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Biochemistry

सेल-प्रकोष्ठ के Microemulsions में चक्र दोलनों का पुनर्गठन-मुक्त Xenopus Egg अर्क

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

हम इन विट्रो में स्व-निरंतर mitotic दोलनों की पीढ़ी के लिए एक विधि वर्तमान में Xenopus laevis के अंडे के अर्क encapsulating द्वारा पानी में तेल microemulsions ।

Abstract

एकल-कक्ष स्तर पर दोलनों का वास्तविक समय मापन जैविक घड़ियों के तंत्र को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि थोक अर्क Xenopus laevis अंडे से तैयार कोशिका चक्र की प्रगति अंतर्निहित जैव रासायनिक नेटवर्क विदारक में शक्तिशाली किया गया है, उनके पहनावा औसत माप आम तौर पर एक नम दोलन करने के लिए सुराग, प्रत्येक के बावजूद व्यक्तिगत थरथरानवाला लगातार किया जा रहा है । यह शोर जैविक प्रणालियों में व्यक्तिगत oscillators के बीच सही तुल्यकालन की कठिनाई के कारण है. थरथरानवाला के एकल सेल गतिशीलता को पुनः प्राप्त करने के लिए, हम एक छोटी बूंद-आधारित कृत्रिम सेल प्रणाली है कि सेल की तरह डिब्बों में mitotic चक्र का पुनर्गठन कर सकते है विकसित Xenopus laevis अंडे की साइकिल चालन cytoplasmic निष्कर्षों encapsulating । इन सरल cytoplasmic केवल कोशिकाओं पर 30 से अधिक चक्र के लिए निरंतर दोलनों का प्रदर्शन । नाभिक के साथ और अधिक जटिल कोशिकाओं का निर्माण करने के लिए, हम demembranated शुक्राणु क्रोमेटिन प्रणाली में नाभिक स्वयं विधानसभा ट्रिगर करने के लिए कहा । हम वास्तविक कोशिकाओं में की तरह गुणसूत्र संघनित्र//विरूपण और नाभिक ढंक टूट/सुधार की आवधिक प्रगति मनाया । यह इंगित करता है कि mitotic थरथरानवाला कार्यों ईमानदारी से कई बहाव mitotic घटनाओं ड्राइव करने के लिए । हम एक साथ बहु चैनल समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर व्यक्तिगत बूंदों में mitotic थरथरानवाला और बहाव की प्रक्रियाओं की गतिशीलता पर नज़र रखी । कृत्रिम कोशिका चक्र प्रणाली मात्रात्मक हेरफेर और एकल सेल संकल्प के साथ mitotic दोलनों के विश्लेषण के लिए एक उच्च प्रवाह ढांचा प्रदान करता है, जो की संभावना नियामक मशीनरी और कार्यों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है घड़ी ।

Introduction

Xenopus laevis अंडे से तैयार Cytoplasmic अर्क कोशिका चक्र के जैव रासायनिक अध्ययन के लिए सबसे प्रमुख मॉडलों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं, अंडाणुओं की बड़ी मात्रा को देखते हुए, तेजी से कोशिका चक्र प्रगति, और पुनर्गठन की क्षमता इन विट्रो मेंmitotic घटनाओं1,2. इस प्रणाली प्रारंभिक खोज और आवश्यक सेल के यंत्रवत लक्षण वर्णन की अनुमति दी है-परिपक्वता को बढ़ावा देने के कारक की तरह चक्र नियामकों (MPF) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहाव mitotic धुरी विधानसभा और गुणसूत्र अलगाव 1 सहित प्रक्रियाओं ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus egg अर्क भी सेल चक्र घड़ी8,12,13,14 के विनियामक नेटवर्क के विस्तृत विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया गया है और डीएनए क्षति के अध्ययन के लिए /replication चौकी15 और mitotic धुरी विधानसभा चौकी16,17,18।

कोशिका चक्र के इन अध्ययनों Xenopus अंडे के अर्क का उपयोग मुख्य रूप से थोक माप के आधार पर किया गया है । हालांकि, पारंपरिक थोक प्रतिक्रिया परख असली सेल व्यवहार की नकल नहीं कर सकते हैं, उनके आयामों और प्रतिक्रिया अणुओं के उपसेलुलर स्थानिक compartmentalization में एक प्रमुख विसंगति दी । इसके अलावा, mitotic गतिविधियों के थोक माप जल्दी से8भिगोने से पहले चक्र की एक सीमित संख्या देने के लिए प्रवण हैं । बल्क प्रतिक्रियाओं का ये नुकसान जटिल घड़ी गतिशील गुणों और कार्यों के आगे की समझ प्रदान करने के लिए निकालने प्रणाली को रोका है । हाल के अध्ययनों से सेल-मुक्त cytostatic फैक्टर encapsulated है-गिरफ्तार (सीएसएफ) Xenopus अर्क19,20 आकार में परिभाषित सेल-डिब्बों की तरह है, जो मदद की है स्पष्ट कैसे धुरी आकार द्वारा संग्राहक है cytoplasmic मात्रा । हालांकि, इस में इन विट्रो सिस्टम cytostatic फैक्टर1की कार्रवाई द्वारा अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय के metaphase में गिरफ्तार किया है, और एक लंबे समय तक निरंतर दोलनों में सक्षम एक प्रणाली सेल के स्तर पर आगे की जांच के लिए सेल चक्र की जरूरत है थरथरानवाला.

एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ सेल चक्र दोलनों का अध्ययन करने के लिए, हमने एक सेल-स्केल, उच्च-प्रवाह प्रणाली को पुनर्गठन के लिए विकसित किया है और व्यक्तिगत microemulsion में कई स्वयं-निरंतर mitotic थरथरानवाला प्रक्रियाओं का एक साथ माप बूंदों. इस विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल में, हम 10 से ३०० microemulsions को लेकर आकारों के µm में साइकलिंग Xenopus laevis एग कोशिका द्रव्य encapsulating द्वारा कृत्रिम mitotic दोलन प्रणाली के निर्माण का प्रदर्शन करते हैं । इस प्रणाली में, mitotic दोलनों गुणसूत्र संघनित्र और de-संघनित्र, परमाणु लिफाफा टूटने और सुधार, और anaphase सब्सट्रेट (जैसे, securin-mCherry के इस प्रोटोकॉल में) की गिरावट और संश्लेषण शामिल थे सफलतापूर्वक पुनर्गठन किया गया ।

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Protocol

सभी विधियां यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) मिशिगन विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. सेल चक्र पुनर्गठन और पता लगाने के लिए सामग्री की तैयारी

  1. गिब्सन विधानसभा प्लाज्मिड डीएनए निर्माण और securin-mCherry के mRNA शुद्धिकरण के लिए क्लोनिंग
    1. एक pMTB2 वेक्टर रीढ़, securin, और mCherry के माध्यम से पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और जेल शुद्धिकरण21,22सहित तीन डीएनए टुकड़े तैयार करें ।
    2. एक fluorospectrometer का उपयोग कर टुकड़े की सांद्रता उपाय । एक 1:1:1 आणविक अनुपात में securin और mCherry आवेषण के साथ रीढ़ की १०० एनजी गठबंधन और पानी जोड़ने के लिए प्रतिक्रिया की कुल मात्रा को समायोजित करने के लिए 5 µ l
    3. 5x इज़ोटेर्माल विधानसभा प्रतिक्रिया बफर के 6 मिलीलीटर 1 एम Tris-एचसीएल (पीएच ७.५) के 3 मिलीलीटर के साथ तैयार, ३०० µ l के 1 m MgCl2, ६०० µ l के 10 mM dNTP, ३०० µ l के 1 m डीटीटी, खूंटी के १.५ g-८०००, और 20 मिलीग्राम की णड23.
    4. 1x इज़ोटेर्माल असेंबली प्रतिक्रिया बफ़र aliquot के एक 15 µ l करने के लिए संयुक्त अंशों जोड़ें । 15 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर एक पीसीआर रिएक्शन ट्यूब में प्रतिक्रिया की मशीन ।
    5. एक ०.८% agarose जेल बनाओ और इन टुकड़ों के एनीलिंग दक्षता की पुष्टि करने के लिए 10 वी/
    6. RNase-मुक्त जल के 15 µ l का उपयोग करते हुए बनवाये प्लाज्मिड और elute को शुद्ध करें । रूपांतर 1 µ शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए के एल में ५० µ एल DH5α सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं के24 भविष्य के उपयोग के लिए ।
    7. DH5α सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं से securin-mCherry के प्लाज्मिड डीएनए को निकालें और शुद्ध करें ।
    8. mRNA में रेखीय securin-mCherry प्लाज्मिड डीएनए टाइप करना और mRNA को शुद्ध करना । mRNA की एकाग्रता से अधिक १०० एनजी/µ एल और २६० एनएम और २८० एनएम के अनुपात के बारे में २.० है कि पुष्टि करने के लिए एक spectrophotometer का उपयोग करें ।
  2. demembranated Xenopus laevis शुक्राणु डीएनए की तैयारी
    नोट: मरे १९९१1से अनुकूलित ।
    1. Euthanize वयस्क नर Xenopus laevis25 और काटना testes से चार नर मेंढक26,27.
    2. एक ही १०० मिलीलीटर पेट्री डिश में चार मेंढकों से जगह परीक्षण । ठंडा 1x एमएमआर समाधान (०.१ मीटर NaCl, 2 मिमी KCl, MgCl2, 2 मिमी CaCl2, 5 मिमी HEPES, ०.१ मिमी EDTA के 1 मिमी) के ५० मिलीलीटर में परीक्षण तीन बार कुल्ला ।
    3. एक १०० मिलीलीटर पेट्री डिश में परीक्षण से अतिरिक्त रक्त और वसा को हटा दें और फिर ठंड परमाणु तैयारी बफर (NPB) में दो बार धो (२५० mm सुक्रोज, 15 मिमी HEPES, पीएच ७.४, 1 मिमी EDTA, पीएच ८.०, ०.५ मिमी spermidine trihydrochloride, ०.२ मिमी spermine tetrahydrochloride) ।
    4. परमाणु तैयारी बफर (NPB) निकालें और एक १०० मिलीलीटर पेट्री डिश में तेज विदारक कैंची का उपयोग कर ०.२ सेमी की तुलना में छोटे लंबाई के साथ टुकड़ों में कटौती का परीक्षण । आगे टूटने के लिए परीक्षण के लिए ठंड NPB के 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. परीक्षण फ़िल्टर करने के लिए ७० µm का एक ताकना आकार के साथ नायलॉन मेष कपड़े का प्रयोग करें और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में शुक्राणु नमूना इकट्ठा । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १,७३० x g पर एकत्र शुक्राणुओं नीचे स्पिन और supernatant निकालें ।
