Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

إعادة تشكيل ذبذبات دورة الخلية في ميكرومولسيونس مستخرجات البيض خالية من الخلية النمو

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

نقدم وسيلة لتوليد في المختبر مكتفية ذاتيا ذبذبات الانقسامية على مستوى خلية واحدة بتغليف البيض مقتطفات من النمو لإيفيس في ميكرومولسيونس الماء في النفط.

Abstract

المهم قياس ذبذبات على مستوى خلية واحدة في الوقت الحقيقي لكشف آليات الساعات البيولوجية. رغم مقتطفات جل إعداد من البيض ليفيس النمو القوية في تشريح الشبكات الحيوية الكامنة وراء تطور دورة الخلية، قياس متوسط الفرقة عادة ما يؤدي إلى التذبذب ثبط، على الرغم من كل مذبذب الفردية التي لحقت. وهذا نظراً لصعوبة تزامن مثالي بين التذبذب الفردية في الأنظمة البيولوجية صاخبة. لاسترداد ديناميات خلية واحدة المذبذب، قمنا بتطوير نظام المستندة إلى الحبرية خلية اصطناعية التي يمكن إعادة تشكيل دورات الانقسامية في المقصورات الخليوي تشبه تغليف مقتطفات هيولى ركوب البيض ليفيس النمو . هذه الخلايا هيولى فقط بسيط يحمل ذبذبات مستمرة لما يزيد على 30 من دورات. لبناء خلايا أكثر تعقيداً مع نويات، أضفنا الكروماتين الحيوانات المنوية ديميمبراناتيد لتحريك نويات التجميع الذاتي في النظام. لاحظنا تقدم دوري كروموسوم التكثيف/ديكوندينسيشن ونوى يطوق انهيار/الإصلاح، مثل في الخلايا الحقيقية. يشير هذا إلى أن المذبذب الانقسامية وظائف أمانة محرك أقراص متعددة الأحداث الانقسامية المتلقين للمعلومات. ونحن في نفس الوقت تعقب ديناميات مذبذب الانقسامية وعمليات المصب في قطرات الفردية باستخدام مجهر الأسفار الوقت الفاصل بين متعدد القنوات. نظام دورة الخلية الاصطناعية يوفر إطارا الفائق للتلاعب بالكمية وتحليل ذبذبات الانقسامية مع القرار خلية واحدة، مما يرجح أن يوفر معلومات هامة بشأن الآلية التنظيمية ووظائفها على مدار الساعة.

Introduction

مقتطفات هيولى إعداد من البيض ليفيس النمو تمثل أحد النماذج الأكثر الغالبة لدراسة الكيمياء الحيوية لدورة الخلية، نظراً لكبر حجم بويضات، والتقدم السريع في دورة الخلية، والقدرة على إعادة تشكيل أحداث الانقسامية في المختبر1،2. هذا النظام قد أتاح اكتشاف الأولية وتوصيف آليا لمنظمي دورة الخلية الأساسية مثل مغزل عامل تشجيع النضج (MPF) فضلا عن العمليات الانقسامية المتلقين للمعلومات بما في ذلك الفصل بين الجمعية وكروموسوم1 ،2،3،4،5،،من67،،من89،10، 11. مقتطفات البيض النمو استخدمت أيضا لتشريح مفصل للشبكات التنظيمية لدورة الخلية على مدار الساعة8،،من1213،14 ودراسات عن أضرار الحمض النووي /replication حاجز15 والمغزل التفتلي الجمعية حاجز16،،من1718.

هذه الدراسات من دورات الخلية باستخدام مقتطفات البيض النمو أساسا قد تم استناداً إلى قياسات السائبة. ومع ذلك، فحوصات رد فعل الجملة التقليدية قد تقليد سلوكيات الخلية الحقيقية، نظراً لاختلاف رئيسي في الأبعاد والتقسيم المكاني سوبسيلولار من جزيئات رد فعل. وعلاوة على ذلك، هم عرضه لإعطاء عدد محدود من دورات قبل التخميد بسرعة8قياسات الجزء الأكبر من الأنشطة الانقسامية. هذه العيوب من ردود فعل معظم حالت دون نظام استخراج لتوفير مزيد من فهم الخصائص الديناميكية المعقدة على مدار الساعة ووظائفها. الدراسات التي أجريت مؤخرا قد مغلفة تثبيط الخلايا الخلية الحرة (CSF) القبض على عامل النمو مقتطفات19،20 في أماكن مثل الخلية تعريف الحجم، التي ساعدت في توضيح كيف هو حجم الدوران عن طريق التضمين حجم هيولى. بيد أن هذا النظام في المختبر هو القبض على الطورية من الانقسام الاختزالي الثاني بفعل العوامل القاتلة1ويلزم وجود نظام قادر على ذبذبات المطرد طويل الأجل على مستوى خلية واحدة لإجراء مزيد من التحقيقات لدورة الخلية مذبذب.

دراسة ذبذبات دورة الخلية مع القرار خلية واحدة، وقد وضعنا على نطاق الخلية، النظام الفائق لقياس المتزامن لعدة عمليات متذبذبة الانقسامية مكتفية ذاتيا في ميكرومولسيون الفردية وإعادة تشكيل قطرات. في هذا البروتوكول فيديو مفصلة، نبدي إنشاء نظام التذبذب الانقسامية الاصطناعية بتغليف ليفيس النمو ركوب البيض السيتوبلازم في ميكرومولسيونس بأحجام تتراوح بين 10 إلى 300 ميكرون. وفي هذا النظام، كانت ذبذبات الانقسامية، بما في ذلك التكثيف كروموسوم والتكثيف دي، وانهيار المغلف النووية واصلاحهم، وتدهور والتوليف من ركائز طور الصعود (مثلاً، سيكورين-مشري في هذا البروتوكول) أعيد تشكيلها بنجاح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميشيغان.

1-إعداد مواد لإعادة تشكيل دورة الخلية والكشف

  1. الجمعية جيبسون الاستنساخ لأغراض تشييد الحمض النووي بلازميد ومرناً تطهير مشري سيكورين
    1. إعداد ثلاث شظايا من الحمض النووي بما في ذلك من pMTB2 ناقلات العمود الفقري وسيكورين ومشري من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وجل تنقية21،22.
    2. قياس تركيزات الأجزاء باستخدام فلوروسبيكتروميتير. ضم 100 نانوغرام من العمود الفقري مع إدراج سيكورين ومشري في 1: نسبة جزيئية 1:1 وإضافة المياه لضبط الحجم الكلي للرد إلى 5 ميليلتر.
    3. إعداد 6 مل 5 × الجمعية متحاور رد فعل المخزن المؤقت مع 3 مل 1 M HCl تريس (درجة الحموضة 7.5)، 300 ميليلتر مجكل م 12600 ميليلتر من دنتب 10 ملم، 300 ميليلتر 1 م DTT، 1.5 غرام من 8000 شماعة و 20 ملغ من NAD23.
    4. إضافة الأجزاء المركبة إلى 15 ميليلتر من 1 x الجمعية متحاور رد فعل المخزن المؤقت اليكووت. تبني رد الفعل في أنبوب تفاعل PCR عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. جعل 0.8% [اغروس] هلام وتشغيل مع جهد V 10/سم للتحقق من كفاءة انلينغ هذه الشظايا.
    6. تنقية بلازميد المشيدة والوت استخدام 15 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. تحويل 1 ميليلتر من بلازميد تنقية الحمض النووي إلى 50 ميليلتر من المختصة DH5α كولاي الخلايا24 لاستخدامها في المستقبل.
    7. استخراج وتنقية بلازميد الحمض النووي من سيكورين-مشري من المختصة DH5α كولاي الخلايا.
    8. نسخ خطية سيكورين-مشري بلازميد الحمض النووي في مرناً وتنقية مرناً. استخدم جهاز المطياف الضوئي للتأكد من أن تركيز مرناً أكثر من 100 نانوغرام/ميليلتر ونسبة امتصاص في 260 nm و 280 نيوتن متر هو حوالي 2.0.
  2. إعداد ديميمبراناتيد الحيوانات المنوية ليفيس النمو الحمض النووي
    ملاحظة: مقتبس من موراي عام 19911.
    1. Euthanize الذكور البالغين ليفيس النمو25 وتشريح الخصيتين من الضفادع الذكور أربعة26،27.
    2. مكان الخصيتين من الضفادع الأربعة في نفس 100 مل طبق بيتري. شطف الخصيتين ثلاث مرات في 50 مل من البرد حل x MMR 1 (0.1 M كلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 1 مم مجكل2, 2 مم كاكل2، 5 ملم حبيس، يدتا 0.1 ملم).
    3. إزالة الخصيتين في طبق بتري 100 مل الدم الزائد والدهون، ويغسل مرتين في المخزن المؤقت إعداد النووية الباردة (بروميد البروبيل – ن) (250 ملم السكروز، 15 ملم هيبيس، درجة الحموضة 7.4، 1 مم يدتا، pH 8.0، 0.5 مم سبيرمدين تريهيدروتشلوريدي، تيتراهيدروتشلوريدي سبيرميني 0.2 مم).
    4. إزالة المخزن المؤقت إعداد النووية (بروميد البروبيل – ن) وقطع الخصيتين إلى قطع ذات أطوال أقل من 0.2 سم باستخدام مقص تشريح حاد في 100 مل طبق بيتري. إضافة 8 مل من البرد بروميد البروبيل – ن للخصيتين لمزيد من الانهيار.
    5. استخدام النايلون مش الأقمشة مع حجم مسام 70 ميكرون لتصفية الخصيتين وجمع عينة الحيوانات المنوية في أنبوب مخروطي 15 مل. تدور أسفل الحيوانات المنوية التي تم جمعها في 1,730 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية.
    6. إمداد الخلايا المنوية مع 1 مل من بروميد البروبيل – ن و 50 ميليلتر من ليسوليسيثين 10 ملغ/مل واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لخلايا الحيوانات المنوية ديميمبراناتي.
    7. غسل الحيوانات المنوية ديميمبراناتيد الحمض النووي مع 10 مل من البرد بروميد البروبيل – ن مع حل جيش صرب البوسنة 3% ثلاث مرات.
    8. قياس كثافة الحيوانات المنوية الحمض النووي مع هيموسيتوميتير.
    9. تجميد الحيوانات المنوية الحمض النووي في 5 ميليلتر مختبرين في النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية. تركيز الحيوانات المنوية DNA الأمثل حوالي 105 النوى/ميليلتر.
  3. تنقية البروتين للتجارة والنقل النووية "التعريب إشارة" (بروتينات فلورية خضراء-NLS)
    1. تحويل بلازميد NLS بروتينات فلورية خضراء معلم ضريبة السلع والخدمات إلى BL21 (DE3) المختصة كولاي الخلايا5.
    2. احتضان الخلايا دون المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية ح 1 وانتشرت بعد ذلك على لوحة [اغروس] رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
    3. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية ل 14 إلى 18 ساعة لزراعة الخلايا في المستعمرات واحدة. بيك وتطعيم المستعمرات واحدة إلى 4 مل الإعلام رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. اهتزاز الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
    4. تعد وسائل الإعلام وأي تي يعقم (ز 16 من بكتو-تريبتوني، 10 جرام من خميرة بكتو مقتطف، 5 غ من كلوريد الصوديوم) والحرارة وسائل الإعلام وأي تي إلى 37 درجة مئوية.
    5. تطعيم 1 مل الخلايا المحتضنة بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام رطل في 250 مل من وسائل الإعلام وأي تي مسخن مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين ويهز لمدة ساعتين لزيادة كثافة الخلية.
    6. قياس كثافة الخلية الضوئية (OD) كل 30 دقيقة، باستخدام جهاز المطياف الضوئي في طول جه 600 نانومتر. إضافة 0.1 مم إيبتج داخل الخلايا للحث على التعبير البروتين بروتينات فلورية خضراء-NLS حالما تصل قيمة التطوير التنظيمي إلى 0.1.
    7. اهتزاز الخلايا عند 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها تقليل معدل نمو الخلايا وتسمح أفضل بروتين التعبير والتوليف.
    8. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 34,524 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
    9. ريسوسبيند الكريات الخلية في 40 مل من برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (مع 800 ميليلتر من ليسوزيمي 50 ملغ/مل، 100 ميليلتر بمسف وميليلتر 13.2 مزيج 10 ملغ/مل من ليوبيبتين وبيبستاتين وتشيموستاتين ميليلتر 8 يدتا 0.5 M 0.2 M) واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    10. كسر أسفل الخلايا باستخدام سونيكاتور بتردد من 20 كيلوهرتز 4 × 30 أعرب s، مع 30 s فواصل بين كل سونيكيشن، بالإفراج عن البروتين بروتينات فلورية خضراء-NLS.
    11. تدور في 20,000 x ز لمدة 35 دقيقة لإزالة الخلايا مكسورة.
    12. استخدام الفصل اللوني لتقارب لاستخراج وتنقية البروتين بروتينات فلورية خضراء-NLS.
    13. أغسل الطين حبة 1.5 مل ثلاث مرات مع 15 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني واحتضان 250 مل من بالخرز لمدة 4 ساعات في 4 درجات مئوية مع انعكاس.
    14. تدور أسفل الخرز في 2000 غ س لمدة 5 دقائق وإضافة 10 مل من محلول الغسيل (25 تريس قاعدة، درجة الحموضة 7.5، كلوريد الصوديوم، 500 مم و 5 مم DTT) الخرز. احتضان الخرز في 700 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (50 تريس-HCl، الجلوتاثيون خفض الرقم الهيدروجيني 8.8، 20 مم، و 5 ملم DTT) بالتناوب في 4 درجات مئوية. جمع قاسمة شطف بحجم 50 ميليلتر.
    15. قياس تركيز البروتين التي تم جمعها عن طريق تشغيل جل أزرق أخذ28.
    16. الوت البروتينات باستخدام أعمدة PD-10 مع 3 مل من مخزن المخزن المؤقت (20 ملم حبيس، 150 مم بوكل، والغليسيرول 10%، 7.7 درجة الحموضة) عن طريق تبادل المخزن المؤقت.

2-إعداد الدراجات النمو مقتطفات

ملاحظة: الإجراء العام لإعداد المقتطفات يتضح في الشكل 1A. مقتبس من موراي عام 19911.

  1. حقن الإناث الناضجة ثلاثة ليفيس النمو مع 66 وحدة دولية تروج مصل الفرس الحامل (بمسج) 10 أيام قبل وضع البيض.
  2. حقن هذه الضفادع النمو مع 500 وحدة دولية من تروج المشيمية البشرية (HCG) للحث على بيضة زرع 18 ساعة قبل إعداد الدراجات مقتطفات.
  3. تجاهل وضع البيض بين عشية وضحاها. استناداً إلى تجارب (البيانات لا تظهر)، مقتطفات من البيض الطازج توليد أنشطة أطول أمداً من مقتطفات إعداد من البيض وضعت من الضفدع الإناث نفس. الضغط على البيض لكل أنثى الضفدع في أطباق بتري 100 ملم التي تحتوي على 10 مل من المخزن المؤقت x MMR 0.2 وفحص تحت مجهر ستيريو.
  4. تجاهل دفعات البيض التي لها حدود غير واضحة بين القطبين فيجيتال والحيوان أو البقع البيضاء غير المنتظمة على رأس الحيوان القطبين.
  5. اختر دفعة البيض من الضفدع أنثى واحدة تعرض سكان متجانسة من البيض مع الحيوانات وضوح متمايزة واقطاب فيجيتال ونقل البيض في كوب 600 مل.
  6. صب العازلة x MMR 0.2 الزائدة وإضافة 250 مل بلطف من 2 غرام لكل 100 مل استخراج سيستين (7.7 درجة الحموضة) في 1 x المخزن المؤقت (100 مم بوكل، 0.1 مم كاكل2، 1 مم مجكل2، 10 مم حبيس، السكروز 50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.7) للبيض.
  7. تهز البيض بقوة باليد وإزالة المعاطف هلام البيض يغسل ما يزيد على ثلاثة بحجم إجمالي 800 مل من سيستين المخزن المؤقت لمدة 3 دقائق أو حتى البيض التجميعية وتسوية في أسفل الكأس، مشيراً إلى أن إزالة طبقة جيلي ناجحة.
  8. أغسل البيض مع 1 لتر من 0.2 x MMR الحل أكثر من أربع مرات.
  9. بيك وتجاهل البيض التي تتحول أبيض ماصة نقل زجاج استخدام.
  10. صب في المخزن المؤقت للحصبة والنكاف وتوريد البيض مع 200 مل من 0.1 ميكروغرام/مل الكالسيوم ionophore الحل A23187 في المخزن المؤقت x MMR 0.2 للتنشيط.
  11. استخدم إلى جانب افتتاح واسعة ماصة زجاجية يقلب البيض بلطف حتى يتم تنشيط البيض وإزالة الكالسيوم ionophore الحل.
  12. التحقق من كفاءة التنشيط بعد أن يستقر البيض في الجزء السفلي من الكأس. البيض جيدا تم تنشيطه بحوالي 25% من القطب الحيواني و 75% من القطب فيجيتال.
  13. أغسل البيض المنشط مرتين مع 50 مل 1 × استخراج المخزن المؤقت تستكمل مع مثبطات البروتياز (10 ميكروغرام/مل كل من ليوبيبتين وبيبستاتين وتشيموستاتين).
  14. نقل البيض بعناية إلى microtube الحد الأقصى للأداة إضافية 0.4 مل وحزمة ثم البيض عن طريق استخدام الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 60 ثانية ومن ثم 600 x ز لمدة 30 ثانية.
  15. إزالة المخزن المؤقت الإضافي على رأس البيض استخدام زجاج ماصة باستور للحد من تخفيف مقتطفات.
  16. سحق البيض في 15,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  17. قطع الأنابيب مع شفرة حلاقة لفصل ثلاث طبقات من البيض سحقت وإبقاء السيتوبلازم الخام في الطبقة الوسطى.
  18. نقل النفط الخام السيتوبلازم في أنابيب أولتراسينتريفوجي جديدة، وتكمل مع مثبطات البروتياز وسيتوتشالاسين ب في 10 ميكروغرام/مل كل.
  19. الطرد المركزي السيتوبلازم النفط الخام مرة أخرى في 15,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لمواصلة تنقية السيتوبلازم عن طريق إزالة الدهون الزائدة وصفار البيض.
  20. تبقى مقتطفات الطازجة على الجليد.

3-الحبرية جيل

  1. إعداد غرفة الزجاج 2D
    ملاحظة: هذه الأنابيب الزجاجية مستطيل بمثابة الدوائر التي تحصر القطرات في طائرة 2-الأبعاد واحد، مما يسمح لتسهيل المراقبة وجمع البيانات.
    1. قطع أنابيب زجاجية مستطيل ذات بعد داخلي من 2 مم × 100 ميكرومتر إلى 4 ملم قطع طويلة. استخدام حافة حادة من ويستون، وضع علامة الحدود المطلوب على السطح الخارجي للأنبوب الزجاج مع محفورة الخفيفة، ثم الضغط بلطف على جانبي محفورة بقطع أجزاء من أنابيب زجاجية.
    2. قبل الحرارة حاضنة حمام جافة إلى 95 درجة مئوية. إخراج كتلة التدفئة ووضعها في مجفف فراغ البولي.
    3. ضع أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل تحتوي على 30 ميليلتر من سيلاني ثلاثي الكلور (ح 1، ح 1، ح 2، ح 2-بيرفلوروكتيل) في كتلة التدفئة. وضع أنابيب قطع الزجاج داخل مجففة فراغ في حوالي 5 سم إلى كتلة التدفئة.
    4. قم بتوصيل مجففة مضخة فراغ. قم بتشغيل المضخة لمدة 1 دقيقة للوصول إلى مستوى الفراغ المطلوب، ثم إغلاق صمام 3-طريقة لختم مجففة والسماح للبخار سيلاني ثلاثي الكلور (ح 1، ح 1، ح 2، ح 2-بيرفلوروكتيل) معطف الجدار الداخلي للأنابيب الزجاجية. وهذا سيخلق بيئة مسعور لاستقرار القطرات.
    5. ترك أنابيب زجاجية داخل مجففة لطلاء بين عشية وضحاها. الأنابيب ستكون جاهزة للاستخدام في اليوم التالي.
  2. جيل الحبرية والتصوير
    ملاحظة: يتم توضيح إجراءات توليد قطرات والتصوير في الأرقام 1 باء وجيم 1
    1. توريد مقتطفات إعدادها في الخطوة 2 مع 10 نانوغرام/ميليلتر مشري سيكورين مرناً لتجارب بسيطة هيولى فقط دورة الخلية. وبدلاً من ذلك، مقتطفات العرض مع ديميمبراناتيد الحيوانات المنوية الكروماتين (250 كل ميليلتر لاستخراج) والبروتين بروتينات فلورية خضراء-NLS ميكرومتر 10 10 نانوغرام/ميليلتر التغييرات مرناً مشري سيكورين لإنشاء قطرات العارضة مورفولوجيا نويات الدوري.
    2. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، زودت مزيج 20 ميليلتر لاستخراج مع البروتين المؤتلف أو مرناً مع 200 ميليلتر من 2% بيرفلوروبولييثير--البولي إثيلين غليكول فلوروسورفاكتانت (فب-شماعة) في HFE7500 المفلورة النفط.
    3. توليد قطرات استخدام خلاط دوامة. يمكن التضمين نطاق أحجام الحبرية بسرعة دوامة ومدتها. لإنشاء قطرات مع إنصاف أقطار تتراوح من 50 إلى 200 ميكرومتر، تعيين سرعة دوامة في 56 x ز (3,200 لفة في الدقيقة مع دائرة نصف قطرها مم 4.9) واضغط برفق بأنبوب ميكروسينتريفوجي المحتوية على الاستخراج وخليط الفاعل في الخلاط لمدة 3.5 ثانية. افحص بصريا إذا القطرات موحدة في الحجم.
    4. استخدام ماصة 20 ميليلتر لنقل قطرات تطفو على أعلى وزيادة في حجم السطح شماعة PFPE متساوية في أنبوب PCR. تراجع أنبوب الزجاج أعدت من الخطوة في طبقة الحبرية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل والانتظار حتى قطرات بتعبئة حوالي 75% الأنبوب، ثم دفع الأنبوب إلى أسفل إلى طبقة السطح حتى يتم ملء الأنبوب تماما. وهذا انخفاض كثافة الحبرية وتسمح القطرات تشكل طبقة واحدة واحدة داخل الدائرة بدون تشويه الشكل أو المتداخلة الناجمة عن الاكتظاظ.
    5. ملء طبق أسفل زجاج التي يبلغ قطرها 40 ملم مع الزيوت المعدنية. تزج أنابيب الحبرية المليئة بالنفط بدفعهم برفق إلى أسفل باستخدام الملاقط ما يرام.
    6. بعد تحميل جميع العينات، استخدام الزجاج "الماصة؛" لإزالة أي الحطام مرئية أو تسربت قطرات. إضافة مزيد من الزيوت المعدنية إذا الأنابيب ليست أو سوف لا تكون مغمورة تماما في عملية التصوير.
    7. إجراء تصوير قطرات على مجهر ابيفلوريسسينسي مجهزة بمرحلة يجهز س ص (انظر الجدول للمواد). استخدم هدفا جوية X 4 لتصوير كافة. للتصوير بالأسفار، استخدام 130 ث الزئبق بخار قصيرة قوس مصباح كتعيين مصدر الضوء الفلورية للإضاءة، ومرشح للتجارة والنقل (الإثارة 482/35 نانومتر والانبعاثات 514/ليرة لبنانية nm) وتعيين عامل تصفية مشري (الإثارة 562/40 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط انبعاث 641/75) للتصوير إشارات NLS بروتينات فلورية خضراء ومشري سيكورين.
    8. سجل الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو في ميدان مشرق وقنوات متعددة الأسفار كل 6 إلى 9 دقائق حتى القطرات تفقد نشاطها.

4-صورة تجهيز وتحليل البيانات

  1. تجزئة وتتبع قطرات
    1. استيراد البيانات المسجلة في تنسيق tif "." أو ".oif" في صورة تحليل البرمجيات (انظر الجدول للمواد).
    2. الجزء قطرات واحدة تستخدم قناة الحقل مشرق. سوف تظهر الصورة الميدانية مشرق قطرات كدوائر مشرقة مع حدود الظلام. تطبيق مستوى العتبة للصورة. إضافة سطح تتبع لكل قطره بضبط العتبة بين الظلام ومشرق بكسل حيث أن كل سطح يغطي منطقة بأكملها من الحبرية المقابلة.
    3. تتبع تلقائياً الشرائح بين الإطارات المتجاورة باستخدام خوارزمية الحركة أوتوريجريسيفي. لحن المسافة السفر الحد الأقصى المقبول لمعالجة تجميعية بين إطارين المتاخمة يكون أصغر من نصف قطر معظم قطرات لتتبع بدقة قطرات صغيرة.
    4. بصريا التحقق من كافة المسارات عبر الفيديو بأكمله للكشف عن الانقسامات غير صحيحة هذا الجزء مساحة فارغة بين قطرات بدلاً من قطرات الفعلية. يدوياً حذف المسارات غير صحيحة.
    5. الجزء وتتبع المنطقة الخلفية دون أي قطرات للحصول على كثافة fluorescence الخلفية. لتحسين إشارة إلى الضوضاء، طرح كثافة الخلفية من شدة الأسفار قطرات في كل إطار زمني.
    6. تصدير تقاس معلمات لكل مسار على مر الزمن، بما في ذلك المتوسط والانحراف المعياري لشدة الأسفار ومنطقة الحبرية إلى ملفات ".csv".
  2. تحليل البيانات لفترة الحجم والتذبذب الحبرية
    1. تحميل ملفات ".csv" في البحث والتطوير لإنشاء قطع شدة الأسفار على مر الزمن لكل قطره. معرف السجل الحبرية في ملف "csv.".
    2. استيراد ملفات ".csv" المصدرة من برامج التحليل وملف "csv." مع قائمة معرف الحبرية في Matlab وحفظها كملفات ".mat" لمزيد من تحليل البيانات.
    3. حساب حجم الحبرية مضغوط استناداً إلى معلومات المجال الحبرية المصدرة بعد تجزئة وارتفاع الزجاج الدائرة19. استخدام وحدة التخزين لحساب دائرة نصف قطرها الحبرية كمجال.
    4. استخراج النقاط الزمنية القصوى وأحواض باستخدام خوارزمية الكشف عن ذروة/الحوض. إجراء التصحيحات اليدوية على موقف قمم وأحواض لضمان دقة يتم الكشف عنها.
    5. لحساب فترة دورة الخلية، حساب الوقت الفاصل بين اثنين من قمم متجاورة. أن متوسط جميع الفواصل الزمنية لكل قطره كفترة دورة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن في الشكل 2، يظهر أن هذا البروتوكول وتنتج ذبذبات الانقسامية في خلايا بسيطة، خالية من الأسلحة النووية، فضلا عن خلايا معقدة مع نويات، حيث يدفع المذبذب التناوب الدوري لتشكيل نواة وتشوه. قطرات خالية من الأنوية توليد ذبذبات الانقسامية يصل إلى 30 دورات على مدى فترة زمنية ساعات 92، كما يتبين من التوليف الدوري وتدهور الأسفار مراسل سيكورين-مشري (الشكل 2A). سيكورين ركيزة في طور الصعود تعزيز مجمع آسيا والمحيط الهادئ/جيم تدهور مشري سيكورين خلال طور الصعود مما يشير إلى النشاط لآسيا والمحيط الهادئ/جيم

لفحص قدرة المذبذب الانقسامية على محرك الأحداث الانقسامية المتلقين للمعلومات، بالإضافة إلى ذلك قدمنا ديميمبراناتيد الحيوانات المنوية الكروماتين وإشارة المنقي التعريب البروتين النووي الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء-NLS)، والأصباغ هويشت 33342 إلى هيولى مقتطفات. ويبين الشكل 2 التناوب المتمتعة بالحكم الذاتي من مراحل دورة الخلية متميزة، الطور البيني (أشرطة زرقاء) والانقسام (أشرطة حمراء)، التي تدفعها التغييرات مورفولوجيا النووية مذبذب الانقسامية مكتفية ذاتيا. كل الأحداث الانقسامية، أي، ديكوندينساتيون كروموسوم والتكثيف عنها هويشت 33342 (الشكل 2B، الصف الأول)، تشكيل النووية وحسب المغلف النووية NLS التجارة والنقل (الشكل 2B، الصف الثاني)، ونشاط وتزامن مذبذب دورة الخلية بالتوليف وتدهور سيكورين-مشري (الشكل 2B، الصف الثالث)، مع بعضها البعض. وجمعت الصور باستخدام مجهر الوقت الفاصل بين قناة متعدد الأسفار. النتائج التجريبية تبين بأن النظام أعيد بناؤها في دورة الخلية قادرة على إعادة بناء مذبذب التفتلي Cdk1 وآسيا والمحيط الهادئ/ج، التي يمكن أن تدفع سلسلة من الأحداث المتلقين للمعلومات بما في ذلك انهيار المغلف النووية والإصلاح، و كروموسوم مورفولوجيا التغيير.

ويبين الشكل 3 ذبذبات أوضح بشدة سيكورين مشري fluorescence يعني قبل وبعد إزالة الضوضاء. ذروة والانخفاض أصبح أكثر وضوحاً بعد إزالة الضوضاء الخلفية، خاصة بالنسبة للذبذبات الأولى والثانية، مشيراً إلى أن إزالة الضوضاء يمكن أن تساعد في تحسين إشارة إلى الضوضاء لمزيد من التحليل.

Figure 1
رقم 1. الإجراءات التجريبية لتوليد الخلايا الانقسامية المستندة إلى الحبرية. وتجمع ألف هيولى مقتطفات عن طريق الترا-الطرد المركزي. باء المقتطفات مزودة بمكونات متعددة بغية إعادة تشكيل وإعداد التقارير ذبذبات الانقسامية. باستخدام أسلوب فورتيكسينج، مقتطفات والنفط الفاعل مختلطة لتوليد قطرات. جيم قطرات يتم تحميلها في أنبوب المغلفة سيلاني ثلاثي الكلور (ح 1، ح 1، ح 2، ح 2-بيرفلوروكتيل) وثم تصويرها من خلال مجهر برنامج التحصين الموسع-الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. الكشف عن ديناميات دورة الخلية استخدام الصحفيين الفلورسنت. ألف مسار وقت شدة الأسفار مشري سيكورين يعني الحبرية المحددة، مشيراً إلى ذبذبات 30 على مدار ساعات 92. ويوضح الشكل إدراج الصورة الأسفار مع الحبرية المحدد مؤطرة بدائرة بيضاء منقطة. شريط مقياس 100 ميكرومتر- باء السلسلة الزمنية للقطات من معالجة تجميعية في ميدان مشرق (الصف الأخير) وقنوات الفلورية (الصفوف الثلاثة الأولى). في نفس الوقت يتم تعقب تطور دوري على مدار الساعة دورة الخلية وعملياتها الانقسامية المصب بالصحفيين نيون متعددة. طور الصعود الركيزة سيكورين-متشيري يشير إلى نشاط الجهة المنظمة على مدار الساعة لآسيا والمحيط الهادئ/ج ووصمة عار هويخست يشير إلى التغيرات الصبغية مورفولوجيا وبروتينات فلورية خضراء-NLS يشير إلى تعطل المغلف النووية وتقاويم. مغلفات النووية (أبرز الأسهم البيضاء) أيضا قابلة للكشف في الصور الميدانية مشرق، مطابقة الترجمة للتجارة والنقل-NLS أشارت إلى نويات. هو شريط مقياس 50 ميكرومتر. الطور البيني وعلى التوالي إلى المرحلة الانقسامية بواسطة أشرطة زرقاء وأشرطة حمراء فوق الصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. خلفية الطرح لشدة الأسفار يعني من مشري سيكورين. ألف التذبذب وقت الدورة قبل إزالة الضوضاء الخلفية. ب التذبذب وقت الدورة بعد إزالة الضوضاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد قدمنا طريقة جديدة لوضع نظام خلية اصطناعية الفائق أن تمكن المختبر في إعادة تشكيل وتتبع ذبذبات دورة الخلية الاكتفاء الذاتي على مستوى خلية واحدة طويلة الأجل. وهناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تجعل هذا الأسلوب الناجح. أولاً، الطازج البيض النمو مع نوعية جيدة، بالمقارنة مع البيض وضعت، تميل إلى إنتاج مقتطفات مع النشاط التذبذب تدوم لفترة أطول. ثانيا، تغليف مقتطفات داخل ميكرونفيرونمينتس استقرت الفاعل أمر حاسم للحفاظ على نشاط التذبذب. الثالثة، من الحضانة لقطرات النفط في حدود أنبوب رفيع القطرات داخل طبقة واحدة، مما يجعل من الأسهل لمعالجة الصور وتتبع طويل الأجل. رابعا، طلاء الجدار الأنبوب الداخلي مع سيلاني ثلاثي الكلور (ح 1، ح 1، ح 2، ح 2-بيرفلوروكتيل) لاصقة المضادة لخفض الطاقة السطحية يساعد على المحافظة على نشاط استخراج. خامسا، ختم الأنابيب النفط سيمنع تدفق الحبرية. طريقة الختم النفط يمكن أيضا أن تمنع التبخر وكذلك الحفاظ على نشاط استخراج. وهذه معا تحسين معدل نجاح للتعمير في المختبر لذبذبات قوية في قطرات والدقة تجزئة وتتبع هذه القطرات المدى الطويل.

لتوليد قطرات ميكرومولسيون، ونحن قد استخدمت كلا فورتيكسينج بسيطة أسلوب، مماثلة لبعض أخرى دراسات29،،من3031، فضلا عن تقنيات أكثر استخداماً ميكروفلويديكس19، 20 (البيانات لا تظهر). وكانت كلتا الطريقتين قادرة على توليد ميكرومولسيونس بنجاح بطريقة الفائق. القيد واحد المرتبطة بالأسلوب فورتيكسينج هو أن حجم القطرة غير الخاضعة لشكل موحد. للدراسات التي تتطلب حجماً واضحة المعالم مع اختلاف حجم مصغر، ينبغي استخدام تقنيات ميكروفلويديكس بتحكم أفضل في أحجام الحبرية. هنا، فقد اخترنا أسلوب فورتيكسينج على الأسلوب موائع جزيئية لسببين. أولاً، أنها إجراءات بسيطة وسهلة لمتابعة، مما يتيح مختبرات دون الوصول إلى تقنيات موائع جزيئية أو مرافق النانومترى التكيف مع هذه الطريقة بسهولة. ثانيا، الأسلوب فورتيكسينج أكثر كفاءة واقتصادية للتحقيق في سلوكيات تعتمد على حجم من المذبذب. ويمكن أن تولد توزيعها على نطاق واسع من أحجام الحبرية مع إنصاف أقطار تتراوح بين ميكرومتر عدة تصل إلى 300 ميكرومتر، بينما يمكن أن تولد تقنية موائع جزيئية فقط توزيع ضيقة تركز على حجم معرف مسبقاً. نطاق أحجام الحبرية التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب يتطابق مع مجموعة واسعة من أحجام الخلايا الناتجة من انقسامات الخلية التخفيض المميزة في مرحلة الانقسام والأجنة في وقت مبكر مثل النمو والزرد.

الأسلوب الحالي تحسنت بشكل ملحوظ استدامة ذبذبات والإنتاجية من تحليل الديناميات المعقدة على مدار الساعة، بالمقارنة مع الأساليب القائمة لإعادة تشكيل التذبذب البيولوجية في الجملة جيدا مختلطة الحل8، 32، التي تميل إلى إنتاج بسرعة ثبط ذبذبات. وقد أظهرنا أن هذا الأسلوب تحسنت بشكل ملحوظ عمر ذبذبات من بضع دورات في معظم ردود الفعل8 دورات ما يزيد على 30 في المكروية قطرات (الشكل 2A). بالإضافة إلى ذلك، معظم ردود الفعل تفتقر إلى التشابه إلى أبعاد الخلايا الفعلية ولا يمكن أن الخص المنظمة المكانية حققها التقسيم الوظيفي في الخلايا الحقيقية. وبعد التغلب على هذه القيود للجزء الأكبر من ردود الفعل، يوفر نظامنا الخلية الاصطناعية منهاجا أساسيا للتحقيق في مسائل صعبة مثل عدم تجانس الخلوية وستوتشاستيسيتي من التذبذب، التي على خلاف ذلك من المستحيل استكشاف.

وعلاوة على ذلك، يوفر هذا الأسلوب مرونة في درجة التعقيد التي يمكن أن يبني الخلايا. لتجنب أي تدخل من ديناميات النووية المعقدة، علينا إعادة تشكيل نظام الحد الأدنى، هيولى فقط دورة خلية التي تحتوي على لا نواة. هذا مذبذب بسيطة وهيولى فقط المعارض ذبذبات مكتفية ذاتيا أفضل بكثير من بعض التذبذب الاصطناعية الموجودة. بتزويد الحيوانات المنوية الكروماتين، ونحن أيضا إعادة تشكيل خلايا أكثر تعقيداً مع الأنوية بالتناوب بين التجميع الذاتي في الطور البيني وتشوه النووية في مرحلة الانقسامية بطريقة إيقاعية. يمكن أن النشاط مذبذب الانقسامية، فضلا عن الأحداث النووية المصب المتزامنة تقاس بتصوير fluorescence متعدد القنوات وتعقب خلية واحدة.

الأسلوب يمكن أيضا درجة عالية من التلاعب في سرعة الحبرية الحجم ودورة الخلية. تقنية فورتيكسينج يسمح لجيل قطرات مع إنصاف أقطار في مجموعة واسعة والذي سيستفيد منه دراسة السلوكيات تعتمد حجم الخلية للخلية دورات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التضمين سرعة دورة الخلية بتزويده بتركيزات مختلفة من cyclin B1 مرناس33، التي سوف تسمح لنا بدراسة وظيفة ألواح عقارب الساعة دورة الخلية.

مع هذه المزايا، سوف في المختبر بناؤها دورة الخلية منهاج العمل وتمكين التصور والتلاعب وتحليل الديناميات خلية واحدة، يرجح أن تمهيد الطريق لرؤى جديدة في السلوكيات العشوائية أكثر تعقيداً من الخلية دورة على مدار الساعة. قد يكون الأسلوب التعميم للدراسات في المختبر لمؤشرات التذبذب الأخرى التي تعتمد تقليديا على الجزء الأكبر من ردود الفعل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء الكشف عنها.

Acknowledgments

ونحن نشكر لو مادلين لتشييد بلازميد مشري سيكورين، لي مان اللفة والن ف ليو للمناقشات حول الجيل الحبرية وجيريمي باء تشانغ وهو كينيث جيمس هاء فيريل الابن لتوفير بناء بروتينات فلورية خضراء-NLS. هذا العمل كان تدعمها "المؤسسة الوطنية للعلوم" (الوظيفي المبكر منحة #1553031)، المعاهد الوطنية للصحة (ميرا #GM119688)، وزمالة أبحاث سلون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. Methods in Enzymology. 91, Academic Press. 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية، مسألة 139، دورة الخلية الانقسامية، مكتفية ذاتيا ذبذبات، ليفيس النمو، ركوب الدراجات مقتطفات الخلية الحرة، fluorescence الوقت الفاصل بين الفحص المجهري، في المختبر، وتحليل خلية واحدة، وخلايا اصطناعية، microemulsion
إعادة تشكيل ذبذبات دورة الخلية في ميكرومولسيونس مستخرجات البيض خالية من الخلية <em>النمو</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., … More

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter