Summary
Burada bir nesil sıralama iletişim kuralı kimliği ve mikrobiyal topluluklar vektörel çizimler içinde karakterizasyonu sağlayan 16S rRNA sıralama için mevcut. Bu yöntem, DNA ekstraksiyon, amplifikasyon ve barkodlama filogenetik bilgi için sıra verileri eşleştirmek için bir akış-hücre ve Biyoinformatik üzerinde sıralama PCR aracılığıyla örnekleri içerir.
Abstract
Son yıllarda, vektör kaynaklı hastalıklar yeniden ortaya çıktı ve fiyatlar, önemli morbidite ve mortalite dünya çapında neden endişe verici genişletilmiş. Etkili ve yaygın olarak kullanılan aşılar roman hastalığı azaltma stratejileri geliştirme gerektiren bir çoğunluğu bu hastalıklar için eksik vardır. Bu amaçla, hastalık kontrol umut verici bir cadde vektör microbiome, topluluk vektör yaşayan mikroplar hedef belirleme içerir. Vektör microbiome patojen dinamiklerini çok önemli bir rol oynar ve microbiome işlemler indirimli vektör vektör kaynaklı hastalıklar bir avuç bereket veya patojen iletiminde yol açmıştır. Ancak bu bulgular hastalık kontrol uygulamaları içine çeviri vektör mikrobiyal ekoloji, tarihsel olarak bu alanda yetersiz teknoloji tarafından sınırlı kapsamlı bir anlayış gerektirir. Yeni nesil sıralama yaklaşımlar gelişiyle hızlı, son derece paralel sıralama çeşitli mikrobiyal toplulukların sağlamıştır. Son derece korunmuş 16S rRNA gen hedefleme karakterizasyonu mikroplar ekolojik ve deneysel koşullar değişen altında vektörel çizimler içinde mevcut kolaylaştırdı. Bu tekniği 16S rRNA gen, PCR, sıralama için bir akış hücre üzerine yükleme örnekleri ile örnek barkodlama amplifikasyon içerir ve filogenetik bilgileriyle sıra verileri eşleştirmek için Biyoinformatik yaklaşımlar. Türler veya çoğaltır yüksek bir dizi için cins düzeyi kimlik genellikle böylece alçak hafiye, çözünürlük ve çıkış geleneksel kültür, mikroskopi veya histolojik boyama engellemeyi bu yaklaşım yoluyla elde edilebilir teknikleri. Bu nedenle, bu yöntem vektör mikroplar çeşitli koşullar altında karakterize için uygundur ancak bilgileri şu anda sağlayamaz mikrobiyal işlevi, konumu vektör veya antibiyotik tedavisine yanıt içinde tarih. Genel olarak, 16S yeni nesil sıralama kimlik ve vektör mikroplar hastalık dinamikleri rolünü daha iyi anlamak için güçlü bir tekniktir.
Introduction
Diriliş ve vektör kaynaklı hastalıkların yayılması olarak son yıllarda küresel insan ve yabani hayvanlar ve bitkiler sağlık için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Etkili aşılar bu hastalıkların bir çoğu için eksik olan ve denetim çabaları vektörel çizimler ve vektör-host etkileşimleri karmaşık biyolojik doğası tarafından engellemiştir. Mikrobiyal etkileşim bir vektör patojen iletim içindeki rolünün anlaşılması için bu zorlukları aşmak roman strateji geliştirme izin verebilirsiniz. Özellikle, mikrobiyal commensals vektör ilişkili, simbiont ve patojenler, microbiome anılacaktır arasındaki etkileşimler patojen iletimi için önemli sonuçları olabilir. Şimdi kanıt ezici bu iddianın vektör microbiome ve sıtma, Zika virüs ve Lyme hastalığı1,2,3gibi hastalıklar için yetki arasında bir bağlantı gösteren örnekler ile destekler. Ancak bu bulgular hastalık kontrol stratejileri içine çeviri yapı, fonksiyon ve vektör microbiomes kökeni çok daha detaylı bir anlayış gerektirir. Kimlik ve ekolojik ve deneysel koşullar değişen altında vektör mikrobiyal topluluk karakterizasyonu bu alanda önemli bir yol oluşturur.
Bir patojen vektör mikrobiyal sakinleri tanımlamak için bir yordam burada Batı siyah bacaklı kene, Ixodes pacificus, Lyme hastalığı Borrelia burgdorferipatojen bir vektör tür kullanarak sağlanır. Nispeten az insan patojenleri daha fazla tür herhangi bir diğer eklem bacaklılar daha keneler liman iken, kene microbiomes4biyoloji ve topluluk ekolojisi hakkında bilinir. Bu kenelerin virüs, bakteri, mantar ve commensals, endosymbionts ve geçici mikrobiyal sakinleri5,4dahil protozoa çeşitli bir dizi liman açıktır. Ön çalışma güçlü Ixodes microbiomes coğrafya, türler, seks, hayat sahne ve kan yemek kaynak6,7,8ile ilişkili değişimler göstermiştir. Ancak, bu varyasyon yatan mekanizmaları bilinmeyen kalır ve daha ayrıntılı araştırmalar kökeni ve mikrobiyal bu toplulukların Meclisi garanti. Keneler mikroplar dikey iletim yoluyla elde ana bilgisayarlar ve vızıltısı, ağız ve anal gözenek9ortamından alımı ile ilgili. İlk oluşumu ve kene microbiome gelişimini şekillendirme faktörleri anlama, dikey ve çevresel iletim, özellikle göreli katkısını doğal desenler ve kene değişimleri anlamak için önemli microbiome çeşitlilik ve nasıl hastalık ya da vektör kontrol etmek mümkün uygulamalarla patojen iletim sırasında bu toplulukların etkileşim.
Yeni nesil sıralama gibi güçlü moleküler teknikler şimdi mikrobiyal toplulukları tanımlamak için mevcut ve vektör microbiomes çeşitli çevresel veya deneysel koşullar altında karakterize etmek için istihdam edilebilir. Bu yüksek üretilen iş sıralama yaklaşımlar gelişiyle önce mikroplar tanımlaması ağırlıklı olarak mikroskobu ve kültür üzerine dayanıyordu. Mikroskopi hızlı ve kolay bir tekniktir, mikroplar tanımlamak için morfolojik yöntemleri doğal olarak öznel ve kaba ve düşük duyarlılık ve algılama10tarafından sınırlı iken. Kültür tabanlı yöntemleri mikrobiyal tanımlama için genel olarak kullanılan ve ilaç tedavileri11mikroplar duyarlılık belirlemek için kullanılabilir. Ancak, çevre mikroplar az % 212ayarlama bir laboratuarda kültürlü olduğunu tahmin ediyor gibi bu yöntem aynı zamanda düşük duyarlılık uğrar. Histolojik boyama yaklaşımlar da algılamak ve belirli mikroplar vektörel çizimler içinde Yerelleştir, araştırmalar kene içinde çeşitli takson dağılımları etkinleştirmek ve mikrobiyal etkileşim hakkında hipotezler incelemek için istihdam edilmiştir. Ancak, mikrobiyal kimliğinin ön bilgi hasta uygun mikrobiyal karakterizasyonu ve kimlik için bu yaklaşım yapmak uygun lekeleri seçmek için gereklidir. Ayrıca, histolojik boyama çok zaman yoğun, zahmetli bir süreç ve iyi örneklerin boyutu büyük ölçekli değil. Sıralama aynı şekilde onların duyarlılık ve algılama mikrobiyal çeşitli toplulukların sınırlı Sanger gibi geleneksel moleküler yaklaşımlar.
Çok sayıda örnekleri üzerinden mikroplar hızlı tanımlanması için yeni nesil sıralama sağlar. Standart marker gen ve başvuru veritabanları daha fazla sağlar geliştirilmiş cins veya tür seviyesine kez taksonomik çözünürlük. Küçük alt birimi ribozomal RNA'ların 16S rRNA gen içinde korunmuş ve değişken bölgeler varlığı nedeniyle en yaygın olanıdır her bakteriyel için benzersiz amplicons ile evrensel astar oluşturmak için izin ile bu hedefe ulaşmak için sık sık kullanılır tür13,14. Bu rapor 16S rRNA yeni nesil sıralama ile kene microbiome takson tanımlamak için bir yordam ayrıntıları. Özellikle, bu protokolü örnekleri sıralama için hazırlanmasında ilgili adımlar vurgular. Daha tafsilât üstünde nasıl yapılacağını yaygın ve Biyoinformatik adımlar sağlanmaktadır, şu anda mevcut, çeşitli sıralama platformları ve analiz programları gibi her biri ayrıntılı varolan belgeleri. Bu yeni nesil sıralama yaklaşımın genel fizibilite soruşturma mikrobiyal topluluk derleme içinde bir anahtar hastalık vektör uygulayarak gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. toplama ve yüzey sterilizasyon kene
- Kene keneler kaldırma bir kene ilişkili yaşam alanı içinde bir 1 m2 beyaz bez sürükleyerek ana türler için bağlı veya yetiştirme keneler lab15,16' toplamak. İyi forseps keneler işlemek ve onları-80 ° C'de depolamak için kullanın.
- Bireysel PCR tüplerde keneler yerleştirin ve vortexing 15 yüzey kirletici kaldırmak s 500 μL hidrojen peroksit (H2O2), % 70 etanol ve GKD2O. ile Art arda
- Keneler yeni bir PCR tüpü yerleştirin ve onları kurumasını sağlar.
- Bu tüp mekanik harcı ve küçük boncuk boncuk çırpıcı içinde kullanarak, (Bu çalışmada kullanılan) havaneli keneler kırma tarafından kene doku bozabilir veya kene apart bir neşter ile kesme.
2. DNA arıtma
- Bireysel keneler, piyasada bulunan bir DNA ekstraksiyon kiti sağlanan yönergeleri izleyerek gelen DNA arındırmak. 100 μL son bir hacim için elute.
Not: resim 1 ' e adımları 2.2-2.8 için genel bakış konusuna bakın. Fenol kloroform ayıklama17,18, etanol yağış19veya ayıklama bir bağlayıcı malzeme20,21ile alternatif çıkarma yöntemleri içerir. - Bir yer veya spektrofotometre kullanarak başarılı DNA arıtma onaylayın. Fluorometry için DNA şablonunun 10 μL 190 μL çift iplikçikli DNA assay olarak kullanın. 0.1-1.0 beklenen verimidir ng/μL22. Spectrophotometry için bir nükleik asit miktar 1 μL DNA şablonu kullanın. Beklenen A260/280 oranı yaklaşık 1.823' tür.
- Eğer değilse geçmeden hemen amplifikasyon, örnekleri-20 ° C'de depolayın
3. 16S rRNA gen amplifikasyon
- Amplicon PCR içeren bir 27,5 μL tepki olarak ayarlayın: 5 μL her astar, 1 mikron; 12.5 μL piyasada bulunan PCR karışımı; ve bir 5 ng/μL konsantrasyon, bireysel keneler çıkarılan DNA'ın 5 μL.
Not: aşağıdaki astar hypervariable V3 V4 bölge 16S rRNA gen13amplifikasyon için kullanın:
5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3',
5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3' - Tüpler için programlanmış bir thermocycler gider: ilk denatürasyon 95 ° c 3 dakika; 1) 95 ° C 25 döngüleri için 30 s, 2) 57 ° C 30 s, 30 3) 72 ° C s; Son bir uzantısı 72 ° c 5 min için; ve son bir tutun 10 ° C'de
- PCR işlem tamamlandıktan sonra PCR ürünü 4-6 μL/örnek % 1.5 özel jel üzerinde yükleyerek görselleştirin. 460 adlı bir grup için bak bp amplifikasyon onaylamak için.
Not: örnek konsantrasyon çok düşükse Amplicon PCR ürünü jel üzerinde görünür olmayabilir (< 10 ng). Astar dimer varlığı düşük konsantrasyon örneklerinde yaygındır. Diğer hedef grup varsa, tavlama sıcaklığı ayarlayın veya devir sayısını azaltın. - Eğer değilse geçmeden hemen arıtma, örnekleri 4 ° C'de depolayın
4. 16S Amplicon arıtma
- Yeni bir PCR tüp her örnek için kullanarak, PCR ürünü 60 μL toplam edinme GKD2ile O birleştirmek. Düşük DNA konsantrasyonları ile örnekleri için amplicon PCR güçlendirme önyargı azaltmak ve konsantre örnekleri havuz nüsha gerçekleştirin.
- Paramagnetic boncuk oda sıcaklığında ve girdap onları kullanmadan önce iyi getirmek.
- Paramagnetic boncuk 48 μL örnek 60 μL ekleyin ve 5 dk. 5 çözüm şeklini alıncaya kadar min için manyetik bir raf üzerine boruları temizle yer kuluçkaya. Süpernatant kaldırın.
Not: Bu boncuk konsantrasyon astar dimer (< 60 bp) kaldırılmasını hedefler. Gerekirse, diğer non-spesifik bantlama kaldırmak için boncuk konsantrasyon belirleyin. - Manyetik raf üzerine boruları ile taze hazırlanmış %80 500 μL eklemek alkol. Alkol tüm tüpler için hemen ekledikten sonra sıvı pipet. Boncuk kaldırmaz. Alkol eklendiğini ve kaldırıldığını bir kez daha yineleyin.
- Aşırı alkol tüplerin açık 5 min için veya küçük çatlaklar boncuklar görünür hale gelene kadar manyetik raf üzerinde bırakarak kaldırmak için örnekleri kuruması.
- TE arabelleği 20 μL ekleyin ve 5-10dk için oda sıcaklığında mıknatıs kapalı örnekleri kuluçkaya.
- Tüpler üzerinde geri mıknatıs yerleştirin. Bir kez boncuk ve sıvı ayrılmıştır, süpernatant temizlenmiş PCR ürünü elde etmek için taze bir tüp aktarın.
- (İsteğe bağlı) 4-6 μL/örnek % 1.5 jel üzerinde yükleyerek başarılı amplicon arıtma onaylamak için ürün görselleştirme. 460 bp grup görünür olmalı ve hiçbir astar dimer olmalıdır.
- Hemen PCR dizini devam değil örnekleri saklayabilirsiniz 4 ° C.
5. örnek tedarikçilerden ve arıtma
- Benzersiz astar bileşimleri her örnek için ileriye veya geriye doğru astar veya her ikisini de bir ticari olarak mevcut Kütüphane Dizin Takımı'ndan seçerek atayın.
Not: Benzersiz olarak etiketleme örnekleri sıralama sonra farklılaşma sağlar. Kitleri genellikle 96-384 örneklerini sıralamak için yeterli astar sağlar. - Çift astar veya endeksi, her astar (N7xx ve S5xx), 12,5 μL piyasada bulunan PCR ana Mix, GKD2O 5 μL ve temizlenmiş amplicon ürünün 2.5 μL 2.5 μL içeren bir 25 μL reaksiyon PCR gerçekleştirerek örnekleri iliştirin.
- Tüpler için programlanmış bir thermocycler gider: ilk denatürasyon 95 ° c 3 dakika; 1) 95 ° c 8-14 devredir 30 s, 2) 55 ° C 30 s, 30 3) 72 ° C s; Son bir uzantısı 72 ° c 5 min için; ve son bir tutun 10 ° C'de
- PCR işlem tamamlandıktan sonra PCR ürünü 4-6 μL/örnek % 1.5 özel jel üzerinde yükleyerek görselleştirin. 550 bir band arayın bp amplifikasyon onaylamak için.
Not: görselleştirme sonuçları Dizin PCR Bisiklet koşullarını bildirmek için kullanabilirsiniz. Non-spesifik bağlama azaltmak veya her örnek için görünür bantları elde etmek için döngü sayımı artırmak için döngü sayısını düşürmesi. - 4. adımda listelenen temizlik yordamı yineleyin. Seyreltme temizlik sırasında önlemek için içinde yinelenen dizin PCR gerçekleştirmek ve ürün burada havuz.
- Eğer değilse geçmeden hemen Kütüphane miktar ve normalleştirme, örnekleri 4 ° C'de depolayın
6. Kütüphane miktar ve normalleştirme
- Her arıtılmış, barkodlu ürün--dan adım bir yer veya spektrofotometre kullanarak 5.5 konsantrasyonu tahmin (bkz. Adım 2.2). Yaklaşık 1 de konsantrasyonları elde etmek TE arabellek örneklerinde sulandırmak.
Not: Kütüphane miktar konsantrasyon sıralama platformu için önerilen yükleme örnek sağlamak gereklidir. Kütüphane miktar qPCR elde edilir, ama örnek konsantrasyon qPCR önce tahmin reaktifler ve zaman kazandırır. Bu miktar Seti24' te sağlanan qPCR standartları ortalama yoğunlukta olduğu gibi 1 de konsantrasyon Kütüphane miktar, doğruluğunu en üst düzeye çıkarmak için önerilir. - QPCR qPCR ana mix (kütüphane miktar kitinden), GKD2O 2.0 μL ve 2.0 μL örnek veya Standart 6.0 μL içeren bir 10 μL reaksiyonu gerçekleştirmek. Her örnek ve standart büyük doğruluk ve kesinlik için nüsha olarak çalıştırın. Üç veya daha fazla seyreltme düzeylerinde her örneği çalıştırmak (Örn., 0 pm 1, 1 pm ve 10 pm için tahmini başlangıç konsantrasyonu) doğru miktar emin olmak için.
Not: Sağlanan astar ve standartları hakkında ayrıntılı bilgi kullanılan miktar kiti göre değişir ve ürünler teknik data sayfasında mevcuttur. Bu çalışmada kullanılan miktar kit için Malzemeler tablo bakın. - QPCR plaka veya borular için programlanmış bir gerçek zamanlı PCR araç taşıma: bir ilk denatürasyon 95 ° c 5 dakika; 1) 95 ° C 35 döngüleri 30 ve 45 için 2) 60 ° C için s; ve ayrılma adım 1) 95 ° C 15 / s, 2) 60 ° C 30 s ve 3) 95 ° C 15 s.
- Konsantrasyon qPCR sonuçlarından elde edilen miktar değerler ve kullanılan örnek seyreltme düzeyleri kullanarak her örnek için başlangıç ortalamasını hesapla.
Not: Örneğin, 2 de seyreltilmiş örnek 1:100,000 için Ortalama bir yoğunlukta bir özgün başlangıç konsantrasyonu 200 verir. nM. Belirli bir örnek için seyreltme seviyeleri hiçbiri standart eğrileri aralığı içinde düşerse, miktar sonuçlar doğru olmayabilir; Bu durumda, seyreltme düzeylerini ayarlamak ve qPCR yeniden gerçekleştirin. - Arıtılmış, barkodlu örnekleri 4 seyreltik nM üzerinde ortalama konsantrasyonları dayalı TE arabellekte hesaplanan adım 7,5.
Not: Örneğin, bir ortalama örnek konsantrasyonu 200 nM, seyreltik örnek 1:50 te arabellek 4 nM konsantrasyonu elde etmek için. Kesin örnek konsantrasyon kullanılan sıralama sistemi ve reaktif kiti göre değişir. Önerilen konsantrasyon için sıralama sistemi kullanıcı kılavuzuna bakın. - Birleşik kitaplığı eşit birimleri (genellikle 5-10 μL) ekleyerek tüm bireysel kütüphanelerin tek bir tüp oluşturun.
Not: tüm örneklerini bir 4 nM konsantrasyonu, olması gerektiği gibi eşit birimleri ekleme havuza alınan kitaplığındaki tüm örnekleri eşit bir konsantrasyon sağlar. - 6.2-6.4 4 nM konsantrasyon onaylamak için birleştirilmiş belge kitaplığını adımları yineleyin.
- Birleşik kitaplığı toplama hesaplamak ve seyreltik veya Kütüphane Tris arabellek 4 ulaşmak için gerektiği gibi kullanarak son, havuza alınan yeniden teşkil nM.
- Eğer değilse geçmeden hemen örnek yükleme, örnekleri-20 ° C'de depolayın Miktar kaybı veya DNA toplama depolama sırasında değişiklikleri en aza indirmek için kısa bir süre sonra çalıştırmak sıralama gerçekleştirir.
7. Kütüphane denatürasyon ve seyreltme ve sıralama çalıştırın (aynı gün gerçekleştirmek)
- Adım 6,9 NaOH ile 4 nM kombine kitaplığından denatüre.
Not: Son Kütüphane hazırlık adımları her sıralama sistemi için farklı. Daha detaylı ve güncel iletişim kuralları için sıralama sistemi kullanıcı kılavuzuna bakın. Yeni kullanıcılar büyük olasılıkla sıralama platform kullanımı hakkında eğitimli olması gerekir veya arşivlerine bir çekirdek sıralama tesisine gönderebilir. - Sıralama reaktif kiti (Tablo reçetesi) sağlanan arabellek kullanarak istenen yükleme konsantrasyon denatüre kitaplığına sulandırmak.
Not: Sıralama sistemi ve genellikle 1-250 pM25arasında değişen tarafından en uygun yükleme konsantrasyonları farklılık. - Denatüre ve sıralama denetimi oranında seyreltin.
Not: sıralama denetimi ekleme düşük çeşitlilik kitaplıklardan doğan sıralama sorunları düzeltir. NaOH kullanarak sıralama denetimini tabiatını ve Kütüphane olarak aynı konsantrasyonu oranında seyreltin. - Kütüphane ve sıralama denetimi birleştirir.
Not: Sıralama denetimini Birleşik kitaplığı için oranını Kütüphane çeşitlilik ve kullanılan sıralama sistemi üzerinde bağlıdır, ama genellikle 11:2626öyle. - Birleşik kitaplığı ve sıralama kontrol karışımı sıralama akışı hücre üzerine yükleyin.
8. Amplicon dizi analizi
- Çalıştır genel başarısı kullanılan sıralama sistemi karşılık gelen bulut bilgi işlem ortamı üzerinde çalışma ölçümleri inceleyerek değerlendirmek.
Not: Sıralama okuma, sayısı gibi çalışma ölçümleri platformu ve reaktif kiti kullanılan sıralama göre değişir. Genel sıralama sistemleri için hedef değerleri Tablo 1' de listelenmiştir. - Ham sıralama veri indirme ve istenen Biyoinformatik açık kaynak bilgisayar yazılımı, mikrobiyal ekoloji (QIIME)27 veya Mothur28nicel anlayışlar.
Not: Her ikisi de QIIME ve Mothur açık kaynak ve ücretsiz olarak yüklenebilir. Bu programları kullanma hakkında ayrıntılı yönergeler çevrimiçi bulunabilir ve ilk kez kullananlar için yeterince ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Aşağıdaki adımları bir Biyoinformatik boru hattı QIIME içinde yürütülen geniş bir genel bakış sağlar. Python ile aşinalık gerekli değildir ancak aşağıdaki komut dosyaları uygulanması kolaylaştıracak - Oluşturun ve QIIME içinde "validate_mapping_file.py" komut dosyası kullanarak eşleme dosyası doğrulayın.
Not: Eşleme dosyası örnek kimliği, amplicon astar dizileri ve örnek açıklama da dahil olmak üzere veri analizi yapmak gerekli tüm meta veriler içerir. Doğrulama adım gerekli tüm veriler doğru biçimde girilen denetler. - Demultiplex ve dizileri "split_libraries.py" komut dosyası (Şekil 1) kullanarak filtre uygulayabilirsiniz.
Not: Bu komut dosyası örnekleri dizin astar kombinasyonlarını temel alarak barkodlu okuma atar ve örnek kimliği eşleme dosyasında girdi. Ayrıca çeşitli kalite adımları hata Kullanıcı tanımlı kesintileri en düşük kalite puanı, sırası uzunlukları ve bitiş kırpma için temel sıralama için denetlemek için filtreleme yapar. - Operasyonel taksonomik birimleri (OTUs) serileri "pick_open_references_otus.py" komut dosyası kullanarak atayın.
Not: Bu adımda, kimlik (%97) bir eşiğe göre başvuru sıra koleksiyon karşı dizileri kümelenir. Başvuru sıra koleksiyon eşleşmiyor okuma birbirlerine karşı kümelenir. De novo ve kapalı-başvuru OTU malzeme çekme seçenekleri de mevcuttur, ancak açık-referans malzeme çekme QIIME geliştiriciler tarafından önerilir. - "Alpha_rarefaction.py" veya "normalize_table.py" komut dosyası kullanarak OTU tablo normalize.
Not: Sütun toplamları varyasyon için bu adım düzeltir veya modern sıralama teknolojilerinden neden örnek başına toplam serisi okur. Normalleştirme gerçekleştirilen geleneksel rarefaction, kullanarak ya da kümülatif toplamı ölçekleme gibi alternatif yöntemler aracılığıyla. - Birkaç Alfa-çeşitlilik, beta-çeşitlilik ve "core_diversity_analysis.py" komut dosyası kullanarak tek seferde taksonomik kompozisyon çeşitlilik analizleri gerçekleştirmek.
Not: Alternatif olarak, bu analizleri ayrı olarak bireysel komut dosyaları kullanarak çalıştırılabilir (Örneğin, "alpha_diversity.py").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üç ayrı yumurtadan 42 keneler toplam debriyajlar ve iki çevre pozlama süreleri, 0 ve 2 hafta içinde toprak, microbiome sıralama için işlenen. Her tedavi grubu, 6-8 kene örnekleri çoğaltmak bulunan tek bir debriyaj ve pozlama zaman, olarak kabul. Bu işlenmiş kene özleri yeni nesil sekanslama dolu ve filtre geçen 12,885,713 eşleştirilmiş uç okuma vermiştir. Bu çalışmasında yer dahil 211,214 okuma (önceki sayıma dahil) Toplam verimli ayıklama adım 3 negatif kontrol edildi. Daha fazla çalışma kalitesi ölçümleri ile birlikte her ölçüm için en uygun değerleri Tablo 2' de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. OTUs sayısı bir sıralama derinlik, ya da sayı-in örnek benzersiz sıra okur 2,129 okur sayısı yeterli mikrobiyal topluluk (çeşitliliği yakalamak yeterli olacağını belirtilen örnek başına sıralaması çaba ilgili rarefaction eğrileri Şekil 2). Rarefaction düzeyleri örnek türüne göre değişir ve tek tek her sıralama çalıştırmak için belirlenmelidir. Bu derinlik arıtılmış sonra 1,714 OTUs tüm örnekler üzerindeki 93,3 ± 4.3 OTUs örnek başına ortalama ile tespit edilmiştir. Aşağı akım Analizi önlemek için seyrek matrisler ve potansiyel kirletici maddeleri, en az bir örneği ≥ % 1'bereket ' bulunamadı tüm OTUs kaldırmak için ortaya çıkan sorunları nadir bir genel kategoride havuza. Ayrıca, R decontam paketinde gerçek örnekleri göre negatif denetimlerde aşırı temsil OTUs tanımlamak için kullanılmıştır ve bu OTUs aşağı akım Analizi çıkarıldı.
Alfa çeşitlilik, beta çeşitlilik ve basit Biyoinformatik boru hattı kullanılarak oluşturulan sınıflandırma kompozisyon çeşitlilik çıkış türlerini göstermek için QIIME çeşitlilik analizleri iş akışı kullanarak topluluk ekoloji analizleri yapıldı. Örneğin, ağırlıklı ve unweighted Unifrac asıl koordinatları analizleri "core_diversity_analyses.py" komut dosyası kullanılarak üretildi ve larva keneler debriyaj kimliğini (Şekil 3) alarak kayma kümeleme açığa vurmuştur. Öğretici Boxplots OTU değişen çevre pozlama kez da bu komut dosyası aracılığıyla oluşturulan zaman (Şekil 4) içinde microbiome türlerin zenginliği farklılıkları gösteren sayar. Bu alpha ve beta çeşitlilik analizleri eşleme dosyasında listelenen kullanıcı tanımlı kategoriler temelinde gerçekleştirilir, ancak rakamlar ve istatistikler genel taksonomik bilgi aynı zamanda tüm örnekleri (Şekil 5) oluşturulur.
Resim 1 : Microbiome sıralama iş akışı. Microbiome sıralama iş akışı önemli adımlar arama-çıkışları Kütüphane hazırlık ve sıralamanın analysis adımlar ile görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Rarefaction eğrileri sırası için saymak normalleştirme. Rarefaction eğriler, keneler, her kohort için gösterilen çaba örnekleme için gözlenen OTU sayıları ilgili. Hata çubukları Çoğalt örnekleri her debriyaj içinde mevcut nedeniyle varsa ve bir standart sapma gösterir. Bir sıralama derinlik ya da nerede eğri yeterince OTUs tam çeşitliliği yakalamak için kararlı hale noktanın seçili olmalıdır. Burada, 2.000 okuma sıralama derinliği uygun görünür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Debriyaj göre analiz koordine müdür. Unweighted Unifrac asıl koordinat analiz (PCoA) microbiome kompozisyon larva dilimleri farklı kavramalar ve yetişkin arasında değişim göstermektedir. Her veri noktası bir bireysel kene gösterir. Bu rakam QIIME "core_diversity_analyses.py" komut dosyası otomatik olarak oluşturulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Alfa çeşitlilik öğretici pozlama süresi tarafından boxplots. OTU gösteren öğretici Boxplots çevre pozlama gruplar gösteri değişim için zaman içinde mikrobiyal çeşitlilik içinde sayar. Bu rakam QIIME "core_diversity_analyses.py" komut dosyası otomatik olarak oluşturulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Şube düzeyinde mikrobiyal tanımlama için debriyaj bir. Microbiome kompozisyon debriyaj bir bireysel kene örnekleri için şube düzeyinde gösterilir. Bu şekil, hem de daha alt düzeylerde yer taksonomik, Özet bilgileri otomatik olarak QIIME "core_diversity_analyses.py" komut dosyası oluşturulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Metrik | Tanımı | Sonuçlarımız (MiSeq V3) | MiSeq V3 görüntülemek için | HiSeq hızlı modunda görüntülemek için | |
| PF okur | Sıralama sayısı iffet filtre geçen okur. 1'den çok temel arama ilk 25 döngülerle 0,6 aşağıda bir bekaret değer varsa bir okuma filtre geçer | 12,885,713 | 14-16 milyon | 600 milyon | |
| Hata oranı | Baz çifti bir döngüsü sırasında yanlış denilen okuma dayalı yüzdesi PhiX denetimine hizalı | 3.28 ±0.10 | * Diğer ölçümler için değerleri bağlıdır | * Diğer ölçümler için değerleri bağlıdır | |
| % ≥Q30 | Üsleri ile Q puanı ≥ 30, % 99.9 temel arama doğruluğunu gösteren yüzdesi | 68.94 | > %70 | > %80 | |
| Küme PF (%) | İffet filtre geçen kümeleri yüzdesi. | 85.61 ±0.81 | % 90 | % 90 | |
| Yoğunluk | Flowcell - veri kalitesi ve çıkış için anahtar bir ölçüm üzerinde küme yoğunluğu | 552 ± 35 küme/mm ^ 2 | 1200-1400 küme/mm ^ 2 | 850-1000 küme/mm ^ 2 | |
Tablo 1: Anahtar performans parametrelerini NGS çıktı. Bu çalışmada (Malzemeler tablo) ve bir % 25 sıralama denetimi ek kullanılan sıralama platform ve reaktif kiti tabanlı kullanıcı veri ve hedef değerleri bildirdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yeni nesil sıralama 16S rRNA, mikrobiyal tanımlama için standart bir yaklaşım haline ve vektör microbiomes patojen iletim etkilemesi çalışma etkin. Burada özetlenen protokolü, ı. pacificus, Lyme hastalığı için bir vektör tür derlemede mikrobiyal topluluk araştırmak için bu yöntemin kullanılması detayları; Ancak, bu kolayca diğer kene türleri veya vektörel arthropod türlerin çalışma için uygulanabilir.
Nitekim, 16S rRNA sıralama microbiome analiz için sivrisinek, psyllids ve Çeçe sinekleri29,30,31gibi vektörel çizimler microbiomes çalışmaya genel olarak kullanılmıştır. Vektörel çizimler içinde mikrobiyal tanımlama için diğer yöntemleri mikroskobu, kültür ve histolojik boyama içerir. Bu yöntemlerin daha Eğer amaç tanımlamak ve Roman mikrop (mikroskopi) tanımlamak, antimikrobiyal ilaçlar (kültür) etkisini değerlendirmek veya belirli ve bilinen mikrop (histolojik boyama) vektör içinde yerelleştirmek için sıralama daha uygun olabilir. Ancak, bu yöntem düşük özgüllük, algılama ve ölçeklenebilirlik muzdarip ve böylece mikroplar bir vektör içinde tam topluluğu tanımlayan veya değişen altında vektör microbiome ekolojik ve deneysel karakterize için daha az uygun olan koşullar. Diğer taraftan, yüksek üretilen iş sıralama 16S rRNA gen düşük-bereket ve culturable bakteri tanımlaması sağlar, yüksek çözünürlüklü ve kapsamlı referans veritabanları verilen algılama sağlar ve yüksek çoğaltma bağlı olarak sağlayabilir kapsama ihtiyaçlarına.
16S rRNA sıralama şimdi yaygın olarak mikrobiyal tanımlama için kullanılırken, bu teknik sınırlamalar değildir. Prensip olarak, mikrobiyal kirlenme sıralama sonuçlarının yorumlanması karanlık ve biyolojik anlamı32yıkmak. Ayrıca, evrensel bakteriyel astar ve hassasiyeti kullanımı düşük için verilen 16S rRNA sıralama için doğal konsantrasyonları, mikrobiyal kirlenme ortak32ulaşıyor. PCR reaktifler, DNA ekstraksiyon kitleri, laboratuvar yüzeyler ve deri ve giyim araştırmacılar33,34,35kirlenme kaynakları içerir. Negatif kontrolleri ve teknik çoğaltır, kullanarak bir steril laboratuvar ortamında çalışarak mikrobiyal kirleticiler etkilerini en aza indirilebilir ve tüm kitleri ve Kimyasalları kaydını tutmak36kullanılan.
Mikrobiyal kontaminasyon ek olarak, düşük kaliteli sıralama çıktı microbiome sıralama veri kullanılabilirliğini büyük ölçüde azaltabilir. Veri kalitesi çalışma ölçümleri filtre, bir Q-puan (Bankası-arama hata tahmini olasılık ölçüsüdür) 30 ve küme yoğunluğu üzerinde okuma yüzdesi geçen okuma sayısı da dahil olmak üzere bir dizi tarafından tespit edilebilir. Bu ölçümler için değerleri sıralama sistemi, reaktif Kartuşu ve kullanılan, Denetim sıralama yüzde çalıştırmak örnek sayısına göre değişir ama en iyi değerleri çalışma koşullara göre online olarak mevcuttur. Özellikle, küme yoğunluğu, Kütüphane küme sıralama önce akış hücrenin belirli bir uçak sayısını veri kalite ve verimi optimize etmek için önemli bir parametredir. Üzerinde ve altında kümeleme veri çıkışı azaltmak ve örnekleri analiz nedeniyle yetersiz kapsama alanı dışında neden. Zavallı küme yoğunluğu kez yanlış Kütüphane miktar yansıtır; Böylece, uygun DNA temizlik, tek tek örnek miktar ve bütün kütüphane miktar gerçekleştirmek için özen gösterilmelidir.
Yüksek veri kalite ve verim elde varsayarsak, büyük veri kümeleri istatistiksel zorlukları aşmak için kullanılan veri analizi farklı yaklaşımlar bu yaklaşımın başka sınırlama poz. Örneğin, adres değişim örnekleri arasında okuma sayıları için birden çok yöntem vardır. Okuma tüm örnekler üzerindeki bir eşit sıralama derinlik elde etmek için alt örnekleme içerir, rarefaction sık sık kullanılır ancak son zamanlarda büyük miktarda veri ve en az sıralama derinlik37 öznel seçim boşa için eleştiri tabi olmuştur ,38,39. Kümülatif toplamı ölçekleme (CSS), tüm sıra okur ama onları sayıları belirli bir yüzde birlik içinde kümülatif toplamı temel tartmak hangi tutar alternatif bir teknik geliştirdi. Ancak, CSS yaygın olarak onun göreli yenilik ve rarefaction varlığı/devamsızlık analizleri önce normalleştirme için onaylanan yarar nedeniyle kabul edilmiş değil.
Standart veri analiz prosedürleri de sıra okuma negatif denetimlerde işlenmesi ve düşük bereket okuma bunlardan ayırt eksik. Belirtildiği gibi negatif denetimleri DNA ekstraksiyon adımda oluşturulan sıralama gerçek vektör microbiome sakinleri mikrobiyal kirleticiler çözümleme sırasında ayırt etmeye yardımcı olmak için önerilir. Henüz, belirlenmesi ve şüpheli kirletici maddeleri süzmek için standart ve istatistiksel olarak sıkı bir yaklaşım bulunmamaktadır. OTUs negatif denetimlerde mevcut tüm örneklerini kaldırmak için ortak bir yaklaşımdır. Ancak, çok büyük olasılıkla bu mikropların kiti reaktifler40yerine gerçek örnekleri kaynaklanan bu yana bu yöntemi aşırı muhafazakar olabilir. Başka bir ortak teknik gruplandırma mikroplar < %1 mevcut mikrobiyal kirleticiler gerçek örnekleri8',41nadirdir varsayımı altında "nadir" bir kategori içine içerir. Ancak, bu yöntem-ebilmek çıkarmak ne zaman özellikle microbiome bir endosymbiont tarafından ı. pacificus ve ı. holocyclus7,42. görüldüğü gibi hakim düşük miktar mevcut olan gerçek vektör mikroplar Bu gibi durumlarda, nadir mikrop tespit endosymbiont amplifikasyon amplicon PCR42sırasında inhibe astar geliştirmek veya hesaplama açısından endosymbiont dizi analizi sırasında kaldırma daha derin sıralama gerektirecektir 7. çeşitli yöntemleri adresine nadir ve kirletici arasında OTUs seçme çalışmalar arasında karşılaştırılması yeteneğini sınırlayabilir microbiome veri analizi öznellik ve önyargı için fırsat oluşturur.
Seçtiğiniz referans veritabanı, Taksonomi ve filogenetik bilgi sıra okuma için atamak için gerekli bir sapma ve öznellik için başka bir fırsat sunuyor. Sıra okuma bir değişken gen bölgesinden bir tanımlanan üst genom ilgili görevi doğal olarak zor olmakla birlikte, güvenilir başvuru veritabanı doğru filogenetik atama için önemlidir. Birden çok veritabanı SILVA43, Greengenes44, RDP45ve NCBI46gibi bu zorluğa karşı çıkmıştır. SILVA 16S tabanlı Taksonomiler SILVA gibi RDP ama büyük, sadece cins düzeyine kadar taksonomik bilgi sağlar. Greengenes türler düzeyi bilgisini sağlar ve QIIME gibi metagenomic analizleri paketleri dahil, ama dört yıldır güncelleştirilmedi. NCBI, not taksonomik bilgi için birincil bir kaynak sırasında Kullanıcı tarafından gönderilen dizilerinden günlük Güncellenme Zamanı sınıflandırmalar sağlar, ancak uncurated. Veritabanları arasında seçim genellikle kullanıcıların gereksinimlerini çözünürlük, kapsamı ve para birimi ile ilgili bağlıdır iken, filogenetik atama ve aşağı akım Analizi47,48üzerinde önemli bir etkisi vardır. Kullanmak için hangi başvuru veritabanı ile ilgili müfettişler arasında fikir birliği böylece analizlerde ek önyargı kaçınmak için şart.
16S rRNA sıralama giderek yaygın bir teknik olarak bu veri işleme zorlukları için standart yaklaşımları büyük olasılıkla ortaya çıkacak. Sıralama maliyet ve zaman içinde sürekli indirimleri daha da bu yöntem halka sevdirmek. Bu teknolojinin artan kullanımı kompozisyon ve vektör microbiomes farklı koşullar altında ekolojisi içine daha derin araştırmalar sağlayacaktır. Vektör microbiome Biyoloji bilgi hala emekleme döneminde olduğu gibi açıklayıcı çalışmaları bu tür girişimleri microbiome vektör kontrol aracı olarak kaldıraç için önceki bir kritik ilk adım vardır. Ancak, gerçekten patojen iletim microbiome rolünü anlamak için mikrobiyal tanımlama bilgisi bu mikropların işlevsel rolü ile birleştiğinde olabilir gerekir. RNA sıralama ve haritalama ve gen ekspresyonu miktarının dahil, transcriptomic yaklaşımlar çıkarımlar mikroplar işlevsel rolü etkinleştirmek ama derin sıralama gerektirir ve tam hedef türler genleri toplandı. Engellemeyi bu zorluklar, hesaplama araçları sıralama veri son zamanlarda geliştirilen ama değil yaygın kabul 16S rRNA henüz49fonksiyonel kompozisyon tahmin etmek. Ekolojik teorisi yanı sıra bu tür araçlar geliştirilmesi, mikrobiyal kimlik ve vektörel çizimler içinde işlevsel rolü bağlama belgili tanımlık yarar 16S rRNA sıralama veri vektör microbiome çalışmalarda artacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser tarafından desteklenen Ulusal Bilim Vakfı a.ş. (DEB #1427772, 1745411, 1750037) verir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
- Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