    6. NPB के 1 मिलीलीटर और ५० µ एल के 10 मिलीग्राम/एमएल lysolecithin और demembranate शुक्राणु कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन के साथ शुक्राणु कोशिकाओं की आपूर्ति ।
    7. demembranated शुक्राणु डीएनए को 3% BSA सॉल्यूशन के साथ 10 मिलीलीटर ठंडा NPB के साथ तीन बार धो लें ।
    8. एक hemocytometer के साथ शुक्राणु डीएनए के घनत्व को मापने ।
    9. तरल नाइट्रोजन में 5 µ एल aliquots में शुक्राणु डीएनए फ्रीज और-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । शुक्राणु डीएनए की इष्टतम एकाग्रता लगभग १०५ नाभिक/µ एल है ।
  3. GFP का प्रोटीन शुद्धिकरण-नाभिकीय स्थानीयकरण संकेत (GFP-एनएलएस)
    1. रूपांतरण जीएसटी-टैग GFP-एनएलएस प्लाज्मिड BL21 में (DE3) सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं5.
    2. 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एंटीबायोटिक दवाओं के बिना कोशिकाओं को मशीन और फिर १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ एक पौंड agarose प्लेट पर फैल गया ।
    3. एकल कालोनियों में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए 14 से 18 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन । उठाओ और १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पौंड मीडिया के 4 मिलीलीटर में एकल कालोनियों inoculate । 12 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हिला ।
    4. autoclaved YT मीडिया (Bacto के 16 जी-tryptone, Bacto के 10 ग्राम-खमीर निकालने, NaCl के 5 जी) तैयार है और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए YT मीडिया गर्मी ।
    5. Inoculate पौंड मीडिया में रातोंरात मशीन की कोशिकाओं के २५० १०० µ जी के साथ गरम YT मीडिया की मिलीलीटर में 1 मिलीलीटर/एमएल एम्पीसिलीन और शेक 2 घंटे के लिए सेल घनत्व को बढ़ाने के लिए ।
    6. माप सेल ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) हर 30 मिनट, ६०० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर एक spectrophotometer का उपयोग कर । ०.१ mM IPTG कोशिकाओं में जोड़ें GFP-एनएलएस प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए एक बार आयुध डिपो के मान ०.१ तक पहुंचता है ।
    7. सेल विकास दर को कम करने और बेहतर प्रोटीन अभिव्यक्ति और संश्लेषण की अनुमति देने के लिए रातोंरात 18 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को हिला ।
    8. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३४,५२४ x g पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन और supernatant हटा दें ।
    9. पंजाब के ४० मिलीलीटर में सेल छर्रों resuspend (५० मिलीग्राम/एमएल lysozyme के ८०० µ एल के साथ आपूर्ति की, ०.२ एम PMSF के १०० µ एल, १३.२ µ एल के एक 10 मिलीग्राम/एमएल मिश्रण के leupeptin, pepstatin, और chymostatin, और ०.५ एम µ के 8 EDTA एल) और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    10. एक आवृत्ति पर एक sonicator का उपयोग कर कोशिकाओं को तोड़ने 20 kHz के लिए 4 एक्स 30 एस, प्रत्येक sonication के बीच 30 s अंतराल के साथ, व्यक्त GFP-एनएलएस प्रोटीन जारी करने के लिए.
    11. टूटी हुई कोशिकाओं को हटाने के लिए ३५ मिनट के लिए २०,००० x g पर स्पिन ।
    12. GFP-एनएलएस प्रोटीन निकालने और शुद्ध करने के लिए अपनत्व क्रोमैटोग्राफी का प्रयोग करें ।
    13. १.५ मिलीलीटर मनका घोल तीन बार पंजाबियों बफर के 15 मिलीलीटर और lysate के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए मोती के साथ २५० मिलीलीटर की गर्मी से धो लें ।
    14. 5 मिनट के लिए २००० x जी में मोतियों नीचे स्पिन और धोने समाधान के 10 मिलीलीटर (25 मिमी Tris आधार, पीएच ७.५, ५०० मिमी NaCl, और 5 मिमी डीटीटी) मोतियों को जोड़ने । ७०० µ एल रेफरेंस बफर (५० मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ८.८, 20 मिमी कम glutathione, और 5 मिमी डीटीटी) 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ में मशीन मोती । ५० µ की मात्रा के साथ रेफरेंस का एक aliquot लीजिए l
    15. एक Coomassie ब्लू जेल28चलाकर एकत्र प्रोटीन की एकाग्रता को मापने ।
    16. Elute के साथ पीडी-10 कॉलम का उपयोग कर प्रोटीन्स का भंडारण बफर (20 मिमी HEPES, १५० मिमी KCl, 10% ग्लिसरॉल, पीएच ७.७) बफर एक्सचेंज के माध्यम से 3 मिलीलीटर के साथ ।

2. साइकलिंग Xenopus अर्क की तैयारी

नोट: अर्क तैयार करने की समग्र प्रक्रिया में चित्र 1aसचित्र है । मरे १९९१1से अनुकूलित ।

  1. ६६ IU गर्भवती घोड़ी सीरम गोनॉडोट्रॉफिन (PMSG) के साथ तीन परिपक्व महिला Xenopus laevis सुई अंडे बिछाने से पहले 10 दिन ।
  2. मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन (एचसीजी) के ५०० IU के साथ इन Xenopus मेंढ़क इंजेक्षन करने के लिए सायक्लिंग अर्क की तैयारी से पहले 18 घंटे अंडे बिछाने प्रेरित ।
  3. रात भर रखी अंडे त्यागें । प्रयोगों के आधार पर (नहीं दिखाया गया डेटा), ताजा निचोड़ा अंडे से तैयार निष्कर्षों एक ही मादा मेंढक से रखी अंडे से तैयार अर्क से अब स्थायी गतिविधियों उत्पन्न करते हैं । 0.2 x एमएमआर बफर के 10 मिलीलीटर युक्त १०० mm पेट्री व्यंजन में प्रत्येक मादा मेंढक के अंडे निचोड़ और एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण किया ।
  4. अंडे है कि पशु और वनस्पति डंडे के बीच स्पष्ट सीमाएं है या पशु डंडे के शीर्ष पर अनियमित सफेद धब्बे है के बैचों त्यागें ।
  5. एक मादा मेंढक स्पष्ट रूप से विभेदित जानवर और वनस्पति डंडे के साथ अंडे की एक सजातीय आबादी पेश से अंडे के बैच चुनें और एक ६०० मिलीलीटर चोंच में अंडे हस्तांतरण ।
  6. बाहर अतिरिक्त 0.2 x एमएमआर बफर डालो और धीरे १०० एमएल cysteine (पीएच ७.७) में 1x निकालने बफर (१०० mm KCl, ०.१ मिमी CaCl2, 1 मिमी MgCl2, 10 मिमी HEPES, ५० मिमी सुक्रोज, पीएच ७.७) के प्रति 2 जी के २५० मिलीलीटर जोड़ने के लिए अंडे ।
  7. हाथ से सख्ती से अंडे हिला और 3 मिनट के लिए या अंडे कुल ८०० मिलीलीटर cysteine बफर की कुल मात्रा के साथ तीन बहाकर पर अंडे की जेली कोट को हटाने और चोंच के नीचे बसा है, यह दर्शाता है कि जेली कोट हटाने सफल है ।
  8. चार बार से अधिक 0.2 x एमएमआर समाधान के 1 एल के साथ अंडे धो लो ।
  9. उठाओ और अंडे है कि एक गिलास हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर सफेद बारी छोड़ दें ।
  10. सक्रियण के लिए 0.2 x एमएमआर बफ़र में ०.१ µ g/ml कैल्शियम ionophore A23187 समाधान के २०० मिलीलीटर के साथ एमएमआर बफर और आपूर्ति अंडे बाहर डालो ।
  11. एक गिलास पिपेट के व्यापक खोलने की ओर का उपयोग करने के लिए अंडे धीरे जब तक हलचल अंडे सक्रिय और कैल्शियम ionophore समाधान को दूर कर रहे हैं ।
  12. अंडे के यूरिन के नीचे बसने के बाद सक्रियण दक्षता की जांच करें । अच्छी तरह से सक्रिय अंडे पशु ध्रुव और वनस्पति पोल के ७५% के लगभग 25% है ।
  13. धोने के साथ दो बार सक्रिय अंडे 1x निकालने बफर की ५० मिलीलीटर के साथ चिढ़ाना अवरोधकों (10 µ g/एमएल leupeptin, pepstatin, और chymostatin) के पूरक ।
  14. ध्यान से एक ०.४ मिलीलीटर स्नैप-कैप microtube करने के लिए अंडे हस्तांतरण और फिर ६० सेकंड के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक के माध्यम से अंडे पैक, और फिर 30 सेकंड के लिए ६०० x g ।
  15. अर्क के कमजोर पड़ने को कम करने के लिए एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर अंडे के शीर्ष पर अतिरिक्त बफर निकालें ।
  16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १५,००० x g पर अंडे क्रश ।
  17. कुचल अंडे की तीन परतों को अलग और मध्यम परत में कच्चे कोशिका द्रव्य रखने के लिए एक उस्तरा ब्लेड के साथ ट्यूबों में कटौती ।
  18. नए ultracentrifuge ट्यूबों में क्रूड कोशिका द्रव्य स्थानांतरण, और के साथ पूरक को छेड़ो अवरोधकों और cytochalasin B पर 10 µ g/एमएल प्रत्येक ।
  19. 4 डिग्री सेल्सियस पर १५,००० x g पर कच्चे तेल की कोशिका द्रव्य फिर से 5 मिनट के लिए और अधिक लिपिड और जर्दी को हटाने के द्वारा कोशिका द्रव्य शुद्ध केंद्रापसारक ।
  20. बर्फ पर नए सिरे से तैयार अर्क रखें ।

