Summary
Her præsenterer vi en next-generation sequencing protokol til 16S rRNA sekvensering, som muliggør identifikation og karakterisering af mikrobielle samfund inden for vektorer. Denne metode involverer DNA udvinding, forstærkning og stregkodesystem prøver gennem PCR, sekventering på en flow-celle, og bioinformatik at matche sekvens data til fylogenetiske oplysninger.
Abstract
I de seneste årtier, har vektorbårne sygdomme genopstået og udvidet med alarmerende hast, forårsager betydelig sygelighed og dødelighed på verdensplan. Effektiv og bredt tilgængelige vacciner mangler for de fleste af disse sygdomme, nødvendiggør udvikling af nye sygdom risikobegrænsende strategier. Med henblik herpå indebærer en lovende avenue til sygdomsbekæmpelse, målretning vektor microbiome, Fællesskabet af mikrober bebo vektoren. Vektor microbiome spiller en central rolle i patogenet dynamics, og manipulationer af microbiome har ført til reducerede vektor overflod eller patogen transmission for en håndfuld af vektor-bårne sygdomme. Omsætte disse resultater til sygdom kontrol applikationer kræver imidlertid en grundig forståelse af vektor mikrobiel økologi, historisk begrænset af utilstrækkelig teknologi på dette område. Fremkomsten af næste generation sequencing tilgange har aktiveret hurtig, meget parallel sekventering af forskelligartede mikrobielle samfund. Målretning meget bevaret 16S rRNA gen har lettet beskrivelser af mikrober til stede inden for vektorer under forskellige økologiske og eksperimentelle betingelser. Denne teknik indebærer forstærkning af 16S rRNA gen, prøve stregkodesystem via PCR, lastning prøver på en flow-celle til sekvensering, og bioinformatik tilgange til at matche sekvens data med fylogenetiske oplysninger. Arten eller slægten-niveau identifikation for et stort antal af flergangsbestemmelser kan typisk opnås gennem denne tilgang, således omgå udfordringer af lav afsløring, opløsning og output fra traditionelle dyrkning, mikroskopi eller histologiske farvning teknikker. Derfor, denne metode er velegnet til kendetegner vektor mikrober forskelligartede betingelser men i øjeblikket kan ikke give oplysninger om mikrobielle funktion, placering i vektor eller reaktion på behandling med antibiotika. Samlet, 16S næste generation sequencing er en kraftfuld teknik til bedre forståelse af identitet og rolle af vektor mikrober i sygdom dynamics.
Introduction
Genopblussen og udbredelsen af vektorbårne sygdomme i de seneste årtier udgøre en alvorlig trussel mod verdenssundheden menneske og dyreliv. Effektive vacciner mangler for de fleste af disse sygdomme, og kontrolindsats er hæmmet af den komplekse biologiske natur af vektorer og vektor-værtssammenspil. Oplysninger om betydningen af mikrobielle interaktioner inden for en vektor i patogen transmission kan åbne mulighed for at udvikle nye strategier, som omgå disse udfordringer. Især kan samspillet mellem vektor-associerede mikrobielle latente, symbionter og patogener, omtales som microbiome, have vigtige konsekvenser for patogen transmission. Overvældende beviser nu støtter denne påstand med eksempler viser en sammenhæng mellem den vektor microbiome og kompetence for sygdomme som malaria, Zika virus og borreliose1,2,3. Omsætte disse resultater til strategier til sygdomsbekæmpelse kræver imidlertid en langt mere detaljeret forståelse af struktur, funktion og oprindelsen af vektor microbiomes. Identifikation og karakterisering af vektor mikrobielle samfund under forskellige økologiske og eksperimentelle betingelser udgør en vigtig vej frem i dette felt.
En procedure til at identificere de mikrobielle beboere af en patogen vektor tilbydes her ved at udnytte den vestlige sort-benede kryds, Ixodes pacificus, en vektor arter sygdomsbærer Lyme sygdom Borrelia burgdorferi. Mens flåter harbor flere typer af menneskelige patogener end nogen andre leddyr, er relativt lidt kendt om biologi og Fællesskabets økologi af kryds microbiomes4. Det er indlysende, at flåter havnen et mangfoldigt udvalg af vira, bakterier, svampe og protozoer, som omfatter latente, endosymbionts og forbigående mikrobielle beboere5,4. Forudgående arbejde har demonstreret stærk variationer i Ixodes microbiomes forbundet med geografi, arter, sex, livsstadium og blodmel kilde6,7,8. Men de mekanismer, der ligger til grund for denne variation forbliver ukendt og garanterer mere detaljerede undersøgelser af oprindelse og montering af disse mikrobielle samfund. Flåter kan erhverve mikrober gennem vertikal overførsel, kontakt med værter, og optagelsen fra miljøet gennem Spirakler, mund og anal pore9. Forstå de faktorer, udformningen af indledende dannelse og udvikling af kryds microbiome, er specielt den relative bidrag af lodrette og miljømæssige transmission, vigtigt for at forstå de naturlige mønstre og variationer i kryds Microbiome mangfoldighed og hvordan disse Fællesskaber interagerer under patogen transmission, med mulige applikationer til sygdom eller vektor kontrol.
Kraftfuld molekylære teknikker, såsom næste generation sequencing, nu eksisterer for at identificere mikrobielle samfund og kan anvendes til at karakterisere vektor microbiomes på forskellige miljømæssige eller eksperimentelle betingelser. Før fremkomsten af disse høj overførselshastighed sekventering strategier påberåbt identifikation af mikrober sig overvejende mikroskopi og kultur. Mens mikroskopi er en hurtig og nem teknik, er morfologiske metoder for at identificere mikrober i sagens natur subjektive og grove og begrænset af lav følsomhed og registrering af10. Kultur-baserede metoder anvendes bredt til mikrobiel identifikation og kan bruges til at bestemme modtagelighed af mikrober til narkotika behandlinger11. Men denne metode også lider af lav følsomhed, som det er blevet anslået, at færre end 2% af miljømæssige mikrober kan dyrkes i et laboratorium indstilling12. Histologiske farvning tilgange har også været ansat til at opdage og lokalisere specifikke mikrober inden for vektorer, aktiverer undersøgelser af forskellige taxa distributioner inden for kryds og studere hypoteser om mikrobielle interaktioner. Forudgående kendskab til mikrobiel identitet er imidlertid nødvendig for at vælge de passende pletter, hvilket gør denne strategi dårligt egnet til mikrobiel karakterisering og identifikation. Derudover histologiske farvning er en meget tidskrævende, arbejdskrævende proces og skalerer ikke godt for store stikprøvestørrelser. Traditionelle molekylære metoder såsom Sanger sekventering er ligeledes begrænset i deres følsomhed og påvisning af forskelligartede mikrobielle samfund.
Næste generation sequencing giver mulighed for hurtig identifikation af mikrober fra et stort antal prøver. Tilstedeværelsen af standard markørgener og reference databaser yderligere giver forbedret taksonomiske opløsning, ofte til niveauet slaegt eller art. Lille subunit ribosomale RNA'er bruges ofte til at nå dette mål med 16S rRNA er den mest almindelige på grund af tilstedeværelsen af bevarede og variable regioner inden for gen, giver mulighed for oprettelsen af universel primere med unikke amplikoner for hver bakteriel arter13,14. Denne rapport beskriver en procedure for at identificere taxa i kryds microbiome gennem 16S rRNA næste generation sequencing. I særdeleshed understreger denne protokol trin involveret i udarbejdelsen af prøver til sekvensering. Mere generelle oplysninger om rækkefølgen og bioinformatik trin leveres, som der er en række sekventering platforme og analyse programmer øjeblikket er til rådighed, hver med omfattende eksisterende dokumentation. Den samlede gennemførligheden af denne næste generation sequencing tilgang er påvist ved at anvende det til en undersøgelse af mikrobielle samfund forsamling inden for en vigtig sygdom vektor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sæt kryds samling og overflade sterilisation
- Indsamle flåter ved at trække en 1 m2 hvid klud over et tick-associerede levesteder, fjernelse af tæger knyttet til vært arter, eller opdræt af flåter i lab15,16. Brug fine pincet til at manipulere flåter og opbevar dem ved-80 ° C.
- Placer flåter i de enkelte PCR rør og fjerne overflade forureninger af vortexing for 15 s successivt med 500 μL af hydrogenperoxid (H2O2), 70% ethanol og Hedeselskabet2O.
- Placer flåter i en ny PCR rør og lade dem lufttørre.
- I dette rør, mekanisk forstyrre kryds væv ved at knuse flåter med en morter og støder (anvendes i denne undersøgelse), ved hjælp af små perler i en perle tæppebanker, eller skære kryds fra hinanden med en skalpel.
2. DNA oprensning
- Rense DNA fra enkelte flåter, følge vejledningen i et kommercielt tilgængelige DNA udvinding kit. Elueres for en endelig mængde på 100 μL.
Bemærk: Se figur 1 for en oversigt over trin 2,2-2,8. Alternative udvindingsmetoder omfatter phenol-chloroform udvinding17,18, ethanol nedbør19eller ekstraktion med en chelaterende materielle20,21. - Bekræft vellykket DNA oprensning ved hjælp af en fluorometer eller spektrofotometeret. For fluorometry, skal du bruge 10 μL af DNA skabelon i en 190 μl dobbelt-strenget DNA analyse. Det forventede afkast er 0,1-1,0 ng/μl22. Spektrofotometri, bruge 1 μL af DNA skabelon i en nukleinsyre kvantificering. Det forventede A260/280-forholdet er ca 1,823.
- Hvis ikke procedure straks til forstærkning, opbevare prøver ved-20 ° C.
3. 16S rRNA gen forstærkning
- Opsætning af amplikon PCR i en 27,5 μL reaktion indeholdende: 5 μl af hver primer på 1 μM 12,5 μl af kommercielt tilgængelige PCR mix; og 5 μl DNA ekstraheret fra enkelte flåter i en koncentration på 5 ng/μl.
Bemærk: Brug de følgende primere for forstærkning af regionen hypervariable V3-V4 af 16S rRNA-gen13:
5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3',
5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3' - Flytte rør til en thermocycler programmeret til: en indledende denaturering ved 95 ° C i 3 min. 25 cyklusser af 1) 95 ° C til 30 s, 2) 57 ° C i 30 s, 3) 72 ° C i 30 s; en sidste udvidelse ved 72 ° C i 5 min; og en sidste hold på 10 ° C.
- Når PCR er gjort, skal du visualisere PCR produkt ved indlæsning 4-6 μL/prøve på en 1,5% agarosegel. Kigge efter et band på 460 bp at bekræfte forstærkning.
Bemærk: Amplicon PCR produkt kan ikke være synlige på gelen hvis prøven er for lav (< 10 ng). Primer dimer tilstedeværelse er fælles i lav-koncentration prøver. Hvis andre ikke-målmakroorganismer bands er til stede, justere den udgloedning temperatur eller formindske antallet af cyklusser. - Hvis ikke procedure straks til rensning, opbevare prøver ved 4 ° C.
4. 16S amplikon rensning
- Ved hjælp af en ny PCR rør til hver prøve, kombinere PCR produkt med ddH2O at få 60 μl samlede. For prøver med lave DNA koncentrationer, udføre amplikon PCR i tre eksemplarer til at reducere forstærkning bias og samle prøver at koncentrere mig.
- Bringe Paramagnetiske perler til stuetemperatur og vortex dem godt før brug.
- Tilføje 48 μL af Paramagnetiske perler til 60 μl af prøven og der inkuberes i 5 min. sted rør på et magnetisk rack i 5 min. indtil løsning bliver klart. Fjern supernatanten.
Bemærk: Denne perle koncentration mål fjernelse af primer dimerer (< 60 bp). Hvis det er nødvendigt, justere perle koncentration for at fjerne andre uspecifikke banding. - Med rør på magnetisk rack, tilsæt 500 μL af frisklavede 80% EtOH. Umiddelbart efter at tilføje EtOH at alle rør, afpipetteres ud af væsken. Fjern ikke perlerne. Gentag EtOH tilføjelse og fjernelse endnu en gang.
- Lufttørre prøver for at fjerne overskydende EtOH ved at lade rør åben på den magnetiske rist i 5 min, eller indtil små revner er synlige i perlerne.
- Der tilsættes 20 μL TE buffer og inkuberes prøver ud magnet, ved stuetemperatur, til 5-10 min.
- Sted rør tilbage på magneten. Når perler og flydende er adskilt, overføre supernatanten til en frisk tube at få renset PCR produktet.
- (Valgfrit) Visualisere produkt for at bekræfte vellykket amplikon rensning af indlæsning 4-6 μL/prøve på en 1,5% gel. 460 bp bandet skal være synlige, og der bør være nogen primer-dimer.
- Hvis ikke går straks til indeks PCR, opbevare prøverne 4 ° C.
5. prøve stregkodesystem og rensning
- Tildele entydige primer kombinationer til hver prøve ved at vælge enten frem eller omvendt primere, eller begge, fra et kommercielt tilgængelige bibliotek indeks kit.
Bemærk: Entydigt mærkning prøver giver mulighed for differentiering efter sekvensering. Kits giver typisk nok primere for at sekvens 96-384 prøver. - Knytte dual primere eller indeks, til prøver ved at udføre PCR i en 25 μL reaktion indeholdende 2,5 μL af hver primer (N7xx og S5xx), 12,5 μl af kommercielt tilgængelige PCR master mix, 5 μl af Hedeselskabet2O og 2,5 μL af renset amplikon produkt.
- Flytte rør til en thermocycler programmeret til: en indledende denaturering ved 95 ° C i 3 min. 8-14 cyklusser af 1) 95 ° C til 30 s, 2) 55 ° C til 30 s, 3) 72 ° C i 30 s; en sidste udvidelse ved 72 ° C i 5 min; og en sidste hold på 10 ° C.
- Når PCR er gjort, skal du visualisere PCR produkt ved indlæsning 4-6 μL/prøve på en 1,5% agarosegel. Kigge efter et band på 550 bp at bekræfte forstærkning.
Bemærk: Brug visualisering resultaterne informere indeks PCR cykel betingelser. Lavere periodisk optælling for at afbøde ikke-specifik binding eller øge den periodiske optælling for at opnå synlige bands for hver prøve. - Gentag den oprydning-proceduren og opført i trin 4. For at undgå fortynding under oprydning, udføre indeks PCR i to eksemplarer og pool produktet her.
- Hvis det ikke straks at bibliotek kvantificering og normalisering, opbevare prøver ved 4 ° C.
6. bibliotek kvantificering og normalisering
- Skøn af den koncentration af hver renset, barcoded produkt fra trin 5,5 ved hjælp af en fluorometer eller spektrofotometeret (Se trin 2.2). Fortynd prøver i TE buffer til at opnå koncentrationer af ca 1 pM.
Bemærk: Bibliotek kvantificering er nødvendige for at opnå prøven lastning koncentration anbefales til sekvensering platform. Bibliotek kvantificering er opnået gennem qPCR, men estimering prøve koncentration før qPCR sparer reagenser og tid. 1 pM koncentration anbefales til at maksimere nøjagtigheden af bibliotek kvantificering, da dette er den gennemsnitlige koncentration af qPCR standarder i kvantificering kit24. - Udføre qPCR i en 10 μL reaktion indeholdende 6.0 μL af qPCR master mix (fra biblioteket kvantificering kit), 2,0 μL af Hedeselskabet2O og 2,0 μL af prøven eller standard. Kør hver prøve og standard i tre eksemplarer til større nøjagtighed og præcision. Kør hver prøve på tre eller flere fortyndingsniveauer (fx., 0:1 pm, 1 pm og 10 pm for anslået start koncentrationer) at sikre nøjagtig kvantificering.
Bemærk: Detaljerede oplysninger om de angivne primere og standarder vil variere baseret på kvantificering kit bruges og er tilgængelige i produkter teknisk datablad. Henvises til Tabel af materialer til kvantificering kit bruges i denne undersøgelse. - Flytte qPCR plade eller rør til en real-time PCR instrument programmeret til: en indledende denaturering af 95 ° C i 5 min; 35 cyklusser af 1) 95 ° C til 30 s og 2) 60 ° C i 45 s; og en dissociation trin 1) 95 ° c i 15 s, 2) 60 ° C i 30 s og 3) 95 ° C i 15 s.
- Beregne gennemsnittet starter koncentrationen i hver prøve, ved hjælp af kvantificering værdier opnået fra qPCR resultater og prøve fortyndingsniveauer anvendes.
Bemærk: For eksempel, en gennemsnitlig koncentration på 2 pM for en stikprøve fortyndet 1:100,000 udbytter en oprindelig udgangspunktet koncentration af 200 nM. Hvis ingen af fortyndingsniveauer for en given prøve falder inden for intervallet af standard kurver, må kvantificering resultater ikke være nøjagtig; i så fald, justere fortyndingsniveauer og igen udføre qPCR. - Fortynd hver renset, barcoded prøve 4 nM i TE buffer, baseret på de gennemsnitlige koncentrationer beregnes i skridt 7,5.
Bemærk: For eksempel, for en gennemsnitlig prøve koncentration på 200 nM, fortyndet prøve 1:50 i TE buffer til at opnå en 4 nM koncentration. Den præcise prøve koncentration vil variere baseret på sekventering system og reagens sættet anvendes. Henvise til sekventering system bruger guide for den anbefalede koncentration. - Oprette biblioteket kombineret ved at tilføje lige store mængder (typisk 5-10 μl) af alle enkelte biblioteker i et enkelt rør.
Bemærk: som alle prøver skal være på en 4 nM koncentration, tilføjer lige store mængder opnår en lige koncentration af alle prøver i de poolede bibliotek. - Gentag trin 6.2-6.4 på kombinerede biblioteket for at bekræfte den 4 nM koncentration.
- Beregne den kombinerede bibliotek koncentration og fortyndes eller re udgør den endelige, poolede bibliotek ved hjælp af Tris buffer som nødvendigt for at opnå 4 nM.
- Hvis det ikke straks at prøve lastning, opbevare prøver ved-20 ° C. Udføre sekventering køre kort efter kvantificering at minimere tab eller ændringer i DNA koncentration under opbevaring.
7. bibliotek denaturering og fortynding og sekventering køre (udføre på samme dag)
- Denaturere 4 nM kombineret biblioteket fra trin 6.9 med NaOH.
Bemærk: Disse endelige bibliotek forberedelsestrin varierer for hver sekventering system. Henvise til sekventering system bruger guide til mere detaljerede og opdaterede protokoller. Nye brugere vil sandsynligvis nødt til at være uddannet på brugen af sekventering platform eller kan sende deres biblioteker til en core sekventering facilitet. - Fortyndet denatureret biblioteket til den ønskede lastning koncentration ved hjælp af bufferen findes i sekventering reagens kit (Tabel af materialer).
Bemærk: Optimal lastning koncentrationer varierer afhængigt af sekventering system og typisk spænder fra 1-250 pM25. - Denaturere og fortyndes sekventering kontrol.
Bemærk: Tilføjer en sekventering kontrol korrigerer for sekventering problemer som følge af lav mangfoldighed biblioteker. Denaturere sekventering kontrol bruge NaOH og fortyndes til den samme koncentration som biblioteket. - Kombinere bibliotek og sekventering kontrol.
Bemærk: Forholdet mellem sekventering kontrol til kombinerede bibliotek vil afhænge af bibliotek mangfoldighed og sekventering system anvendes, men det er typisk 1:126. - Indlæse den kombinerede bibliotek og sekventering kontrol blandingen på cellen sekventering flow.
8. amplikon Sekvensanalyse
- Vurdere den samlede succes af flugt ved at undersøge den køre målinger på cloud computing miljø svarende til sekventering system anvendes.
Bemærk: Den køre målinger, som antallet af sekventering læser, vil variere baseret på sekvensering platform og reagens kit bruges. Målværdierne for fælles sekventering systemer er angivet i tabel 1. - Download rå sequencing data og ønskede Bioinformatik open source software, kvantitative indsigt i mikrobiel økologi (QIIME)27 eller Mothur28.
Bemærk: Både QIIME og Mothur er open source og gratis at downloade. Detaljerede instruktioner om brug af disse programmer kan findes online og er tilstrækkeligt detaljerede for førstegangsbrugere. Nedenstående trin giver et bredt overblik over en Bioinformatik rørledningen udføres i QIIME. Kendskab til python er ikke nødvendig men vil lette gennemførelsen af følgende scripts - Oprette og validere kortlægning filen ved hjælp af scriptet "validate_mapping_file.py" i QIIME.
Bemærk: Tilknytningsfilen indeholder alle de metadata, der er nødvendige for at udføre dataanalyse, herunder sample ID, amplikon primer sekvenser og prøve beskrivelse. Valideringstrinet kontrollerer, at alle nødvendige data er angivet i det rigtige format. - Afmultiplekse og filtrere sekvenser ved hjælp af scriptet "split_libraries.py" (figur 1).
Bemærk: Dette script tildeler barcoded læser til prøver baseret på indekset primer kombinationer og prøve id'er input i tilknytningsfilen. Den udfører også flere kvalitet filtrering skridt til kontrol for sekventering fejl baseret på brugerdefinerede cut-offs for minimum kvalitetsresultat, sekvens længder og ende-trimning. - Tildele operationelle taksonomiske enheder (OTUs) til sekvenser ved hjælp af scriptet "pick_open_references_otus.py".
Bemærk: I dette trin, sekvenser er grupperet mod en reference sekvens samling baseret på en tærskel på identitet (typisk 97%). Læser, der ikke matcher sekvens referencesamling er grupperet mod hinanden. De novo og afsluttet reference OTU picking indstillinger er også tilgængelige, men open-reference picking anbefales af QIIME udviklere. - Normalisere OTU tabel ved hjælp af scriptet "alpha_rarefaction.py" eller "normalize_table.py".
Bemærk: Dette trin korrigerer for variation i kolonnen beløb eller samlet sekvens læser pr. sample, som følge af moderne sekventering teknologier. Normalisering kan udføres ved hjælp af traditionelle rarefaction, eller gennem alternative metoder som kumulativ sum skalering. - Udføre flere alpha-mangfoldighed, beta-mangfoldighed og taksonomiske sammensætning mangfoldighed analyser på én gang ved hjælp af scriptet "core_diversity_analysis.py".
Bemærk: Alternativt disse analyser kan køres separat ved hjælp af de enkelte scripts (f.eks. "alpha_diversity.py").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I alt 42 flåter fra tre separate æg koblinger og to miljøeksponering perioder, 0 og 2 uger i jorden, blev behandlet for microbiome sekvensering. Hver behandling gruppe, anses for at være en enkelt kobling og eksponering tid, indeholdt 6-8 replikere kryds prøver. Disse ekstrakter, forarbejdede kryds blev læsset på en næste-generations sequencer og gav 12,885,713 parret ende læser passerer filter. Inkluderet i dette løb var 3 negative kontroller fra ekstraktionstrinet, giver alt af 211,214 læser (inkluderet i tidligere count). Yderligere køre quality metrics sammen med optimale værdier for hvert målepunkt er nærmere beskrevet i tabel 2. Rarefaction kurver, der vedrører antallet af OTUs pr. prøve, viste, at en sekventering dybde, eller antallet af unikke sekvens læser pr. sample, af 2,129 læser ville være tilstrækkelig til at tilstrækkeligt indfange mangfoldigheden af mikrobielle samfund (sekventering indsats Figur 2). Rarefaction niveauer vil variere baseret på prøvetypen og skal fastsættes individuelt for hver sekventering køre. Efter rarefying til denne dybde, blev 1,714 OTUs identificeret på tværs af alle prøver med et gennemsnit på 93.3 ± 4.3 OTUs pr. prøve. For at undgå downstream analyse blev spørgsmål, der opstår fra sparsom matricer og fjerne potentielle forurenende stoffer, alle OTUs ikke fundet i mindst én prøve på ≥ 1% overflod samlet i en sjælden generelle kategori. Yderligere, decontam pakken i R blev udnyttet til at identificere OTUs overrepræsenteret i negative kontroller i forhold til reelle prøver, og disse OTUs blev fjernet fra downstream analyse.
Fællesskabet økologi analyser blev udført ved hjælp af QIIME mangfoldighed analyser arbejdsproces til at vise typerne af alpha mangfoldighed, beta mangfoldighed og taksonomi sammensætning mangfoldighed output genereret ved hjælp af en simpel Bioinformatik rørledning. For eksempel, vejede og oejeblikkelige Unifrac vigtigste koordinater analyser blev produceret ved hjælp af scriptet "core_diversity_analyses.py", og de afslørede rumlige klynger af larve flåter baseret på kobling identitet (figur 3). Boxplots i OTU tæller på varierende miljømæssig eksponering gange var også genereres gennem dette script viser forskelle i microbiome arter rigdom over tid (figur 4). Disse alpha og beta mangfoldighed analyser udføres baseret på bruger-definerede kategorier angivet i filen kortlægning, men tal og statistikker på taksonomiske holdingselskab genereres også for alle prøver (figur 5).
Figur 1 : Microbiome sekventering arbejdsproces. Store trin i arbejdsprocessen microbiome sekventering vises med udrykninger til biblioteket forberedelse og sekventering analyse skridt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Rarefaction kurver for sekvens tælle normalisering. Rarefaction kurver, vist for hver kohorte af flåter, vedrører observerede OTU tæller prøveudtagning indsats. Fejllinjer er til stede på grund af Kontraprøverne, der udtages til stede inden for hver kobling, og de betegner én standardafvigelse. Sekventering dybde skal være markeret på eller ud over det punkt, hvor kurven bliver stabil til tilstrækkeligt fange det fulde mangfoldighed af OTUs. Her, hensigtsmæssigt en sekventering dybde af 2.000 læser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Principal koordinere analyse af kobling. Oejeblikkelige Unifrac vigtigste koordinere analyse (PCoA) viser variationen i microbiome sammensætning mellem larve flåter fra forskellige koblinger, og voksne. Hvert datapunkt betegner en enkelte kryds. Dette tal er automatisk genereret via QIIME "core_diversity_analyses.py" script. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Alpha mangfoldighed boxplots af eksponeringstid. Boxplots skildrer OTU tæller for miljøeksponering grupper vis variation i mikrobiel diversitet over tid. Dette tal er automatisk genereret via QIIME "core_diversity_analyses.py" script. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Phylum-niveau mikrobielle identifikation for kobling, en. Microbiome sammensætning for individuelle kryds prøver fra kobling, en er vist på niveauet phylum. Denne figur, samt oversigtsoplysninger på lavere taksonomiske niveauer, er automatisk genereret via QIIME "core_diversity_analyses.py" script. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Metrisk | Definition | Vores resultater (MiSeq V3) | Optimal til MiSeq V3 | Optimal til HiSeq hurtigt tilstand | |
| Læser PF | Antallet af sekventering læser passerer filteret kyskhed. Et Læs passerer filter, hvis ikke mere end 1 base opkald har kyskhed værdi ligger under 0,6 i de første 25 cykler | 12,885,713 | 14-16 millioner | 600 millioner | |
| Fejlprocent | Procentdel af base par kaldet forkert under en cyklus, baseret på læsninger afstemt til PhiX kontrol | 3,28 ±0.10 | * Afhænger af værdier for andre målinger | * Afhænger af værdier for andre målinger | |
| % ≥Q30 | Procentdel af baser med en Q score ≥ 30, der viser en base opkald nøjagtighed på 99,9% | 68.94 | > 70% | > 80% | |
| Klynge PF (%) | Procentdel af klynger passerer filteret kyskhed. | 85.61 ±0.81 | 90% | 90% | |
| Massefylde | Tætheden af klynger på flowcell - en vigtig metrik for datakvalitet og output | 552 ± 35 klynge/mm ^ 2 | 1200-1400 klynge/mm ^ 2 | 850-1000 cluster/mm ^ 2 | |
Tabel 1: Key performance parametre for NGS output. Bruger data og target værdier rapporteret baseret på sekvensering platform og reagens sættet anvendes i denne undersøgelse (Tabel af materialer) og en 25% sekventering kontrol tilføjelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Næste generations sekventering af 16S rRNA har blive en standardmetode for mikrobiel identifikation og aktiveret studiet af hvordan vektor microbiomes påvirke patogen transmission. Protokol her skitserede detaljer brugen af denne metode til at undersøge mikrobielle samfund forsamling i I. pacificus, en vektor arter for Lyme sygdom; Det kan dog nemt anvendes til at studere andre fiskearter, kryds eller leddyr vektor.
Faktisk, 16S rRNA sekventering microbiome analyse har været brugt med stort set at studere microbiomes af vektorer herunder myg, psyllids og Inge fluer29,30,31. Andre metoder til rådighed for mikrobiel identifikation inden for vektorer omfatter mikroskopi, dyrkning og histologiske farvning. Disse metoder kan være mere passende end sekventering hvis målet er at identificere og beskrive en roman mikrobe (mikroskopi), evaluere virkningen af antimikrobielle lægemidler (kultur) eller lokalisere specifikke og kendte mikrober i vektor (histologiske farvning). Men disse metoder lider af lav specificitet, skalerbarhed og registrering, og er derfor mindre egnet til at identificere den fulde fællesskab af mikrober i en vektor eller kendetegner vektor microbiome under forskellige økologiske og eksperimenterende betingelser. Omvendt, høj overførselshastighed sekventering af 16S rRNA gen muliggør identifikation af bakterier, lav-overflod og ikke-bestemmelse, giver høj opløsning og påvisning givet omfattende reference databaser og kan give høj replikation afhængigt af på dækning behov.
Mens 16S rRNA sekventering er nu udbredt til mikrobiel identifikation, er denne teknik ikke uden begrænsninger. Hovedsagelig, kan mikrobiel kontaminering overskygge fortolkning af resultaterne, sekventering og forvirre biologiske betydning32. Derudover givet brug af universal bakteriel primere og følsomhed til lav begyndende koncentrationer, der er forbundet med 16S rRNA sekventering, mikrobiel forurening er fælles32. Kilder til forurening omfatter PCR reagenser, DNA udvinding kits, laboratorium overflader, og hud og tøj af forskere33,34,35. Virkningerne af mikrobielle forureninger kan minimeres ved at arbejde i en steril laboratoriemiljø, ved hjælp af negative kontroller og tekniske replikater, og opbevaring af alle kits og reagenser, der anvendes36.
Ud over mikrobiel forurening, kan lav kvalitet sekventering output høj grad hindre anvendeligheden af microbiome sequencing data. Datakvaliteten kan blive vurderet af en række køre måleparametre, herunder antallet af læser passerer filter, procentdel af læser over en Q-score (et mål for den forudsagte sandsynligheden for fejl i base-ringer) på 30 og klynge tæthed. Værdier for disse målinger vil variere baseret på antallet af prøver, køre, sekventering system, reagens patron, og den procent, sekventering kontrolelement, der anvendes, men optimale værdier baseret på opstille betingelser er tilgængelige online. Især er klynge tæthed, antallet af bibliotek klynger på en given planet for cellen flow før sekventering, en afgørende parameter for at optimere datakvalitet og udbytte. Både over og under-klynger kan reducere data output og resultere i prøver at blive udelukket fra analyse på grund af utilstrækkelig dækning. Dårlig klynge tæthed afspejler ofte unøjagtige bibliotek kvantificering; pleje bør derfor tages at udføre ordentlig oprydning til DNA, individuelle prøve kvantificering og hele biblioteket kvantificering.
Forudsat, at der opnås høje datakvalitet og udbytte, udgør forskellige fremgangsmåder i dataanalyse, der bruges til at overvinde statistiske udfordringer af store datasæt en anden begrænsning af denne fremgangsmåde. For eksempel findes flere metoder til adresse variation i Læs tæller mellem prøver. Rarefaction, som omfatter sub prøveudtagning læser at opnå et lige sekventering dybde på tværs af alle prøver, der ofte bruges men har været udsat for kritik for nylig til spilde store mængder data og den subjektive udvalg af minimum sekventering dybde37 ,38,39. Kumulativ sum skalering (CSS), som holder alle sekvens læser men vejer dem baseret på den kumulative sum tæller inden for en given fraktil, er blevet udviklet som et alternativ teknik. Men CSS er ikke almindeligt vedtaget på grund af dens relative nyhed, og de bekræftede nytten af rarefaction for normalisering inden tilstedeværelse eller mangler analyser.
Standard data analyse procedurer også mangler for håndtering sekvens læsninger i negative kontroller og skelne disse fra lav overflod læser. Som nævnt, anbefales sekventering negative kontroller genereret fra DNA ekstraktion trin at hjælpe med at differentiere sand vektor microbiome beboere fra mikrobielle forureninger under analysen. Endnu mangler en standard og statistisk stringent tilgang til at identificere og filtrere formodet forurenende stoffer. En fælles tilgang er at fjerne OTUs stede i de negative kontroller fra alle prøver. Dog kan denne metode være alt for konservative, da mange af disse mikrober sandsynligvis stammer fra virkelige prøver snarere end kit reagenserne40. En anden almindelig teknik indebærer gruppering mikrober til stede på < 1% i en "sjældne" kategori under den antagelse, at mikrobielle forureninger er sjældne i virkelige prøver8,41. Men denne metode kan fjerne sand vektor mikrober, der er til stede ved lave mængder, især når microbiome er domineret af en endosymbiont, som ses i I. pacificus og I. holocyclus7,42. I disse tilfælde ville afsløre sjældne mikrober kræve dybere sekventering, udvikle primere, der hæmmer forstærkning af endosymbiont under amplikon PCR42, eller beregningsmæssigt at fjerne endosymbiont under Sekvensanalyse 7. valg blandt de forskellige metoder til adresse sjældne og forurenende OTUs skaber mulighed for subjektivitet og bias i microbiome dataanalyse, som kan begrænse muligheden for at sammenligne resultater på tværs af undersøgelser.
Valget af referencedatabase, nødvendigt, tildele sekvens lyder, taksonomi og Fylogenetisk information udgør en anden mulighed for divergens og subjektivitet. Mens opgave vedrørende sekvens læser fra en variabel gen regionen en identificerede overordnede genom er i sagens natur udfordrende, er en pålidelig referencedatabase afgørende for nøjagtig fylogenetiske tildeling. Flere databaser er dukket op for at imødekomme denne udfordring, som SILVA43, Greengenes44, RDP45og NCBI46. SILVA er den største af de 16S-baserede taksonomier, men SILVA, samt RDP, kun giver taksonomiske information til slægten niveau. Greengenes indeholder arter-niveau oplysninger og er inkluderet i metagenomic analyser pakker gerne QIIME, men det er ikke blevet opdateret i over fire år. NCBI, mens ikke en primær kilde taksonomiske oplysninger, giver dagligt opdaterede klassifikationer fra bruger-indsendte sekvenser, men det er uncurated. Mens valget blandt databaserne afhænger typisk brugernes behov med hensyn til opløsning, dækning og valuta, har det betydning om fylogenetiske tildeling og downstream analyse47,48. Konsensus blandt efterforskere vedrørende hvilke referencedatabase til brug er således bydende nødvendigt for at undgå yderligere bias i analyser.
Standard tilgange til udfordringerne databehandling vil sandsynligvis emerge som 16S rRNA sekventering bliver en stadig mere almindelig teknik. Fortsatte nedskæringer i sekventering omkostninger og tid vil yderligere popularisere denne metode. Den øgede brug af denne teknologi vil give dybere undersøgelser sammensætning og økologi af vektor microbiomes under forskellige betingelser. Kendskab til vektor microbiome biologi er stadig i sin vorden, er disse typer af deskriptive studier et kritisk første skridt forud for forsøg på at udnytte microbiome som et middel til vektor kontrol. For virkelig at forstå rollen af microbiome i patogen transmission, skal mikrobiel identifikation kobles med kendskab til funktionelle rolle af disse mikrober. RNA sekvensering og transkriptom tilgange, som indebærer kortlægning og kvantificere genekspression, aktiverer slutninger til den funktionelle rolle af mikrober, men kræver dyb sekvensering og fuldt samlet genomer af målarter. Omgå disse udfordringer, beregningsmæssige redskaber for at forudsige funktionelle sammensætning fra 16S rRNA sequencing data er for nylig blevet udviklet men er ikke almindeligt vedtaget endnu49. Udviklingen af sådanne værktøjer, samt økologisk teori, forbinder mikrobielle identitet og den funktionelle rolle inden for vektorer vil øge nytten af 16S rRNA sequencing data i vektor microbiome undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation støtte til A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
- Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
