Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Tick Microbiome karakterisering av neste generasjons 16S rRNA Amplicon sekvenser

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/58239

Summary

Her presenterer vi en neste generasjons sekvensering protokoll for 16S rRNA sekvensering som gjør identifisering og karakterisering av mikrobielle samfunn i vektorer. Denne metoden innebærer DNA utvinning, forsterkning og barcoding av prøver gjennom PCR, sekvensering flyt-celle og bioinformatikk å matche sekvens data til phylogenetic informasjon.

Abstract

I de siste tiårene, har vektor-sykdommer igjen dukket opp og utvidet på urovekkende priser, forårsaker betydelig sykelighet og dødelighet verden. Effektiv og lett tilgjengelige vaccines mangler for et flertall av disse sykdommer, nødvendiggjør utviklingen av Roman sykdom forminskingsmodulen strategier. Dette innebærer en lovende avenue sykdom kontroll målretting vektor microbiome, fellesskapet av mikrober som bor vektoren. Vector microbiome spiller en sentral rolle i patogen dynamics og manipulering av microbiome har ført til redusert vektor overflod eller patogen overføring for en håndfull vektor-sykdommer. Men krever oversette disse funnene i sykdom kontroll programmene en grundig forståelse av vektor microbial ecology, historisk begrenset av utilstrekkelig teknologi på dette området. Bruk av neste generasjons sekvensering metoder har aktivert rask, svært parallelle sekvenser av ulike mikrobielle samfunn. Målretting svært bevart 16S rRNA genet har muliggjort characterizations av mikrober stede i vektorer under varierende økologiske og eksperimentelle forhold. Denne teknikken innebærer forsterkning av 16S rRNA genet, prøve barcoding via PCR, lasting eksempler på en flyt for sekvensering, og bioinformatikk tilnærminger tilsvarer sekvens databehandling Fylogenetiske informasjon. Art eller slekt nivå identifikasjon for et høyt tall av replikat kan vanligvis oppnås gjennom denne metoden, og dermed omgå utfordringene i lav oppdagelsen, oppløsning og utdata fra tradisjonelle dyrking, mikroskopi eller histologiske flekker teknikker. Derfor denne metoden er velegnet for å karakterisere vektor mikrober under ulike forhold, men for tiden gir ikke informasjon om mikrobiell funksjon, sted vektor, eller svar på antibiotikabehandling. Total, 16S neste generasjons sekvensering er en kraftfull teknikk for å bedre forstå identitet og rollen av vektor mikrober i sykdom dynamics.

Introduction

Fremveksten og spredningen av vektor-sykdommer i de siste tiårene utgjør en alvorlig trussel mot global menneske og dyr helse. Effektive vaksiner mangler for et flertall av disse sykdommene, og kontroll innsats er hindret av komplekse biologiske natur vektorer og vektor-vert interaksjoner. Forståelsen av mikrobielle interaksjoner i en vektor i patogen overføring kan tillate utviklingen av romanen strategier som omgå disse utfordringene. Spesielt kan interaksjoner mellom vektor-assosiert mikrobiell commensals og symbionter patogener, kalles microbiome, ha viktige konsekvenser for patogen overføring. Overveldende bevis nå støtter denne påstanden, med eksempler som demonstrerer et koblingen mellom vektor microbiome og kompetanse for sykdommer som malaria og Zika virus Lyme sykdom1,2,3. Oversette disse funnene i strategier for Skadekontroll krever imidlertid en langt mer detaljert forståelse av strukturen, funksjon og opprinnelsen til vektor microbiomes. Identifikasjon og karakterisering av vektor mikrobiell samfunnet under varierende økologiske og eksperimentelle forhold utgjør et viktig vei fremover i dette feltet.

En prosedyre for å identifisere mikrobiell innbyggerne i en patogen vektor tilbys her ved å bruke Western black legged kryss, Ixodes pacificus, vector art av patogen Lyme sykdom Borrelia burgdorferi. Mens flått havn flere typer mennesker enn noen andre leddyr, er relativt lite kjent om biologi og samfunnet økologi tick microbiomes4. Det er tydelig at flått havn en variert utvalg av virus, bakterier, sopp og protozoans inkluderer commensals, endosymbionts og forbigående mikrobiell beboere5,4. Tidligere arbeid har vist sterk variasjoner i Ixodes microbiomes forbundet med geografi, arter, sex, liv Stadium og blod måltid kilde6,7,8. Imidlertid mekanismene bak denne varianten er fortsatt ukjent og garanterer mer detaljerte undersøkelser av opprinnelsen og montering av disse mikrobielle samfunn. Flått kan skaffe mikrober gjennom vertikal overføring, kontakt med verter og opptak fra miljøet gjennom voksne, munn og anal pore9. Forstå faktorer forme første dannelsen og utviklingen av tick microbiome, er spesielt relative bidrag loddrett og miljømessige overføring, viktig for å forstå den naturlige mønstre og variasjoner i kryss Microbiome mangfold og hvordan disse samfunnene samhandle i patogen overføring, med mulige programmer sykdom eller vektor.

Kraftig molekylær teknikker, som neste generasjons sekvensering, nå eksisterer for å identifisere mikrobielle samfunn og kan brukes til å karakterisere vektor microbiomes under ulike miljømessige eller eksperimentelle forhold. Før ankomsten av disse høy gjennomstrømming sekvensering tilnærminger avhengig identifikasjon av mikrober hovedsakelig mikroskopi og kultur. Mikroskopi er en rask og enkel teknikk, er morfologiske metoder for å identifisere mikrober iboende subjektiv og grov og begrenset av lav sensitivitet og gjenkjenning10. Kultur-baserte metoder brukes generelt for mikrobiell identifisering og kan brukes til å bestemme mottakelighet av mikrober til narkotika behandlinger11. Men lider denne metoden også av lav følsomhet, som det har blitt anslått at færre enn 2% av miljømessige mikrober kan kultivert i et laboratorium sette12. Histologiske flekker tilnærminger har også vært ansatt å oppdage og lokalisere bestemt mikrober innen vektorer, aktiverer undersøkelser av ulike taxa distribusjoner i haken og studere hypoteser om mikrobiell interaksjoner. Forkunnskaper mikrobiell identitet er imidlertid nødvendig for å velge riktig flekker, gjør denne tilnærmingen dårlig tilpasset for mikrobiell karakterisering og identifikasjon. Videre histologiske flekker er en svært tidkrevende, arbeidskrevende prosess og skalere ikke godt for store. Tradisjonelle molekylær tilnærminger som Sanger sekvensering er tilsvarende begrenset i sin følsomhet og påvisning av ulike mikrobielle samfunn.

Neste generasjons sekvensering tillater rask identifisering av mikrober fra mange eksempler. Standard markør gener og referanse databaser ytterligere muliggjør forbedret taksonomisk oppløsning, ofte til slekten eller arter. Liten delenhet ribosomal RNAs brukes ofte til å oppnå dette målet, med 16S rRNA er den vanligste av bevarte og variable regioner i genet, slik at etableringen av universell primere med unik amplicons for hver bakteriell Art13,14. Denne rapporten viser en prosedyre for å identifisere taxa i kryss microbiome gjennom 16S rRNA neste generasjons sekvensering. Spesielt understreker denne protokollen trinnene involvert i forbereder prøver sekvensering. Mer generalisert informasjon om sekvensering og bioinformatikk trinnene vises, som det er en rekke sekvensering plattformer og analyse programmer tilgjengelig, med omfattende eksisterende dokumentasjon. Generelle muligheten for denne neste generasjons sekvensering er demonstrert ved å bruke det på en undersøkelse av mikrobielle samfunn montering i en nøkkel sykdom vektor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sjekke innsamling og overflaten sterilisering

  1. Samle flått ved å dra en 1 m2 hvit klut over et kryss-assosiert habitat, fjerne flått knyttet til verten arter, eller oppdrett flått i lab15,16. Bruke fine tang manipulere flått og lagre dem på-80 ° C.
  2. Plasser flått i individuelle PCR rør og fjerne overflaten smuss ved vortexing for 15 s suksessivt med 500 μL hydrogenperoksid (H2O2), 70% etanol og ddH2O.
  3. Plasser flått i en ny PCR-tube, og tillate dem å air-dry.
  4. I dette røret, mekanisk forstyrre tick vev ved å knuse merkene med en morter (brukt i denne studien), med små perler i en perle beater, eller fjerner haken med en skalpell.

2. DNA rensing

  1. Rense fra personlige flått, følge instruksjonene i en kommersielt tilgjengelig DNA utvinning kit. Elute for et siste volum av 100 μL.
    Merk: Se figur 1 for en oversikt over trinnene 2.2-2.8. Alternative utvinning metodene omfatter fenol-kloroform utvinning17,18, etanol nedbør19eller ekstraksjon med chelaterande materiale20,21.
  2. Bekrefte vellykket DNA rensing med en fluorometer eller spektrofotometeret. Fluorometry, bruke 10 μL DNA mal i en 190 μL double-strandet DNA analysen. Den forventede avkastningen er 0,1-1.0 ng/μL22. Spectrophotometry, bruke 1 μL DNA mal i en nukleinsyre kvantifisering. Forventet A260/280 forholdet er omtrent 1,823.
  3. Hvis ikke går umiddelbart til forsterkning, lagre prøver på 20 ° C.

3. 16S rRNA Gene forsterkning

  1. Definere amplicon PCR i en 27.5 μL reaksjon inneholder: 5 μL av hver primer på 1 μM; 12.5 μL kommersielt tilgjengelig PCR blanding; og 5 μL DNA utvunnet fra personlige flått på en 5 ng/μL konsentrasjon.
    Merk: Bruk følgende primerne for forsterkning av regionen hypervariable V3 V4 16S rRNA genet13:
    5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3',
    5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3
  2. Flytte rør til en thermocycler programmert for: en innledende rødsprit ved 95 ° C i 3 min; 25 sykluser av 1) 95 ° C for 30 s, 2) 57 ° C for 30 s, 3) 72 ° C for 30 s; en endelig utvidelse ved 72 ° C i 5 min; og endelig tak på 10 ° C.
  3. Når PCR er gjort, visualisere PCR produktet ved lasting 4-6 μL/prøve på en 1,5% agarose gel. Se etter et band på 460 bp å bekrefte forsterkning.
    Merk: Amplicon PCR produkt kan ikke være synlig på gel hvis prøven konsentrasjonen er for lav (< 10 ng). Primer dimer tilstedeværelse er vanlig i lav-konsentrasjon prøver. Hvis det finnes andre ikke-target band, justere annealing temperaturen eller redusere antall sykluser.
  4. Hvis ikke går umiddelbart til rensing, lagre prøver på 4 ° C.

4. 16S Amplicon rensing

  1. Bruker en ny PCR-tube for hver prøve, kombinere PCR produktet med ddH2O å få 60 μL totalt. For prøver med DNA Lavinnblanding, utføre amplicon PCR i tre eksemplarer å redusere forsterkningen bias og basseng prøvene å konsentrere seg.
  2. Bringe spinn perler til romtemperatur og vortex dem godt før bruk.
  3. Tilsett 48 μL av spinn perler 60 μL prøven og ruge for 5 min. sted rør på en magnetisk rack for 5 min til løsning blir klart. Fjerne nedbryting.
    Merk: Denne bead konsentrasjon mål fjerning av primer dimers (< 60 bp). Hvis nødvendig, Juster bead konsentrasjon for å fjerne andre uspesifikke striper.
  4. Rør på magnetiske rack, legge til 500 μL nylagde 80% EtOH. Umiddelbart etter tilføyer EtOH til alle rør, Pipetter ut væske. Ikke Fjern perler. Gjenta EtOH tillegg og fjerning én gang.
  5. Air-Dry prøver å fjerne overflødig EtOH ved forlater rørene åpen på magnetiske stativet i 5 minutter, eller til små sprekker er synlige i perler.
  6. Legg til 20 μL TE buffer og ruge prøvene av magneten, i romtemperatur, i 5-10 min.
  7. Plass rør bak på magneten. Når perler og flytende skilles, overføre nedbryting slik frisk å få renset PCR produktet.
  8. (Valgfritt) Visualisere produktet for å bekrefte vellykket amplicon rensing av lessing 4-6 μL/prøve på en 1,5% gel. 460 bp bandet skal være synlig, og det bør ikke være uten primer dimer.
  9. Hvis ikke fortsetter umiddelbart indeksen PCR, lagre prøvene 4 ° C.

5. prøve Barcoding og rensing

  1. Tilordne unike primer kombinasjoner til hver prøve ved å velge enten fremover eller bakover grunning, eller begge, fra et kommersielt tilgjengelig biblioteket indeks kit.
    Merk: Unikt merking prøver tillater differensiering etter sekvensering. Kits gir vanligvis nok primere å sekvens 96-384 prøver.
  2. Fest de to primere, eller indekser, smakebiter ved å utføre PCR i en 25 μL reaksjon med 2,5 μL av hver primer (N7xx og S5xx), 12.5 μL av kommersielt tilgjengelig PCR master mix, 5 μL ddH2O og 2,5 μL renset amplicon produktet.
  3. Flytte rør til en thermocycler programmert for: en innledende rødsprit ved 95 ° C i 3 min; 8-14 sykluser av 1) 95 ° C for 30 s, 2) 55 ° C for 30 s, 3) 72 ° C for 30 s; en endelig utvidelse ved 72 ° C i 5 min; og endelig tak på 10 ° C.
  4. Når PCR er gjort, visualisere PCR produktet ved lasting 4-6 μL/prøve på en 1,5% agarose gel. Se etter et band på 550 bp å bekrefte forsterkning.
    Merk: Bruke visualisering resultatene for å informere indeks PCR sykling forhold. Lavere syklus greven å redusere ikke-spesifikk binding eller øke syklus greven å få synlige bånd for hvert utvalg.
  5. Gjenta rydde opp i trinn 4. For å unngå fortynning under opprydding, utføre indeks PCR i duplikat og basseng produktet her.
  6. Hvis ikke går umiddelbart til biblioteket kvantifisering og normalisering, lagre prøver på 4 ° C.

6. biblioteket kvantifisering og normalisering

  1. Beregne konsentrasjonen av hvert renset, barcoded produkt fra trinn 5.5 bruke fluorometer eller spektrofotometeret (se trinn 2.2). Fortynne prøvene i TE buffer for å skaffe konsentrasjoner på ca 1 pM.
    Merk: Biblioteket kvantifisering er nødvendig for å oppnå prøven lasting konsentrasjon anbefales for sekvensering plattformen. Biblioteket kvantifisering oppnås gjennom qPCR, men estimering eksempel konsentrasjonen før qPCR sparer reagenser og tid. 1 pM konsentrasjon anbefales å maksimere nøyaktigheten av biblioteket kvantifisering, da dette er gjennomsnittlig konsentrasjon av qPCR gitt i kvantifisering kit24.
  2. Utføre qPCR i en 10 μL reaksjon som inneholder 6.0 μL qPCR master mix (fra biblioteket kvantifisering kit), 2.0 μL ddH2O og 2.0 μL av prøve eller standard. Kjør hver eksempel og standard i tre eksemplarer større nøyaktighet og presisjon. Kjøre hver prøve på tre eller flere fortynning nivåer (f.eks., 0 1 pm, 1 pm og 10 pm for anslagsvis Start konsentrasjoner) å sikre nøyaktige kvantifisering.
    Merk: Detaljert informasjon om angitte primere og standarder vil variere etter kvantifisering settet brukes og er tilgjengelig i produkter tekniske datablad. Se Tabellen for materiale for kvantifisering kit brukt i denne studien.
  3. Flytte qPCR plate eller rør til et sanntid PCR instrument programmert for: en innledende denaturering av 95 ° C i 5 min; 35 sykluser av 1) 95 ° C for 30 s og 2) 60 ° C i 45 s; og et dissosiasjon skritt 1) 95 ° c for 15 s, 2) 60 ° C i 30 s, og 3) 95 ° C i 15 s.
  4. Beregne den gjennomsnittelige konsentrasjon for hver prøve, kvantifisering verdiene hentes fra qPCR resultatene og prøve fortynning nivåene brukes.
    Merk: For eksempel en gjennomsnittlig konsentrasjon av 2 pM for en eksempel fortynnet 1:100,000 gir en original Start konsentrasjon av 200 nM. Hvis ingen fortynning nivåer for et gitt utvalg faller innenfor området av standard kurver, kan kvantifisering resultater ikke være nøyaktig; i så fall, justerer de fortynning og re-utføre qPCR.
  5. Fortynn hver renset, barcoded prøve til 4 nM i TE buffer, basert på de gjennomsnittlige konsentrasjonene beregnet i trinn 7.5.
    Merk: For eksempel for en gjennomsnittlig eksempel konsentrasjon av 200 nM, fortynnet eksempel 1:50 i TE buffer for å oppnå en 4 nM konsentrasjon. Nøyaktig utvalg konsentrasjonen vil variere basert på sekvensering system og reagens kit brukes. Se sekvensering systemet brukerhåndboken for anbefalte konsentrasjonen.
  6. Opprette kombinert biblioteket ved å legge like volum (vanligvis 5-10 μL) av alle personlige biblioteker i en enkelt rør.
    Merk: som alle prøver skal være i en 4 nM konsentrasjon, legge like volum oppnår en lik konsentrasjonen av alle prøvene i grupperte biblioteket.
  7. Gjenta trinn 6.2-6.4 på kombinert bibliotek å bekrefte 4 nM konsentrasjonen.
  8. Beregn konsentrasjonen kombinert bibliotek og fortynne eller nytt utgjør siste, gruppert biblioteket bruker Tris buffer som er nødvendig for å oppnå 4 nM.
  9. Hvis ikke fortsetter å prøve lasting, lagre prøver på 20 ° C. Utføre den sekvensering kjøre etter kvantifisering å minimere tap eller endringer i DNA konsentrasjon under lagring.

7. biblioteket rødsprit og fortynning og sekvensering kjøre (utføre samme dag)

  1. Denature 4 nM kombinert biblioteket fra trinn 6,9 med NaOH.
    Merk: Disse siste biblioteket forberedelsene varierer for hvert sekvensering system. Se sekvensering systemet brukerhåndboken for mer detaljert og oppdatert protokoller. Nye brukere vil trolig må trenes på bruk av sekvensering plattformen eller sender sine biblioteker til et kjernen sekvensering.
  2. Fortynne denaturert biblioteket til ønsket lasting konsentrasjonen bruker bufferen i sekvensering reagenssett (Tabell for materiale).
    Merk: Optimal lasting konsentrasjonene varierer etter sekvensering systemet og vanligvis varierer fra 1-250 pM25.
  3. Denature og fortynne sekvensering kontrollen.
    Merk: Legge til en sekvensering kontroll korrigerer for sekvenser problemer som oppstår fra lav mangfold biblioteker. Denature sekvensering kontrollen med NaOH og fortynne til samme konsentrasjonen som biblioteket.
  4. Kombinere bibliotek og sekvensering kontroll.
    Merk: Forholdet mellom sekvensering kontroll kombinert biblioteket vil avhenge av bibliotek mangfoldet og sekvensering systemet brukes, men det er vanligvis 1:1-26.
  5. Last kombinert biblioteket og sekvensering kontroll blanding på sekvensering flyt cellen.

8. Amplicon Sequence Analysis

  1. Vurdere den totale suksessen av kjøringen ved å kjøre beregningene på cloud computing miljø tilsvarer sekvensering systemet brukes.
    Merk: De kjøre beregningene, som antall sekvensering leser, vil variere avhengig av sekvensering plattform og reagens kit brukes. Målverdier for vanlige sekvensering systemer er oppført i tabell 1.
  2. Last ned rå sekvensering data og ønsket bioinformatikk åpen kildekode programvare, kvantitativ innsikt i Microbial Ecology (QIIME)27 eller Mothur28.
    Merk: Både QIIME og Mothur er åpen kildekode og gratis å laste ned. Detaljerte instruksjoner om hvordan du bruker disse programmene kan grunnlegge online og er tilstrekkelig detaljert for førstegangsbrukere. Disse trinnene gir en bred oversikt over en bioinformatikk rørledning utført i QIIME. Fortrolighet med python er ikke nødvendig, men vil lette gjennomføringen av skriptene nedenfor
  3. Opprett og Valider Tilordningsfilen bruke skriptet "validate_mapping_file.py" i QIIME.
    Merk: Tilordningsfilen inneholder alle metadata må analysere data, inkludert prøve-ID, amplicon primer sekvenser og prøve beskrivelse. Valideringstrinnet kontrollerer at alle nødvendige data er angitt i riktig format.
  4. Demultiplex og filtrere sekvenser ved hjelp av skriptet "split_libraries.py" (figur 1).
    Merk: Dette skriptet tilordner barcoded leser smakebiter basert på indeks primer de og eksempel IDer inn Tilordningsfilen. Den utfører også flere kvalitet filtrering slik kontroll for sekvensering feil basert på brukerdefinerte avskjær for minimum kvalitetspoeng, sekvens lengder og slutten-trimmer.
  5. Tilordne taksonomisk driftsenheter (OTUs) til sekvenser ved hjelp av skriptet "pick_open_references_otus.py".
    Merk: I dette trinnet klynger sekvenser mot en referanse sekvens samling basert på en terskel identitet (vanligvis 97%). Leser som ikke samsvarer referanse sekvens samlingen står mot hverandre. De novo og lukket-referanse OTU plukking er også tilgjengelig, men åpne referanse plukking er anbefalt av QIIME utviklere.
  6. Normalisere tabellen OTU bruke skriptet "alpha_rarefaction.py" eller "normalize_table.py".
    Merk: Dette trinnet korrigerer for variasjon i kolonnen Summer eller samlede sekvens leser per prøve, som følge av moderne sekvensering teknologi. Normalisering kan utføres ved hjelp av tradisjonelle rarefaction, eller via alternative metoder som kumulativ sum skalering.
  7. Utføre flere alpha-mangfold, beta-mangfold og taksonomisk komposisjon mangfold analyser samtidig ved hjelp av skriptet "core_diversity_analysis.py".
    Merk: Alternativt disse analyser kan kjøres separat på de enkelte skriptene (f.eks "alpha_diversity.py").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Totalt 42 flått fra tre separate egg clutches og to miljømessige eksponering perioder, 0 og 2 uker i jord, ble behandlet for microbiome sekvensering. Hver behandlingsgruppe, anses å være en enkelt clutch og eksponering tid, inneholdt 6-8 gjenskape tick prøver. Disse behandlet tick ekstrakter var lastet inn en neste generasjons sequencer og gitt 12,885,713 sammen-end leser passerer filteret. Inkludert i dette løpet var 3 negative kontroller fra utvinning trinn, gir totalt 211,214 leser (inkludert i tidligere teller). Ytterligere er kjøre kvalitet beregninger med optimale verdiene for hver beregning beskrevet i tabell 2. Rarefaction kurver, som gjelder antall OTUs per eksempel indikert at en sekvensering dybde eller antall unik bokstavkombinasjon leser per eksempel av 2,129 ville være nok til å tilstrekkelig fange mangfoldet av mikrobielle samfunn (sekvensering innsats Figur 2). Rarefaction vil variere avhengig av prøvetype og må avgjøres individuelt for hver sekvensering kjøre. Etter rarefying til denne dybde, ble 1,714 OTUs identifisert over alle prøver med et gjennomsnitt på 93,3 ± 4.3 OTUs per prøve. For å unngå nedstrøms ble problemer som oppstår fra Glisne matriser og fjerne potensielle miljøgifter, alle OTUs ikke funnet i minst ett eksempel på ≥ 1% overflod samlet i en sjelden generell kategori. Videre decontam pakken R ble benyttet for å identifisere OTUs overrepresentert i negative kontroller i forhold til reelle eksempler, og disse OTUs ble fjernet fra nedstrøms.

Samfunnet økologi analyser ble utført ved hjelp av QIIME mangfold analyser arbeidsflyten for å demonstrere alpha mangfold, beta mangfold og taksonomi komposisjon mangfold utdataene som genereres ved hjelp av en enkel bioinformatikk rørledning. For eksempel veid og unweighted Unifrac viktigste koordinater analyser ble produsert ved hjelp av skriptet "core_diversity_analyses.py", og de avslørte romlige klynger av larver flått basert på clutch identitet (Figur 3). Boxplots i OTU teller med varierende miljømessige eksponering ganger også genereres gjennom dette skriptet viser forskjeller i microbiome arter rikdom over tid (Figur 4). Disse alfa og beta mangfold analyser utføres basert på brukerdefinerte kategoriene i Tilordningsfilen, men tall og statistikk på generell taksonomisk informasjon generert for alle utvalg (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Microbiome sekvensering arbeidsflyten. Hovedtrinn i microbiome sekvensering arbeidsflyten vises med utrykninger biblioteket forberedelse og sekvensering analyse trinnene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Rarefaction kurver for forløp telle normalisering. Rarefaction kurver, vises for hver kohort av flått, gjelder observert OTU teller prøvetaking innsats. Feilfelt finnes på grunn av Repliker prøver stede i hver clutch, og de betegne ett standardavvik. Sekvensering dyp skal velges på eller utenfor et punkt der kurven blir stabil tilstrekkelig fange hele mangfoldet av OTUs. Her vises en sekvensering dybde av 2000 riktig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Rektor koordinere analyse av clutch. Unweighted Unifrac viktigste koordinere analyse (PCoA) viser variasjon i microbiome komposisjon mellom larver flått fra forskjellige clutches og voksne. Hvert datapunkt betegner en personlige tick. Dette tallet genereres automatisk via QIIME "core_diversity_analyses.py" script. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Alpha mangfold boxplots av eksponeringstid. Boxplots viser OTU teller for miljømessige eksponering grupper viser variasjon i mikrobiell mangfold over tid. Dette tallet genereres automatisk via QIIME "core_diversity_analyses.py" script. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Rekke nivå mikrobiell identifikasjon for clutch en. Microbiome komposisjon for individuelle tick prøver fra clutch en vises på rekke nivå. Dette tallet, samt sammendragsinformasjon på lavere taksonomisk nivåer, genereres automatisk via QIIME "core_diversity_analyses.py" script. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Beregning Definisjon Våre resultater (MiSeq V3) Optimale MiSeq v3 Optimale HiSeq rask modus
Leser PF Antall sekvensering leser passerer kyskhet filteret. Lese passerer filteret hvis ikke mer enn 1 base samtalen har kyskhet verdien under 0,6 i de første 25 syklusene 12,885,713 14-16 millioner 600 millioner
Feil Prosentandel av base parene kalt feil under en syklus, basert på leser justert til PhiX kontroll 3,28 ±0.10 * Avhengig av verdiene for andre beregninger * Avhengig av verdiene for andre beregninger
% ≥Q30 Prosentandel av baser med en Q score ≥ 30, som indikerer en base samtale nøyaktighet på 99,9% 68.94 > 70% > 80%
Klynge PF (%) Prosent av klynger passerer kyskhet filteret. 85.61 ±0.81 90% 90%
Tetthet Tettheten av klynger på flowcell - en nøkkelberegning datakvaliteten og produksjon 552 ± 35 klynge/mm ^ 2 1200-1400 klynge/mm ^ 2 850-1000 klynge/mm ^ 2

Tabell 1: Nøkkel ytelsesparameterne for NGS utdata. Bruker data og målet verdiene rapportert basert på sekvensering plattform og reagens kit brukes i denne studien (Tabell for materiale) og en 25% sekvensering kontroll tillegg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neste generasjons sekvensering av 16S rRNA har blitt en standard tilnærming for mikrobiell identifikasjon og aktivert studiet av hvordan vektor microbiomes påvirker patogen overføring. Protokollen skissert her viser bruk av denne metoden å undersøke mikrobiell samfunnet montering i I. pacificus, vector art for Lyme sykdom; men kan det lett brukes for å studere andre kryss arter eller leddyr vector art.

Faktisk, 16S rRNA sekvenser for microbiome analyse er brukt grovt å studere microbiomes av vektorer inkludert mygg, psyllids og tsetse fluer29,30,31. Andre metoder som er tilgjengelige for mikrobiell identifikasjon i vektorer er mikroskopi, dyrking og histologiske flekker. Disse metodene kan være mer hensiktsmessig enn sekvensering hvis målet er å identifisere og beskrive en roman mikrobe (mikroskopi), evaluere effekten av antimikrobielle narkotika (kultur) eller lokalisere konkrete og kjente mikrober innen vektor (histologiske farging). Men metodene lider av lav spesifisitet, gjenkjenning og skalerbarhet, og dermed er færre passende for identifisere hele samfunnet av mikrober i en vektor eller karakteriserer vektor microbiome under varierende økologiske og eksperimentelle forhold. Derimot høy gjennomstrømming sekvensering av 16S rRNA genet kan identifikasjon av lav-overflod og ikke-culturable, skaffer høy resolution og gjenkjenning gitt omfattende referanse databasene, og kan gi høy replikering avhengig på dekning behov.

Mens 16S rRNA sekvensering er nå mye brukt for mikrobiell identifikasjon, er denne teknikken ikke uten begrensninger. Prinsipielt kan mikrobiell forurensning skjule tolkning av sekvensering resultatene og forvirre biologisk betydning32. Videre, gitt bruk av universal bakteriell primere og følsomhet til lav starte konsentrasjoner som ligger på 16S rRNA sekvensering, mikrobielle forurensning er vanlige32. Beskyttet mot kontaminering inkluderer PCR reagenser, DNA utvinning kits, laboratorium overflater, og hud og klær forskere33,34,35. Effekter av mikrobielle miljøgifter kan minimeres ved å arbeide i et sterilt laboratoriemiljø, bruker negative kontroller og teknisk gjentak, og holder oversikt over alle kits og reagenser brukt36.

I tillegg mikrobiell forurensning, kan lav kvalitet sekvensering utgang betydelig hindre brukbarheten av microbiome sekvensering data. Datakvaliteten kan vurderes av en rekke kjøre beregninger inkludert antall leser passerer filteret, prosentandelen av leser over en Q-score (et mål på spådd sannsynligheten for feil i base-ringer) på 30 og klynge tetthet. Verdiene for disse verdiene varierer avhengig av antall utdrag kjører, sekvensering systemet og påreagenskassetten prosent sekvensering kontroll brukes, men optimal verdier basert på kjøre er tilgjengelig online. Spesielt er klynge tetthet, antallet biblioteket klynger på et gitt fly av flyt cellen før sekvensering, en viktig parameter for å optimalisere kvalitet og dekkevne. Både over og under-klynging kan redusere dataene utgangen og føre prøver å bli ekskludert fra analyse på grunn av manglende dekning. Dårlig klynge tetthet gjenspeiler ofte unøyaktig biblioteket kvantifisering; Derfor bør utvises utføre riktig DNA opprydding, enkelte eksempel kvantifisering og hele biblioteket kvantifisering.

Forskjellige tilnærminger i analyse brukt for å overvinne statistiske utfordringer av store datasett forutsatt høy kvalitet og dekkevne er oppnådd, og utgjør en annen begrensning av denne tilnærmingen. For eksempel finnes flere metoder til adressen variasjon i Les teller mellom eksempler. Rarefaction, som innebærer sub prøvetaking leser å oppnå en lik sekvensering dybde på tvers av alle prøver, brukes ofte, men har vært utsatt for kritikk nylig for å kaste bort store mengder data og subjektive valg av minimum sekvensering dybde37 ,38,39. Kumulativ sum skalering (CSS), som holder alle sekvens leser men veier dem basert på den akkumulerte summen av teller i en gitt persentil, er utviklet som en alternativ teknikk. Men har CSS ikke vært allment vedtatt sin relative nyheten og bekreftet nytten av rarefaction for normalisering før tilstedeværelse/fravær analyser.

Standarddata analyse prosedyrer er også mangler for håndtering sekvens leser i negative kontroller og skille disse fra lav overflod leser. Som nevnt, anbefales sekvensering negative kontroller generert fra DNA utvinning trinn å skille ekte vektor microbiome beboere fra mikrobiell forurensninger under analyse. Likevel, mangler en standard og statistisk strenge tilnærming for å identifisere og filtrere mistenkt forurensninger. En felles tilnærming er å fjerne OTUs i negativ kontrollene fra alle prøvene. Men kan denne metoden være altfor konservativ siden mange av disse mikrobene trolig stammer fra reelle eksempler i stedet for kit reagenser40. En annen vanlig teknikk involverer gruppering mikrober tilstede på < 1% i en "sjeldne" kategori under forutsetning av at mikrobielle forurensninger er sjelden i virkelige eksempler8,41. Men kan denne metoden fjerne sant vektor mikrober som finnes på lave antall, spesielt når microbiome er dominert av en endosymbiont sett i I. pacificus og I. holocyclus7,42. I disse tilfellene ville oppdager sjeldne mikrober kreve dypere sekvensering, utvikle primere som hemmer forsterkning av endosymbiont under amplicon PCR42eller beregningsmessig fjerne endosymbiont under rekkefølge analyse 7. velge blant ulike metoder for å adresse sjeldne og miljøgifter OTUs skaper muligheter for subjektivitet og bias i microbiome dataanalyse, noe som kan begrense evnen til å sammenligne resultatene på tvers av studier.

Valg av referansedatabase, nødvendig for å tilordne taksonomi og Fylogenetiske informasjon til sekvens leser, presenterer en mulighet for divergens og subjektivitet. Mens oppgaven knyttet sekvens leser fra en variabel gen-regionen til en identifisert overordnede genom er iboende utfordrende, er en pålitelig referansedatabase avgjørende for nøyaktig Fylogenetiske tildeling. Flere databaser har dukket opp for å møte denne utfordringen som SILVA43, Greengenes44, RDP45og NCBI46. SILVA er den største av de 16S-baserte taksonomiene, men SILVA, i tillegg til RDP, bare gir taksonomiske informasjon ned til slekten nivå. Greengenes gir arter-nivå informasjon og er inkludert i metagenomic analyser pakker som QIIME, men det er ikke oppdatert i over fire år. NCBI, mens ikke en primær kilde for taksonomisk informasjon, gir daglig oppdaterte klassifiseringer fra brukerutsendt sekvenser, men det er uncurated. Mens utvalg blant databasene er vanligvis avhengig av brukernes behov når det gjelder oppløsning, dekning og valuta, har en betydelig innvirkning på Fylogenetiske tildeling og nedstrøms47,48. Konsensus blant etterforskere om hvilke referansedatabase bruke er avgjørende for å unngå ytterligere skjevhet i analyser.

Standard tilnærmingsmåter til disse databehandling utfordringer vil trolig fremstå som 16S rRNA sekvensering blir en stadig mer vanlig teknikk. Fortsatt reduksjoner i sekvensering og vil ytterligere popularisere denne metoden. Økt bruk av denne teknologien vil gjøre dypere undersøkelser i sammensetning og økologi av vektor microbiomes under ulike forhold. Kunnskap om vektor microbiome biologi er fortsatt i sin barndom, er disse typer beskrivende studier en kritisk første skritt før forsøk på å utnytte microbiome for vektor kontroll. Men for å virkelig forstå rollen microbiome i patogen overføring, må mikrobielle identifikasjon være kombinert med kunnskap om disse mikrobene funksjonelle rolle. RNA sekvensering og transcriptomic tilnærminger, som involverer kartlegging og kvantifisere genuttrykk, aktiverer slutninger i funksjonelle rolle mikrober men krever dyp sekvensering og ferdig montert genomer av målet artene. Omgå disse utfordringene, beregningsorientert verktøy for å forutsi funksjonelle komposisjon fra 16S rRNA sekvensering data har nylig blitt utviklet, men ikke er allment vedtatt ennå49. Utviklingen av slike verktøy, i tillegg til økologiske teori, knytte mikrobiell identitet og funksjonelle rolle innen vektorer vil øke nytten av 16S rRNA sekvensering data i vektor microbiome studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation gir AS (DEB #1427772, 1745411, 1750037).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Item Name of Material/Equipment Company Catalog #
1 DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
2 Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Scientific Q3326
3 NanoDrop 8000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-8000-GL
4 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa Biosystems KK2501
5 AMPure XP beads Agen Court A63880 
6 Magnetic Rack ThermoFisher Scientific MR02
6 TE buffer Teknova T0223
7 Nextera Index Kit Illumina FC-121-1011
8 KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824
9 MiSeq System Illumina SY-410-1003
10 MiSeq Reagent Kit v3  Illumina MS-102-3001
11 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 Teknova T7724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
  2. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
  3. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  4. Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
  5. Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
  6. van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
  7. Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
  8. Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
  9. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  10. Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
  11. Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
  12. Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
  13. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
  14. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  15. Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
  16. Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
  17. Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
  18. Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
  19. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  20. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
  21. Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
  22. Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
  23. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  24. TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
  25. Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
  26. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
  27. Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  28. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
  29. Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
  30. Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
  31. Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
  33. Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
  34. Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
  35. Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
  36. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
  37. Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
  38. Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
  39. McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
  40. Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
  41. Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
  42. Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
  43. Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
  44. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  45. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
  46. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
  47. Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
  48. Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
  49. Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).

Tags

Biologi problemet 138 Tick vektor microbiome 16S rRNA amplicon neste generasjons sekvensering Ixodes
Tick Microbiome karakterisering av neste generasjons 16S rRNA Amplicon sekvenser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Couper, L., Swei, A. Tick Microbiome More

Couper, L., Swei, A. Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (138), e58239, doi:10.3791/58239 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter