Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

אנו מציגים שיטה לדור של במבחנה עצמית מתמשכת mitotic תנודות ברמת תא בודד על-ידי לבצע תמציות ביצה של צפרדע רפואית זריזה microemulsions מים בתוך שמן.

Abstract

בזמן אמת מדידה של תנודות ברמת תא בודד חשוב לחשוף את המנגנונים של שעונים ביולוגיים. למרות תמציות בצובר להכין מביצים צפרדע רפואית זריזה היה חזק בניתוח רשתות הביוכימי שבבסיס את התקדמות מחזור התא, מדידה הממוצע שלהם אנסמבל בדרך כלל מוביל לאי תנודה לח, למרות כל אחד מתנד בודדים עם השיתופן. זאת בשל הקושי של סנכרון מושלם בין מתנדים בודדים במערכות ביולוגיות רועש. כדי לאחזר את הדינמיקה תא בודד של מתנד, פיתחנו מערכת מבוססת-droplet תא מלאכותיים יכולים לשקם מחזורים mitotic בתאים קטנים לבצע רכיבת אופניים cytoplasmic תמציות של צפרדע רפואית זריזה ביצים. תאים פשוטים אלה cytoplasmic בלבד התערוכה תנודות ממושכת מעל 30 מחזורים. כדי לבנות יותר מסובך תאים עם גרעינים, הוספנו demembranated כרומטין הזרע כדי לעורר את הגרעינים הרכבה עצמית במערכת. הבחנו התקדמות תקופתיים של כרומוזום עיבוי/decondensation, גרעינים אופפים התמוטטות/הרפורמציה, כמו תאים אמיתיים. אפשרות זו מציינת כי מתנד mitotic מתפקד בנאמנות להסיע מספר אירועים mitotic במורד הזרם. במקביל איתרנו את הדינמיקה של מתנד mitotic ואת התהליכים במורד הזרם droplets בודדים באמצעות מיקרוסקופ רב ערוצית זריחה זמן לשגות. מערכת מחזור התא המלאכותי מספק מסגרת תפוקה גבוהה עבור מניפולציה כמותיים וניתוח של תנודות mitotic עם רזולוציה מתא בודד, אשר סביר להניח מספק תובנות חשובות מכונות רגולטוריות והפונקציות של השעון.

Introduction

תמציות cytoplasmic להכין מביצים זריזה צפרדע רפואית מייצג אחד המודלים הדומיננטית ביותר לחקר התא מחזורים, נתון הכמות הגדולה של oocytes, את התקדמות מהירה מחזור התא, את היכולת לשחזר הביוכימי אירועים mitotic במבחנה1,2. מערכת זו אפשרה את התגלית הראשונית ואפיון מכניסטית של מחזור התא חיוני הרגולטורים, כמו קידום ההבשלה פקטור (MPF), כמו גם התהליכים mitotic במורד הזרם, כולל ציר סגרגציה הרכבה של כרומוזום1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. תמציות ביצה צפרדע רפואית גם שימשו עבור ניתוח מפורט של רשתות רגולטוריות של מחזור התא שעון8,12,13,14 , מחקרים של נזק לדנ א מחסום /replication15 , פלך mitotic הרכבה מחסום16,17,18.

מחקרים אלה מחזורי תאים באמצעות תמציות ביצה צפרדע רפואית בעיקר התבססו על מדידות בצובר. עם זאת, התגובה בצובר קונבנציונאלי מבחני עשוי לא לחקות התנהגויות תא אמיתי, בהתחשב פער גדול הממדים שלהם, subcellular מידור המרחבי של מולקולות התגובה. יתר על כן, מדידות בכמות גדולה של פעילויות mitotic נוטים לתת מספר מוגבל של מחזורים לפני דעיכת במהירות8. החסרונות של תגובות בצובר למנוע את תמצית למערכת לספק נוסף להבנה של מאפיינים דינאמי שעון מורכבים ופונקציות. מחקרים שנעשו לאחרונה יש אנקפסולציה ללא תא cytostatic בבידוד-פקטור (CSF) צפרדע רפואית תמציות19,20 לתוך מוגדרת על-ידי גודל תא דמוי מדורים, סייעו להבהיר איך לגודל צירים הוא מווסת על ידי נפח cytoplasmic. עם זאת, מערכת זו במבחנה נעצר בשדה מפה של מיוזה II על ידי הפעולה של גורם cytostatic1, מערכת מסוגלת לטווח ארוך מתמשכת תנודות ברמת התא היחיד שנדרש לחקירה נוספת של מחזור התא מתנד.

ללמוד מחזור התא תנודות ברזולוציה של תא בודד, פיתחנו של התא-סולם, מערכת תפוקה גבוהה למפת המדידה בו זמנית מספר תהליכי מתנדנדות עצמית מתמשכת mitotic microemulsion בודדים טיפות. בפרוטוקול זה וידאו מפורט, נדגים על הקמת מערכת תנודה mitotic מלאכותי על ידי לבצע רכיבת אופניים הציטופלסמה ביצה זריזה צפרדע רפואית ב microemulsions בגדלים החל מ 10 מיקרומטר 300. במערכת זו, היו תנודות mitotic כולל כרומוזום עיבוי, דה-עיבוי, התמוטטות מעטפת הגרעין, הרפורמציה, השפלה ואת סינתזה של סובסטרטים "אנאפאזה" (למשל, securin-mCherry ב פרוטוקול זה) בהצלחה מחדש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.

1. הכנת חומרי שיחזור מחזור התא וזיהוי

  1. הרכבה גיבסון שיבוט על פלסמיד DNA הבנייה ועל טיהור mRNA של securin-mCherry
    1. להכין שלוש שברי DNA כולל של עמוד השדרה וקטור pMTB2, securin mCherry דרך תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), ג'ל לטיהור21,22.
    2. למדוד את ריכוזי שברי באמצעות fluorospectrometer. לשלב 100 ננוגרם של עמוד השדרה עם מוסיף securin ו- mCherry-1:1:1 יחס מולקולרית ומוסיפים מים יונים כדי לכוונן את העוצמה הכוללת של תגובה 5 µL.
    3. להכין 6 מ של 5 x מאגר התגובה הרכבה איזותרמי עם 3 מ"ל של 1 מ' טריס-HCl (pH 7.5), µL 300 של 1 מ' MgCl2, 600 µL של 10 מ מ dNTP, µL 300 של 1 מ' DTT, 1.5 גר' פג-8000 ו 20 מ ג של NAD23.
    4. להוסיף שברי משולב µL 15 1 x הרכבה איזותרמי התגובה מאגר aliquot. דגירה התגובה בשפופרת התגובה PCR ב 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
    5. להפוך agarose של 0.8% ג'ל ו לרוץ עם מתח של 10 ס"מ/V כדי לוודא את יעילות מחזק של קטעים אלו.
    6. לטהר את פלסמיד נבנה, elute באמצעות µL 15 RNase ללא מים. להפוך את µL 1 של פלסמיד מטוהרים הדנ א 50 µL של DH5α המוסמכת e. coli בתאי24 לשימוש עתידי.
    7. תמצית ולטהר את פלסמיד-DNA של securin-mCherry מ DH5α המוסמכים e. coli תאים.
    8. לתמלל את פלסמיד ליניארית securin-mCherry DNA לתוך ה-mRNA ולטהר את ה-mRNA. השתמש ספקטרופוטומטרים כדי לוודא הריכוז של ה-mRNA הוא יותר מ-100 ng/µL ואת היחס של ספיגת ב-260 nm ו 280 ננומטר הוא כ 2.0.
  2. הכנת demembranated צפרדע רפואית זריזה זרע דנ א
    הערה: חיבור מקורי מורי 19911.
    1. המתת חסד למבוגרים זכר צפרדע רפואית זריזה25 ומנתחים האשכים של ארבעה צפרדעים זכרים26,27.
    2. מקום האשכים מצפרדעים ארבע mL 100 באותה צלחת פטרי. יש לשטוף את האשכים שלוש פעמים ב 50 מ של פתרון קר x MMR 1 (0.1 M NaCl, 2 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ מ MgCl2, 2 מ מ CaCl2, 5 מ מ. HEPES, מ מ 0.1 EDTA).
    3. להסיר האשכים בצלוחית 100 מ ל דם עודף ושומן ולאחר מכן לשטוף פעמיים תוך קר הכנה גרעיני מאגר (NPB) (250 מ מ סוכרוז, 15 מ מ HEPES, pH 7.4, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0, 0.5 מ מ spermidine trihydrochloride, tetrahydrochloride spermine 0.2 מ מ).
    4. להסיר את המאגר הגרעיני הכנה (NPB) וחותכים האשכים לחלקים באורכים קטנים יותר 0.2 ס מ באמצעות מספריים חדות ויבתר ב- 100 מ ל צלחת פטרי. הוסף 8 מ של NPB קר את האשכים לפירוק נוסף.
    5. שימוש ניילון mesh בדים עם גודל הנקבוביות של מיקרומטר 70 כדי לסנן את האשכים לאסוף דגימת זרע לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין למטה תאי זרע שנאספו ב 1,730 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר תגובת שיקוע.
    6. אספקת תאי הזרע עם 1 מ ל NPB, µL 50 של lysolecithin 10 מ"ג/מ"ל, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי תאי זרע demembranate.
    7. לשטוף את הזרע demembranated DNA עם 10 מ"ל של NPB קר עם 3% BSA פתרון שלוש פעמים.
    8. למדוד צפיפות הזרע DNA עם hemocytometer.
    9. הקפאת הזרע דנ א ב 5 µL aliquots בחנקן נוזלי ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. ריכוז אופטימלי של זרע הדנ א הוא כ גרעינים/µL 105.
  3. חלבון טיהור של לוקליזציה GFP-גרעיני אות (GFP-NLS)
    1. להפוך את פלסמיד GFP-NLS מתויג GST BL21 (DE3) המוסמכת e. coli בתאי5.
    2. דגירה התאים ללא אנטיביוטיקה ב 37 ° C עבור 1 h ולאחר מכן התפשטה על צלחת agarose ליברות עם 100 אמפיצילין µg/mL.
    3. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14 עד 18 שעות לצמוח התאים מושבות יחיד. לבחור, לחסן מושבות יחיד לתוך מ 4 ל LB מדיה עם 100 אמפיצילין µg/mL. לנער את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות.
    4. להכין את המדיה יט בלוק (16 גרם של מה נשארתי-טריפטון, 10 גר' תמצית מה נשארתי-שמרים, 5 g של NaCl), מחממים את המדיה יט 37 מעלות צלזיוס.
    5. לחסן 1 מ"ל של התאים incubated לילה בתקשורת LB לתוך 250 מ של מדיה יט טרופה עם אמפיצילין µg/mL 100 ומנערים 2 שעות להגדיל את צפיפות התאים.
    6. למדוד צפיפות אופטית תא (OD) כל 30 דקות, באמצעות ספקטרופוטומטרים באורך-גל של 600 ננומטר. הוסף 0.1 מ מ IPTG לתוך תאים לזירוז ביטוי חלבון ה-GFP-NLS ברגע הערך OD מגיע 0.1.
    7. לנער את התאים ב 18 ° C בלילה כדי להפחית את שיעור הצמיחה תא ולאפשר סינתזה וביטוי חלבונים טובים יותר.
    8. ספין למטה התאים ב g x 34,524 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהסיר תגובת שיקוע.
    9. Resuspend תא כדורי ב- 40 מ של מאגר PBS (שסופקו עם 800 µL של 50 מ"ג/מ"ל ליזוזים, 100 µL של 0.2 מ' PMSF, µL 13.2 של שילוב 10 מ"ג/מ"ל של leupeptin, pepstatin chymostatin 8 µL של 0.5 M EDTA), דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
    10. לשבור את התאים באמצעות של sonicator בתדר של-20 קילו-הרץ עבור 4 x 30 s, עם 30 s המרווחים בין כל sonication, לשחרר הביע GFP-NLS חלבון.
    11. ספין-g x 20,000 עבור 35 דקות להסיר תאים שבור.
    12. השתמש כרומטוגרפיית זיקה כדי לחלץ ולטהר GFP-NLS חלבון.
    13. רוחצים את slurry חרוז 1.5 מ ל שלוש פעמים עם 15 מ"ל PBS המאגר את תקופת דגירה 250 מ של lysate עם חרוזים של 4 שעות ב 4 ° C עם היפוך.
    14. ספין למטה החרוזים-g x 2000 עבור 5 דקות ולהוסיף 10 מ"ל של שטיפת פתרון (25 מ"מ טריס בסיס pH 7.5, 500 מ מ NaCl, ו- 5 מ"מ DTT) חרוזים. דגירה חרוזים ב- 700 µL מאגר • תנאי (50 מ מ טריס-HCl, גלוטתיון pH 8.8, 20 מ מ מופחת ו 5 מ מ DTT) עם סיבוב ב 4 º C. לאסוף את aliquot של • תנאי עם נפח של 50 µL.
    15. למדוד את הריכוז של חלבון שנאספו על-ידי הפעלת עם ג'ל כחול Coomassie28.
    16. Elute את החלבונים תוך שימוש בעמודות PD-10 עם 3 מ"ל של מאגר אחסון (20 מ מ HEPES, 150 מ מ אשלגן כלורי, גליצרול 10%, pH 7.7) דרך מאגר exchange.

