Summary
Hier presenteren we een volgende-generatie sequencing-protocol voor het 16S rRNA rangschikken waarmee identificatie en karakterisering van microbiële gemeenschappen binnen de vectoren. Deze methode houdt het DNA-extractie, versterking en barcoding van monsters door middel van PCR, rangschikking op een stroom-cel, en bio-informatica aan sequencedata tot fylogenetische informatie.
Abstract
In de afgelopen decennia hebben vector-overgedragen ziekten weer naar voren en uitgebreid op alarmerend tarieven, veroorzaken aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Effectieve en wijd-beschikbaar vaccins ontbreken voor een meerderheid van deze ziekten, waardoor de ontwikkeling van nieuwe ziekte risicobeperkende strategieën. Te dien einde houdt een veelbelovende laan van ziektebestrijding gericht op de vector microbiome, de Gemeenschap van microben bevolken de vector. De vector microbiome speelt een centrale rol in pathogen dynamiek en manipulaties van de microbiome hebben geleid tot verminderde vector overvloed of pathogen transmissie voor een handvol vector-overgedragen ziekten. Het vertalen van deze bevindingen in disease control toepassingen vereist echter een gedegen kennis van vector microbiële ecologie, historisch beperkt door onvoldoende technologie op dit gebied. De komst van de volgende generatie sequencing benaderingen heeft snelle, zeer parallelle sequencing van cultuurgemeenschappen microbiële ingeschakeld. Gericht op het zeer geconserveerd 16S rRNA gen heeft vergemakkelijkt karakterisaties van microben in vectoren onder variërende ecologische en experimentele voorwaarden aanwezig. Deze techniek gaat om versterking van het 16S rRNA gen, monster barcoding via PCR, laden monsters naar een cel van de stroom voor het rangschikken, en bio-informatica benaderingen aan sequencedata met fylogenetische informatie. Soort of geslacht-niveau identificatie voor een groot aantal replicatieonderzoeken kan meestal worden bereikt door deze aanpak, dus het omzeilen van uitdagingen van loeien speurder, resolutie en uitvoer van traditionele kweken, microscopie of histologische kleuring technieken. Daarom deze methode is geschikt voor het karakteriseren van vector microben onder uiteenlopende omstandigheden, maar op dit moment geen informatie worden verkregen op microbiële functie, locatie binnen de vector of reactie op de behandeling met antibiotica. Over het geheel genomen is 16S volgende-generatie rangschikken een krachtige techniek voor het beter begrijpen van de identiteit en de rol van vector microben in de dynamiek van de ziekte.
Introduction
De heropleving en de verspreiding van de vector-overgedragen ziekten in de afgelopen decennia bedreiging een ernstige voor globale gezondheid van mensen en dieren in het wild. Effectieve vaccins ontbreken voor een meerderheid van deze ziekten, en controle-inspanningen worden belemmerd door de complexe biologische aard van vectoren en vector-gastheer interacties. Inzicht in de rol van microbiële interacties binnen een vector in pathogen transmissie kan zorgen voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën die het omzeilen van deze uitdagingen. In het bijzonder, interacties tussen vector-geassocieerde microbiële commensals, symbionten en ziekteverwekkers, hierna aangeduid als de microbiome, kunnen belangrijke gevolgen hebben voor pathogen transmissie. Overweldigend bewijs nu ondersteunt deze bewering, met voorbeelden waaruit blijkt van een koppeling tussen de vector microbiome en bekwaamheid voor ziekten zoals malaria, Zika-virus en de ziekte van Lyme1,2,3. Het vertalen van deze bevindingen in strategieën voor ziektepreventie en-bestrijding vereist echter een veel gedetailleerder inzicht in de structuur, functie en herkomst van de vector microbiomes. Identificatie en karakterisering van de microbiële Gemeenschap van vector onder variërende ecologische en experimentele omstandigheden vormen een belangrijke weg vooruit op dit gebied.
Een procedure voor de identificatie van de microbiële bewoners van een ziekteverwekker vector is hier geboden door gebruik te maken van de westerse zwart-legged teek, Ixodes pacificus, een vector soorten van de verwekker van de ziekte van Lyme Borrelia burgdorferi. Terwijl teken meer soorten menselijke pathogenen dan elke andere arthropod haven, is relatief weinig bekend over de ecologie van de biologie en de Gemeenschap van de teek microbiomes4. Het is duidelijk dat teken haven een divers scala aan virussen, bacteriën, schimmels en protozoa, waaronder commensals, endosymbionten en voorbijgaande microbiële bewoners5,4. Voorafgaande werk heeft aangetoond sterke variaties in de Ixodes microbiomes geografie, soort, geslacht, leven stadium en bloedmeel bron6,7,8is gekoppeld. Nochtans, de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze variatie onbekend blijven en garandeert u dat meer gedetailleerde onderzoek van de oorsprong en samenstelling van deze microbiële gemeenschappen. Teken kunnen verwerven microben via verticale transmissie, contact met hosts en opname van het milieu door middel van de spiracles, mond en anale poriën9. Inzicht in de factoren die het vormgeven van de initiële vorming en ontwikkeling van de microbiome van de teek, is specifiek de relatieve bijdrage van verticale en milieu transmissie, belangrijk voor het begrip van de natuurlijke patronen en variaties in de teek microbiome diversiteit en de wisselwerking van deze gemeenschappen tijdens pathogen transmissie, met mogelijke toepassingen aan ziekte of vector.
Krachtige moleculaire technieken, zoals de sequencing van de volgende generatie, nu bestaan voor de identificatie van microbiële gemeenschappen en kunnen worden gebruikt om te karakteriseren vector microbiomes onder uiteenlopende milieu- of experimentele omstandigheden. Voorafgaand aan de komst van deze high-throughput sequencing benaderingen, de identificatie van microben ingeroepen overwegend microscopie en cultuur. Terwijl microscopie een snelle en gemakkelijke techniek is, zijn morfologische methoden voor het identificeren van microben inherent subjectief en grof en beperkt door lage gevoeligheid en detectie10. Cultuur gebaseerde methoden zijn over het algemeen gebruikt voor microbiële identificatie en kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de gevoeligheid van bacteriën voor drug behandelingen11. Echter, deze methode ook lijdt aan lage gevoeligheid, als er wordt geschat dat minder dan 2% van milieu microben kunnen worden gekweekt in een laboratorium, instelling van12. Histologische kleuring benaderingen zijn ook tewerkgesteld te detecteren en lokaliseren specifieke microben binnen vectoren, onderzoek van verschillende taxa distributies binnen de teek mogelijk te maken en studeren hypothesen over microbiële interacties. Voorafgaande kennis van microbiële identiteit is echter vereist voor het selecteren van de juiste vlekken, maken deze aanpak niet geschikt voor microbiële karakterisering en de identificatie. Anderzijds histologische kleuring is een zeer tijdrovende en moeizame proces en niet schaalt ook bij grote steekproeven. Traditionele moleculaire benaderingen zoals Sanger sequencing zijn ook beperkt in hun gevoeligheid en opsporen van microbiële cultuurgemeenschappen.
Volgende-generatie sequencing zorgt voor de snelle identificatie van microben uit een groot aantal monsters. De aanwezigheid van standaard-markers en verwijzing databases verdere hiermee verbeterd taxonomische resolutie, vaak naar het geslacht of de soort niveau. Kleine subeenheid ribosomaal RNAs worden vaak gebruikt om dit te bereiken, met 16S rRNA worden de meest voorkomende als gevolg van de aanwezigheid van geconserveerde en variabele regio's binnen het gen, waardoor voor de totstandbrenging van universele inleidingen met unieke waarbij voor elk bacteriële soorten13,14. Dit verslag beschrijft in detail een procedure voor de identificatie van taxa in de microbiome van de teek door 16S rRNA volgende-generatie sequencing. Dit protocol onderstreept met name de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van monsters voor het rangschikken. Meer algemene informatie over de volgorde en bioinformatics stappen dienen, aangezien er een verscheidenheid van sequencing platformen en analyse programma's die momenteel beschikbaar, elk met uitgebreide bestaande documentatie. De algehele haalbaarheid van deze next-generation sequencing aanpak wordt aangetoond door het toe te passen op een onderzoek van microbiële Gemeenschap vergadering binnen een belangrijke ziekte vector.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vink collectie en oppervlakte sterilisatie
- Verzamelen teken door te slepen een 1 m2 witte doek over een teek-geassocieerde habitat, het verwijderen van teken gekoppeld aan host soorten of fokken teken in het lab15,16. Fijne pincet gebruiken om te manipuleren teken en bewaar ze bij-80 ° C.
- Teken in de individuele PCR buisjes plaatsen en verwijderen van oppervlakte verontreinigingen door de vortexing voor 15 s achtereenvolgens met 500 μL van waterstof peroxide (H2O2), 70% ethanol en ddH2O.
- Plaats het teken in een nieuwe PCR-buis en laten drogen.
- In deze buis, mechanisch teek weefsels door het breken van het teken met een mortier en een stamper (gebruikt in deze studie), kleine kralen met een kraal klopper, verstoren of snijden van de teek na elkaar, met een scalpel.
2. DNA zuivering
- Zuiveren van DNA van individuele teken, na de instructies in een commercieel beschikbare DNA-extractie kit. Elueer voor een eindvolume van 100 μl.
Nota: Verwijs naar Figuur 1 voor een overzicht van stappen 2.2-2.8. Alternatieve extractiemethoden omvatten fenol-chloroform extractie17,18, ethanol neerslag19of extractie met een chelaatvormers materiële20,-21. - Bevestig succesvolle DNA zuivering met behulp van een Fluorimeter of spectrofotometer. Voor fluorometry, 10 μL van DNA sjabloon in een 190 μL double-stranded DNA test te gebruiken. Het verwachte rendement is 0.1-1.0 ng/μL22. Voor spectrofotometrie, 1 μL van DNA sjabloon in een nucleïnezuur kwantificering te gebruiken. De verwachte verhouding van A260/280 is ongeveer 1,823.
- Als geen procedure onmiddellijk om versterking, opslag van de monsters bij-20 ° C.
3. 16S rRNA Gene versterking
- Instellen van de amplicon PCR in een 27.5 μL reactie bevattende: 5 μL van elke primer op 1 μM; 12.5 μL van commercieel beschikbare PCR-mix; en 5 μL van DNA geëxtraheerd uit individuele teken bij een concentratie van 5 ng/μL.
Opmerking: Gebruik de volgende inleidingen voor versterking van de hypervariable V3-V4-regio van het 16S rRNA gene13:
5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3',
5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3' - Buizen verplaatsen naar een thermocycler geprogrammeerd voor: een initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 3 min; 25 cycli van 1) 95 ° C gedurende 30 s, 2) 57 ° C gedurende 30 s, 3) 72 ° C gedurende 30 s; een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten; een laatste Houd bij 10 ° C.
- Zodra de PCR wordt gedaan, visualiseer het PCR-product door het laden van 4-6 μL/monster op een 1,5% agarose gel. Zoekt u een band op 460 bp te bevestigen versterking.
Opmerking: Amplicon PCR product mogelijk niet zichtbaar op de gel als de concentratie van de steekproef te laag is (< 10 ng). Primer dimeer aanwezigheid is gebruikelijk in lage concentratie monsters. Als andere niet-doelbandbreedtes aanwezig zijn, de onthardende temperatuur aanpassen of verminderen van het aantal cycli. - Als geen procedure onmiddellijk naar zuivering, opslag van de monsters bij 4 ° C.
4. 16S Amplicon zuivering
- Met behulp van een nieuwe PCR-buis voor elk monster, het combineren van het PCR-product met ddH2O te verkrijgen van 60 μL totale. Voor monsters met een lage concentraties van DNA, uitvoeren van amplicon PCR in drievoud te verminderen amplificatie bias en bundelen van de monsters te concentreren.
- Paramagnetisch kralen brengen op kamertemperatuur en vortex die hen goed vóór gebruik.
- 48 μL van paramagnetisch kralen toevoegen aan 60 μL van het monster en incubeer gedurende 5 min. plaats de buizen op een magnetische rek voor 5 min tot oplossing wordt duidelijk. Verwijder het supernatant.
Opmerking: De concentratie van deze parel richt zich op het wegnemen van inleidingsdimeer (< 60 bp). Wijzig indien nodig, de concentratie van de kraal Schakel andere aspecifieke "banding". - Met buizen op magnetische rek, voeg 500 l 80% vers bereide EtOH. Onmiddellijk na het toevoegen van EtOH alle buizen, Pipetteer uit de vloeistof. Verwijder niet de kralen. Herhaal de EtOH toevoeging en verwijdering nog een keer.
- Het drogen van de monsters Schakel overtollige EtOH door bloot op het magnetische rek voor 5 minuten, of totdat de scheurtjes zijn zichtbaar in de kralen van de buizen.
- Voeg 20 μL van TE buffer en Incubeer de monsters uit de magneet, bij kamertemperatuur, voor 5-10 min.
- Plaats die de buizen terug aan de magneet. Zodra de kralen en de vloeistof worden gescheiden, overbrengen in het supernatant een verse buis de schoongemaakte PCR product te verkrijgen.
- (Optioneel) Visualiseren van het product om te bevestigen van succesvolle amplicon zuivering door het laden van 4-6 μL/monster op een 1,5% gel. De 460 bp band zichtbaar moet zijn, en er moet geen primer dimeer.
- Indien geen vooruitgang onmiddellijk naar index PCR, slaan de monsters 4 ° C.
5. proef Barcoding en zuivering
- Toewijzen uniek primer combinaties aan elk monster door vooruit of omgekeerde inleidingen, of beide, van een commercieel beschikbare bibliotheek index kit te selecteren.
Opmerking: Uniek labeling monsters zorgt voor differentiatie na sequencing. Kits bieden meestal genoeg inleidingen te volgnummer 96-384 monsters. - De dubbele inleidingen of indexen, aan de monsters door het uitvoeren van PCR 25 μL reactie met 2,5 μL van elke primer (N7xx en S5xx), 12,5 μL van commercieel beschikbare PCR master mix, 5 μL van ddH2O en 2.5 μL van de schoongemaakte amplicon product toevoegen.
- Verplaatsen van de buizen naar een thermocycler geprogrammeerd voor: een initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 3 min; 8-14 cycli van 1) 95 ° C gedurende 30 s, 2) 55 ° C gedurende 30 s, 3) 72 ° C gedurende 30 s; een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten; een laatste Houd bij 10 ° C.
- Zodra de PCR wordt gedaan, visualiseer het PCR-product door het laden van 4-6 μL/monster op een 1,5% agarose gel. Zoekt u een band op 550 bp te bevestigen versterking.
Opmerking: Gebruik de visualisatie resultaten te informeren index PCR fietsen voorwaarden. De cyclus telt aspecifieke bindende beperken of verhogen de telling van de cyclus te verkrijgen van de zichtbare banden voor elk monster Verlaag. - Herhaal de procedure van de schoonmaakoperaties vermeld in stap 4. Om te voorkomen dat de verdunning tijdens opschonen, index PCR uitvoeren in tweevoud en bundelen het product hier.
- Als geen procedure onmiddellijk aan de kwantificering van de bibliotheek en de normalisatie, opslag van de monsters bij 4 ° C.
6. bibliotheek kwantificering en normalisatie
- Schatten van de concentratie van elk gezuiverde, barcoded product uit stap 5.5 met behulp van een Fluorimeter of spectrofotometer (zie stap 2.2). Verdun de monsters in de buffer TE verkrijgen van concentraties van ongeveer 1 uur.
Opmerking: Bibliotheek kwantificering nodig is om het monster laden concentratie aanbevolen voor de sequencing-platform. Kwantificering van de bibliotheek wordt bereikt door qPCR, maar de concentratie van het monster vóór qPCR schatten slaat reagentia en tijd. De 1 pM-concentratie wordt aanbevolen om het maximaliseren van de nauwkeurigheid van de kwantificering van de bibliotheek, zoals dit de gemiddelde concentratie van de normen van de qPCR waarin de kwantificering kit24 is. - Voer qPCR in een reactie van de 10 μL met 6.0 μL van de master mix qPCR (uit de bibliotheek kwantificering kit), 2.0 μL van ddH2O en 2.0 μL van het monster of standaard. Elk monster en standaard in drievoud voor meer nauwkeurigheid en precisie uitvoeren. Elk monster worden uitgevoerd op drie of meer niveaus van verdunning (bv., 0: 1 pm, 1 pm en 10 pm voor de geschatte startende concentraties) om ervoor te zorgen nauwkeurige kwantificering.
Opmerking: Gedetailleerde informatie over de verstrekte primers en normen zal variëren op basis van de kwantificering kit gebruikt en zijn beschikbaar in de technische fiche van producten. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor de kwantificering kit die wordt gebruikt in deze studie. - De qPCR plaat of buizen naar een real-time PCR-instrument dat is geprogrammeerd voor verplaatsen: een initiële denaturatie van 95 ° C gedurende 5 minuten; 35 cycli van 1) 95 ° C voor 30 s en 2) 60 ° C gedurende 45 s; en een stap in de dissociatie van 1) 95 ° C gedurende 15 s, 2) 60 ° C gedurende 30 s, en 3) 95 ° C gedurende 15 s.
- Bereken de gemiddelde concentratie voor elk monster met behulp van de kwantificering waarden, verkregen uit de resultaten van de qPCR en de monster verdunning niveaus gebruikt.
Opmerking: bijvoorbeeld een gemiddelde concentratie van 2 pM voor een monster verdunde 1:100,000 levert een originele beginconcentratie van 200 nM. Als geen van de niveaus van de verdunning voor een monster binnen het bereik van de standaard curven valt, kwantificering resultaten mogelijk niet nauwkeurig zijn; in dat geval de verdunning niveaus aanpassen en opnieuw uit te voeren qPCR. - Verdun elk gezuiverde, barcoded monster 4 nM in TE buffer, gebaseerd op de gemiddelde concentraties berekend in stap 7.5.
Opmerking: bijvoorbeeld, voor de concentratie van een gemiddeld monster van 200 nM, verdunde de monster 1:50 TE buffer naar een 4 nM-concentratie wordt bereikt. De precieze monster concentratie zal variëren op basis van de volgorde systeem en reagens kit gebruikt. Raadpleeg de gebruikershandleiding van sequencing systeem voor de aanbevolen concentratie. - De gecombineerde bibliotheek maakt door gelijke hoeveelheden (meestal 5-10 μl) toe te voegen van alle individuele bibliotheken in een enkele buis.
Opmerking: zoals alle monsters op een 4 nM concentratie moeten, toevoegen van gelijke hoeveelheden behaalt een gelijke concentratie van alle monsters in de gepoolde bibliotheek. - Herhaal stap 6.2-6.4 op de gecombineerde bibliotheek om te bevestigen de 4 nM-concentratie.
- Bereken de concentratie van de gecombineerde bibliotheek en verdunnen of opnieuw vormen de finale, gebundelde bibliotheek gebruiken Tris buffer als dit nodig is om te bereiken van 4 nM.
- Als geen procedure onmiddellijk bij het laden van de steekproef, opslag van de monsters bij-20 ° C. De volgorde uitvoeren kort na kwantificering te minimaliseren verlies of veranderingen in DNA concentratie tijdens de opslag uit te voeren.
7. bibliotheek denaturatie en verdunning en Sequencing Run (uitvoeren op dezelfde dag)
- Het denatureren van de 4 nM gecombineerde bibliotheek vanaf stap 6.9 met NaOH.
Opmerking: Deze laatste bibliotheek voorbereiding stappen verschillen voor elk rangschikkend systeem. Raadpleeg de gebruikershandleiding van sequencing systeem voor meer gedetailleerde en bijgewerkte protocollen. Nieuwe gebruikers zullen waarschijnlijk moeten worden opgeleid over het gebruik van het platform sequencing of hun bibliotheken kunnen verzenden met een core sequencing faciliteit. - Verdun de gedenatureerde bibliotheek bij de concentratie van de gewenste laden met behulp van de buffer waarin de sequencing reagens kit (Tabel van materialen).
Opmerking: Optimale laden concentraties verschillen door sequentiebepaling systeem en meestal variëren van 1-250 uur25. - Denatureren en Verdun het rangschikken-besturingselement.
Opmerking: Het toevoegen van een besturingselement sequencing corrigeert voor sequencing kwesties die voortvloeien uit lage diversiteit bibliotheken. Denatureren van de controle van de sequencing met behulp van NaOH en Verdun tot dezelfde concentratie als de bibliotheek. - Het combineren van de bibliotheek en de sequencing controle.
Opmerking: De verhouding van sequencing besturingselement gecombineerde bibliotheek zal afhangen van de diversiteit van de bibliotheek en rangschikkend systeem gebruikt, maar het is meestal 1:1-26. - De gecombineerde bibliotheek en sequencing controle mengsel naar de cel sequencing stroom laden.
8. Amplicon sequentieanalyse
- Beoordelen van het algehele succes van de run door het onderzoek van de looppas metriek op de cloud computing omgeving overeenkomt met de sequencing-systeem gebruikt.
Opmerking: De run statistieken, zoals aantal sequencing leest, zal variëren afhankelijk van sequencing platform en reagens kit gebruikt. Streefwaarden voor gemeenschappelijke sequencing systemen staan in tabel 1. - Download de ruwe sequencing gegevens en gewenste bioinformatics open bronsoftware, kwantitatieve inzichten in microbiële ecologie (QIIME)27 of Mothur28.
Opmerking: Beide QIIME en Mothur zijn open-source en gratis te downloaden. Gedetailleerde instructies over het gebruik van deze programma's zijn online te vinden en zijn voldoende gedetailleerd voor first-time gebruikers. De volgende stappen geven een algemeen overzicht van een pijpleiding van de bioinformatica uitgevoerd in QIIME. Vertrouwdheid met python is niet nodig maar vergemakkelijkt de tenuitvoerlegging van de volgende scripts - Maak en valideer het toewijzingsbestand met behulp van de "validate_mapping_file.py" script in QIIME.
Opmerking: Het toewijzingsbestand bevat alle metagegevens nodig voor het uitvoeren van data-analyse, waaronder de ID van de steekproef, amplicon primer sequenties, en beschrijving van het monster. De stap van de validatie wordt gecontroleerd dat alle benodigde gegevens zijn ingevoerd in het juiste formaat. - Demultiplex en filteren van sequenties met behulp van de "split_libraries.py" script (Figuur 1).
Opmerking: Dit script wijst barcoded leest aan samples gebaseerd op de index primer combinaties en monster-id invoeren in het toewijzingsbestand. Het voert ook verschillende kwaliteit filteren stappen om te bepalen voor het rangschikken op basis van gebruiker gedefinieerde cut-offs voor minimale kwaliteitsscore, de lengten van de volgorde en einde-trimmen fout. - Operationele taxonomische eenheden (OTUs) aan sequenties met behulp van de "pick_open_references_otus.py" script toewijzen.
Opmerking: In deze stap sequenties zijn geclusterd tegen een reeks referentieverzameling gebaseerd op een drempel van identiteit (gewoonlijk 97%). Leest die niet overeenkomen met de volgorde van de referentieverzameling geclusterd zijn tegen elkaar. De novo en gesloten-reference OTU plukken opties zijn ook beschikbaar, maar open-reference picken wordt aanbevolen door QIIME ontwikkelaars. - Normaliseren de OTU tabel met behulp van de "alpha_rarefaction.py" of "normalize_table.py" script.
Opmerking: Deze stap corrigeert voor variatie in kolom bedragen, of totaal volgorde leest per monster, die voortvloeien uit het rangschikken van de moderne technologieën. Normalisatie kan worden uitgevoerd met behulp van traditionele rarefaction, of via alternatieve methoden zoals het cumulatieve totaal over schalen. - Verschillende alpha-diversiteit, bèta-diversiteit en taxonomische samenstelling diversiteit analyses tegelijk met het "core_diversity_analysis.py" script uitvoeren
Opmerking: U kunt ook deze analyses kunnen worden uitgevoerd afzonderlijk met behulp van de afzonderlijke scripts (b.v., "alpha_diversity.py").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een totaal van 42 teken uit drie aparte ei klauwen en twee omgevingsblootstelling periodes, 0 en 2 weken in de bodem, werden verwerkt voor het rangschikken van de microbiome. Alle behandelde groepen, beschouwd als een interne koppeling en blootstelling tijd, opgenomen 6-8 repliceren teek monsters. Deze verwerkte teek-extracten werden geladen op een volgende-generatie sequencer en 12,885,713 gekoppeld-einde leest passeren filter opgeleverd. Inbegrepen in deze run 3 negatieve controles werden vanaf de winning stap, levert een totaal van 211,214 luidt (opgenomen in vorige telling). Verder zijn lopen kwaliteit statistieken samen met optimale waarden voor elke metrische gedetailleerd in tabel 2. Rarefaction curven, die verband houden met aantal OTUs per monster, aangegeven dat een sequencing diepte, of aantal unieke reeks leest per monster, van 2,129 leest voldoende zijn zou om voldoende vangen de diversiteit van de microbiële Gemeenschap (sequencing inspanning Figuur 2). Rarefaction niveaus zal variëren op basis van monster type en individueel moeten worden bepaald voor elke volgorde uitvoeren. Na de rarefying tot deze diepte, werden 1.714 OTUs geïdentificeerd in verschillende alle steekproeven met een gemiddelde van 93.3 ± 4.3 OTUs per monster. Voorkom downstream analyse werden kwesties die voortvloeien uit sparse matrices en verwijderen van potentiële verontreinigingen, alle OTUs niet gevonden in ten minste één monster bij ≥ 1% overvloed gebundeld in een zeldzame algemene categorie. Verder, het decontam-pakket in R werd gebruikt om te identificeren OTUs oververtegenwoordigd zijn in de negatieve controles ten opzichte van echte monsters, en deze OTUs werden verwijderd uit de downstream-analyse.
Gemeenschap ecologie analyses werden uitgevoerd met behulp van de QIIME diversiteit analyses workflow om aan te tonen van de soorten Alfa diversiteit, diversiteit van de beta en taxonomie samenstelling diversiteit uitvoer gegenereerd met behulp van een eenvoudige bioinformatics pijpleiding. Bijvoorbeeld, gewogen en ongewogen Unifrac belangrijkste coördinaten analyses werden geproduceerd met behulp van de "core_diversity_analyses.py" script, en ze bleek ruimtelijke clustering van larvale teken op basis van de identiteit van de koppeling (Figuur 3). Boxplots van OTU telt op variërend van milieublootstelling tijden werden ook gegenereerd door dit script, tonen verschillen in microbiome soortenrijkdom na verloop van tijd (Figuur 4). Deze Alfa en beta diversiteit analyses worden uitgevoerd op basis van de door de gebruiker gedefinieerde categorieën vermeld in het toewijzingsbestand, maar cijfers en statistieken over algemene taxonomische informatie ook worden gegenereerd voor alle monsters (Figuur 5).
Figuur 1 : Microbiome sequencing werkstroom. Belangrijke stappen van de microbiome rangschikking workflow worden weergegeven met call-outs voor de bibliotheek voorbereiding en sequencing analyse stappen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Rarefaction curven voor reeks tellen normalisatie. Rarefaction curven, weergegeven voor elk cohort van teken, hebben betrekking op waargenomen OTU graven bemonstering van inspanning. Foutbalken zijn aanwezig als gevolg van monsters binnen elke koppeling aanwezig, en zij geven één standaarddeviatie. De diepte van een volgorde moet worden geselecteerd op of voorbij het punt waar de curve stabiel wordt om de volledige diversiteit van OTUs adequaat te vangen. Hier, passend een diepte van de sequencing van 2.000 luidt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Principal coördineren analyse per koppeling. Ongewogen Unifrac belangrijkste coördinaat analyse (PCoA) toont de variatie in microbiome samenstelling tussen larvale teken uit verschillende klauwen en van volwassenen. Elk gegevenspunt duidt een individuele teek. Dit cijfer wordt automatisch gegenereerd door het QIIME "core_diversity_analyses.py" script. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Alpha diversiteit boxplots door belichtingstijd. Boxplots beeltenis OTU telt voor omgevingsblootstelling groepen Toon variatie in microbiële diversiteit na verloop van tijd. Dit cijfer wordt automatisch gegenereerd door het QIIME "core_diversity_analyses.py" script. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : De microbiële identificatie phylum-niveau voor de koppeling een. Microbiome samenstelling voor individuele teek monsters van koppeling een wordt weergegeven op het niveau van de stam. Deze figuur, evenals de beknopte informatie op lager taxonomisch niveau, wordt automatisch gegenereerd door het QIIME "core_diversity_analyses.py" script. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Metrisch | Definitie | Onze resultaten (MiSeq V3) | Optimaal voor MiSeq V3 | Optimaal voor HiSeq snelle modus | |
| PF leest | Aantal sequencing leest de kuisheid filter passeren. Een lees passeert filter als niet meer dan 1 basis oproep kuisheid waarde lager is dan 0,6 in de eerste 25 cycli heeft | 12,885,713 | 14-16 miljoen | 600 miljoen | |
| Foutenpercentage | Percentage van basenparen genaamd onjuist tijdens een cyclus, gebaseerd op leest uitgelijnd met PhiX controle | 3,28 ±0.10 | * Afhankelijk van de waarden voor andere statistieken | * Afhankelijk van de waarden voor andere statistieken | |
| % ≥Q30 | Percentage van de honken schoon met een Q score ≥ 30, met vermelding van een base oproep nauwkeurigheid van 99,9% | 68.94 | > 70% | > 80% | |
| Cluster PF (%) | Percentage van clusters passeren de kuisheid filter. | 85.61 ±0.81 | 90% | 90% | |
| Dichtheid | Dichtheid van clusters op de flowcell - een belangrijke metriek voor datakwaliteit en -uitvoer | 552 ± 35 cluster/mm ^ 2 | 1200-1400 cluster/mm ^ 2 | 850-1000 cluster/mm ^ 2 | |
Tabel 1: Belangrijkste prestatieparameters voor NGS uitvoer. Gebruiker gegevens- en het doeldomein waarden gemeld gebaseerd op de sequencing platform en reagens kit gebruikt in deze studie (Tabel van materialen) en een 25% rangschikken controle toevoeging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Volgende-generatie sequentiebepaling van het 16S rRNA is geworden van een standaardaanpak voor microbiële identificatie en de studie van de invloed van vector microbiomes op pathogen transmissie ingeschakeld. Het protocol hier geschetste details het gebruik van deze methode te onderzoeken van de microbiële Gemeenschap vergadering in I. pacificus, een vector soorten voor de ziekte van Lyme; het kan echter gemakkelijk worden toegepast om te bestuderen van andere geleedpotigen vector of teek soorten.
Inderdaad, 16S rRNA volgorde van microbiome analyse is gebruikt in grote lijnen te bestuderen van de microbiomes van vectoren met inbegrip van tseetseevliegen29,30,31, muggen en psyllids. Andere beschikbare methoden voor microbiële identificatie in vectoren omvatten microscopie, kweken en histologische kleuring. Deze methoden mogelijk geschikter dan sequencing als het doel is om te identificeren en beschrijven een roman microbe (microscopie), om te evalueren van het effect van antimicrobiële geneesmiddelen (cultuur), of lokaliseren specifieke en bekende microben in de vector (histologische kleuring). Echter, deze methoden lijden aan lage specificiteit, detectie en schaalbaarheid, en zijn dus minder geschikt is voor het identificeren van de volledige Gemeenschap van microben binnen een vector of de vector microbiome onder variërende ecologische en experimentele karakterisering voorwaarden. Omgekeerd, high-throughput sequentiebepaling van het 16S rRNA gen identificatie van lage-overvloed en niet-culturable bacteriën mogelijk maakt, biedt hoge resolutie en detectie gezien de uitgebreide naslagwerk databases en kan hoge replicatie afhankelijk van op de behoeften van de dekking.
Terwijl 16S rRNA sequencing nu veel voor microbiële identificatie gebruikt wordt, is deze techniek niet zonder beperkingen. Hoofdzakelijk, kan microbiële besmetting verbergen interpretatie van de resultaten van de sequencing en verwarren biologische zin32. Bovendien, gezien het gebruik van universele bacteriële primers en gevoeligheid te laag beginnend concentraties die inherent aan 16S rRNA sequencing zijn, microbiële verontreiniging is gemeenschappelijk32. Bronnen van besmetting zijn PCR reagentia, DNA-extractie-kits, laboratorium oppervlakken, en de huid en kleding van onderzoekers33,34,35. De effecten van microbiële verontreinigingen kunnen geminimaliseerd worden door het werken in een steriele testomgeving, met behulp van de negatieve controles en technische replicaten, en het houden van een record van alle kits en reagentia36gebruikt.
Naast bacteriële besmetting, kan lage kwaliteit sequencing uitvoer sterk belemmeren de bruikbaarheid van de microbiome rangschikking gegevens. Kwaliteit van de gegevens kan worden beoordeeld door een aantal run statistieken zoals het aantal leest passeren filter, het percentage van luidt boven een Q-score (een maatregel van de voorspelde kans van fout in base-roept) van 30 en de cluster dichtheid. Waarden voor deze statistieken zal variëren op basis van het aantal monsters worden uitgevoerd, de sequencing-systeem, de reagens cartridge en het percentage sequencing besturingselement dat wordt gebruikt, maar optimale waarden op basis van run voorwaarden zijn online beschikbaar. Met name is cluster dichtheid, het aantal bibliotheek clusters op een bepaald vlak van de cel van de stroom vóór sequencing, een belangrijke parameter voor het optimaliseren van de kwaliteit van de gegevens en de opbrengst. Zowel boven als onder-clustering kunnen gegevens output verminderen en leiden tot monsters worden uitgesloten van de analyse als gevolg van onvoldoende dekking. Slechte cluster dichtheid weerspiegelt vaak onnauwkeurig bibliotheek kwantificering; Dus, moet worden gewaakt voor het uitvoeren van de juiste DNA-opschonen, individuele monster kwantificering en kwantificering van de hele bibliotheek.
Ervan uitgaande dat hoge datakwaliteit en rendement worden bereikt, vormen uiteenlopende benaderingen in de data-analyse gebruikt om statistische uitdagingen van grote datasets te overwinnen een andere beperking van deze aanpak. Er bestaan bijvoorbeeld meerdere methoden tot adres variatie in Lees graven tussen de monsters. Rarefaction, waarbij de sub bemonstering leest aan het bereiken van een gelijke rangschikking diepte over alle monsters, wordt vaak gebruikt maar heeft ondergaan kritiek onlangs voor het verspillen van grote hoeveelheden gegevens en de subjectieve selectie van minimale sequencing diepte37 3938, ,. Cumulatieve Som schalen (CSS), welke houdt alle volgorde leest maar weegt hen op basis van het cumulatieve totaal van graven binnen een bepaalde percentiel, is ontwikkeld als een alternatieve techniek. Echter, CSS is niet wijd goedgekeurd als gevolg van de relatieve nieuwheid en het bevestigde nut van rarefaction voor normalisatie voorafgaand aan analyses van de aanwezigheid/afwezigheid.
Standaard data analyse procedures ontbreken ook voor behandeling volgorde leest in de negatieve controles en het registratienummer van lage overvloed leest. Zoals vermeld, wordt sequencing negatieve controles gegenereerd op basis van de DNA-extractie-stap aanbevolen om te onderscheiden van echte vector microbiome bewoners van microbiële verontreinigingen tijdens de analyse. Nog, is een standaard en statistisch strenge benadering voor het identificeren en filteren van vermoedelijke contaminanten ontbreekt. Een gemeenschappelijke aanpak is om OTUs aanwezig in de negatieve controles van alle monsters. Deze methode kan echter al te conservatief aangezien veel van deze microben die waarschijnlijk afkomstig van echte monsters in plaats van kit reagentia40 zijn. Een andere gemeenschappelijke techniek omvat groepering microben bij < 1% aanwezig in een "zeldzame" categorie in de veronderstelling dat microbiële verontreinigingen zeldzaam in echte monsters8,41 zijn. Echter, deze methode mag verwijderen waar vector microben die aanwezig zijn op lage abundanties, met name wanneer de microbiome wordt gedomineerd door een endosymbiont, zoals te zien in I. pacificus en I. holocyclus7,42. In deze gevallen, zou opsporen van zeldzame microben vereisen dieper sequencing, ontwikkelt inleidingen die een remmende werking van de versterking van de endosymbiont tijdens de amplicon PCR42of computationeel het verwijderen van de endosymbiont tijdens sequentieanalyse 7. keuze tussen de verschillende methoden naar adres zeldzame en verontreinigingen OTUs biedt de mogelijkheid voor subjectiviteit en bias in microbiome data-analyse, die de mogelijkheid beperken kan om de resultaten van studies met elkaar vergelijken.
De keuze van referentiedatabank, nodig voor het toewijzen van taxonomie en fylogenetische informatie aan volgorde leest, presenteert een nieuwe gelegenheid om divergentie- en subjectiviteit. Terwijl de taak van een volgorde leest uit een variabele gene regio betreffende een geïdentificeerde bovenliggende genoom inherent uitdagend is, is een betrouwbare referentie database cruciaal voor nauwkeurige fylogenetische toewijzing. Meerdere databases opgedoken om deze uitdaging, zoals SILVA43, Greengenes44, RDP-45en46van de NCBI. SILVA is de grootste van het 16S gebaseerde taxonomieën, maar SILVA, evenals RDP, alleen de taxonomische informatie tot op het niveau van het geslacht. Greengenes informatie van de soorten-niveau en is opgenomen in de metagenomic analyses pakketten zoals QIIME, maar het is niet bijgewerkt in meer dan vier jaar. NCBI, terwijl niet een primaire bron voor de informatie van het taxonomische, biedt dagelijks bijgewerkte classificaties van gebruiker-voorgelegd sequenties, maar het is uncurated. Terwijl selectie onder de databases is meestal afhankelijk van de behoeften van de gebruikers met betrekking tot resolutie, dekking en valuta, heeft een grote invloed op de fylogenetische toewijzing en downstream analyse47,48. Consensus tussen onderzoekers over welke referentie-database te gebruiken is dus absoluut noodzakelijk voor het vermijden van extra bias in de analyses.
Standaard aanpak van deze uitdagingen gegevensverwerking zal waarschijnlijk ontstaan als 16S rRNA sequencing een steeds vaker voorkomende techniek wordt. Aanhoudende reducties sequencing kosten en tijd zal deze methode verder populariseren. Het toegenomen gebruik van deze technologie kan dieper onderzoek naar de samenstelling en de ecologie van vector microbiomes onder uiteenlopende omstandigheden. Kennis van de vector microbiome biologie is nog in de kinderschoenen, zijn deze soorten beschrijvende studies een kritieke eerste stap voorafgaand aan pogingen om de invloed van de microbiome als een middel van vectorbestrijding. Echter, om echt te begrijpen de rol van de microbiome in pathogen transmissie, microbiële identificatie moet gepaard gaan met kennis van de functionele rol van deze microben. RNA sequencing en transcriptomic benaderingen, waarbij mapping en kwantificeren van de genexpressie, gevolgtrekkingen inschakelen in de functionele rol van microben maar vereisen diepe sequencing en volledig geassembleerd genoom van doelsoorten. Deze uitdagingen, computerhulpmiddelen te voorspellen van functionele samenstelling van 16S rRNA sequencing gegevens zijn onlangs ontwikkeld maar niet algemeen worden aangenomen nog49te omzeilen. De ontwikkeling van dergelijke tools, evenals de ecologische theorievorming, koppeling tussen microbiële identiteit en de functionele rol binnen de vectoren zal leiden het nut van het 16S rRNA sequencing gegevens in vector microbiome studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door National Science Foundation verleent aan A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
- Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