3. छोटी बूंद पीढ़ी

  1. 2d ग्लास चैंबर की तैयारी
    नोट: आयत ग्लास ट्यूबों चैंबर के रूप में सेवा है कि एक एकल 2 आयामी विमान में बूंदें सीमित, आसान अवलोकन और डेटा संग्रह के लिए अनुमति देता है ।
    1. कट आयत ग्लास ट्यूबों 2 मिमी x १०० µm के एक आंतरिक आयाम के साथ 4 मिमी लंबे टुकड़ों में । एक व्हेटस्टोन की तेज धार का प्रयोग करें, प्रकाश नक़्क़ाशी के साथ कांच ट्यूब की बाहरी सतह पर वांछित सीमाओं निशान, तो धीरे से खोदना के दोनों किनारों पर दबाव को लागू करने के लिए बंद कांच ट्यूबों के टुकड़े तोड़ ।
    2. पूर्व ९५ डिग्री सेल्सियस के लिए एक सूखी स्नान मशीन गर्मी । हीटिंग ब्लॉक बाहर ले लो और यह एक पाली कार्बोनेट वैक्यूम desiccator में जगह है ।
    3. हीटिंग ब्लॉक में trichloro (एक ज, एक, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane के 30 µ एल युक्त एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब रखें । हीटिंग ब्लॉक करने के लिए लगभग 5 सेमी में निर्वात desiccator के अंदर कटौती ग्लास ट्यूबों करना ।
    4. एक वैक्यूम पंप करने के लिए desiccator कनेक्ट । 1 मिनट के लिए पंप पर मुड़ें वांछित निर्वात स्तर तक पहुंचने के लिए, तो 3 तरह के वाल्व को बंद करने के लिए desiccator सील और दो trichloro (1, 4, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane भाप कोट कांच ट्यूबों के भीतरी दीवार । यह बूंदों को स्थिर करने के लिए एक hydrophobic वातावरण पैदा करेगा ।
    5. रात भर कोटिंग के लिए desiccator के अंदर कांच ट्यूबों छोड़ दें । ट्यूबों अगले दिन उपयोग के लिए तैयार हो जाएगा ।
  2. छोटी बूंद पीढ़ी और इमेजिंग
    नोट: बूंदों और इमेजिंग पैदा करने की प्रक्रियाओं के आंकड़े 1b और 1C में सचित्र हैं ।
    1. आपूर्ति अर्क 10 एनजी/µ एल securin-mCherry mRNA के साथ चरण 2 में तैयार सरल cytoplasmic के लिए केवल सेल चक्र प्रयोगों । वैकल्पिक रूप से, demembranated शुक्राणु क्रोमेटिन के साथ आपूर्ति निष्कर्षों (निकालने के µ l प्रति २५०), 10 µ m GFP-एनएलएस प्रोटीन, और 10 एनजी/µ l securin-mCherry mRNA आवर्ती नाभिक आकृति परिवर्तन दर्शाती बूंदों को बनाने के लिए ।
    2. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन या mRNA के साथ २०० µ एल के साथ आपूर्ति की 20 µ एल मिश्रण 2% perfluoropolyether-पॉलीथीन ग्लाइकोल (PFPE-खूंटी) fluorosurfactant HFE7500 fluorinated तेल में ।
    3. एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर बूंदों उत्पन्न । छोटी बूंद आकार की सीमा भंवर गति और अवधि से संग्राहक जा सकता है । ५० से २०० µm को लेकर radii के साथ बूंदें बनाने के लिए, ५६ x g पर भंवर गति सेट (३,२०० rpm ४.९ mm के एक त्रिज्या के साथ) और धीरे ३.५ सेकंड के लिए मिक्सर पर निकालने और surfactant मिश्रण युक्त microcentrifuge ट्यूब दबाएँ । अगर बूंदों आकार में एक समान है निरीक्षण नेत्रहीन ।
    4. एक 20 µ एल पिपेट का उपयोग करने के लिए शीर्ष पर चल बूंदों हस्तांतरण और एक पीसीआर ट्यूब में PFPE-खूंटी surfactant की एक बराबर मात्रा । ग्लास ट्यूब में कदम से तैयार १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में छोटी बूंद परत में डुबकी और जब तक बूंदों ट्यूब के लगभग ७५% भर गया है इंतज़ार करो, तो ट्यूब surfactant परत में नीचे धक्का जब तक ट्यूब पूरी तरह से भर जाता है । यह छोटी बूंद घनत्व कम हो जाएगा और बूंदों अतिव्यापी या आकार विकृति भीड़ की वजह से बिना चैंबर के अंदर एक एकल परत के रूप में अनुमति देते हैं ।
    5. खनिज तेल के साथ ४० मिमी का व्यास के साथ एक गिलास नीचे पकवान भरें । धीरे से उंहें धक्का नीचे एक ठीक नोचना का उपयोग करके तेल में छोटी बूंद-ट्यूब भर विसर्जित कर दिया ।
    6. सभी नमूनों को लोड करने के बाद, किसी भी दृश्य मलबे या लीक बूंदों को हटाने के लिए एक गिलास पिपेट का उपयोग करें । अधिक खनिज तेल जोड़ें यदि ट्यूबों नहीं है या पूरी तरह से इमेजिंग प्रक्रिया में डूबे नहीं होंगे ।
    7. एक मोटर चालित एक्स-वाई स्टेज के साथ सुसज्जित एक epifluorescence माइक्रोस्कोप पर बूंदों की इमेजिंग आचरण ( सामग्री की तालिकादेखें). सभी इमेजिंग के लिए एक 4x हवा उद्देश्य का प्रयोग करें । प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, एक १३० W बुध वाष्प के लिए प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत के रूप में लघु चाप लैंप का उपयोग करें, और एक GFP फिल्टर सेट (उत्तेजना 482/35 एनएम और उत्सर्जन 514/LP एनएम) और इमेजिंग के लिए एक mCherry फ़िल्टर सेट (उत्तेजना 562/40 एनएम और उत्सर्जन 641/75 एनएम) GFP-एनएलएस और securin-mCherry के संकेत हैं ।
    8. उज्ज्वल क्षेत्र और कई प्रतिदीप्ति चैनलों में समय चूक वीडियो रिकॉर्ड हर 6 से 9 मिनट तक बूंदों अपनी गतिविधि खो देते हैं ।

4. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण

  1. विभाजन और बूंदों की ट्रैकिंग
    1. ". tif" या ". oif" के स्वरूप में छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ( सामग्री तालिकादेखें) में रिकॉर्ड किया गया डेटा आयात करें ।
    2. उज्ज्वल क्षेत्र चैनल का उपयोग कर एकल बूंदों सेगमेंट. उज्ज्वल क्षेत्र छवि अंधेरे सीमाओं के साथ उज्ज्वल हलकों के रूप में बूंदों दिखाएगा । छवि पर थ्रेशोल्ड लागू करें । डार्क और ब्राइट पिक्सेल के बीच की सीमा ट्यूनिंग द्वारा प्रत्येक छोटी बूंदों के लिए एक ट्रैकिंग सतह जोड़ें ताकि प्रत्येक सतह इसी छोटी बूंद के पूरे क्षेत्र को शामिल किया गया ।
    3. स्वचालित रूप से autoregressive गति एल्गोरिथ्म का उपयोग कर आसंन फ्रेम के बीच क्षेत्रों ट्रैक । सही छोटी बूंदों को ट्रैक करने के लिए सबसे बूंदों की त्रिज्या की तुलना में छोटे होने के लिए दो आसंन फ्रेम के बीच एक छोटी बूंद की स्वीकार्य अधिकतम यात्रा दूरी की धुन ।
    4. नेत्रहीन वास्तविक बूंदों के बजाय बूंदों के बीच खाली जगह खंड कि गलत फॉल्ट का पता लगाने के लिए पूरे वीडियो भर में सभी पटरियों की जाँच करें । मैंयुअल रूप से ग़लत ट्रैक्स हटाएं ।
    5. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करने के लिए किसी भी बूंदों के बिना खंड और ट्रैक पृष्ठभूमि क्षेत्र । शोर करने के लिए संकेत में सुधार करने के लिए, हर समय सीमा पर बूंदों की प्रतिदीप्ति तीव्रता से पृष्ठभूमि तीव्रता घटाना.
    6. ". csv" फ़ाइलों में प्रतिदीप्ति तीव्रता और छोटी बूंद क्षेत्र का मतलब है और मानक विचलन सहित, समय के साथ प्रत्येक ट्रैक के लिए मापा मापदंडों निर्यात.
  2. छोटी बूंद आकार और दोलन अवधि के डेटा विश्लेषण
    1. प्रत्येक छोटी बूंद के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता के भूखंडों बनाने के लिए आर में ". csv" फ़ाइलें लोड । रिकॉर्ड छोटी बूंद आईडी एक ". csv" फ़ाइल में ।
    2. Matlab में छोटी बूंद आईडी की एक सूची के साथ विश्लेषण सॉफ्टवेयर और ". csv" फ़ाइल से निर्यात ". csv" फ़ाइलों को आयात और आगे डेटा विश्लेषण के लिए ". mat" फ़ाइलों के रूप में सहेजें.
    3. विभाजन और ग्लास चैंबर19की ऊंचाई के बाद निर्यात छोटी बूंद क्षेत्र की जानकारी के आधार पर एक संपीड़ित छोटी बूंद की मात्रा की गणना । एक क्षेत्र के रूप में छोटी बूंद की त्रिज्या की गणना करने के लिए खंड का उपयोग करें ।
    4. पीक और गर्त का समय अंक का उपयोग कर पीक/गर्त का पता लगाने एल्गोरिथ्म निकालें । वे सही पता लगाया है सुनिश्चित करने के लिए चोटियों और गर्त की स्थिति पर मैनुअल सुधार करने के लिए ।
    5. सेल चक्र की अवधि की गणना करने के लिए, दो आसंन चोटियों के बीच अंतराल समय की गणना । अपनी सेल चक्र अवधि के रूप में प्रत्येक छोटी बूंद के लिए सभी अंतराल के औसत ले लो ।

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Representative Results

चित्रा 2में, हम बताते हैं कि इस प्रोटोकॉल mitotic दोलनों दोनों सरल, परमाणु मुक्त कोशिकाओं में के रूप में अच्छी तरह से नाभिक, जहां थरथरानवाला नाभिक गठन और विकृति के चक्रीय बारी ड्राइव के साथ जटिल कोशिकाओं के साथ पैदा करता है. नाभिक-मुक्त बूंदों ९२ घंटे के समय अवधि में 30 नम चक्र तक mitotic दोलनों उत्पंन, के रूप में आवधिक संश्लेषण और एक प्रतिदीप्ति रिपोर्टर securin-mCherry (चित्रा 2a) के क्षरण द्वारा संकेत दिया । Securin के एक सब्सट्रेट है anaphase को बढ़ावा देने के जटिल APC/ anaphase के दौरान securin-mCherry का ह्रास इस प्रकार APC/सी की सक्रियता को इंगित करता है.

बहाव mitotic घटनाओं ड्राइव करने के लिए mitotic थरथरानवाला की क्षमता की जांच करने के लिए, हम इसके अतिरिक्त demembranated शुक्राणु क्रोमेटिन, शुद्ध हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन-नाभिकीय स्थानीयकरण संकेत (GFP-एनएलएस), और Hoechst ३३३४२ रंजक की आपूर्ति की cytoplasmic अर्क. चित्रा बी सी अलग कोशिका चक्र चरणों, चरण (नीली सलाखों) और बँटवारा (लाल सलाखों), जो परमाणु आकृति विज्ञान के परिवर्तन स्वयं निरंतर mitotic थरथरानवाला द्वारा संचालित कर रहे हैं के स्वायत्त बारी से पता चलता है. सभी mitotic घटनाओं, यानी, गुणसूत्र विरूपण और संघनित्र Hoechst द्वारा रिपोर्ट ३३३४२ (चित्रा बीएक, पहली पंक्ति), परमाणु गठन और परमाणु लिफाफा टूटने से GFP-एनएलएस (चित्रा बीएक, दूसरी पंक्ति), और की गतिविधि securin-mCherry (चित्रा बी, तीसरी पंक्ति) के संश्लेषण और क्षरण के द्वारा सेल चक्र थरथरानवाला, एक दूसरे के साथ मेल किया । छवियां समय चूक मल्टी चैनल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकत्र किए गए थे । हमारे प्रयोगात्मक परिणाम प्रदर्शित करता है कि पुनर्निर्माण सेल-चक्र प्रणाली Cdk1 और APC की एक mitotic थरथरानवाला के पुनर्निर्माण में सक्षम है/सी, जो परमाणु लिफाफा टूटने और सुधार सहित बहाव की घटनाओं की एक श्रृंखला ड्राइव कर सकते हैं, और गुणसूत्र आकृति विज्ञान परिवर्तन ।

चित्रा 3 से पहले और शोर हटाने के बाद securin-mCherry का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा संकेत दोलनों से पता चलता है. चोटियों और गर्त पृष्ठभूमि शोर को हटाने के बाद अधिक स्पष्ट हो गया, विशेष रूप से पहले दो दोलनों के लिए, यह दर्शाता है कि शोर हटाने में मदद कर सकते हैं और विश्लेषण के लिए शोर करने के लिए संकेत में सुधार.

Figure 1
चित्र 1. छोटी बूंद-आधारित mitotic कोशिकाओं पैदा करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया । A. Cytoplasmic अर्क अल्ट्रा के माध्यम से एकत्र कर रहे है-केंद्रापसारक । B. अर्क mitotic दोलनों के पुनर्गठन और रिपोर्टिंग के प्रयोजन के लिए एकाधिक घटकों के साथ प्रदान किए जाते हैं । एक भंवर विधि का प्रयोग, अर्क और surfactant तेल बूंदें पैदा करने के लिए मिश्रित कर रहे हैं । C. बूंदों एक trichloro में भरी हुई है (एक सी, एक ज, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane-लेपित ट्यूब और फिर एक महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से imaged । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. सेल साइकिल गतिशीलता का पता लगाने के फ्लोरोसेंट पत्रकारों का उपयोग कर । a. का समय पाठ्यक्रम मतलब securin-mCherry चयनित छोटी बूंद की प्रतिदीप्ति तीव्रता, ९२ घंटे के एक कोर्स पर 30 undamp दोलनों का संकेत है । संमिलित करें आंकड़ा चयनित छोटी बूंद सफेद बिंदीदार सर्कल द्वारा फंसाया के साथ प्रतिदीप्ति छवि दिखाता है । स्केल बार १०० µm. बी. प्रतिदीप्ति चैनल (शीर्ष तीन पंक्तियों) और उज्ज्वल क्षेत्र (अंतिम पंक्ति) में एक छोटी बूंद की स्नैपशॉट की समय श्रृंखला । सेल चक्र घड़ी और उसके बहाव mitotic प्रक्रियाओं के चक्रीय प्रगति एक साथ कई फ्लोरोसेंट पत्रकारों द्वारा ट्रैक कर रहे हैं । anaphase सब्सट्रेट securin-mCherry घड़ी नियामक APC/सी की गतिविधि इंगित करता है, Hoescht दाग गुणसूत्र आकृति विज्ञान परिवर्तन इंगित करता है, और GFP-एनएलएस परमाणु लिफाफा टूटने और सुधार को इंगित करता है. परमाणु लिफाफे (सफेद तीर से प्रकाश डाला) उज्ज्वल क्षेत्र छवियों में भी detectable हैं, GFP के स्थानीयकरण मिलान-एनएलएस संकेत नाभिक । स्केल बार ५० µm है । चरण और mitotic चरण क्रमशः नीले सलाखों और छवियों के ऊपर लाल सलाखों से चिह्नित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. securin-mCherry का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए पृष्ठभूमि घटाव । A. पृष्ठभूमि शोर हटाने से पहले दोलन समय पाठ्यक्रम. ख. शोर हटाने के बाद दोलन समय पाठ्यक्रम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम एक उच्च प्रवाह कृत्रिम कोशिका प्रणाली के विकास के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत किया है कि इन विट्रो में सक्षम बनाता है पुनर्गठन और दीर्घकालिक ट्रैकिंग स्वयं की-निरंतर सेल-चक्र दोलनों पर एकल-कक्ष स्तर । कई अहम कदम हैं जो इस विधि को सफल बनाते हैं । सबसे पहले, एक अच्छी गुणवत्ता के साथ ताजा Xenopus अंडे निचोड़ा, रखी अंडे के साथ तुलना में, लंबे समय तक चलने दोलन गतिविधि के साथ निष्कर्षों का उत्पादन करते हैं । दूसरा, surfactant के भीतर अर्क के encapsulation-स्थिर microenvironments दोलन गतिविधि को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । तीसरा, एक पतली ट्यूब में तेल की बूंदों की मशीन एक ही परत के भीतर बूंदों को परिभाषित करता है, यह आसान छवि प्रसंस्करण और दीर्घकालिक ट्रैकिंग के लिए बना । चौथा, trichloro के साथ ट्यूब भीतरी दीवार कोटिंग (एक सी, ज, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane के रूप में एक विरोधी चिपकने वाला सतह ऊर्जा कम करने के लिए निकालने गतिविधि को बनाए रखने में मदद करता है । पांचवां, तेल के साथ ट्यूबों सील छोटी बूंद प्रवाह को रोकने जाएगा । तेल सीलिंग विधि भी वाष्पीकरण को रोकने और आगे निकालने गतिविधि को संरक्षित कर सकते हैं । इन विट्रो में की सफलता की दर में सुधार बूंदों में मजबूत दोलनों के पुनर्निर्माण और एक लंबी अवधि में इन बूंदों के विभाजन और ट्रैकिंग की सटीकता ।

microemulsion बूंदें उत्पंन करने के लिए, हम दोनों एक सरल भंवर विधि कार्यरत है, कुछ अंय अध्ययन के समान29,30,31, और साथ ही अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया microfluidics तकनीक19, 20 (डेटा नहीं दिखाया गया है) । दोनों तरीकों को सफलतापूर्वक एक उच्च प्रवाह तरीके से microemulsions उत्पंन करने में सक्षम थे । एक भंवर विधि के साथ जुड़े सीमा है कि छोटी बूंद आकार समान रूप से नियंत्रित नहीं है । छोटे आकार भिन्नता के साथ एक अच्छी तरह से परिभाषित आकार की आवश्यकता होती है कि अध्ययन के लिए, microfluidics तकनीक छोटी बूंद आकार के बेहतर नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यहां, हम दो कारणों के लिए microfluidic विधि पर भंवर विधि चुना है । सबसे पहले, यह सरल और आसान करने के लिए प्रक्रियाओं का पालन करें, जो microfluidic तकनीक या nanofabrication सुविधाओं के उपयोग के बिना प्रयोगशालाओं की अनुमति होगी इस पद्धति को आसानी से अनुकूलन । दूसरा, भंवर विधि और अधिक कुशल और थरथरानवाला के आकार पर निर्भर व्यवहार की जांच के लिए आर्थिक है । यह कई micrometers से ३०० micrometers तक बदलती radii के साथ छोटी बूंद आकार का एक व्यापक वितरण उत्पंन कर सकते हैं, जबकि microfluidic तकनीक केवल एक संकीर्ण एक पूर्वनिर्धारित आकार पर केंद्रित वितरण उत्पंन कर सकते हैं । इस विधि के साथ उत्पन्न छोटी बूंद आकार की सीमा सेल ऐसे Xenopus और zebrafish के रूप में जल्दी भ्रूण की दरार चरण में विशेषता प्रडक्टर कोशिका विभाजन से उत्पंन आकार की विस्तृत श्रृंखला से मेल खाता है ।

वर्तमान विधि अच्छी तरह से मिश्रित थोक समाधान 8 में जैविक oscillators के पुनर्गठन के मौजूदा तरीकों के साथ तुलना में दोलनों की स्थिरता और जटिल घड़ी गतिशीलता का विश्लेषण का प्रवाह में काफी सुधार हुआ है, ३२, जो जल्दी से नम दोलनों का उत्पादन करते हैं । हमें पता चला है कि इस विधि काफी भारी प्रतिक्रिया में कुछ चक्र से दोलनों की उम्र में सुधार हुआ है8 बूंदों की microenvironment में 30 से अधिक चक्र (चित्रा 2a). साथ ही, बल्क प्रतिक्रियाओं वास्तविक कक्ष आयाम के लिए समानता की कमी है और स्थानिक संगठन वास्तविक कोशिकाओं में कार्यात्मक compartmentalization द्वारा प्राप्त दोहराऊंगा नहीं कर सकता । बल्क प्रतिक्रियाओं की इन सीमाओं पर काबू पाने के बाद, हमारे कृत्रिम सेल प्रणाली ऐसे सेलुलर विविधता और oscillators के stochasticity, जो अन्यथा असंभव है के रूप में चुनौतीपूर्ण सवालों की जांच के लिए एक आवश्यक मंच प्रदान करता है पता लगाने.

इसके अलावा, इस विधि जटिलता की डिग्री है जो कोशिकाओं को बनाया जा सकता है में लचीलापन प्रदान करता है । जटिल परमाणु गतिशीलता से किसी भी हस्तक्षेप से बचने के लिए, हम एक ंयूनतम, cytoplasmic केवल कोशिका चक्र प्रणाली है कि कोई नाभिक शामिल पुनर्गठन कर सकते हैं । यह सरल और cytoplasmic-केवल थरथरानवाला प्रदर्शन आत्म निरंतर दोलनों काफी बेहतर कुछ मौजूदा सिंथेटिक oscillators की तुलना में. शुक्राणु क्रोमेटिन की आपूर्ति करके, हम भी नाभिक के साथ और अधिक जटिल कोशिकाओं का पुनर्गठन कर सकते हैं जो स्व-विधानसभा के बीच वैकल्पिक और mitotic चरण में एक लयबद्ध तरीके से परमाणु विकृति पर. mitotic थरथरानवाला की गतिविधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहाव परमाणु घटनाओं एक साथ मल्टी चैनल प्रतिदीप्ति इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग द्वारा मापा जा सकता है ।

विधि भी छोटी बूंद आकार और कोशिका चक्र की गति में हेरफेर के एक उच्च डिग्री सक्षम बनाता है । भंवर तकनीक एक विस्तृत श्रृंखला में radii के साथ बूंदों के उत्पादन के लिए अनुमति देता है, जो कोशिका चक्र के आकार पर निर्भर व्यवहार के अध्ययन को लाभ होगा । इसके अलावा, सेल चक्र की गति cyclin B1 mRNAs३३, जो हमें सेल चक्र घड़ी के tunability समारोह का अध्ययन करने की अनुमति होगी की अलग सांद्रता की आपूर्ति द्वारा संग्राहक जा सकता है ।

इन विट्रो के साथ, इन में इन में इन इन इन में से एक कोशिका को खंगाला, दृश्य, हेरफेर सक्षम करने, और एकल सेल गतिशीलता का विश्लेषण, की संभावना सेल के अधिक जटिल stochastic व्यवहार में नए अंतर्दृष्टि के लिए मार्ग प्रशस्त होगा चक्र घड़ी । विधि भी पारंपरिक रूप से थोक प्रतिक्रियाओं पर निर्भर है कि अन्य oscillators के इन विट्रो अध्ययन करने के लिए सामान्य रूप से हो सकता है.

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Madeleine लू के निर्माण के लिए धंयवाद securin-mCherry प्लाज्मिड, गोद आदमी ली, केनेथ हो और एलन पी लियू छोटी बूंद पीढ़ी के बारे में विचार विमर्श के लिए, जेरेमी बी चांग और जेंस ई. Ferrell GFP प्रदान करने के लिए जूनियर-एनएलएस का निर्माण । इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अर्ली करियर ग्रांट #1553031), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (मीरा #GM119688), और एक Sloan रिसर्च फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

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References

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सेल-प्रकोष्ठ के Microemulsions में चक्र दोलनों का पुनर्गठन-मुक्त <em>Xenopus</em> Egg अर्क
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Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

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