i mappningsfilen. Den presterar också flera kvalitet filtrering steg till kontrollen för sekvensering fel baserat på användardefinierade cut-off för minsta kvalitetsresultat, sekvens längder och slutet-trimning.
  5. Tilldela operativa taxonomiska enheter (OTUs) sekvenser med hjälp av skriptet ”pick_open_references_otus.py”.
    Obs: I det här steget är sekvenser klustrade mot en referens sekvens samling baserat på en tröskel av identitet (typiskt 97%). Läsningar som inte matchar samlingen referens sekvens är klustrade mot varandra. De novo och stängt-reference OTU plockning alternativ finns också, men öppen-referens plockning rekommenderas av QIIME utvecklare.
  6. Normalisera OTU tabellen med skriptet ”alpha_rarefaction.py” eller ”normalize_table.py”.
    Obs: Detta steg korrigerar för variation i kolumnen belopp eller totala sekvensen läser per prov, som resulterar från moderna sekvensering teknik. Normalisering kan utföras med traditionella förtunning, eller genom alternativa metoder såsom kumulativa summan skalning.
  7. Utföra flera alpha-mångfald, beta-mångfald och artsammansättning mångfalden analyser på en gång med hjälp av skriptet ”core_diversity_analysis.py”.
    Obs: Alternativt dessa analyser kan köras separat med de enskilda skripten (t.ex. ”,alpha_diversity.py”).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sammanlagt 42 fästingar från tre separata ägg kopplingar och två miljöexponering perioder, 0 och 2 veckor i jorden, behandlades för mikrobiomet sekvensering. Varje behandlingsgrupp, anses vara en enda koppling och exponering tid, innehöll 6-8 replikera tick prover. Dessa bearbetade tick utdrag lastades på en nästa generations sequencer och gett 12,885,713 Parade-end läsningar passerar filtret. Ingår i denna springa var 3 negativa kontroller från utvinning steg, vilket ger totalt 211,214 läsningar (ingår i tidigare antal). Kör kvalitet mätvärden tillsammans med optimala värden för varje mätvärde är närmare i tabell 2. Förtunning kurvor, som avser antalet OTUs per prov, anges att en sekvensering djup, eller antalet unika sekvensen läser per prov, 2 129 läsningar skulle räcka att på lämpligt sätt fånga mångfalden av mikrobiell gemenskapen (sekvensering ansträngning (Se figur 2). Förtunning nivåer kommer att variera utifrån Provtyp och måste bestämmas individuellt för varje sekvensering som kör. Efter rarefying till detta djup, identifierades 1 714 OTUs över alla prover med ett genomsnitt på 93,3 ± 4,3 OTUs per prov. För att undvika efterföljande analys var frågor som uppstår från glesa matriser och att avlägsna potentiella föroreningar, alla OTUs hittades inte i minst ett prov på ≥ 1% överflöd poolade i en sällsynt allmänna kategori. Vidare decontam paketet i R utnyttjades för att identifiera OTUs överrepresenterade i negativa kontroller i förhållande till riktiga prover, och dessa OTUs togs bort från efterföljande analys.

Gemenskapens ekologi analyser utfördes med QIIME mångfald analyser arbetsflödet för att demonstrera typerna av alfa mångfald, beta mångfald och taxonomi sammansättning mångfald utdata som genereras med hjälp av en enkel bioinformatik pipeline. Till exempel vägda och ovägda Unifrac huvudsakliga koordinater analyser producerades med hjälp av skriptet ”core_diversity_analyses.py”, och de avslöjade spatial klustring av larval fästingar baserat på koppling identitet (figur 3). Boxplots av OTU räknar på varierande miljöexponering gånger genererades också genom detta skript, Visar skillnader i mikrobiomet artrikedom över tiden (figur 4). Dessa alfa och beta mångfalden analyser utförs utifrån de användardefinierade kategorier som anges i mappningsfilen, men siffror och statistik på allmän taxonomisk information genereras också för alla prover (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Mikrobiomet sekvensering arbetsflödet. Stora steg av mikrobiomet sekvensering arbetsflödet visas med länktexter för bibliotek förberedelse och sekvensering analys steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Förtunning kurvor för sekvens räkna normalisering. Förtunning kurvor, visas för varje kohort av fästingar, avser observerade OTU räknas provtagning ansträngning. Felstaplar är närvarande på grund av identiska prover inom varje koppling och de beteckna en standardavvikelse. Sekvensering djup bör väljas vid eller efter den punkt där kurvan blir stabil tillräckligt fånga hela mångfalden av OTUs. Här, verkar ett sekvensering djup av 2 000 läser lämplig. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Principal samordna analys av koppling. Ovägda Unifrac huvudsakliga samordna analys (PCoA) visar variationen i mikrobiomet sammansättning mellan larval fästingar från olika kopplingar och från vuxna. Varje datapunkt betecknar en enskilda fästing. Denna siffra genereras automatiskt igenom skriptet QIIME ”core_diversity_analyses.py”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Alpha mångfald boxplots av exponeringstid. Boxplots föreställande OTU räknar för miljöexponering grupper Visa variation i mikrobiell mångfald över tid. Denna siffra genereras automatiskt igenom skriptet QIIME ”core_diversity_analyses.py”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Stam-nivå mikrobiell identifiering för koppling en. Mikrobiomet sammansättning för enskilda tick prover från kopplingen en visas på nivån stam. Denna figur, liksom sammanfattande information på lägre taxonomiska nivåer, genereras automatiskt genom skriptet QIIME ”core_diversity_analyses.py”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Metriska Definition Våra resultat (MiSeq V3) Optimalt för MiSeq V3 Optimalt för HiSeq Rapid Mode
Läser PF Antal sekvensering läser passerar filtret kyskhet. En läsa passerar filtret om högst 1 bas samtal har kyskhet värde understiger 0,6 i de första 25 cyklerna 12,885,713 14-16 miljoner 600 miljoner
Felprocent Procentandel av baspar kallas felaktigt under en cykel, baserat på läsningar anpassas till PhiX kontroll 3.28 ±0.10 * Beror på värden för andra mätvärden * Beror på värden för andra mätvärden
% ≥Q30 Andelen grunder med en Q poäng ≥ 30, som visar en bas samtal noggrannhet på 99,9% 68.94 > 70% > 80%
Klustret PF (%) Andelen frögyttringar som passerar filtret kyskhet. 85.61 ±0.81 90% 90%
Densitet Tätheten av kluster på flowcell - ett viktiga mått för datakvalitet och utgång 552 ± 35 kluster/mm ^ 2 1200-1400 kluster/mm ^ 2 850-1000 kluster/mm ^ 2

Tabell 1: Nyckel prestandaparametrar för NGS utdata. Användaren data och mål värden rapporterade baserat på sekvensering plattform och reagens kit används i denna studie (Tabell av material) och en 25% sekvensering kontroll tillägg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nästa generations sekvensering av 16S rRNA har blivit en standardmetod för mikrobiell identifiering och aktiverat studiet av hur vektor microbiomes påverkar patogener överföring. Protokollet beskrivs här Detaljer användningen av denna metod att undersöka mikrobiell gemenskapen församlingen i I. pacificus, en vector art för borrelia; Det kan dock enkelt appliceras för att studera andra fästing arter eller arter av leddjur vektor.

Faktiskt, 16S rRNA sekvensering för mikrobiomet analys har använts i stora drag att studera microbiomes av vektorer som myggor, psyllids och tsetseflugor29,30,31. Andra metoder som är tillgängliga för mikrobiell identifiering inom vektorer inkluderar mikroskopi, odling och histologiska färgning. Dessa metoder kan vara mer lämpligt än sekvensering om målet är att identifiera och beskriva en roman mikrob (mikroskopi), utvärdera effekten av antimikrobiella läkemedel (kultur) eller lokalisera specifika och kända mikrober inom vektorn (histologiska färgning). Dock dessa metoder lider av låg specificitet, detektion och skalbarhet, och därmed är mindre lämpliga för att identifiera hela gemenskapen av mikrober inom en vektor eller karakterisera den vektor mikrobiomet under varierande ekologiska och experimentell villkor. Däremot hög genomströmning sekvensering av 16S rRNA genen möjliggör identifiering av låg-överflöd och icke-odlingsbara bakterier, ger hög upplösning och detektering med tanke på de omfattande referensdatabaser och kan ge hög replikering beroende på täckning behov.

Medan 16S rRNA sekvensering är nu allmänt används för mikrobiell identifiering, är denna teknik inte utan begränsningar. Huvudsakligen, kan mikrobiell kontamination skymma tolkning av sekvensering resultaten och blanda ihop biologiska menande32. Dessutom ges universella bakteriell primers och känslighet till låga koncentrationer som är förbundna med 16S rRNA sekvensering, mikrobiell kontamination är gemensamma32. Källor till förorening inkluderar PCR reagens, DNA extraktion kit, laboratorium ytor, och hud och kläder av forskare33,34,35. Effekterna av mikrobiella föroreningar kan minimeras genom att arbeta i en steril laboratoriemiljö, med negativa kontroller och tekniska replikat, och föra register över alla kit och reagenser används36.

Utöver mikrobiell kontamination, kan låg kvalitet sekvensering utdata kraftigt hindra användbarheten av mikrobiomet sekvensering data. Datakvaliteten kan bedömas av ett antal kör mätvärden inklusive antalet läsningar som passerar filtret, andelen läser ovan en Q-Poäng (ett mått på den förutspådda sannolikheten för fel i base-ringer) 30 och kluster densitet. Värden för dessa mätvärden varierar beroende på antalet prov köra, sekvensering systemet, reagens patronen och procent sekvensering kontroll som används, men optimala värden baserat på springa villkor är tillgängliga online. I synnerhet är kluster densitet, antalet bibliotek kluster på ett visst plan av cellen flöde före sekvensering, en viktig parameter för att optimera datakvalitet och avkastning. Både över och under-kluster kan minska datautgång och resultera i prover som uteslutits från analysen på grund av otillräcklig täckning. Dåliga kluster densitet speglar ofta felaktig bibliotek kvantifiering; Således bör vara försiktig att utföra korrekt DNA sanering, enskilda prov kvantifiering och hela biblioteket kvantifiering.

Förutsatt att hög datakvalitet och avkastning uppnås, utgör olika förhållningssätt i analys av data som används för att övervinna statistiska utmaningar av stora datamängder en annan begränsning med denna metod. Exempelvis finns flera metoder att adress variation i Läs räknas mellan prover. Förtunning, som innebär sub provtagning läsningar att uppnå en lika sekvensering djup över alla prover, används ofta men har varit föremål för kritik nyligen för att slösa bort stora mängder data och subjektiva val av lägsta sekvensering djup37 ,38,39. Kumulativa summan skalning (CSS), som håller alla sekvensen läser men väger dem baserat på den kumulativa summan av räknas inom en viss percentil, har utvecklats som ett alternativ teknik. CSS har dock inte varit allmänt antagit på grund av dess relativa nyhet och bekräftade nyttan av förtunning för normalisering före närvaro/frånvaro analyser.

Standard data analys procedurer saknas också för hantering av sekvensen läser i negativa kontroller och särskilja dessa från låga överflöd läsningar. Som nämnts, rekommenderas sekvensering negativa kontroller genereras från DNA extraktion steg att skilja sant vektor mikrobiomet invånare från mikrobiella föroreningar under analysen. Ändå, en standard och statistiskt strikt metod för att identifiera och filtrera misstänkta föroreningar saknas. En vanlig metod är att ta bort OTUs närvarande i de negativa kontrollerna från alla prover. Dock kan denna metod vara alltför konservativ eftersom många av dessa mikrober som sannolikt härstammar från riktiga prover i stället för kit reagenser40. En annan vanlig teknik innebär gruppering mikrober närvarande vid < 1% i en ”sällsynta” kategori under antagandet att mikrobiella föroreningar är sällsynta i riktiga prover8,41. Men denna metod kan ta bort sann vektor mikrober som är närvarande vid låga förekomsten, särskilt när mikrobiomet domineras av en endosymbiont som sett i I. pacificus och I. holocyclus7,42. I dessa fall skulle att upptäcka ovanliga mikrober kräva en djupare sekvensering, utveckla primers som hämmar förstärkning av endosymbiont under PCR-amplikon42eller avlägsna computationally endosymbiont under sekvensanalys 7. att välja bland de olika metoder till adress sällsynta och föroreningars OTUs skapar möjlighet för subjektivitet och bias i mikrobiomet dataanalys, vilket kan begränsa möjligheten att jämföra resultat mellan studierna.

Valet av referensdatabas, krävs för att tilldela taxonomin och fylogenetiska information sekvens lydelse, utgör en annan möjlighet för divergens och subjektivitet. Samtidigt som avser en identifierad överordnade arvsmassa sekvens läsningar från en variabel gen region uppgift sig utmanande, är en pålitlig referensdatabas avgörande för korrekt fylogenetiska tilldelning. Flera databaser har dykt upp för att möta denna utmaning, som SILVA43, Greengenes44, RDP45och NCBI46. SILVA är den största av de 16S-baserade taxonomier, men SILVA, samt RDP, endast ger taxonomisk information slutmottagarnivå släkte. Greengenes ger artnivå information och ingår i gjorts analyser paket som QIIME, men det har inte uppdaterats på över fyra år. NCBI, medan inte en primär källa för taxonomisk information, ger dagliga uppdaterade klassificeringar från användaren in sekvenser, men det är uncurated. Medan urval bland databaserna beror vanligtvis på användarnas behov angående upplösning, täckning och valuta, har den en betydande inverkan på fylogenetiska tilldelning och efterföljande analys47,48. Konsensus bland utredare angående vilken referensdatabas att använda är alltså absolut nödvändigt för att undvika ytterligare bias i analyser.

Standardmetoder dessa databehandling utmaningar kommer troligen dyka upp som 16S rRNA sekvensering blir en allt vanligare teknik. Fortsatt kostnadsminskningar sekvensering och tid kommer ytterligare popularisera denna metod. Den ökade användningen av denna teknik kommer att möjliggöra djupare utredningar sammansättning och ekologi av vektor microbiomes under olika förhållanden. Kunskap om vector mikrobiomet biologi är fortfarande i sin linda, är dessa typer av beskrivande studier ett viktigt första steg som föregår försök att utnyttja mikrobiomet som smittospridare. Men för att verkligen förstå rollen av mikrobiomet i patogener överföring, måste mikrobiell identifiering kombineras med kunskap om den funktionella rollen för dessa mikrober. RNA-sekvensering och transcriptomic metoder, som innebär kartläggning och kvantifiering av genuttryck, möjliggöra slutsatser i den funktionella rollen av mikrober men kräver djupsekvensering och färdigmonterad genomen hos målarten. Kringgå dessa utmaningar, beräkningsverktyg för att förutsäga funktionella sammansättning från 16S rRNA sekvensering data har nyligen utvecklats men är inte allmänt antas ännu49. Utvecklingen av sådana verktyg, samt ekologisk teori, länka mikrobiell identitet och den funktionella rollen inom vektorer kommer att öka nyttan av 16S rRNA sekvensering data i vektor mikrobiomet studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av National Science Foundation bidrag till A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Item Name of Material/Equipment Company Catalog #
1 DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
2 Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Scientific Q3326
3 NanoDrop 8000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-8000-GL
4 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa Biosystems KK2501
5 AMPure XP beads Agen Court A63880 
6 Magnetic Rack ThermoFisher Scientific MR02
6 TE buffer Teknova T0223
7 Nextera Index Kit Illumina FC-121-1011
8 KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824
9 MiSeq System Illumina SY-410-1003
10 MiSeq Reagent Kit v3  Illumina MS-102-3001
11 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 Teknova T7724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
  2. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
  3. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  4. Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
  5. Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
  6. van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
  7. Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
  8. Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
  9. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  10. Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
  11. Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
  12. Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
  13. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
  14. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  15. Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
  16. Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
  17. Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
  18. Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
  19. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  20. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
  21. Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
  22. Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
  23. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  24. TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
  25. Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
  26. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
  27. Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  28. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
  29. Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
  30. Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
  31. Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
  33. Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
  34. Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
  35. Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
  36. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
  37. Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
  38. Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
  39. McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
  40. Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
  41. Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
  42. Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
  43. Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
  44. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  45. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
  46. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
  47. Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
  48. Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
  49. Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).

Tags

Biologi fråga 138 fästing vektor microbiom 16S rRNA amplikon nästa generations sekvensering Ixodes
Tickande mikrobiomet karakterisering av nästa generations 16S rRNA amplikon sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Couper, L., Swei, A. Tick Microbiome More

Couper, L., Swei, A. Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (138), e58239, doi:10.3791/58239 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter