Summary
여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.
Abstract
최근 수십 년간, 벡터 품 어진 질병이 다시 등장 있고 속도, 상당한 병 적 상태와 사망률 세계를 일으키는 놀라운 확대. 효과적이 고 널리 사용 가능한 백신은 소설 질병 완화 전략의 개발을 필요로 하는이 질병의 대부분 부족 합니다. 이 위해, 질병 통제의 한 유망한 애비뉴 벡터 미생물, 미생물 거주 벡터의 커뮤니티를 대상으로 포함 됩니다. 벡터 미생물 병원 체 역학에서 중추적인 역할을 담당 하 고는 미생물의 조작 벡터 품 어진 질병의 소수에 대 한 감소 된 벡터 풍부 또는 병원 체 전송 이어졌다. 그러나, 질병 제어 응용 프로그램에 이러한 결과 번역 벡터 미생물 생태학, 역사적으로이 분야에서 부족 한 기술에 의해 제한에 대 한 철저 한 이해를 필요 합니다. 차세대 시퀀싱 방법의 출현은 다양 한 미생물 커뮤니티의 급속 한, 높은 병렬 시퀀싱을 활성화 하 고 있다. 높은 보존 16S rRNA 유전자를 대상으로 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 내의 미생물의 characterizations 촉진 했다. 이 기술은 PCR, 시퀀싱, 흐름 셀에 로드 샘플 통해 샘플 바코드, 16S rRNA 유전자의 증폭과 생물 정보학 계통 발생 정보 시퀀스 데이터에 맞게 접근. 종 또는 속 수준 id 복제의 높은 숫자에 대 한 일반적으로 따라서 낮은 검출, 확인, 및 전통적인 경작, 현미경, 또는 조직학에 게 얼룩이 지기에서 출력의 문제를 우회 하는이 접근을 통해 달성 될 수 있다 기술입니다. 따라서,이 방법은 다양 한 조건 하에서 벡터 미생물을 특성화 하는 데 적합 하지만 현재 미생물 함수, 벡터, 또는 항생제 치료에 반응 내에서 위치 정보를 제공할 수 없습니다. 전반적으로, 16S 차세대 시퀀싱 정체성과 역할에서 질병 역학 벡터 미생물의 더 나은 이해를 위한 강력한 기술입니다.
Introduction
부활과 벡터 품 어진 질병의 확산을 최근 몇 십년 간에서 글로벌 인간과 야생 동물의 건강에 심각한 위협이 포즈. 이 질병의 대부분에 대 한 효과적인 백신 부족 하 고 제어 노력 벡터와 벡터-호스트 상호 작용의 복잡 한 생물 학적 특성에 의해 방해. 병원 체 전송에서 벡터 내 미생물 상호 작용의 역할을 이해 이러한 문제를 회피 하는 새로운 전략의 개발에 대 한 수 있습니다. 특히, 벡터 관련 미생물 공생, symbionts, 병원 균, 미생물로 사이 상호 작용 병원 체 전송에 대 한 중요 한 결과가 있을 수 있습니다. 압도적인 증거를 이제 벡터 미생물과 질병 말라리아, Zika 바이러스, 그리고 라임 질병1,2,3에 대 한 능력 사이의 링크를 보여 주는 예제와 함께이 단언을 지원 합니다. 그러나, 질병 통제 예방 전략으로 이러한 결과 번역 구조, 기능, 및 벡터 microbiomes의 기원에 대 한 훨씬 더 상세한 이해를 요구 한다. 식별 및 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 미생물 커뮤니티의이 분야에서 앞으로 중요 한 경로 구성 합니다.
병원 체 벡터의 미생물 주민 확인을 위한 절차는 여기 서양 검은 다리 진드기, Ixodes pacificus, Lyme 질병 병원 체의 보렐 리아 burgdorferi종의 벡터를 이용 하 여 제공 됩니다. 틱 항구 다른 절지동물 보다 인간 병원 체의 더 많은 종류의, 하는 동안 상대적으로 작은 틱 microbiomes4의 생물학과 사회 생태에 대 한 알려져 있다. 그것은 분명 진드기 바이러스, 박테리아, 균 류, protozoans 공생, endosymbionts, 및 과도 미생물 주민5,4의 다양 한 배열을 항구. 이전 작업 Ixodes microbiomes 지리, 종, 성별, 생활 단계, 및 혈액 식사 소스6,,78와 관련 된 강력한 변화를 설명 했다. 그러나,이 변화를 기본 메커니즘 알 수와 자세한 출처의 조사와 이러한 미생물 커뮤니티의 보증 합니다. 틱 수직 전송을 통해 미생물을 수집할 수 있습니다 호스트 및 spiracles, 입, 항문 기 공9를 통해 환경에서 글귀와 접촉. 초기 형성 및 개발 틱 미생물의 형성 요인 이해, 특히 수직 및 환경 전송의 상대적 기여도 자연 패턴 및 눈금의 변화를 이해 하기 위한 중요 한 미생물 다양성 및 이러한 지역 사회 병원 체 전송, 질병 또는 벡터 제어 가능한 응용 프로그램 중 상호 작용 하는 방법.
차세대 시퀀싱 등 강력한 분자 기법, 지금 식별 미생물 지역 사회에 대 한 존재 하 고 다양 한 환경 또는 실험 조건에서 벡터 microbiomes 하 채택 될 수 있다. 이러한 높은 처리량 시퀀싱 접근의 출현 전에 미생물의 식별 현미경 검사 법 그리고 문화에 주로 의존 했다. 현미경 검사 법은 신속 하 고 쉽게 기술, 미생물을 식별 하기 위한 형태학 메서드는 본질적으로 주관적이 고 굵고 낮은 감도와 감지10제한. 문화 기반 방법 미생물 식별을 위해 광범위 하 게 사용 하 고 약물 치료11미생물의 감수 성을 결정 하는 데 사용 수 있습니다. 그러나,이 방법은 또한 겪고 있다 낮은 감도에서 환경 미생물의 2% 미만12설정 실험실에서 경작 될 수 추정 되었습니다. 조직학 얼룩 접근 감지 하 고 벡터 내에서 특정 미생물을 지역화, 틱, 내 다양 한 taxa 배포판의 조사 활성화 미생물 상호 작용에 대 한 가설을 공부 고용 또한 있다. 그러나, 미생물 정체성의 사전 지식을 적절 한 얼룩, 미생물 특성화 및 식별에 어울리지이 이렇게 만들기를 선택 하는 데 필요 합니다. 또한, 조직학 얼룩 매우 시간이 오래 걸리는, 힘 드는 프로세스 이며 큰 샘플 크기 위해 잘 확장 되지 않습니다. 생어 시퀀싱은 마찬가지로 그들의 감도 다양 한 미생물 커뮤니티의 탐지에서 제한 등 전통적인 분자 접근.
다음-세대 시퀀싱 샘플의 많은 수에서 미생물의 급속 한 식별 수 있습니다. 표준 표식 유전자 및 참조 데이터베이스 추가 하면 종종 단계로 속 또는 종의 분류학 해상도 향상. 작은 소 단위 ribosomal RNAs는 자주 16S rRNA 유전자 보존 및 가변 지역의 존재로 인해 가장 일반적인 각 세균에 대 한 독특한 amplicons 보편적인 뇌관의 창조에 대 한 허용으로이 목표를 달성 하는 데 사용 됩니다. 종13,14. 이 보고서는 16S rRNA 차세대 시퀀싱을 통해 틱 미생물에 taxa를 식별 하기 위한 절차를 자세히 설명 합니다. 특히,이 프로토콜 시퀀싱에 대 한 샘플 준비 단계를 강조 합니다. 더는 시퀀싱에 대 한 내용을 일반화 및 생물 정보학 단계 제공 됩니다, 현재 사용할 수 있는 다양 한 시퀀싱 플랫폼 및 분석 프로그램으로 각각의 광범위 한 기존 문서. 이 다음-세대 시퀀싱 방법의 전반적인 타당성은 주요 질병 벡터 내 미생물 커뮤니티 어셈블리의 조사에 적용 하 여 설명 했다.
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Protocol
1. 틱 컬렉션 및 표면 살 균
- 틱 틱 관련 서식, 진드기 제거에 1 m2 흰 헝겊을 끌어 호스트 종, 또는 실험실15,16틱 양육 수집. 미세 집게를 사용 하 여 진드기를 조작-80 ° c.에서 그들을 저장 하
- 개별 PCR 튜브에 틱 하 고 15 vortexing에 의해 표면 오염 물질을 제거 연속적으로 과산화 수소 (H2O2), 70% 에탄올 및 ddH2오 500 μ s
- 새로운 PCR 튜브에 진드기를 놓고 건조 하도록 허용 합니다.
- 이 튜브에 기계적으로 박격포와 유 봉 (이 연구에 사용), 작은 구슬 구슬 때리는에 사용 하 여 진드기를 분쇄 하 여 틱 조직을 방해 또는 틱 메스와 떨어져 절단.
2. DNA 정화
- 상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트에 제공 된 지침에 따라 개별 틱에서 DNA를 정화. 100 μ의 최종 볼륨을 elute.
참고: 단계 2.2-2.8의 개요 그림 1 을 참조 하십시오. 대체 추출 방법에는 페 놀-클로 프롬 적 출17,18, 에탄올 강수량19또는 추출 chelating 소재20,21포함 됩니다. - 성공 DNA 정화 fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 확인 합니다. Fluorometry, 190 μ 이중 가닥 DNA 분석 결과에서 DNA 템플렛의 10 μ를 사용 합니다. 예상된 수익률은 0.1-1.0 ng/μ22. 분 광 광도 학, 핵 산의 정량화에 DNA 템플렛의 1 μ를 사용 합니다. 예상된 A260/280 비율 약 1.823이다.
- 증폭, 즉시 진행-20 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우
3. 16S rRNA 유전자 증폭
- 포함 하는 27.5 μ 반응에서 PCR amplicon 설정: 1 μ M;에서 각 뇌관의 5 μ 상용의 12.5 μ PCR 혼합; 그리고 5 ng/μ 농도에 개별 틱에서 추출한 DNA의 5 μ.
참고 다음 프라이 머를 사용 하 여 16S rRNA 유전자13의 하이퍼 V3-V4 영역의 확대를 위한.:
5 '-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'
5 '-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3' - 튜브에 대 한 프로그래밍 thermocycler 이동: 95 ° c 3 분;에 대 한 초기 변성 30 대 1) 95 ° C의 25 주기 s, 30 ° C 2) 57 s, 30 대 3) 72 ° C s; 5 분; 72 ° C에서 최종 확장 그리고 10 ° c.에 최종 보류
- PCR 완료 되 면, 4-6 μ/샘플 1.5 %agarose 젤에 로드 하 여 PCR 제품을 시각화. 460에서 밴드를 찾고 증폭을 확인 하는 혈압.
참고: Amplicon PCR 제품 보이지 않을 수 있습니다 젤에 샘플 농도 너무 낮은 경우 (< 10 ng). 뇌관 이합체 존재 낮은 농도 샘플에서 일반적 이다. 다른 비 목표 밴드 경우 어 닐 링 온도 조정 하거나 사이클의 수를 감소 합니다. - 정화, 즉시 진행 4 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우
4. 16 Amplicon 정화
- 각 샘플에 대 한 새로운 PCR 튜브를 사용 하 여, 케이블의 PCR 제품을 ddH2O 총 60 μ를에 결합. 낮은 DNA 농도와 샘플에 대 한 증폭 바이어스를 줄이고 집중 샘플 수영장을 3 중 amplicon PCR을 수행 합니다.
- 실내 온도 소용돌이 그들 사용 하기 전에 잘 상자성 구슬가지고.
- 샘플의 60 μ에 상자성 구슬의 48 μ를 추가 하 고 5 분 장소 솔루션은 때까지 5 분에 대 한 자석 선반에 튜브 취소에 대 한 품 어. 제거는 상쾌한.
참고:이 구슬 농도 뇌관 이합체 (< 60 bp)의 제거 대상. 필요한 경우, 다른 일반적인 밴딩을 제거 하 비드 농도 조정 합니다. - 마그네틱 랙 튜브, 추가 갓 80%의 500 μ EtOH. 모든 튜브에 EtOH를 추가한 후 즉시 액체 밖으로 플라스틱. 비즈를 제거 하지 마십시오. EtOH 추가 및 제거 한 번 더 반복 합니다.
- 5 분, 또는 작은 균열 구슬에 표시 됩니다 때까지 자석 선반에 튜브를 열어두고 여 초과 EtOH를 제거 하는 예제 건조
- TE 버퍼의 20 μ를 추가 하 고 5-10 분 동안 실내 온도에 자석에서 샘플을 품 어.
- 자석에 다시 튜브를 놓습니다. 일단 구슬 및 액체 분리, PCR 제품을 청소를 얻으려면 신선한 튜브는 상쾌한 전송.
- (선택 사항) 4-6 μ/샘플 1.5% 젤에 로드 하 여 성공적인 amplicon 정화를 확인 하려면 제품을 시각화. 460 bp 밴드 표시, 고 아무 뇌관 이합체 이어야 한다.
- 샘플을 저장 색인 PCR에 즉시 진행 하지, 4 ° c.
5. 샘플 바코드 및 정화
- 앞으로 또는 반전 뇌관, 또는 상업적으로 사용 가능한 라이브러리 인덱스 키트에서 둘 다를 선택 하 여 각 샘플을 독특한 뇌관 조합을 할당 합니다.
참고: 고유 라벨 샘플 시퀀싱 후 차별화 수 있습니다. 키트는 일반적으로 충분 한 뇌관 96-384 샘플 시퀀스를 제공 합니다. - 듀얼 프라이 머, 또는 인덱스, 각 뇌관 (N7xx 및 S5xx), 12.5 μ 상용 PCR 마스터 믹스, ddH2O, 5 μ 그리고 청소 amplicon 제품의 2.5 μ의 2.5 μ를 포함 하는 25 μ 반응에서 PCR을 수행 하 여 샘플을 첨부 합니다.
- 튜브에 대 한 프로그래밍 thermocycler 이동: 95 ° c 3 분;에 대 한 초기 변성 8-14 주기 1) 95 ° C 30에 대 한 s, 30 대 2) 55 ° C s 30 3) 72 ° C s; 5 분; 72 ° C에서 최종 확장 그리고 10 ° c.에 최종 보류
- PCR 완료 되 면, 4-6 μ/샘플 1.5 %agarose 젤에 로드 하 여 PCR 제품을 시각화. 550에 밴드를 찾고 증폭을 확인 하는 혈압.
참고: 인덱스 PCR 순환 상태를 시각화 결과 사용 합니다. 일반적인 바인딩 완화 또는 각 샘플에 대 한 보이는 밴드를 사이클 수를 증가 사이클 수를 낮춥니다. - 4 단계에서 나열 된 청소 절차를 반복 합니다. 정리 하는 동안 희석을 방지 하려면 중복에서 인덱스 PCR을 수행 하 고 제품 여기 수영장.
- 즉시 라이브러리 정량화 및 정규화를 진행 4 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우
6. 도서관 정량화 및 정규화
- 단계는 fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 5.5에서 각 순화, 바코드 제품의 농도 추정 (단계 2.2 참조). 오후 1 시 약의 농도를 테 버퍼에서 샘플을 희석.
참고: 라이브러리 정량화는 시퀀싱 플랫폼에 권장 하는 농도 로딩 하는 샘플을 달성 하는 데 필요한. 도서관 부 량 정량을 통해 이루어집니다 하지만 시 약 및 시간 저장 정량 이전 샘플 농도 추정 합니다. 이 정량화 키트24에서 제공 하는 정량 기준의 평균 농도 1 오후 농도 라이브러리 정량화의 정확도 극대화 하기 위해 좋습니다. - (라이브러리 정량화 kit)에서 정량 마스터 믹스, ddH2O, 2.0 μ 및 샘플 또는 표준의 2.0 μ의 6.0 μ를 포함 하는 10 μ 반응에서 정량 Pcr를 수행 합니다. 각 샘플 및 큰 정확도 정밀도 대 한 3 중에서 표준 실행 합니다. 세 개 이상의 희석 수준에서 각 샘플을 실행 (예., 오후 0 시 1 분, 1 오후, 그리고 10 오후 예상된 시작 농도 대 한) 정확한 정량화를 위해.
참고: 제공 된 뇌관 및 표준에 대 한 자세한 내용은 정량화 키트 사용에 따라 달라 집니다 및 제품 기술 데이터 시트에서 사용할 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 정량화 키트에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. - 프로그램에 대 한 실시간 PCR 악기를 정량 플레이트 또는 관 이동:; 5 분 동안 95 ° C의 초기 변성 1) 95 ° C의 35 주기 30 s와 45 2) 60 ° C에 대 한 s; 그리고 15 대 1) 95 ° C의 분리 단계 s, 30 대 2) 60 ° C, 및 3) 95 ° C 15에 대 한 s.
- 시작 하는 농도 정량 결과에서 얻은 부 량 값과 사용 하는 샘플 희석 수준을 사용 하 여 각 샘플에 대 한 평균을 계산 합니다.
참고: 예를 들어 샘플 희석 1:100,000에 대 한 2pm의 평균 농도 수익률 200의 원래 시작 농도 nM. 부 량 결과; 정확 하지 않을 수 있습니다 주어진된 샘플에 대 한 희석 레벨의 범위 내에 표준 곡선의 경우, 어떤 경우에, 희석 레벨을 조정 하 고 다시 정량 Pcr을 수행. - 4 각 순화, 바코드 샘플 희석 단계 7.5에서에서 계산한 평균 농도에 따라 TE 버퍼에 nM.
참고: 예를 들면, 200의 평균 샘플 농도 nM, 희석 테에 샘플 1시 50분 4 nM 농도 달성 하기 위해 버퍼. 정확한 샘플 농도 시퀀싱 시스템 및 시 약 키트를 사용에 따라 달라 집니다. 권장된 농도 대 한 시퀀싱 시스템 사용자 설명서를 참조 하십시오. - 단일 관으로 모든 개별 라이브러리의 동등한 볼륨 (일반적으로 5-10 μ)을 추가 하 여 결합 된 라이브러리를 만듭니다.
참고: 모든 샘플 4 nM 농도에 있어야 해 서 동일한 볼륨 추가 풀링된 라이브러리에서 모든 샘플의 동등한 농도를 달성 한다. - 6.2-6.4 4 nM 농도 확인 하는 결합 된 라이브러리에 단계를 반복 합니다.
- 결합 된 라이브러리 농도 계산 하 고 희석 또는 다시 4를 달성 하기 위해 필요한 Tris 버퍼를 사용 하 여 최종, 풀링된 라이브러리 구성 nM.
- 즉시 샘플 로드를 진행-20 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우 손실 또는 변경 내용을 저장 하는 동안 DNA 농도 최소화 하기 위해 정량화 직후 실행 시퀀싱을 수행 합니다.
7. 도서관 변성 및 희석, 고 시퀀싱 실행 (같은 날에 수행)
- NaOH와 단계 6.9에서에서 4 nM 결합된 라이브러리 변성
주: 각 시퀀싱 시스템에 대 한 최종 라이브러리 준비 단계 다. 보다 상세 하 고 업데이트 된 프로토콜에 대 한 시퀀싱 시스템 사용자 가이드를 참조 하십시오. 새로운 사용자가 가능성이 시퀀싱 플랫폼의 사용에 훈련 될 필요가 있을 것 이다 또는 그들의 라이브러리 코어 시퀀싱 시설에 보낼 수 있습니다. - 시퀀싱 시 약 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 버퍼를 사용 하 여 원하는 로드 농도에 변성된 라이브러리를 희석.
참고: 최적의 로드 농도 시퀀싱 시스템 및 일반적으로 1-250 오후25범위에서 다릅니다. - 변성 고 시퀀싱 제어를 희석.
참고: 낮은 다양성 라이브러리에서 발생 하는 시퀀싱 문제에 대 한 수정 시퀀싱 제어를 추가 합니다. NaOH를 사용 하 여 시퀀싱 제어를 변성 하 고 도서관으로 동일한 농도에 희석. - 라이브러리 및 시퀀싱 제어를 결합 한다.
참고: 결합 된 라이브러리를 시퀀싱 제어의 비율 라이브러리 성과 시퀀싱 시스템 사용에 따라 달라 집니다 하지만 일반적으로 1:126. - 결합 된 라이브러리 및 시퀀싱 흐름 셀에 시퀀싱 제어 혼합물을 로드 합니다.
8. Amplicon 시퀀스 분석
- 해당 시퀀싱 시스템 사용 하는 클라우드 컴퓨팅 환경에 실행된 통계를 검사 하 여 실행의 전반적인 성공을 평가 합니다.
참고: 연속 읽기 수 등 실행된 통계 시퀀싱 플랫폼 및 시 약 키트 사용에 따라 달라 집니다. 일반적인 시퀀싱 시스템에 대 한 목표 값은 표 1에 나열 됩니다. - 원시 시퀀싱 데이터를 다운로드 하 고 원하는 생물 정보학 오픈 소스 소프트웨어, 양적 통찰력 미생물 생태학 (QIIME)27 또는 Mothur28.
참고: 둘 다 QIIME와 Mothur는 오픈 소스 무료 다운로드. 이러한 프로그램을 사용 하 여 자세한 내용은 온라인 찾을 수 있습니다와 처음 사용자를 위한 상세한 충분히 있습니다. 다음 단계는 QIIME에서 실시 하는 생물 정보학 파이프라인에 대 한 광범위 한 개요를 제공 합니다. Python 친숙 하지만 필요 하지 않습니다 다음 스크립트의 구현을 용이 하 게 한다 - 만들고 QIIME에 "validate_mapping_file.py" 스크립트를 사용 하 여 매핑 파일의 유효성을 검사 합니다.
참고: 매핑 파일 샘플 ID, amplicon 뇌관 시퀀스 및 샘플 설명을 포함 한 데이터 분석을 수행 하는 데 필요한 모든 메타 데이터를 포함 합니다. 유효성 검사 단계를 적절 한 형식에 필요한 모든 데이터가 입력 되었습니다 확인 합니다. - Demultiplex 고 "split_libraries.py" 스크립트 (그림 1)를 사용 하 여 시퀀스를 필터링 합니다.
참고:이 스크립트 샘플 인덱스 뇌관 조합에 따라 바코드 읽기를 할당 하 고 샘플 Id 매핑 파일에서 입력. 그것은 또한 여러 품질 필터링 단계 오류 기반으로 사용자 정의 최소 품질 평가 점수, 시퀀스 길이, 및 최종-트리밍 컷 오프 시퀀싱에 대 한 제어를 수행 합니다. - "Pick_open_references_otus.py" 스크립트를 사용 하 여 시퀀스에 조작 상 분류학 단위 (OTUs)를 할당 합니다.
참고:이 단계에서 시퀀스 id (일반적으로 97%)의 임계값에 따라 참조 시퀀스 컬렉션에 대 한 클러스터링 됩니다. 참조 시퀀스 컬렉션을 일치 하지 않는 읽기는 서로 대 한 클러스터링 됩니다. 드 노 보 및 폐쇄 기준 OTU 따기 옵션은 또한 사용할 수, 하지만 오픈 참조 따기 QIIME 개발자에 의해 권장 합니다. - "Alpha_rarefaction.py" 또는 "normalize_table.py" 스크립트를 사용 하 여 OTU 테이블 정규화.
참고:이 단계는 열 합계에는 변형에 대 한 수정 또는 전체 순서 현대 시퀀싱 기술에서 발생 하는 샘플 당 읽습니다. 정규화는 전통적인 진공을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 누적 합계 스케일링 등 다른 방법을 통해. - 여러 알파-, 베타-다양성, 다양 성과 분류학 구성 다양성 분석 "core_diversity_analysis.py" 스크립트를 사용 하 여 한 번에 수행 합니다.
참고: 또는, 이러한 분석 실행할 수 있습니다 별도로 개별 스크립트를 사용 하 여 (예를 들어, "alpha_diversity.py").
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Representative Results
총 3 개의 별도 달걀에서 42 틱 클러치 및 두 환경 노출 기간, 0과 토양, 2 주 미생물 시퀀싱에 대 한 처리 했다. 각 치료 그룹, 6-8 틱 샘플 복제를 포함 한 단일 클러치와 노출 시간으로 간주 됩니다. 이러한 처리 진드기 추출 물 다음-세대 시퀀서에 로드 된 하 고 필터를 통과 하는 12,885,713 쌍 간 읽기를 굴복. 이 실행에 포함 211,214 읽기 (이전 수에 포함)의 총 저조한 추출 단계에서 3 부정적인 컨트롤을 했다. 또한 각 통계에 대 한 최적의 값과 함께 실행된 품질 기준은 표 2에 자세히 나와 있습니다. OTUs는 시퀀싱 깊이, 또는 수의 독특한 시퀀스 샘플 당 읽습니다 2,129 읽기의 충분 한 것 미생물 지역 사회 (의 다양성을 적절 하 게 잡으려고 표시 샘플 당 수가 시퀀싱 노력 관련 진공 곡선 그림 2)입니다. 진공 레벨 샘플 형식에 따라 달라 집니다 그리고 각 연속 실행에 대 한 개별적으로 결정 되어야 합니다. 이 깊이 rarefying 후 1,714 OTUs 93.3 ± 4.3 OTUs 샘플 당 평균 모든 샘플에서 확인 되었다. 다운스트림 분석을 방지 하려면 모든 OTUs ≥ 1% 풍부에서 적어도 하나의 샘플에서 찾을 수 없습니다, 잠재적인 오염 물질을 제거 하 고 스파스 매트릭스에서 발생 하는 문제는 드문 일반 범주에 풀링된 했다. 또한, R에서 decontam 패키지 OTUs-실제 샘플, 상대적으로 부정적인 컨트롤에 표시를 식별 하기 위해 이용 되었다 그리고 이러한 OTUs 다운스트림 분석에서 제거 되었습니다.
사회 생태 분석 알파 다양성, 베타, 다양 성과 간단한 생물 정보학 파이프라인을 사용 하 여 생성 하는 분류 구성 다양성 출력의 종류를 보여 주기 위해 QIIME 다양성 분석 워크플로 사용 하 여 수행 했다. 예를 들어가 중 및 unweighted Unifrac 주 좌표 분석 "core_diversity_analyses.py" 스크립트를 사용 하 여 제작 하 고 애벌레 틱 클러치 id (그림 3)에 따라 공간 클러스터링을 밝혀. Boxplots의 OTU 시간별 (그림 4) 미생물 종 부유에 차이 보여주는 다양 한 환경 노출 시간 또한이 스크립트를 통해 생성 된 계산 합니다. 이들 알파와 베타 다양성 분석 매핑 파일에 나열 된 사용자 정의 범주에 따라 수행 됩니다 하지만 수치와 통계 일반 분류학 정보에 모든 샘플 (그림 5)에 대 한 생성 됩니다.
그림 1 : 미생물 시퀀싱 워크플로. 미생물 시퀀싱 작업의 주요 단계 도서관 준비 및 시퀀싱 분석 단계에 대 한 설명선 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 시퀀스에 대 한 진공 곡선 계산 정규화. 진공 곡선, 틱, 각 코 호트 표시 관찰된 OTU 건의 노력을 샘플링와 관련이 있습니다. 오차 막대는 각 클러치에서 현재 복제 샘플 때문 그리고 그들은 1 개의 표준 편차를 나타냅니다. 이상인 곡선 OTUs의 전체 다양성을 적절 하 게 잡으려고 안정 되는 지점에서 시퀀싱 깊이 선택 합니다. 여기, 2000 읽기의 시퀀싱 깊이 적절 한 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 교장 분석 클러치로 조정입니다. Unweighted Unifrac 주 좌표 분석 (PCoA) 성인 및 다른 클러치에서 애벌레 틱 사이의 미생물 구성에 변화를 보여줍니다. 각 데이터 요소는 개별 틱을 나타냅니다. 이 그림은 QIIME "core_diversity_analyses.py" 스크립트를 통해 자동으로 생성 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 노출 시간으로 알파 다양성 boxplots. Boxplots OTU 묘사 시간이 지남에 미생물 다양성에 환경 노출 그룹 쇼 변화에 대 한 건의. 이 그림은 QIIME "core_diversity_analyses.py" 스크립트를 통해 자동으로 생성 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 한 클러치에 대 한 문 수준 미생물 id. 클러치 하나에서 개별 틱 샘플에 대 한 미생물 구성 문 수준에서 표시 됩니다. 이 그림으로 더 낮은 분류학 수준에서 요약 정보 자동으로 QIIME "core_diversity_analyses.py" 스크립트를 통해 생성 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 통계 | 정의 | 우리의 결과 (MiSeq V3) | MiSeq v 3에 대 한 최적의 | HiSeq 빠른 모드에 대 한 최적의 | |
| PF를 읽습니다. | 시퀀싱의 수 순 필터 전달 읽습니다. 더 이상 1 기본 통화 처음 25 사이클에서 순 결 값 0.6 아래 경우 읽기 필터를 통과 | 12,885,713 | 14-16 백만 | 600 백만 | |
| 오류 평가 | 읽기에 따라 기본 쌍 한 주기 동안 제대로 호출의 백분율 PhiX 컨트롤 정렬 | 3.28 ±0.10 | * 다른 통계에 대 한 값에 따라 달라 집니다. | * 다른 통계에 대 한 값에 따라 달라 집니다. | |
| % ≥Q30 | 99.9%의 정확도 기본 호출을 나타내는 Q 점수 ≥ 30, 기지의 비율 | 68.94 | > 70% | > 80% | |
| 클러스터 PF (%) | 순 결 필터를 통과 하는 클러스터의 백분율입니다. | 85.61 ±0.81 | 90% | 90% | |
| 밀도 | Flowcell-데이터 품질 및 출력에 대 한 주요 통계에는 클러스터의 밀도 | 552 ± 35 클러스터/mm ^2 | 1200-1400 클러스터/mm ^2 | 850-1000 클러스터/mm ^2 | |
표 1: NGS 출력에 대 한 성능 매개 변수 키. 사용자 데이터 및 대상 값이이 연구 (자료 테이블)와 25% 시퀀싱 제어 추가에 사용 된 시퀀싱 플랫폼 및 시 약 키트에 따라 보고.
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Discussion
16S rRNA의 다음-세대 시퀀싱와 벡터 microbiomes 병원 체 전송에 미치는 영향의 연구 활성화 미생물 식별을 위한 표준 접근 되고있다. 여기에 설명 된 프로토콜 세부 I. pacificus, 라임 병;에 대 한 벡터 종에에서 미생물 커뮤니티 어셈블리를 조사 하기 위해이 메서드를 사용 하 여 그러나, 그것은 쉽게 다른 틱 종 또는 arthropod 벡터 종 연구에 적용할 수 있습니다.
실제로, 16S rRNA 시퀀싱 미생물 분석을 위한 벡터 모기, 체체파리 파리29,,3031, psyllids, 등의 microbiomes 연구를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 벡터 내 미생물 확인을 위해 사용할 수 있는 다른 방법 등 현미경, 배양, 조직학에 게 얼룩이 지기. 이러한 메서드는 시퀀싱 목표 식별 및 설명 소설 미생물 (현미경), 항균 약물 (문화)의 효과 평가 하거나 (조직학 얼룩) 벡터 내에서 구체적이 고 알려진 미생물 지역화 하는 경우 보다 더 적절 한 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법에서 낮은 특이성, 탐지, 및 확장성, 고통 그리고 따라서 덜 벡터 내에서 미생물의 전체 지역 사회를 식별 하거나 생태이 고 실험적인 다양 한에서 벡터 미생물 특성화에 적합 조건입니다. 반대로, 16S rRNA 유전자의 높 처리량 연속 낮은 풍요와 비 culturable 박테리아의 식별을 가능 하 게, 높은 해상도 포괄적인 참조 데이터베이스를 주어진 탐지 하며 높은 복제 따라 제공할 수 있습니다. 범위의 요구에
16S rRNA 시퀀싱은 지금은 널리 사용 되는 반면 미생물 식별,이 기술은 아니다 제한 없이. 주로, 미생물 오염 시퀀싱 결과의 해석 불분명 하 고 생물학 의미32혼동 수 있습니다. 또한, 주어진 보편적인 세균성 뇌관과 감도 사용 하 여 낮은 농도 16S rRNA 시퀀싱을 내재 하 고 있는 시작, 미생물 오염은 일반적인32. 오염 소스는 PCR 시 약, DNA 추출 키트, 실험실 표면 및 피부 및 연구원33,,3435의 의류를 포함합니다. 메 마른 환경에서 부정적인 컨트롤 및 기술 복제를 사용 하 여 협력 하 여 미생물 오염 물질의 효과 최소화할 수 있습니다 및36를 사용 모든 장비 및 시 약의 기록을 유지.
미생물 오염, 뿐만 아니라 고품질 시퀀싱 출력 크게 미생물 연속 데이터의 유용성을 방해 수 있습니다. 데이터 품질 실행된 통계 읽기 필터, 30, 및 클러스터 밀도의 Q-점수 (기본 호출에서 오류 예측된 확률의 측정) 위 읽기의 비율을 통과 수 등의 숫자에 의해 평가 될 수 있다. 이러한 통계에 대 한 값은 샘플 시퀀싱 시스템, 시 약 카트리지 및 % 컨트롤 사용, 시퀀싱, 실행의 수에 따라 달라 집니다 하지만 실행된 조건에 따라 최적의 값 온라인 사용할 수 있습니다. 특히, 클러스터 밀도, 시퀀싱, 이전 흐름 셀의 주어진된 평면에 라이브러리 클러스터 수 데이터 품질 및 수율을 최적화 하기 위한 키 매개 변수입니다. 둘 다 및에서 클러스터링 데이터 출력을 감소 하 고 샘플 때문에 부족 한 보도 분석에서 제외 되 고 결과 수 있습니다. 종종 부정확 한 라이브러리 정량화;을 반영 하는 불 쌍 한 클러스터 밀도 따라서, 치료는 적절 한 DNA 정리, 개별 샘플 정량화, 및 전체 도서관 정량화를 수행 하기 위해 취해야 한다.
높은 데이터 품질 및 수율 달성을 가정할 때, 분기 접근 방식을 큰 데이터 집합의 통계 문제를 해결 하는 데 사용 하는 데이터 분석에이 접근의 또 다른 한계 포즈. 예를 들어 여러 메서드 샘플 사이의 읽기 건의 주소 편차를 존재합니다. 서브 샘플링 모든 샘플에서 동일한 시퀀싱 깊이 달성 하기 위해 읽기 관련, 진공은 자주 사용 하지만 최근 데이터와 최소 시퀀싱 깊이37의 주관적인 선택의 다량을 낭비에 대 한 비판의 대상이 되었습니다. ,,3839. 스케일링 (CSS), 누적 합계 모든 시퀀스 읽지만 주어진된 백분위 수 내에서 누적 합계에 따라 그들의 무게를 유지 하는 대체 기술로 개발 되었습니다. 그러나, CSS는 널리 채택 되지 그 상대 참신 및 존재/부재 분석 하기 전에 정규화에 대 한 진공의 확인된 유틸리티.
표준 데이터 분석 절차는 또한 부정적인 컨트롤 시퀀스 읽기를 처리 및 낮은 풍부 읽기에서 이러한 구별에 대 한 부족 합니다. 앞에서 언급 했 듯이, 시퀀싱 부정적인 컨트롤 DNA 추출 단계에서 생성 된 것이 좋습니다 분석 중 미생물 오염 물질에서 진정한 벡터 미생물 거주자를 구분 하는 데 도움이. 그러나, 식별 및 필터링 의심된 오염 물질에 대 한 표준 및 통계적으로 엄격한 접근 부족 이다. 일반적인 방법은 OTUs 부정적인 컨트롤에 있는 모든 샘플에서 제거 하는 것입니다. 그러나,이 방법은 가능성이 이러한 미생물의 많은 키트 시 약40보다는 실제 샘플에서 발생 하는 때문에, 지나치게 보수적인 수 있습니다. 또 다른 일반적인 기술은 미생물 오염 물질 실제 샘플8,41에서 희소 하다 가정에 "희귀" 카테고리에 그룹화 미생물을 < 1%에 포함 한다. 그러나,이 메서드는 미생물 I. pacificus 그리고 I. holocyclus7,42. 에서 보듯이 endosymbiont에 의해 지배 된다 하는 경우에 특히 낮은 나타났는데에 존재 하는 진정한 벡터 미생물을 제거할 수 있습니다. 이러한 경우, 희귀 미생물 검출 필요 깊은 시퀀싱, amplicon PCR42, 동안에 endosymbiont의 확대를 억제 하는 뇌관을 개발 또는 계산 순서 분석 동안에 endosymbiont를 제거 7. 미생물 데이터 분석, 연구에서 결과 비교 하는 기능을 제한할 수 있습니다에서 주관과 편견에 대 한 기회를 만듭니다 OTUs 다양 한 희귀 주소로 방법 및 오염 물질 중 선택.
분류학과 계통 발생 정보 순서 읽기를 할당에 필요한 참조 데이터베이스의 선택과 주관에 대 한 또 다른 기회를 선물 한다. 변수 진 지역에서 확인 된 부모 게놈 시퀀스 읽기를 관련 된 작업은 본질적으로 도전, 신뢰할 수 있는 레퍼런스 데이터베이스 정확한 계통 발생 임무 결정적 이다. 여러 데이터베이스 실바43, Greengenes44, RDP45, NCBI46등이 과제를 나왔다. 실바는 RDP로 실바, 하지만 16S 기반 분류의 가장 큰만 속 수준 분류학 정보를 제공 합니다. Greengenes 종 수준 정보를 제공 하 고 QIIME, 같은 metagenomic 분석 패키지에 포함 되어 있지만 그것은 4 년 동안에 업데이트 되지 않은. NCBI, 분류학 정보에 대 한 기본 소스로 하는 동안 사용자가 제출한 시퀀스에서 매일 업데이트 분류 제공 하지만 그것은 큐레이터. 일반적으로 데이터베이스 중 선택, 범위, 및 통화에 대 한 사용자의 요구에 따라, 그것은 계통 발생 할당 및 다운스트림 분석47,48에 상당한 영향을 있습니다. 사용 하는 참조 데이터베이스에 관한 조사 간의 합의 이렇게 분석에 추가 바이어스를 피하는 것이 필수적.
이러한 데이터 처리 과제에 표준 접근 16S rRNA 시퀀싱 되는 점점 더 일반적인 기법으로 나타날 가능성이 것입니다. 시퀀싱 비용 및 시간에 지속적인된 감소가이 방법을 대중화 추가 됩니다. 이 기술의 증가 사용 구성과 다양 한 조건 하에서 벡터 microbiomes의 생태에 대 한 더 깊은 조사를 수 있게 된다. 아직도 그것의 유년기에 벡터 미생물 생물학의 지식으로 이러한 유형의 설명 연구는 선행 하는 벡터 제어의 수단으로는 미생물을 활용 하려고 중요 한 첫 번째 단계입니다. 그러나, 진정으로 병원 체 전송에서 미생물의 역할 이해, 미생물 식별은 이러한 미생물의 기능 역할의 지식으로 결합 해야 합니다. RNA 시퀀싱 transcriptomic 접근, 매핑 및 유전자 발현 측정을 포함 하는 미생물의 기능적 역할에 추론을 가능 하 게 하지만 깊은 시퀀싱을 필요로 하 고 대상 종의 게놈을 완벽 하 게 조립. 이러한 도전, 전산 도구 16S rRNA 시퀀싱 데이터 하지만 최근에 개발 되어 널리 채택 되지 않습니다 아직49에서 기능 구성 예측 우회. 생태 이론 뿐 아니라 이러한 도구를 개발, 미생물 id와 벡터 내의 기능적 역할 연결 벡터 미생물 연구에 16S rRNA 시퀀싱 데이터의 유틸리티를 증가할 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품에 의해 지원 되었다 국립 과학 재단 부여 A.S. (뎁 #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
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