Summary
Hier präsentieren wir ein Next Generation Sequencing-Protokoll für die 16 s rRNA-Sequenzierung die Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in Vektoren ermöglicht. Bei dieser Methode wird die DNA-Extraktion, Amplifikation und Barcoding der Proben durch PCR, Sequenzierung auf eine-Durchflusszelle und Bioinformatik Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen.
Abstract
In den letzten Jahrzehnten haben vektorübertragene Krankheiten wieder aufgetaucht und mit alarmierender Rate, wodurch erhebliche Morbidität und Mortalität weltweit ausgebaut. Effektive und allgemein verfügbaren Impfstoffe sind für einen Großteil dieser Erkrankungen erfordern die Entwicklung von neuartigen Krankheit Minderungsstrategien fehlen. Zu diesem Zweck beinhaltet eine vielversprechende Möglichkeit der Seuchenbekämpfung targeting Vektor Mikrobiom, die Gemeinschaft der Mikroben bewohnen den Vektor. Der Vektor Microbiome spielt eine Schlüsselrolle in der Erreger Dynamik und Manipulationen das Mikrobiom zu reduzierten Vektor Fülle oder Erreger-Übertragung für eine Handvoll vektorübertragene Krankheiten geführt haben. Allerdings erfordert die Umsetzung dieser Erkenntnisse in Krankheit Steuer-und Regelanwendungen ein gründliches Verständnis der Vektor mikrobielle Ökologie, historisch durch unzureichende Technologie in diesem Bereich begrenzt. Das Aufkommen der Next Generation Sequencing Ansätze hat schnelle, hochparallele Sequenzierung von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften ermöglicht. Ausrichtung auf das hoch konserviert 16 s rRNA-gen hat Charakterisierungen von Mikroben in Vektoren unter unterschiedlichen ökologische und experimentellen Bedingungen erleichtert. Diese Technik beinhaltet die Verstärkung der 16 s rRNA-gen, Probe Barcoding über Laden Proben auf einer Durchflusszelle für die Sequenzierung, PCR und Bioinformatik Ansätze Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen. Art oder Gattung-Ebene Kennung für eine hohe Anzahl von Wiederholungen kann in der Regel durch diesen Ansatz, damit umgehen Herausforderungen mißraten Entdeckung, Auflösung und Ausgabe von traditionellen Kultivierung, Mikroskopie oder histologische Färbung erreicht werden Techniken. Daher ist diese Methode eignet sich gut für die Charakterisierung von Vektor Mikroben unter unterschiedlichen Bedingungen aber kann nicht aktuell informieren über mikrobielle Funktion, Stelle innerhalb des Vektors oder Reaktion auf Antibiotika-Behandlung. Insgesamt ist 16 s Next Generation Sequencing eine leistungsfähige Technik für die Identität und Rolle der Vektor Mikroben in der Dynamik der Krankheit besser zu verstehen.
Introduction
Das Wiederaufleben und Verbreitung von vektorübertragenen Krankheiten in den letzten Jahrzehnten Bedrohung eine ernsthafte für globale Gesundheit von Mensch und Natur. Wirksame Impfstoffe fehlen für die meisten dieser Krankheiten, und Bemühungen sind durch die komplexe biologische Natur der Vektoren und Vektor-Wirt Interaktionen behindert. Verständnis der Rolle der mikrobielle Wechselwirkungen innerhalb eines Vektors bei der Übertragung der Erreger können für die Entwicklung von neuen Strategien, die diese Herausforderungen umgehen. Insbesondere müssen die Wechselwirkungen zwischen Vektor-assoziierten mikrobielle Kommensalen, Symbionten und Krankheitserreger, genannt das Mikrobiom wichtige Konsequenzen für die Übertragung der Erreger. Überwältigende Beweise jetzt unterstützt diese Behauptung mit Beispiele, die zeigen einer Verbindung zwischen dem Vektor Mikrobiom und Kompetenz für Krankheiten wie Malaria, Zika-Virus und Lyme-Borreliose1,2,3. Allerdings erfordert die Umsetzung dieser Erkenntnisse in Strategien zur Seuchenbekämpfung weit mehr Detailwissen über die Struktur, Funktion und Herkunft der Vektor mikrobiome. Identifizierung und Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft unter unterschiedlichen ökologische und experimentellen Bedingungen Vektor bilden einen wichtigen Weg in die Zukunft in diesem Bereich.
Ein Verfahren zur Identifizierung von mikrobiellen Bewohner eines Vektors Erreger erfolgt hier durch die Verwendung von westlichen schwarzen Beinen Zecke, Ixodes Pacificus, eine Vektor-Spezies von der Lyme-Borreliose-Erreger Borrelia Burgdorferi. Während Zecken mehr Arten von menschlichen Krankheitserreger als andere Arthropoden Hafen, ist relativ wenig über die Biologie und Gemeinschaft Ökologie der Tick mikrobiome4bekannt. Es ist offensichtlich, dass Zecken beherbergen eine Vielzahl von Viren, Bakterien, Pilze und Protozoen die Kommensalen, Endosymbionts und transiente mikrobiellen Bewohner5,4enthalten. Vorherige Arbeit hat gezeigt, dass starke Schwankungen der Ixodes mikrobiome Geographie, Spezies, Geschlecht, Lebensphase und Blutmehl Quelle6,7,8zugeordnet. Jedoch die Mechanismen, die diese Variante unbekannt bleiben und detailliertere Untersuchungen über den Ursprung und Montage dieser mikrobiellen Gemeinschaften zu rechtfertigen. Zecken können Mikroben durch vertikale Übertragung erwerben Kontakt mit Gastgebern und Aufnahme aus der Umgebung durch die Luftlöcher, Mund und anal Pore9. Verständnis der Faktoren, die Gestaltung der Ausbildung und Entwicklung der Zecke Mikrobiom, ist speziell der relative Anteil der vertikalen und ökologischen Übertragung, wichtig für das Verständnis der natürlichen Muster und Variationen in tick Microbiome Vielfalt und wie interagieren diese Gemeinschaften während der Übertragung der Erreger, mit möglichen Anwendungen, Krankheit oder Vektor-Steuerung.
Leistungsstarke Molekulare Techniken, wie Next Generation Sequencing, jetzt zur Identifizierung von mikrobieller Gemeinschaften existieren und können eingesetzt werden, um Vektor mikrobiome unter verschiedenen Umwelt- oder experimentellen Bedingungen zu charakterisieren. Vor dem Aufkommen dieser Hochdurchsatz-Sequenzierung Ansätze die Identifizierung von Mikroben stützte sich überwiegend auf Mikroskopie und Kultur. Während Mikroskopie eine schnelle und einfache Technik ist, sind morphologische Methoden zur Identifizierung von Mikroben von Natur aus subjektiv und grob und begrenzt durch geringe Empfindlichkeit und Erkennung10. Kultur-basierte Methoden sind im großen und ganzen für mikrobielle Identifizierung verwendet und können zur Anfälligkeit von Mikroben für Droge-Behandlungen-11zu ermitteln. Allerdings leidet diese Methode auch geringe Empfindlichkeit, wie es hat geschätzt, dass weniger als 2 % der ökologischen Mikroben in einem Labor Einstellung12kultiviert werden können. Histologische Färbung Ansätze sind auch eingesetzt worden, zu erkennen und bestimmte Mikroben innerhalb von Vektoren zu lokalisieren, Untersuchungen von verschiedenen Taxa Ausschüttungen innerhalb der Zecke zu aktivieren und Hypothesen über mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren. Allerdings sind Vorkenntnisse der mikrobiellen Identität für die Auswahl der geeigneten Flecken, was diesen Ansatz ungeeignet für mikrobielle Charakterisierung und Identifizierung erforderlich. Darüber hinaus histologische Färbung ist eine sehr zeitaufwendige und mühsame Prozess und skaliert nicht gut für große Probenmengen. Traditionelle Molekulare Ansätze wie Sanger-Sequenzierung sind ähnlich in ihrer Empfindlichkeit und Erkennung von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften begrenzt.
Sequenzierung der nächsten Generation ermöglicht die schnelle Identifizierung von Mikroben aus einer großen Anzahl von Proben. Das Vorhandensein von standard Markergene und Referenz Datenbanken weitere ermöglicht verbesserte taxonomische Auflösung oft auf die Gattung oder Art. Kleinen Untereinheit ribosomalen RNAs sind häufig verwendet, um dieses Ziel zu erreichen mit 16 s rRNA ist die am häufigsten aufgrund des Vorhandenseins von konservierten und Variable Regionen innerhalb des Gens, so dass für die Erstellung von universellen Primer mit einzigartigen Amplifikate für jede bakterielle Art13,14. Dieser Bericht beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung von Taxa in der Zecke Microbiome durch 16 s rRNA Next Generation Sequencing. Dieses Protokoll betont insbesondere die Schritte bei der Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung. Mehr Details über die Sequenzierung verallgemeinert und Bioinformatik Schritte vorgesehen sind, da gibt es eine Vielzahl von Plattformen Sequenzierung und Analyse-Programme verfügbar, jeweils mit umfangreicher Dokumentation. Die Machbarkeit dieses Ansatzes Next Generation Sequencing zeigt eine Untersuchung der mikrobiellen Gemeindeversammlung innerhalb eine wichtige Krankheit Vektor zuweisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kreuzen Sie Sammlung und Oberfläche Sterilisation
- Durch Ziehen einer 1 m2 weiße Tuch über einen Tick-assoziierten Lebensraum, Entfernen von Zecken Zecken an Wirtsarten, oder Aufzucht im Labor15,16Zecken sammeln. Verwenden Sie feine Pinzette, um Zecken zu manipulieren und bei-80 ° c aufbewahren
- Zecken in die einzelnen PCR-Rohre und entfernen Oberflächenverunreinigungen durch Vortexen für 15 s sukzessive mit 500 μL von Wasserstoffperoxid (H2O2), 70 % Ethanol und DdH2O.
- Legen Sie die Zecken in einem neuen PCR-Röhrchen und an der Luft trocknen lassen.
- In diesem Rohr mechanisch stören Tick Gewebe durch Zerkleinern die Zecken mit einem Mörser und Stößel (in dieser Studie verwendet), mit kleinen Perlen in einen Wulst-Schläger oder die Zecke mit einem Skalpell auseinander schneiden.
(2) DNA-Reinigung
- Reinigen Sie die DNA aus einzelnen Zecken, gemäß die Anweisungen in den im Handel erhältlichen DNA-Extraktion Kit. Für ein Endvolumen von 100 μL eluieren.
Hinweis: Siehe Abbildung 1 für eine Übersicht der Schritte 2,2-2,8. Alternative Extraktionsmethoden sind Phenol-Chloroform Extraktion17,18, Ethanol Niederschlag19oder Extraktion mit einem Komplexbildner Material20,21. - Erfolgreiche DNA-Reinigung mit einem Fluorometer oder Spektralphotometer zu bestätigen. Verwenden Sie für Fluorometry 10 μL der DNA Schablone in einem 190 μL doppelsträngigen DNA-Assay. Die erwartete Rendite ist 0,1 bis 1,0 ng/μl22. Spektrophotometrie verwenden Sie 1 μl DNA Schablone in einer Nukleinsäure-Quantifizierung. Die erwartete A260/280 Verhältnis ist etwa 1,823.
- Wenn nicht sofort zu Verstärkung, speichern die Proben bei-20 ° C.
3. 16 s rRNA-gen-Verstärkung
- Einrichten der Amplifikate PCR in eine 27,5 μL Reaktion mit: 5 μL jeder Grundierung auf 1 μM; 12.5 μL des im Handel erhältlichen PCR-Mix; und 5 μl DNA extrahiert aus einzelnen Zecken bei einer Konzentration von 5 ng/μl.
Hinweis: Verwenden Sie die folgenden Primer für die Amplifikation der hypervariablen V3-V4 Region der 16 s rRNA gen13:
5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3',
5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3' - Rohre in einem Thermocycler programmiert für verschieben: eine erste Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 25 Zyklen 1) 95 ° c für 30 s, (2) 57 ° C für 30 s, (3) 72 ° C für 30 s; eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 5 min; und einen letzten Halt bei 10 ° C.
- Das erledigt die PCR ist, visualisieren Sie das PCR-Produkt durch das Laden von 4-6 μL/Probe auf einem 1,5 % Agarosegel. Suchen Sie nach einer Band bei 460 bp um Verstärkung zu bestätigen.
Hinweis: Amplicon PCR-Produkt möglicherweise nicht auf dem Gel sichtbar wenn die probenkonzentration zu niedrig ist (< 10 ng). Grundierung Dimer Anwesenheit ist häufig in geringer Konzentration Proben. Wenn andere nicht-Zielorganismen Bands vorhanden sind, passen Sie die Anlasstemperatur oder verringern Sie die Anzahl der Zyklen. - Wenn nicht sofort zu Reinigung, speichern Sie die Proben bei 4 ° c
(4) 16 s Amplikons Reinigung
- Mit einem neuen PCR-Schlauch für jede Probe, kombinieren Sie das PCR-Produkt mit DdH2O 60 μL insgesamt zu erhalten. Führen Sie für Proben mit geringer DNA-Konzentrationen PCR Amplifikate in dreifacher Ausfertigung zu reduzieren Verstärkung Voreingenommenheit und bündeln die Proben zu konzentrieren.
- Raumtemperatur und Wirbel, die sie vor dem Gebrauch gut verleihen Sie PARAMAGNETISCHE Perlen.
- 60 μl der Probe 48 μL der paramagnetischen Beads hinzufügen und 5 min. Platz die Rohre auf einem magnetischen Gestell für 5 min bis Lösung wird klar inkubieren. Den überstand zu entfernen.
Hinweis: Diese Perle Konzentration zielt auf die Beseitigung der Grundierung Dimere (< 60 bp). Passen Sie ggf. die Wulst-Konzentration um andere unspezifische Streifenbildung zu entfernen. - Mit Röhren auf magnetische Gitter hinzufügen 500 μL von frisch zubereiteten 80 % EtOH. Sofort nachdem alle Röhren EtOH hinzugefügt, pipette Flüssigkeit. Entfernen Sie nicht die Perlen. Die EtOH hinzufügen und entfernen noch einmal zu wiederholen.
- An der Luft Trocknen der Proben um überschüssige EtOH durch offengelassen die Rohre auf dem magnetischen Rack für 5 Minuten, oder bis kleine Risse sichtbar in die Perlen sind zu entfernen.
- Fügen Sie 20 μl TE-Puffer und inkubieren Sie die Proben aus der Magnet bei Raumtemperatur für ca. 5-10 min.
- Setzen Sie die Rohre wieder auf den Magneten. Sobald die Perlen und Flüssigkeit getrennt werden, übertragen des Überstands zu einem frischen Schlauch der gereinigte PCR-Produkt zu erhalten.
- (Optional) Visualisieren Sie das Produkt bestätigen erfolgreiche Amplikons Reinigung durch das Laden von 4-6 μL/Probe auf einem 1,5 % Gel. 460 bp-Band sollte sichtbar sein, und es dürfen keine Grundierung-Dimer.
- Wenn nicht sofort zum Index PCR Verfahren, speichern Sie die Proben 4 ° C.
5. Probieren Sie Barcoding und Reinigung
- Jede Probe weisen Sie einzigartige Grundierung Kombinationen auswählen, entweder vorwärts oder rückwärts Primer, oder beides, aus einem handelsüblichen Bibliothek Index Bausatz zu.
Hinweis: Eindeutig beschriften Proben kann zur Differenzierung nach Sequenzierung. Kits bieten in der Regel genügend Primer um 96-384 Proben zu sequenzieren. - Proben mit PCR in eine 25 μL Reaktion mit 2,5 μL jeder Grundierung (N7xx und S5xx), 12,5 μL der im Handel erhältlichen PCR master-Mix, 5 μL der DdH2O und 2,5 μL der gereinigten Amplikons Produkt zuordnen Sie der dual Primer oder Indizes.
- Die Rohre in einem Thermocycler programmiert für verschieben: eine erste Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 8-14 Zyklen 1) 95 ° c für 30 s, (2) 55 ° C für 30 s, (3) 72 ° C für 30 s; eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 5 min; und einen letzten Halt bei 10 ° C.
- Das erledigt die PCR ist, visualisieren Sie das PCR-Produkt durch das Laden von 4-6 μL/Probe auf einem 1,5 % Agarosegel. Suchen Sie nach einer Band bei 550 bp um Verstärkung zu bestätigen.
Hinweis: Verwenden Sie die Visualisierung Ergebnisse Index PCR Radfahren Bedingungen zu informieren. Senken Sie die Zyklenzahl zu unspezifischen Bindung verringern oder erhöhen Sie die Anzahl der Zyklus um sichtbare Bänder für jede Probe zu erhalten. - Wiederholen Sie die Aufräumarbeiten, in Schritt 4 aufgeführt. Zur Vermeidung von Verdünnung während der Aufräumarbeiten durchführen Sie Index PCR in zweifacher Ausfertigung und bündeln Sie das Produkt hier.
- Wenn nicht sofort zu Bibliothek Quantifizierung und Normalisierung, speichern Sie die Proben bei 4 ° C.
6. Bibliothek Quantifizierung und Normalisierung
- Die Konzentration der einzelnen gereinigten, Barcode-Produkte aus Schritt 5.5 mit einem Fluorometer oder Spektralphotometer zu schätzen (siehe Punkt 2.2). Verdünnen Sie die Proben in TE-Puffer, Konzentrationen von ca. 13:00 zu erhalten.
Hinweis: Bibliothek Quantifizierung ist notwendig, die Probe laden Konzentration empfohlen für die Sequenzierung Plattform zu erreichen. Bibliothek-Quantifizierung wird erreicht durch qPCR, sondern schätzen die probenkonzentration vor qPCR spart Zeit und Reagenzien. 13:00-Konzentration wird empfohlen, maximieren Sie die Genauigkeit der Bibliothek Quantifizierung, denn dies ist die mittlere Konzentration der qPCR-Standards in der Quantifizierung Kit24zur Verfügung gestellt. - Führen Sie qPCR 6.0 μL qPCR-master-Mix (aus Bibliothek Quantifizierung Kit) 2.0 μl DdH2O und 2.0 μl der Probe oder Standard mit 10 μL Reaktion. Führen Sie jede Probe und standard in dreifacher Ausführung für höhere Genauigkeit und Präzision. Führen Sie jedes Beispiel auf drei oder mehr Verdünnung Ebenen (zB., 12:01, 1 Uhr und 22:00 für geschätzte ab Konzentrationen) um genaue Quantifizierung zu gewährleisten.
Hinweis: Detaillierte Informationen über die zur Verfügung gestellten Grundierungen und Standards variieren basierend auf der Quantifizierung Kit verwendet und sind in den Datenblättern der Produkte zur Verfügung. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Quantifizierung Kit in dieser Studie verwendet. - Verschieben Sie die qPCR Platte oder Rohre zu einem Echtzeit-PCR-Instrument für programmiert: eine erste Denaturierung von 95 ° C für 5 min; 35 Zyklen 1) 95 ° c für 30 s und (2) 60 ° C für 45 s; und eine Dissoziation Schritt 1) 95 ° c für 15 s, (2) 60 ° C für 30 s und 3) 95 ° C für 15 s.
- Berechnen Sie den Mittelwert ab Konzentration für jede Probe mit der Quantifizierung Werte aus der qPCR-Ergebnisse und die Probe Verdünnung verwendet.
Hinweis: zum Beispiel eine durchschnittliche Konzentration von 14:00 für eine Probe verdünnt 1: 100.000 ergibt eine original Start Konzentration von 200 nM. Wenn keiner der Verdünnung Ebenen für eine gegebene Probe innerhalb des Bereichs der standard Kurven liegt, können Quantifizierung Ergebnisse ungenau sein; in diesem Fall passen Sie die Verdünnung und durchführen Sie qPCR erneut. - Jede gereinigten, Barcode-Probe 4 verdünnen nM in TE-Puffer, basierend auf den durchschnittlichen Konzentrationen in Schritt 7,5 berechnet.
Hinweis: zum Beispiel für eine durchschnittliche probenkonzentration von 200 nM, verdünnte die Probe 01:50 in TE-Puffer 4 nM Konzentration zu erreichen. Die präzise probenkonzentration variiert je nach der Sequenzierung System und Reagenz-Kit verwendet. Finden Sie im Benutzerhandbuch Sequenzierung System für die empfohlenen Konzentration. - Erstelle die kombinierte Bibliothek indem du gleiche Volumina (in der Regel 5 bis 10 μl) aller einzelnen Bibliotheken in ein einzelnes Rohr.
Hinweis: wie alle Proben in einer 4 nM-Konzentration sollte gleiche Volumina hinzufügen einen gleichen Konzentration aller Proben in der gepoolten Bibliothek erreicht. - Wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.4 auf der kombinierten Bibliothek, 4 nM-Konzentration zu bestätigen.
- Die kombinierte Bibliothek Konzentration berechnen und verdünnen oder neu bilden die endgültige, gepoolte Bibliothek mit Tris-Puffer bei Bedarf um 4 zu erreichen nM.
- Wenn nicht sofort zu probenbeladung, speichern die Proben bei-20 ° C. Führen Sie die Sequenzierung laufen kurz nach Quantifizierung, Verlust oder Änderungen an DNA-Konzentration während der Lagerung zu minimieren.
(7) Bibliothek Denaturierung und Verdünnung und Sequenzierung (am selben Tag durchführen)
- Die 4 nM kombinierte Bibliothek aus Schritt 6,9 mit NaOH zu denaturieren.
Hinweis: Diese letzte Bibliothek vorbereitende Schritte für jede Sequenzierung System variieren. Lesen Sie in der Sequenzierung System Bedienungsanleitung für mehr detaillierte und aktualisierte Protokolle. Neue Benutzer müssen wahrscheinlich auf die Nutzung der Plattform Sequenzierung ausgebildet werden oder können ihre Bibliotheken zu einer Kern-Sequenzierung-Anlage senden. - Verdünnen der denaturierten Bibliothek, um die gewünschte Belastung Konzentration mit Hilfe des Puffers in der Sequenzierung Reagenz-Kit (Table of Materials) zur Verfügung gestellt.
Hinweis: Optimale Beladung Konzentrationen variieren je nach Sequenzierung System und in der Regel reichen von 1-250 pM25. - Denaturieren Sie und verdünnen Sie die Sequenzierung Kontrolle.
Hinweis: Hinzufügen eines Steuerelements Sequenzierung für Sequenzierung Probleme, die aus niedrigen Vielfalt Bibliotheken korrigiert. Denaturieren Sie die Sequenzierung Steuerung mit NaOH und verdünnen Sie, die gleiche Konzentration wie die Bibliothek. - Kombinieren Sie die Bibliothek und Sequenzierung Kontrolle.
Hinweis: Das Verhältnis der Sequenzierung Kontrolle kombinierte Bibliothek hängt die Bibliothek Vielfalt und Sequenzierung System verwendet, aber es ist in der Regel 1:1-26. - Laden Sie die kombinierte Bibliothek und Sequenzierung Kontrolle Mischung auf die Sequenzierung Durchflusszelle.
8. Amplikons Sequenzanalyse
- Bewerten Sie den Gesamterfolg des Laufs durch die Untersuchung der laufen Metriken auf die Cloud-computing-Umgebung entspricht der Sequenzierung System verwendet.
Hinweis: Die laufen Metriken, wie z.B. Anzahl der Sequenzierung liest, variiert je nach Sequenzierung Plattform und Reagenz-Kit verwendet. Zielwerte für gängige Sequenzierung Systeme sind in Tabelle 1aufgeführt. - Laden Sie die rohen Sequenzierungsdaten und gewünschte Bioinformatik open-Source Software, Quantitative Einblicke in mikrobiellen Ökologie (QIIME)27 oder Mothur28.
Hinweis: Beide QIIME und Mothur sind Open Source und kostenlos zum Download bereit. Detaillierte Anweisungen zur Verwendung dieser Programme können online eingesehen werden und sind für erstmalige Nutzer ausreichend detailliert. Die folgenden Schritte geben einen umfassenden Überblick über eine Bioinformatik-Pipeline in QIIME durchgeführt. Vertrautheit mit Python ist nicht notwendig, aber erleichtert die Umsetzung der folgenden Skripte - Erstellen und Validieren der Zuordnungsdatei verwenden das Skript "validate_mapping_file.py" in QIIME.
Hinweis: Die Zuordnungsdatei enthält alle Metadaten, die Datenanalyse, einschließlich Proben-ID, Amplifikate Grundierung Sequenzen und Beispielbeschreibung durchführen. Der Überprüfungsschritt prüft, ob alle erforderliche Daten in das richtige Format eingegeben wurden. - Demultiplex und Filtern von Sequenzen mit dem Skript "split_libraries.py" (Abbildung 1).
Hinweis: Dieses Skript weist Barcodes liest zu Proben, basierend auf der Index-Grundierung-Kombinationen und Probe-IDs geben Sie in der Zuordnungsdatei. Es führt auch mehrere Qualität Filtern Schritte zur Kontrolle für die Sequenzierung Fehler basierend auf benutzerdefinierten trenngrenzen für minimale Qualitätsfaktor, Sequenz Längen und Ende trimmen. - Sequenzen mit dem Skript "pick_open_references_otus.py" weisen Sie operative taxonomische Einheiten (OTUs zu).
Hinweis: In diesem Schritt werden Sequenzen gegen eine Referenzsammlung Sequenz basierend auf einem Schwellenwert der Identität (in der Regel 97 %) zusammengefasst. Liest, die die Referenz-Sequence-Auflistung nicht übereinstimmen, werden gegeneinander zusammengefasst. De Novo und geschlossen-Referenz OTU Kommissionierung Optionen sind auch verfügbar, aber Open-Referenz Kommissionierung von QIIME Entwickler empfohlen. - Normalisieren Sie die OTU-Tabelle mithilfe des Skripts "alpha_rarefaction.py" oder "normalize_table.py".
Hinweis: Dieser Schritt korrigiert für Variation in Spalte Summen oder gesamtsequenz liest pro Probe, die durch moderne Sequenziertechnologien entstehen. Normalisierung kann mit traditionellen Verdünnung durchgeführt werden oder durch alternative Methoden wie z. B. die kumulative Summe Skalierung. - Führen Sie mehrere Alpha-Diversität, Beta-Diversität und taxonomische Zusammensetzung Vielfalt Analysen auf einmal mit dem "core_diversity_analysis.py"-Skript.
Hinweis: Alternativ diese Analysen können ausgeführt werden separat mit der einzelnen Scripte (z. B. "alpha_diversity.py").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Insgesamt 42 Zecken aus drei separaten Ei Kupplungen und zwei Umweltexposition Perioden 0 und 2 Wochen im Boden für die Sequenzierung Microbiome verarbeitet wurden. Jeder Behandlungsgruppe, als ein einziges Kupplung und Belichtung Mal enthalten 6-8 Tick Proben zu replizieren. Diese verarbeiteten Tick-Extrakte wurden auf einer nächsten Generation Sequenzer geladen und ergab 12,885,713 gepaart Ende liest Filter übergeben. Waren in diesem Lauf 3 Negativkontrollen aus dem Extraktionsschritt, insgesamt 211.214 mal gelesen (im vorherigen Zählung enthalten) nachgeben. Weiter sind geführte Qualitätsmetriken zusammen mit optimalen Werten für jede Metrik in Tabelle 2aufgeführt. Verdünnung Kurven, die Anzahl der OTUs pro Probe, erklärt, dass eine Sequenzierung Tiefe oder Anzahl der eindeutige Sequenz liest pro Probe, 2.129 liest ausreichen, um die Vielfalt der mikrobiellen Gemeinschaft (adäquat zu erfassen wäre Sequenzierung Aufwand betreffen ( Abbildung 2). Verdünnung wird variieren je nach Probentyp und muss individuell ermittelt werden, für jede Sequenzierung ausgeführt. Nach rarefying in dieser Tiefe, konnten 1.714 OTUs über alle Proben mit einem Durchschnitt von 93,3 ± 4,3 OTUs pro Probe identifiziert werden. Zur Vermeidung von nachgelagerten Analyse wurden Fragestellungen aus spärlichen Matrizen und mögliche Verunreinigungen, alle OTUs nicht in mindestens eine Probe bei ≥ 1 % Fülle gefunden zu entfernen in einem seltenen Kategorie "Allgemein" zusammengefasst. Weiter, das Decontam Paket in R wurde eingesetzt, um OTUs überrepräsentiert in Negativkontrollen im Vergleich zu realen Proben zu identifizieren und diese OTUs wurden aus nachgelagerten Analyse entfernt.
Gemeinschaft Ökologie Analysen wurden durchgeführt mit der QIIME Vielfalt Analysen Workflow um die Arten von alpha-Diversität, Beta-Diversität und Taxonomie Zusammensetzung Vielfalt Ausgabe generiert, mit einer einfachen Bioinformatik-Pipeline zu demonstrieren. Z. B. gewichtete und ungewichtete Unifrac wichtigsten Koordinaten Analysen entstanden mit dem Skript "core_diversity_analyses.py", und sie offenbart räumliche Cluster-Bildung des larvalen Zecken basierend auf Kupplung Identität (Abbildung 3). BOXPLOTS OTU zählt zu unterschiedlichen Umweltbelastungen, die oft auch durch dieses Skript generiert wurden, zeigen Unterschiede in Microbiome Artenreichtum im Laufe der Zeit (Abbildung 4). Diese Alpha- und Beta-Vielfalt-Analysen werden basierend auf den frei definierbaren Kategorien in der Zuordnungsdatei durchgeführt, aber zahlen und Statistiken auf allgemeine taxonomische Informationen entstehen auch für alle Proben (Abbildung 5).
Abbildung 1 : Microbiome Sequenzierung Workflow. Wichtige Schritte des Mikrobiom Sequenzierung Workflows werden mit Beschriftungen für die Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung Analyseschritte angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Verdünnung Kurven für Sequenz zählen Normalisierung. Verdünnung Kurven, gezeigt für jede Kohorte von Zecken, betreffen beobachteten OTU zählt Probenahme Aufwand. Fehlerbalken durch wiederholte Proben in jede Kupplung vorhanden sind, und sie bezeichnen eine Standardabweichung. Eine Sequenzierung Tiefe sollte gewählt werden, bei oder über den Punkt, wo die Kurve stabil um die ganze Vielfalt der OTUs adäquat zu erfassen wird. Hier erscheint eine Sequenzierung Tiefe von 2.000 liest angemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Principal Analyse von Kupplung zu koordinieren. Ungewichtete Unifrac wichtigsten koordinieren Analyse (HKoA) zeigt Variation in Microbiome Zusammensetzung zwischen den Larven Ticks von verschiedenen Kupplungen und von Erwachsenen. Jeder Datenpunkt bezeichnet einen einzelnen Tick. Diese Zahl wird durch das QIIME "core_diversity_analyses.py" Script automatisch generiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Alpha Vielfalt Boxplots durch Belichtungszeit. BOXPLOTS Darstellung OTU zählt Umweltexposition Gruppen zeigen Variationen in mikrobiellen Diversität im Laufe der Zeit. Diese Zahl wird durch das QIIME "core_diversity_analyses.py" Script automatisch generiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Phylum-Ebene mikrobielle Identifizierung für Kupplung eine. Microbiome Zusammensetzung für einzelne Zecke Proben aus einer Kupplung ist auf der Phylum Ebene angezeigt. Diese Abbildung, sowie zusammenfassende Informationen auf den unteren taxonomischen Ebenen wird automatisch generiert, durch das QIIME-Skript "core_diversity_analyses.py". Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Metrik | Definition | Unsere Ergebnisse (MiSeq V3) | Optimal für MiSeq V3 | Optimal für Leseweite Rapid-Modus | |
| PF liest | Anzahl der Sequenzierung liest den Keuschheit Filter übergeben. Lesen Sie übergibt Filter, wenn nicht mehr als 1 Basis Anruf Keuschheit Wert unter 0,6 in den ersten 25 Zyklen hat | 12,885,713 | 14 Millionen | 600 Millionen | |
| Fehlerquote | Anteil der Basenpaare genannt nicht falsch während eines Zyklus basierend auf Lesevorgänge auf PhiX Kontrolle ausgerichtet | 3.28 ±0.10 | * Werte für andere Metriken hängt | * Werte für andere Metriken hängt | |
| % ≥Q30 | Anteil der Basen mit einem Q Score ≥ 30, Angabe einer Basis Anruf Genauigkeit von 99,9 % | 68,94 | > 70 % | > 80 % | |
| Cluster PF (%) | Prozentsatz von Clustern den Keuschheit Filter übergeben. | 85.61 ±0.81 | 90 % | 90 % | |
| Dichte | Dichte von Clustern auf der Durchflusszelle - eine wichtige Metrik für die Qualität der Daten und Ausgabe | 552 ± 35 Cluster/mm ^ 2 | 1200-1400 Cluster/mm ^ 2 | 850-1000 Cluster/mm ^ 2 | |
Tabelle 1: Wichtige Leistungsparameter für die NGS Ausgabe. Daten und Ziel Benutzerwerte berichtete über die Sequenzierung Plattform und Reagenz-Kit verwendet in dieser Studie (Table of Materials) und eine 25 % Sequenzierung Kontrolle Ergänzung basierend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA geworden eine Standardmethode für die mikrobielle Identifizierung und aktiviert die Studie wie Vektor mikrobiome Erreger-Übertragung auswirken. Die hier beschriebene Protokoll beschreibt die Verwendung dieser Methode zu untersuchen, mikrobielle Gemeindeversammlung in I. Pacificus, ein Vektor-Arten für Lyme-Borreliose; Allerdings kann es leicht angewendet werden, um andere Zeckenarten oder Arthropoden Vektor Arten zu studieren.
In der Tat wurde 16 s rRNA Sequenzierung für Microbiome Analyse im großen und ganzen zur mikrobiome von Vektoren wie Mücken, Psyllids und Tsetsefliegen29,30,31zu studieren. Andere Methoden zur Verfügung für mikrobielle Identifizierung innerhalb von Vektoren umfassen Mikroskopie, Kultivierung und histologische Färbung. Diese Methoden möglicherweise besser geeignet als Sequenzierung, wenn das Ziel zu identifizieren und beschreiben eine neuartige Mikrobe (Mikroskopie), bewerten die Wirkung von antimikrobiellen Medikamenten (Kultur) oder bestimmte und bekannte Mikroben innerhalb des Vektors (histologische Färbung) zu lokalisieren. Doch diese Methoden leiden unter niedrigen Spezifität, Erkennung und Skalierbarkeit und somit eignen sich weniger für die volle Gemeinschaft der Mikroben innerhalb eines Vektors zu identifizieren oder die Vektor Microbiome unter unterschiedlichen ökologischen und experimentelle Charakterisierung Bedingungen. Im Gegensatz dazu Hochdurchsatz-Sequenzierung der 16 s rRNA-Gen ermöglicht die Identifikation von niedrig-Fülle und nicht kultivierbarer Bakterien sorgt für hohe Auflösung und Erkennung, die angesichts der umfassenden Referenzdatenbanken und bieten hohe Replikation je auf die Bedürfnisse der Abdeckung.
Während 16 s rRNA Sequenzierung für mikrobielle Identifizierung jetzt weit verbreitet ist, ist diese Technik nicht ohne Einschränkungen. Grundsätzlich kann mikrobieller Kontamination obskuren Interpretation der Sequenzierung Ergebnisse und biologische Bedeutung32verwirren. Darüber hinaus angesichts der Verwendung von universal bakterielle Primern und Empfindlichkeit zu niedrig ab Konzentrationen, die 16 s rRNA Sequenzierung innewohnen, mikrobieller Kontamination ist gemeinsame32. Kontaminationsquellen gehören PCR Reagenzien, DNA-Extraktion-Kits, Labor Flächen und der Haut und Kleidung Forscher33,34,35. Die Auswirkungen der mikrobiellen Verunreinigungen minimiert werden, durch die Arbeit in einer sterilen Laborumgebung Negativkontrollen mit technischen repliziert und Aufzeichnungen über alle Kits und Reagenzien36verwendet.
Neben mikrobiellen Kontamination kann minderwertige Sequenzierung Ausgabe die Verwendbarkeit des Mikrobiom Sequenzierungsdaten erheblich behindern. Die Qualität der Daten kann durch eine Reihe von geführten Metriken, die unter anderem die Anzahl der Lesevorgänge, vorbei an den Prozentsatz der liest über einen Q-Score (ein Maß für die vorhergesagten Fehlerwahrscheinlichkeit in Basis-Aufruf) von 30 und Cluster-Dichte-Filter bewertet werden. Werte für diese Kennzahlen variieren basierend auf der Anzahl der Stichproben ausgeführt, die Sequenzierung System, die reagenzkassette und die Prozent Sequenzierung Steuerelement verwendet, aber optimale Werte anhand der geführten Bedingungen sind online verfügbar. Insbesondere ist Cluster Dichte, die Anzahl der Bibliothek-Cluster auf einer bestimmten Ebene der Durchflusszelle vor der Sequenzierung, ein wichtiger Parameter zur Optimierung der Datenqualität und Ertrag. Sowohl über als auch unter clustering können verringern Datenausgabe und Proben von Analyse aufgrund unzureichender Deckung ausgeschlossen. Schlechte Cluster Dichte reflektiert häufig ungenau Bibliothek Quantifizierung; Daher sollte darauf geachtet werden, um korrekte DNA-clean-Up, einzelnen Probe Quantifizierung und ganze Bibliothek Quantifizierung durchzuführen.
Vorausgesetzt, dass hohe Datenqualität und Ertrag erzielt werden, stellen divergierende Ansätze in der Datenanalyse verwendet, um statistische Herausforderungen von großen Datasets eine weitere Einschränkung dieses Ansatzes. Beispielsweise gibt es mehrere Methoden zur Adresse Variation in Lesen Sie zählt zwischen Proben. Verdünnung, die miteinbezieht, Sub-sampling liest eine Tiefe gleich Sequenzierung über alle Proben zu erreichen, wird häufig verwendet, aber wurde Kritik vor kurzem für große Datenmengen und die subjektive Auswahl der minimale Sequenzierung Tiefe37 zu verschwenden ,38,39. Kumulative Summe Skalierung (CSS), welche hält alle Sequenz liest aber wiegt sie auf Basis der kumulierten Summe zählt innerhalb einer gegebenen Perzentil als eine alternative Technik entwickelt wurde. Allerdings hat die CSS aufgrund seiner relativen Neuheit und bestätigten Dienstprogramms Verdünnung für Normalisierung vor der Anwesenheit/Abwesenheit Analysen keine breite Akzeptanz.
Standard-Daten-Analyse-Verfahren fehlen auch für handling Sequenz liest in Negativkontrollen und unterscheiden diese von niedrigen Fülle mal gelesen. Wie bereits erwähnt, empfiehlt Sequenzierung Negativkontrollen generiert aus der DNA Extraktionsschritt zu helfen, wahre Vektor Microbiome Bewohner von mikrobiellen Verunreinigungen während der Analyse zu unterscheiden. Allerdings fehlt ein standard und statistisch strenger Ansatz zur Identifizierung und vermuteten Schadstoffe filtern. Ein gemeinsamer Ansatz ist OTUs vorhanden in den Negativkontrollen aus allen Proben zu entfernen. Diese Methode kann jedoch zu konservativ sein, da viele dieser Mikroben wahrscheinlich aus realen Proben statt Kit Reagenzien40stammen. Eine weitere gängige Methode beinhaltet Gruppierung Mikroben bei < 1 % in eine "seltene" Kategorie unter der Annahme, dass mikrobielle Verunreinigungen in realen Proben8,41selten sind. Diese Methode kann jedoch wahre Vektor Mikroben entfernen, die bei geringen Häufigkeiten anwesend sind, vor allem wenn das Mikrobiom durch eine Endosymbiont beherrscht wird, wie im I. Pacificus und I. Holocyclus7,42. In diesen Fällen müsste seltenere Mikroben erkennen tiefer Sequenzierung, Grundierungen, die die Verstärkung der Endosymbiont während der Amplifikate PCR42hemmen die Entwicklung oder rechnerisch Entfernen der Endosymbiont während der Sequenzanalyse 7. Auswahl unter den verschiedenen Methoden, um seltene Adresse und Verunreinigung OTUs schafft die Möglichkeit für Subjektivität und Voreingenommenheit Microbiome Datenanalyse, wodurch die Fähigkeit, Ergebnisse in Studien vergleichen eingeschränkt werden kann.
Die Wahl der Referenzdatenbank, notwendig für Reihenfolge liest, Taxonomie und eine phylogenetische Informationen zuordnen stellt eine weitere Möglichkeit für die Abweichung und Subjektivität. Während im Zusammenhang mit Sequenz liest aus einer Variable gen Region ein identifizierten Elternteil-Genom von Natur aus anspruchsvollen obliegt, ist eine zuverlässige Referenzdatenbank für genaue phylogenetische Zuordnung von entscheidender Bedeutung. Mehrere Datenbanken sind entstanden, um dieser Herausforderung, wie SILVA43, Greengenes44, RDP45und NCBI46. SILVA ist die größte der 16 s-basierte Taxonomien, aber SILVA sowie RDP, nur bis zur Ebene der Gattung taxonomische informiert. Greengenes Spezies-Ebene informiert und ist in metagenomische Analysen Pakete wie QIIME, aber es wurden in vier Jahren nicht aktualisiert. NCBI, während keine primäre Quelle für taxonomische Informationen bietet tägliche aktualisierte Klassifikationen von Benutzern eingereichte Sequenzen, aber es ist unkuratierte. Während Auswahl unter den Datenbanken in der Regel auf die Bedürfnisse der Nutzer hinsichtlich Auflösung, Abdeckung und Währung abhängt, hat es einen erheblichen Einfluss auf phylogenetische Zuordnung und nachgelagerte Analyse47,48. Konsens unter den Ermittler über die zu verwendende Referenzdatenbank ist somit unerlässlich für die Vermeidung von zusätzlichen Verzerrungen bei Analysen.
Standardansätze für diese Datenverarbeitung Herausforderungen entstehen wahrscheinlich als 16 s rRNA Sequenzierung ein zunehmend verbreitetes Verfahren wird. Anhaltenden Rückgang der Sequenzierung Kosten und Zeit werden diese Methode weiter popularisieren. Die verstärkte Nutzung dieser Technologie ermöglicht tiefere Untersuchungen über die Zusammensetzung und die Ökologie des Vektors mikrobiome unter verschiedenen Bedingungen. Wie wissen über Vektor Microbiome Biologie noch in den Kinderschuhen steckt, sind diese Arten von beschreibenden Studien ein entscheidender erster Schritt, die vorhergehenden Versuche das Mikrobiom als ein Mittel der Vektorregelung nutzen können. Jedoch muss um wirklich zu verstehen, die Rolle des Mikrobiom Erreger Transmission, mikrobielle Identifizierung mit Wissen über die funktionelle Rolle dieser Mikroben gekoppelt werden. RNA-Sequenzierung und transkriptomischen Ansätze, die Zuordnung und Quantifizierung der Genexpression, ermöglichen Rückschlüsse in die funktionale Rolle der Mikroben aber erfordern Tiefe Sequenzierung und komplett montiert Genome der Zielarten. Umgehen diese Herausforderungen, Berechnungswerkzeuge um funktionale Zusammensetzung aus 16 s rRNA Sequenzierungsdaten vor kurzem entwickelt worden, aber keine breite Akzeptanz noch49zu prognostizieren. Die Entwicklung solcher Werkzeuge, wie auch die ökologische Theorie, Verknüpfung von mikrobiellen Identität und die funktionale Rolle in Vektoren das Dienstprogramm der 16 s rRNA Sequenzierungsdaten in Vektor Microbiome Studien erhöht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Foundation vergibt an A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
- Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