2. הכנת רכיבה על אופניים צפרדע רפואית תמציות

הערה: הליך הכולל הכנת תמציות מודגם ב איור 1A. להתאים בין מורי 19911.

  1. מזריקים נקבה בוגרת שלושה צפרדע רפואית זריזה 66 IU סוסה הרה סרום גונדוטרופין (PMSG) 10 ימים לפני הנחת ביצים.
  2. מזריקים אלה צפרדעים צפרדע רפואית 500IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG) כדי לגרום ביצה הנחת 18 שעות לפני הכנת תמציות רכיבה על אופניים.
  3. ביטול הטילו ביצים בן לילה. על סמך ניסויים (נתונים לא מוצג), תמציות שהוכנו מן הביצים סחוט טרי מפיקים יותר מתמיד בפעילויות מאשר תמציות מקריסטלים של הביצים הניח הצפרדע הנשי באותו. לסחוט את הביצים של צפרדע נקבה לכל 100 מ מ פטרי המכיל מאגר x MMR 0.2 מ"ל, לבדוק תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  4. למחוק את קבוצות של ביצים גבולות ברורים בין החיה לבין הפולנים vegetal או לא סדיר כתמים לבנים על גבי החיה הפולנים.
  5. לבחור את האצווה של ביצים אחד צפרדע נקבה עם חיה בבירור הבדיל ותרנים vegetal הצגת אוכלוסיה הומוגנית של ביצים, להעביר את הביצים לתוך גביע 600 מ.
  6. שופכים עודף-0.2 x MMR מאגר ולהוסיף בעדינות 250 מ של דור 2 לכל 100 מ ל תמצית ציסטאין (pH 7.7) ב- 1 x מאגר (100 מ"מ אשלגן כלורי, 0.1 מ"מ CaCl2, 1 מ MgCl2, 10 מ מ HEPES, 50 מ מ סוכרוז, pH 7.7) את הביצים.
  7. לנער את הביצים נמרצות על ידי יד ולהסיר את המעילים ג'לי של ביצים מעל שלושה שוטף עם הנפח הכולל של 800 מ של ציסטאין מאגר במשך 3 דקות או עד ביצים צבירה ולהתיישב בתחתית הספל, המציינת כי ג'לי המעיל להסרת מוצלח.
  8. לשטוף ביצים עם 1 ליטר של 0.2 x MMR פתרון ארבע פעמים.
  9. לבחור ולמחוק את הביצים להפוך לבן באמצעות פיפטה העברה של זכוכית.
  10. שופכים את המאגר MMR והענק ביצים עם 200 מ של µg/mL 0.1 סידן ionophore A23187 פתרון במאגר x MMR 0.2 להפעלה.
  11. השתמש בצידי פתח רחב פיפטה מזכוכית כדי מערבבים את הביצים בעדינות עד הביצים מופעלים ולהסיר את תמיסת ionophore סידן.
  12. בדוק את יעילות ההפעלה לאחר ביצים להתיישב בתחתית הספל. ביצים היטב מופעל יש כ- 25% של חיה הקוטב, 75% של הקוטב vegetal.
  13. לרחוץ את הביצים הופעל פעמיים עם 50 מ של 1 x מאגר תמצית בתוספת מעכבי פרוטאז (10 µg/mL כל של leupeptin, pepstatin ו- chymostatin).
  14. להעביר בזהירות ביצים microtube snap-cap 0.4 mL, לאחר מכן לארוז ביצים באמצעות צנטריפוגה ב 200 x g למשך 60 שניות ולאחר מכן 600 x גרם במשך 30 שניות.
  15. הסר את מאגר נוסף על ביצים באמצעות כוס פסטר פיפטה כדי להפחית את הדילול של תמציות.
  16. לרסק ביצים ב 15,000 x g 10 דקות ב 4 º C.
  17. חותכים את הצינורות עם סכין גילוח כדי להפריד בין שלוש שכבות של ביצים מרוסקות ולשמור הציטופלסמה גולמי בהשכבה האמצעית.
  18. להעביר את הציטופלסמה גסה לתוך צינורות ultracentrifuge חדש, להשלים עם מעכבי פרוטאז ו cytochalasin B-10 µg/mL בכל.
  19. Centrifuge הציטופלסמה גולמי שוב ב 15,000 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לטהר הציטופלסמה עוד יותר על-ידי הסרת השומנים העודפים ואת החלמון.
  20. לשמור על תמציות טריות על קרח.

3. droplet דור

  1. הכנה קאמרית 2D זכוכית
    הערה: צינורות זכוכית מלבן לשמש צ'יימברס זה להגביל את טיפות על מטוס 2-ממדי יחיד, ומאפשר איסוף נתונים ופיקוח קל יותר.
    1. חותכים מלבן צינורות זכוכית עם ממד פנימי של 2 מ"מ x 100 מיקרומטר 4 מ מ חתיכות ארוך. להשתמש בקצה חד אבן משחזת, לסמן את הגבולות הרצויים על המשטח החיצוני של הצינור זכוכית עם תחריטים אור ולאחר מכן לחץ על בעדינות משני צידי שפותח כדי לשבור חתיכות של צינורות זכוכית.
    2. מראש בחום של חממה אמבט יבש עד 95 מעלות צלזיוס. להוציא את הבלוק חימום ולמקם אותו לתוך desiccator ואקום לוחות פוליקרבונט.
    3. הצב צינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל 30 µL של טריכלורו (1H 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane בבלוק חימום. להניח צינורות זכוכית מלוטשת פנימה desiccator ואקום של 5 ס מ כדי לחסום את החימום.
    4. לחבר את desiccator משאבת ואקום. תדליק את המשאבה במשך דקה אחת להגיע לרמה ואקום הרצוי, ולאחר מכן סגור את השסתום 3-דרך לאטום את desiccator ולתת את אדי טריכלורו (1H 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane מעיל את הדופן הפנימית של צינורות זכוכית. פעולה זו תיצור סביבה הידרופובי לייצב את טיפות.
    5. להשאיר את צינורות זכוכית פנימה desiccator לציפוי לילה. הצינורות יהיה מוכן לשימוש למחרת.
  2. דור droplet והדמיה
    הערה: ההליכים של יצירת טיפות והדמיה מומחשים דמויות 1B ו- C 1
    1. לספק תמציות מוכן בשלב 2 עם 10 ng/µL securin-mCherry mRNA עבור ניסויים פשוטים cytoplasmic רק מחזור התא. לחלופין, תמציות אספקה עם demembranated כרומטין הזרע (250 לכל µL של תמצית), 10 מיקרומטר GFP-NLS חלבון ו- 10 ng/µL securin-mCherry mRNA ליצירת טיפות תערוכת גרעינים תקופתיים מורפולוגיה משתנה.
    2. בשפופרת microcentrifuge 1.5 mL, µL 20 מיקס של תמצית שסופק עם חלבון רקומביננטי או mRNA עם 200 µL של 2% perfluoropolyether-פוליאתילן גליקול (PFPE-PEG) fluorosurfactant בשמן fluorinated HFE7500.
    3. להפיק טיפות באמצעות מערבל מערבולת. המגוון של גדלים droplet יכול להיות מווסת על ידי מערבולת המהירות ומשך. כדי ליצור טיפות עם רדיוס ועד 50 מיקרומטר 200, להגדיר את מהירות מערבולת ב x 56 g (3,200 סל ד עם רדיוס של 4.9 מ מ) והקש בעדינות את microcentrifuge שפופרת המכילה החילוץ ואת תערובת חומרים פעילי שטח על המיקסר במשך 3.5 שניות. מבחינה ויזואלית לבדוק אם טיפות הם אחידים בגודלם.
    4. להשתמש על פיפטה 20 µL להעביר את טיפות צף למעלה, אמצעי אחסון שווה של חומרים פעילי שטח PFPE-יתד לתוך צינור ה-PCR. טובלים את שפופרת הזכוכית המוכן צעד לתוך השכבה droplet ב 1.5 mL microcentrifuge צינור ולחכות עד טיפות מילאו כ- 75% של הצינור, ואז לדחוף את הצינור לתוך השכבה חומרים פעילי שטח עד הצינור מתמלא לגמרי. זה את הדחיסות droplet ולאפשר את טיפות ליצור שכבה אחת אחת בתוך החדר ללא חפיפה או צורה העיוות שנגרם בשל צפיפות יתר.
    5. למלא צלחת תחתית זכוכית בקוטר 40 מ מ עם שמן מינרלי. לטבול הצינורות droplet מלא בשמן על ידי בעדינות דוחף אותם למטה באמצעות פינצטה משובחים.
    6. לאחר טעינת כל הדגימות, להשתמש זכוכית פיפטה כדי להסיר את כל פסולת גלוי או דלף טיפות. להוסיף יותר שמן מינרלי אם הצינורות אינם או לא תהיה לגמרי שקוע את תהליך ההדמיה.
    7. לערוך הדמיה של טיפות על מיקרוסקופ epifluorescence מצויד במה ממונע x-y (ראה טבלה של חומרים). השתמש מטרה אוויר 4 X עבור כל הדמיה. עבור הדמיה פלורסצנטיות, להשתמש 130 W כספית אדי קצר קשת מנורת מקור אור זריחה לתאורת ומסנן GFP להגדיר (nm עירור 482/35, פליטה 514/LP ננומטר) והגדר מסנן mCherry (עירור 562/40 ננומטר, פליטה 641/75 ננומטר) עבור הדמיה אותות GFP-NLS ו- securin-mCherry.
    8. סרטי זמן לשגות רשומה השדה החיובי, קרינה פלואורסצנטית מרובות ערוצים כל 6 עד 9 דקות עד טיפות מאבדים את פעילותם.

4. התמונה עיבוד וניתוח נתונים

  1. פילוח ומעקב של טיפות
    1. לייבא נתונים מוקלט בפורמט של ". tif" או ".oif" תמונות ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים).
    2. קטע טיפות יחיד באמצעות הערוץ שדה בהיר. תמונת שדה בהיר יראה טיפות כעיגולים בהיר עם גבולות כהה. קביעת סף להחיל על התמונה. להוסיף משטח מעקב לכל droplet על-ידי כוונון הסף בין פיקסלים כהים ובהירים, כך כל אחד מממדי מכסה את כל האזור של ה-droplet המתאימים.
    3. עקוב אוטומטית אחר המקטעים בין מסגרות סמוכות באמצעות האלגוריתם תנועה autoregressive. מנגינה מרחק נסיעה מרבי מקובל droplet בין שתי מסגרות סמוכות כדי להיות קטנים מהרדיוס של רוב טיפות לעקוב בצורה מדויקת אחר הטיפות הקטנות.
    4. בדיקה חזותית כל רצועות לרוחב הווידאו כולו כדי לזהות segmentations שגוי מהחתך הזה החלל הריק בין טיפות במקום טיפות בפועל. מחק ידנית את רצועות שגוי.
    5. קטע ולעקוב אחר שטח הרקע ללא כל טיפות כדי להשיג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רקע. כדי לשפר את אות רעש, להחסיר רקע עוצמת בעצימות זריחה של טיפות על כל מסגרת זמן.
    6. ייצוא למדוד פרמטרים עבור כל רצועה לאורך זמן, כולל את וסטיית של עוצמת קרינה פלואורסצנטית ואזור droplet לתוך קבצי "csv".
  2. ניתוח נתונים של גודל droplet ותקופת תנודה
    1. לטעון קבצי ה-"csv" לתוך R כדי ליצור מתווה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן לכל droplet. מזהה רשומה droplet לתוך קובץ "csv".
    2. ייבוא קבצי ה-"csv" שיוצאו את תוכנת ניתוח ואת הקובץ ". csv" עם רשימה של מזהה droplet לתוך Matlab ושמור קבצים ".mat" עבור ניתוח נתונים נוסף.
    3. חישוב הנפח של droplet דחוס על סמך המידע אזור droplet שיוצאו לאחר פילוח, ואת הגובה של זכוכית קאמרית19. להשתמש באמצעי האחסון כדי לחשב הרדיוס של droplet ככדור.
    4. לחלץ את נקודות זמן של פסגות, שקתות באמצעות אלגוריתם זיהוי שיא/שוקת. לבצע תיקונים ידניים על מיקומה של פסגות, שקתות כדי להבטיח שהם מזוהים באופן מדויק.
    5. כדי לחשב את תקופת מחזור התא, לחשב את מרווח הזמן בין שתי הפסגות הסמוכות. אקח את הממוצע של כל מרווחי לכל droplet בתור תקופת מחזור התא שלו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2, אנו מראים כי פרוטוקול זה מייצרת תנודות mitotic הן פשוטות, ללא גרעיני תאים, כמו גם מסובך תאים עם גרעינים, איפה מתנד כוננים ההתחלפות מחזורית של היווצרות גרעינים, דפורמציה. טיפות ללא גרעינים יוצרות תנודות mitotic למעלה כדי 30 מחזורים undamped מעל משך הזמן של 92 שעות, כפי שמציין את סינתזה תקופתיים והשפלות של קרינה פלואורסצנטית כתב securin-mCherry (איור 2 א). Securin הוא מצע של במחבת הכתומה קידום APC מורכבות/ג ההשפלה של securin-mCherry במהלך "אנאפאזה" ובכך מציין הפעילות של APC/ג

כדי לבחון את היכולת של מתנד mitotic לנהוג אירועים mitotic במורד הזרם, בנוסף סיפקנו כרומטין הזרע demembranated אות מטוהרים לוקליזציה חלבון גרעיני פלואורסצנטי ירוק (GFP-NLS), צבעי Hoechst 33342 cytoplasmic תמציות. איור 2B מראה ההתחלפות האוטונומי של שלבים ברורים של מחזור התא, לאטמוספרה (סרגל כחול) מיטוזה (ברים אדומה), במהלכן השינויים של מורפולוגיה גרעיני מונעים על ידי מתנד mitotic עצמית מתמשכת. כל האירועים mitotic, קרי, decondensation כרומוזום ועיבוי שדווחו על-ידי Hoechst 33342 (איור 2B, בשורה הראשונה), היווצרות גרעיני מעטפת הגרעין פירוט על-ידי ה-GFP-NLS (איור 2B, בשורה השניה) ואת הפעילות של מתנד מחזור התא על ידי סינתזה השפלה של securin-mCherry (איור 2B, בשורה השלישית), בד בבד עם אחד את השני. תמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות רב ערוצית זמן לשגות. תוצאות הניסוי שלנו להפגין המערכת המשוחזרת של מחזור התא הוא מסוגל שיחזור של מתנד mitotic Cdk1 ו- APC/ג, אשר יכול לנהוג סדרה של אירועים במורד הזרם כולל מעטפת הגרעין התמוטטות הרפורמציה, ו כרומוזום מורפולוגיה שינוי.

איור 3 מראה תנודות שמציין את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע securin mCherry לפני ואחרי הסרת רעש. פסגות ו שקתות הפך מבטאים יותר לאחר הסרת רעשי הרקע, במיוחד עבור תנודות שני הראשונים, המציין כי הסרת רעש יכול לעזור לשפר את אות רעש לצורך ניתוח נוסף.

Figure 1
איור 1. הליך ניסיוני עבור יצירת droplet מבוססי תאים mitotic. א תמציות Cytoplasmic נאספים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. B. תמציות מסופקות עם רכיבים מרובים כדי לשחזר ודיווח mitotic תנודות. באמצעות שיטת vortexing, מעורבבים תמציות של חומרים פעילי שטח שמן לייצר טיפות. ג. טיפות נטען לתוך צינור מצופים silane טריכלורו (1 H 1 H, 2 H, 2 H-perfluorooctyl), ואז עם תמונה דרך מיקרוסקופ epi-זריחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. הגילוי של מחזור התא dynamics באמצעות עיתונאים פלורסנט. א מסלול הזמן של עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע securin-mCherry של ה-droplet שנבחר, המציין 30 תנודות undamped במהלך מספר שעות 92. האיור הוספה מציג את התמונה זריחה עם ה-droplet שנבחר המוקפת בעיגול לבן. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. B. זמן סדרת תמונות של droplet ערוצי קרינה פלואורסצנטית (בראש שלוש שורות) ושדה בהיר (השורה האחרונה). התקדמות מחזורי השעון מחזור התא ומהלכיו mitotic במורד הזרם מסומנים בו-זמנית על-ידי כתבים פלורסנט מרובים. "אנאפאזה" המצע securin-mCherry מציין פעילות של הרגולטורים שעון APC/C, הכתם Hoescht מציינת שינויים מורפולוגיה כרומוזומלית, ומציין GFP-NLS מעטפת הגרעין קלקולים ו- reformations. מעטפות גרעיני (מודגשת על ידי החצים הלבנים) גם לזיהוי של תמונות שדה בהיר, התאמת הלוקליזציה של GFP-NLS יצוינו גרעינים. סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. לאטמוספרה, שלב mitotic מסומנים בהתאמה על ידי סרגל כחול הים וברים אדום מעל התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. רקע חיסור עבור עוצמת קרינה פלואורסצנטית אכזרי של securin mCherry. א זמן הקורס תנודה לפני הסרת רעש רקע. B. זמן הקורס תנודה לאחר הסרת רעש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הוצגו שיטה לפיתוח מערכת תפוקה גבוהה התא המלאכותי הזה מאפשר חוץ גופית בתוך שיחזור ומעקב לטווח ארוך של מחזור התא עצמית מתמשכת תנודות ברמת תא בודד. ישנם מספר שלבים קריטיים, ההופכות שיטה זו מוצלחת. ביצים צפרדע רפואית הראשון, סחוט טרי באיכות טובה, בהשוואה עם ביצים הניח, נוטים לייצר תמציות בפעילות תנודה יותר מתמיד. שנית, כימוס של תמציות בתוך microenvironments מיוצב חומרים פעילי שטח חיוני לשמר את הפעילות תנודה. שלישית, דגירה של טיפות שמן לתוך וביתנו צינורית דקה טיפות בתוך שכבה אחת, ובכך להקל על עיבוד תמונה ומעקב ארוך טווח. רביעית, ציפוי הקיר הפנימי צינור עם טריכלורו (1H 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane כמו אנטי-דבק להורדת האנרגיה משטח מסייעת לשמר את תמצית הפעילות. חמישית, איטום הצינורות עם שמן למנוע זרימה droplet. השיטה ואטימתם שמן ניתן גם למנוע אידוי של עוד יותר לשמר את תמצית הפעילות. אלה ביחד לשפר את אחוזי ההצלחה של שחזור במבחנה של תנודות חזקות בטיפות, הדיוק של פילוח ומעקב של אלה טיפות לטווח.

כדי להפיק טיפות microemulsion, יש לנו עובדים בשני vortexing פשוט שיטה, הדומה כמה אחרים מחקרים29,30,31, כמו גם טכניקות הנפוצות מיקרופלואידיקה19, 20 (נתונים לא מוצג). שתי השיטות הצליחו להפיק בהצלחה microemulsions באופן תפוקה גבוהה. מגבלה אחת המשויך בשיטת vortexing היא כי הגודל droplet לא נשלט בצורה אחידה. ללימודים הדורשים בגודל מוגדר היטב עם גודל ממוזער וריאציה, טכניקות מיקרופלואידיקה אמור לשמש בקרה טובה יותר של גדלים droplet. כאן בחרנו בשיטת vortexing על פני השיטה microfluidic משתי סיבות. ראשית, יש נהלים פשוטים, easy-to-בצע, אשר תאפשר מעבדות ללא גישה microfluidic טכניקות או מתקנים nanofabrication להתאים שיטה זו בקלות. שנית, שיטת vortexing היא יותר יעילה וכלכלית על חקירת תלויי-גודל התנהגויות של מתנד. זה יכול ליצור הפצה רחב בגדלים droplet עם רדיוס משתנה מ מיקרומטר מספר עד 300 מיקרומטר, ואילו הטכניקה microfluidic יכול רק ליצור התפלגות הצר שבמרכזה בגודל מוגדר מראש. המגוון של גדלים droplet שנוצר בשיטה זו תואמת את מגוון רחב של גדלים תא הנובע לחטיבות תא אופיינית ממעיט בשלב המחשוף של עוברי מוקדם כמו צפרדע רפואית ו דג זברה.

השיטה הנוכחית השתפרה במידה ניכרת את הקיימות של תנודות ואת התפוקה של ניתוח דינמיקה מתחם השעון, לעומת שיטות קיימות של לשחזר מתנדים ביולוגי בצובר מעורבב היטב פתרון8, 32, אשר נוטים לייצר במהירות damped תנודות. אנחנו הראו כי שיטה זו השתפרה באופן משמעותי את תוחלת החיים של תנודות של כמה מחזורים בצובר תגובה8 כדי מעל 30 מחזורים ב microenvironment של טיפות (איור 2 א). בנוסף, גורפת תגובות חוסר הדמיון לממדים התא בפועל, לא יכול לסכם את הארגון המרחבי מושגת על ידי מידור פונקציונלי בתאים אמיתי. יש להתגבר על מגבלות אלה של תגובות בתפזורת, מערכת תא מלאכותי שלנו מספק פלטפורמה חיוני עבור חוקרים שאלות מאתגרות כגון את הטרוגניות הסלולר, את stochasticity של מתנדים, כאלו אחרת שקשה לחקור.

יתר על כן, שיטה זו מספקת גמישות ב מידת המורכבות אשר יכול להיות בנוי תאים. כדי למנוע הפרעות. הדינמיקות גרעיני מסובך, אנחנו יכולים לשקם מערכת מינימלית, cytoplasmic בלבד-מחזור התא המכיל גרעינים אין. מתנד הזה ופשוט cytoplasmic בלבד תערוכות תנודות עצמית מתמשכת משמעותית טוב יותר כמה מתנדים סינתטי הקיים. על ידי אספקת כרומטין הזרע, אנחנו יכולים גם לשקם מורכבים יותר תאים עם גרעינים זה לסירוגין הרכבה עצמית לאטמוספרה, דפורמציה גרעיני בשלב mitotic בצורה אומנותית. הפעילות של מתנד mitotic, כמו גם האירועים גרעיני במורד הזרם, יכול להיות בו זמנית נמדד על-ידי קרינה פלואורסצנטית רב ערוצית הדמיה ומעקב תא בודד.

השיטה מאפשרת גם רמה גבוהה של מניפולציה מהירות מחזור התא וגודל droplet. הטכניקה vortexing מאפשר לדור של טיפות עם רדיוס במגוון רחב, אשר יפיקו תועלת המחקר של התנהגויות תלויים בגודל תא תא מחזורים. בנוסף, מהירות מחזור התא יכול להיות מאופנן הרציונאלית, ריכוזים שונים של cyclin B1 mRNAs33, אשר תאפשר לנו לחקור את הפונקציה tunability של השעון מחזור התא.

עם היתרונות הללו, במבחנה שיחזר מחזור התא פלטפורמה, המאפשר ויזואליזציה, מניפולציה וניתוח של דינמיקה מתא בודד, סביר להניח יסלול את הדרך לקבלת תובנות חדשות ההתנהגויות סטוכסטי מורכב יותר של התא מחזור שעון. השיטה גם ייתכן להכליל מחקרים במבחנה של אחרים מתנדים המסתמכים באופן מסורתי על תגובות בצובר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לו מדלן על בניית פלסמיד securin-mCherry, הברכיים Man Lee, קנת הו, אלן ליו P לדיונים על יצירת droplet, ג'רמי B. צ'אנג, ג'יימס דגלס פרל ג'וניור למתן ש-GFP-NLS לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (הקריירה המוקדמת מענק #1553031), מכוני הבריאות הלאומיים (מירה #GM119688), מלגת מחקר סלואן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. Methods in Enzymology. 91, Academic Press. 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Tags

ביוכימיה גיליון 139 Mitotic-מחזור התא עצמית מתמשכת תנודות צפרדע רפואית זריזה רכיבה על אופניים ללא תא תמציות זריחה זמן לשגות מיקרוסקופ במבחנה ניתוח מתא בודד תאים מלאכותיים microemulsion
שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא <em>צפרדע רפואית</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., … More

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter