Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Восстановление клеточного цикла колебаний в микроэмульсий свободных клеток Xenopus яйцо экстрактов

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Мы представляем метод для генерации в vitro хозрасчетных митотическая колебаний на уровне одной ячейки, инкапсулируя яйцо экстрактов Xenopus laevis в воду в масло микроэмульсий.

Abstract

В реальном времени измерение колебаний на уровне одной ячейки имеет важное значение для выявления механизмов биологические часы. Хотя массовых экстрактов из Xenopus laevis яйца были мощные в рассекает биохимических сетей, лежащие в основе прогрессирования клеточного цикла, среднее измерение их ансамбль обычно приводит к затухающих колебаний, несмотря на каждый Индивидуальные осциллятор имелось. Это из-за сложности идеальной синхронизации между отдельными осцилляторов в шумной биологических систем. Чтобы получить одноклеточных динамика осциллятора, мы разработали систему на основе капельки искусственные клетки, которая может воссоздать митотического цикла в отсеках клеток как инкапсуляция Велоспорт цитоплазматических экстракты Xenopus laevis яиц. Эти простые только цитоплазмы клетки демонстрируют устойчивый колебания для более чем 30 циклов. Для построения более сложных клетки с ядрами, мы добавили demembranated хроматина спермы для самостоятельной сборки вызывают ядер в системе. Мы наблюдали периодических прогрессии хромосома конденсации/decondensation и ядер окутывать разбивка/Реформации, как в реальных клеток. Это означает, что митотическая осциллятор функции добросовестно управлять несколько ниже по течению митотическая события. Мы одновременно отслеживать динамику митотическая осциллятор и технологических процессов в отдельных капель, с помощью микроскопии флуоресцирования многоканальный промежуток времени. Система искусственного клеточного цикла обеспечивает рамки высокой пропускной способностью для количественной обработки и анализа митотическая колебаний с одной ячейкой резолюции, которая вероятно обеспечивает важное понимание механизма регулирования и функции Часы.

Introduction

Цитоплазматическая экстрактов, приготовленные из яиц Xenopus laevis представляют собой один из наиболее основных моделей для биохимического исследования клеток циклов, учитывая большой объем ооцитов, прогрессирование быстрого клеточного цикла и возможность воссоздания Митотическая события в пробирке1,2. Эта система позволила первоначального обнаружения и механистических характеристик регуляторов основных цикла клетки как фактор содействия созревания (MPF), а также течению mitotic процессов, в том числе шпинделя собраний и хромосомы сегрегации1 ,2,3,4,5,6,,78,9,10, 11. Экстракты яйцо Xenopus также были использованы для подробного рассечение регулирования сетей клеточного цикла часов8,12,13,14 и исследования повреждений ДНК /Replication контрольно-пропускного пункта15 и митотического шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускного пункта16,17,18.

Эти исследования клеток циклов с использованием экстрактов яйцо Xenopus главным образом были основаны на массовых измерений. Однако реакция обычных массовых анализов не могут имитировать реальные ячейки поведения, учитывая крупные расхождения в их размеры и внутриклеточных пространственной разобщенности реакции молекул. Кроме того измерения массовых митотическая деятельности склонны дать ограниченное количество циклов перед быстро демпфирования8. Эти недостатки массовых реакций помешали экстракт системы для дальнейшего понимания сложных часов динамических свойств и функций. Недавние исследования инкапсулированные клетки бесплатно цитостатическим фактор арестован (CSF) Xenopus извлекает19,20 в определенных размер ячейки как отсеков, которые помогли прояснить, как размер шпинделя модулируется цитоплазматическая объем. Однако эта система в vitro арестован в метафаза мейоз II под действием цитостатического фактор1, и системы, способной долгосрочных устойчивых колебаний на уровне одной ячейки необходим для дальнейшего расследования клеточного цикла осциллятор.

Для изучения клеточного цикла колебаний с одной ячейкой резолюции, мы разработали клетки шкала, высокой пропускной способности системы для растворения и одновременное измерение нескольких хозрасчетных митотическая колебательных процессов в отдельных микроэмульсия капельки. В этом подробные видео-протокол мы продемонстрировать создание системы искусственного митотическая колебание, инкапсулируя Велоспорт Xenopus laevis яйцо цитоплазмы в микроэмульсий размером от 10 до 300 мкм. В этой системе были митотическая колебаний, включая конденсация хромосом де конденсации, ядерная оболочка разбивка и Реформации и деградации и синтез анафазе субстратов (например, securin-mCherry в настоящем протоколе) успешно восстановлена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Мичиган.

1. Подготовка материалов для клеточного цикла и обнаружения

  1. Гибсон Ассамблеи клонирования для плазмида ДНК строительство и очистка мРНК securin-mCherry
    1. Подготовка трех фрагментов ДНК, включая pMTB2 вектор позвоночника, securin и mCherry через полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гель очистки21,22.
    2. Измерение концентрации фрагментов с помощью fluorospectrometer. Комбинат 100 нг магистралей с securin и mCherry вставки на 1: молекулярном соотношении 1:1 и Добавьте деионизированной воды для регулировки объема реакции 5 мкл.
    3. Подготовка 6 мл 5 x изотермический Ассамблеи реакции буфер с 3 мл 1 М трис-HCl (рН 7,5), 300 мкл MgCl 1 М2, 600 мкл dNTP 10 мм, 300 мкл 1 м DTT, 1,5 g, ПЭГ-8000 и 20 мг NAD23.
    4. Добавьте объединенные фрагменты 15 мкл 1 x изотермический Ассамблеи реакции буфера аликвота. Инкубируйте реакции в пробке реакции PCR при 50 ° C за 15 минут.
    5. Сделайте 0,8% агарозном гель и работать с напряжением 10 V/см для проверки отжига эффективность этих фрагментов.
    6. Очистить сконструированный плазмида и элюировать с использованием 15 мкл РНКазы свободной воды. Преобразование 1 мкл очищенного плазмидной ДНК в 50 мкл DH5α сведущее Escherichia coli клетки24 для использования в будущем.
    7. Извлечь и очистить плазмидной ДНК securin mCherry от DH5α сведущее Escherichia coli клетки.
    8. Транскрибировать линеаризованного securin-mCherry плазмидной ДНК в мРНК и очистить мРНК. Использовать спектрофотометр для проверки, что концентрация mRNA более чем 100 нг/мкл и коэффициент поглощения на 260 Нм и 280 Нм составляет около 2,0.
  2. Подготовка demembranated Xenopus laevis спермы ДНК
    Примечание: Адаптировано из Мюррей 1991 года1.
    1. Усыпить взрослых мужчин Xenopus laevis25 и вскрыть яички от четырех мужских лягушек26,27.
    2. Место семенников из четырех лягушек в же 100 мл Петри. Промывайте яички три раза в 50 мл холодного 1 x MMR раствора (0,1 М NaCl, 2 мм KCl, 1 мм MgCl2, 2 мм CaCl2, 5 мм HEPES, ЭДТА 0,1 мм).
    3. Удалите избыток крови и жира из семенников в чашке Петри 100 мл и затем вымыть в холодной ядерных подготовка буфера (NPB) (250 мм сахарозы, 15 мм HEPES, рН 7,4, 1 мм ЭДТА, рН 8,0, trihydrochloride спермидина 0,5 мм, 0,2 мм Спермин tetrahydrochloride) дважды.
    4. Удаление ядерных подготовка буфера (НПБ) и нарезать яичек с длиной меньше, чем 0,2 см, с использованием рассечения острыми ножницами в 100 мл Петри. Добавьте 8 мл холодного NPB в яичках для дальнейшей разбивки.
    5. Использование нейлон сетка ткани с порами размером 70 мкм для фильтрации семенников и сбора спермы образец в коническую пробирку 15 мл. Спин вниз собранных сперматозоидов в 1730 x g 10 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
    6. Поставка клеток спермы с 1 мл раствора НПБ и 50 мкл 10 мг/мл lysolecithin и инкубации при комнатной температуре за 5 мин до demembranate сперматозоиды.
    7. Мыть demembranated сперме ДНК с 10 мл холодного NPB с 3% раствора БСА в три раза.
    8. Измерения плотности спермы ДНК с Горяева.
    9. Замораживание спермы ДНК в 5 мкл аликвоты в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C. Оптимальная концентрация сперматозоидов ДНК является примерно 105 ядер/мкл.
  3. Очистка белка GFP-ядерной локализации сигнала (GFP-NLS)
    1. GST-тегами GFP-NLS плазмида превратить BL21 (DE3) сведущее Escherichia coli клетки5.
    2. Инкубировать клетки без антибиотиков при 37 ° C за 1 ч, а затем распространился на тарелке агарозы LB с 100 мкг/мл ампициллина.
    3. Инкубируйте пластины при 37 ° C 14 до 18 часов вырастить клетки в одной колонии. Выбрать и прививать одной колонии в 4 мл LB СМИ с 100 мкг/мл ампициллина. Shake клетки при 37 ° C для 12 часов.
    4. Подготовить газобетона YT СМИ (16 g Bacto Триптон, 10 г Bacto дрожжевой экстракт, 5 г NaCl) и тепла YT СМИ до 37 ° C.
    5. Прививок 1 мл раствора камер ночного инкубируют в LB СМИ в 250 мл разогретой YT СМИ с 100 мкг/мл Ампициллин и встряхнуть для 2 часов, чтобы увеличить плотность клеток.
    6. Измерения оптической плотности клеток (OD) каждые 30 минут, используя спектрофотометр на длине волны 600 Нм. Добавьте 0,1 мм ИПТГ в клетки, чтобы побудить GFP-NLS белков после ОП значение достигает 0,1.
    7. Встряхните клетки на 18 ° C на ночь, чтобы снизить темпы роста клеток и позволяют лучше выражения протеина и синтеза.
    8. Спин вниз клетки на 34,524 x g при 4 ° C на 5 минут и удалить супернатант.
    9. Ресуспензируйте клетки окатышей в 40 мл PBS буфера (поставляется с 800 мкл лизоцима 50 мг/мл, 100 мкл PMSF 0,2 М, 13.2 мкл 10 мг/мл смеси leupeptin, pepstatin и chymostatin и 8 мкл ЭДТА 0.5 М) и Инкубируйте на 4 ° C на 20 минут.
    10. Сломать вниз клеток с использованием sonicator на частоте 20 кГц для 4 x 30 сек, 30 s интервалы между каждой sonication, чтобы освободить выразил белка GFP-NLS.
    11. Спина на 20000 x g 35 минут удалить сломанной клетки.
    12. Хромотография сродства используйте для извлечения и очистки белка GFP-NLS.
    13. Смыв навозной шарик 1,5 мл три раза с 15 мл буфера PBS и проинкубируйте 4 часа при температуре 4 ° C с инверсией 250 мл lysate с бисером.
    14. Спин вниз бусы на 2000 x g 5 минут и добавить 10 мл промывочного раствора (25 мм Tris база, pH 7.5, 500 мм NaCl и 5 мм DTT) бисер. Инкубировать бусины в 700 мкл буфера (50 Tris-HCl, глутатион рН 8,8, 20 мм сокращены и 5 мм DTT) с вращением на 4 ° C. Собирайте Алиготе элюирование с объемом 50 мкл.
    15. Измерьте концентрацию собранных белка, запустив Кумасси синий гель28.
    16. Элюировать белков, используя адаптер PD-10 столбцов с 3 мл для хранения буфера (20 мм HEPES, 150 мм KCl, 10% глицерина, рН 7,7) через буфер обмена.

2. Подготовка Велоспорт Xenopus экстракты

Примечание: Общий порядок подготовки экстракты иллюстрируется на рисунке 1A. Адаптировано из Мюррей 1991 года1.

  1. Придать три зрелых женщин Xenopus laevis с 66 ме беременных Маре гонадотропина сыворотки (ГСЖК) 10 дней перед кладкой яиц.
  2. Внедрить эти лягушки Xenopus с 500 ед хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) побудить откладки яиц 18 часов до подготовки Велоспорт экстрактов.
  3. Отменить отложили яйца в одночасье. На основании экспериментов (данные не показаны), экстракт, приготовленный из свежевыжатого яйца генерировать деятельности дольше чем экстракт, приготовленный из положил яйца от же девушки лягушки. Выжмите яйца каждый женский frog в Петри 100 мм, содержащие 10 мл 0,2 x MMR буфера и осмотрите под микроскопом стерео.
  4. Отказаться от партий яиц, которые имеют нечеткие границы между животных и растительных поляков или нерегулярные белые пятна на верхней части полюсов животных.
  5. Выберите пакет яиц от одной женщина лягушка, представляя однородность населения яиц с четко дифференцированных животных и растительных поляков и передавать яйца в 600 мл стакан.
  6. Слейте излишки 0.2 x MMR буфера и аккуратно добавить 250 мл 2 г на 100 мл цистеина (рН 7,7) в 1 x Извлечение буфера (100 мм KCl, 0,1 CaCl2, 1 мм MgCl2, 10 мм HEPES, 50 мм сахарозы, рН 7,7) яйца.
  7. Встряхнуть яйца вручную и удалить желе пальто яиц за три автомойки с общим объемом 800 мл цистеина буфер 3 минут или до яйца совокупного и поселиться в нижней части стакан, указав, что желе пальто удаление выполнено успешно.
  8. Мыть яйца с 1 Л раствора 0,2 x MMR более чем в четыре раза.
  9. Выбрать и удалить яйца, которые становятся белыми с помощью пипетки стеклянные передачи.
  10. Слейте буфер MMR и поставлять яйца с 200 мл ionophore кальция 0,1 мкг/мл A23187 раствора в 0,2 x MMR буфер для активации.
  11. Используйте широкий открытия сторону стеклянной пипетки для перемешать яйца мягко, пока яйца активизируются и удалить раствор кальция ionophore.
  12. Проверьте эффективность активации после того, как яйца поселиться в нижней части стакан. Хорошо активированные яйца имеют приблизительно 25% животных полюса и 75% растительных полюса.
  13. Вымойте активированные яйца дважды с 50 мл 1 x экстракт буфера дополняют ингибиторы протеазы (10 мкг/мл leupeptin, pepstatin и chymostatin).
  14. Тщательно передавать яйца 0,4 мл микропробирок оснастки Кап и затем упаковать яйца путем центрифугирования в 200 x g 60 секунд, а затем 600 x g за 30 секунд.
  15. Удалите дополнительный буфер на вершине яйца с помощью стеклянной пипетки Пастера по сокращению разбавления экстрактов.
  16. Раздавить яйца на 15000 x g 10 минут при 4 ° C.
  17. Вырежьте трубки с лезвием бритвы, чтобы отдельные три слоя измельченные яйца и сырой цитоплазмы в среднем слое.
  18. Передача сырой цитоплазмы в новые ультрацентрифуга трубы и дополнить с ингибиторами протеазы и cytochalasin B на 10 мкг/мл каждый.
  19. Центрифуга сырой цитоплазме снова на 15000 x g при 4° C на 5 минут для дальнейшей очистки цитоплазмы, удалив избыток липидов и желток.
  20. Держите свежеприготовленные выдержки на льду.

3. капелька поколение

  1. Подготовка камеры 2D стекла
    Примечание: Прямоугольник стеклянных трубок служат камер, которые ограничить капельки в одной 2-мерной плоскости, что позволяет легче наблюдения и сбора данных.
    1. Разрежьте прямоугольник стеклянных трубок с внутренним измерением 2 мм x 100 мкм на 4 мм длинные куски. Используйте острый край по Уэтстон, Марк желаемого границы на внешней поверхности стеклянной трубки с легкими офорты, затем осторожно применять давление на обе стороны офортов разорвать куски стеклянных трубок.
    2. Предварительно нагрейте инкубатор сухой ванны до 95 ° C. Вынуть блок Отопление и поместить его в поликарбоната вакуумный сушильный шкаф.
    3. Место 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая 30 мкл трихлор (1H, 1 Ч, 2 Ч, 2H-perfluorooctyl) силана в блоке Отопление. Лежат хрусталя трубы внутри вакуумного эксикатора примерно 5 см на Отопление блок.
    4. Подключите эксикатор для вакуумного насоса. Включите насос 1 минуты, чтобы достичь желаемого уровня вакуума, а затем закройте 3-ходового клапана печать Эксикатор, и пусть трихлор (1H, 1 Ч, 2 Ч, 2H-perfluorooctyl) силана пара пальто внутренней стенки стеклянных трубочек. Это создаст гидрофобные условий для стабилизации капли.
    5. Оставьте стеклянных трубок внутри эксикатора ночь покрытия. Трубы будет готова для использования следующий день.
  2. Капелька генерация и обработка изображений
    Примечание: Процедуры генерации капельки и визуализации проиллюстрированы в цифры 1B и 1C.
    1. Поставка экстрактов, подготовленную на этапе 2, с 10 нг/мкл securin mCherry мРНК для экспериментов простой только цитоплазматических клеточного цикла. Кроме того поставки экстрактов с demembranated хроматина спермы (250 мкл концентрированного экстракта), 10 белка GFP-NLS мкм и 10 нг/мкл мРНК securin-mCherry для создания капельки экспонируется периодические ядер морфология изменяется.
    2. В пробки microcentrifuge 1,5 мл микс 20 мкл концентрированного экстракта поставляется с рекомбинантных белков или мРНК с 2% perfluoropolyether-полиэтиленгликоль 200 мкл Перфторуглеводороды (PFPE-PEG) в HFE7500 фторированные нефти.
    3. Генерировать капельки, используя вихревой смеситель. Диапазон размеров капли можно модулировать вихревой скорость и продолжительность. Для создания капель с радиусом от 50 до 200 мкм, установите скорость вихревой на 56 x g (3200 об/мин с радиусом 4.9 мм) и осторожно нажмите на microcentrifuge трубка, содержащая экстракт и ПАВ смесь на смеситель за 3,5 секунды. Осмотрите Если капли являются одинаковыми по размеру.
    4. Используйте 20 мкл пипетки для передачи капельки, плавающей на верхней и равный объем PFPE-PEG сурфактанта в ПЦР-пробирку. Окуните стеклянной трубки, приготовленный из шаг в слой капелька в пробки microcentrifuge 1,5 мл и ждать пока капельки заполнили примерно 75% трубки, а затем вставьте трубку поверхностно слоя до тех пор, пока трубка полностью заполнены. Это более низкая плотность капли и позволит капельки для формирования одного слоя внутри камеры без дублирования или форму искажения, вызванные переполненностью.
    5. Заполните блюдо дно стекла с диаметром 40 мм с минеральным маслом. Погружайте капелька заполнены трубы в масле, осторожно нажимая их вниз с помощью тонкой пинцет.
    6. После загрузки все образцы, использовать стекло Пипетка удалить любые видимые мусора или утечка капельки. Добавьте больше минеральное масло, если трубы не или не быть полностью погружен в визуализации процесса.
    7. Поведения визуализации капель на эпифлуоресцентного микроскопа, оснащена моторизованным x-y стадии (см. Таблицу материалы). Используйте 4 X воздушные цели для всех изображений. Для флуоресценции изображений, используйте 130 Вт светильник пара ртути короткие дуги, как флуоресценции источник света для освещения и фильтр GFP (возбуждения 482/35 Нм и выбросов 514/LP Нм) и набор фильтров mCherry (возбуждения 562/40 Нм и выбросов 641/75 Нм) для изображений GFP-NLS и securin-mCherry сигналов.
    8. Запись отснятого видео в поле яркие и множественные каналы флуоресценции каждые 6-9 минут до капли теряют свою деятельность.

4. обработка изображений и анализ данных

  1. Сегментация и отслеживания капель
    1. Импортировать записанные данные в формате «.tif» или «.oif» в программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалы).
    2. Сегмент одной капельки, используя яркие области канала. Светлые области изображения будет показывать капельки как яркие круги с темной границ. Бинаризация примените к изображению. Добавьте отслеживание поверхности каждой капли, тюнинг порог между темных и светлых пикселей, так что каждая поверхность покрывает всю площадь соответствующего капли.
    3. Автоматически Отслеживайте сегменты между соседними кадрами, используя алгоритм движения авторегрессии. Настройте приемлемых максимальную путешествия расстояние капли между двумя соседними кадрами будет меньше, чем радиус большинство капель точно отслеживать небольшие капельки.
    4. Визуально проверьте, все треки через весь видео обнаружить неправильные segmentations этого сегмента пустое пространство между каплями вместо фактических капельки. Вручную удалите неправильные треков.
    5. Сегмент и трек фона области без капельки получить интенсивности флуоресценции фона. Для улучшения сигнала к шуму, вычитание фона интенсивность размытости из интенсивности флуоресценции капель в каждый период времени.
    6. Экспорт измеряемых параметров для каждого трека, со временем, включая среднее и стандартное отклонение интенсивности флуоресценции и капелька области в «CSV» файлов.
  2. Анализ данных капелька размер и колебание периода
    1. Загрузите файлы «.csv» в R для создания участков интенсивности флуоресценции со временем для каждой капли. Идентификатор записи капелька в файл «CSV».
    2. Импорт «.csv» файлы, экспортированные из программного обеспечения для анализа и «CSV»-файл со списком ID капелька в Matlab и сохранить как файлы «.mat» для дальнейшего анализа данных.
    3. Рассчитайте объем сжатой капли на основе экспортированный капли области информации после сегментации и Высота стекла камере19. Используйте объем для вычисления радиуса капли как сфера.
    4. Экстракт точки время пиков и впадин, используя алгоритм обнаружения пик/корыта. Выполнение ручного исправления на позиции пиков и впадин, чтобы убедиться, что они точно обнаруживаются.
    5. Чтобы вычислить период цикла клетки, вычислить промежуток времени между двумя соседними пиками. Возьмите среднее всех интервалов для каждой капли как его период цикла клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 2мы показываем, что этот протокол производит митотическая колебания в простой, свободной от-клетки, а также сложные клетки с ядрами, где осциллятор диски циклическое чередование формирования ядер и деформации. Свободных ядрах капель генерировать митотическая колебания до 30 циклов undamped над пядью времени 92 часа, как указано на периодические синтеза и деградации флуоресценции репортер securin-mCherry (рисунок 2A). Securin является субстратом анафазе, поощрение комплекс APC/C. Деградации securin-mCherry в анафазе таким образом указывает на активность APC/C.

Для изучения митотическая осциллятор способность управлять течению митотическая события, мы дополнительно поставляется demembranated хроматина спермы, очищенный Зеленый флуоресцентный белок ядерной локализации сигнал (GFP-NLS) и Hoechst 33342 красители для цитоплазмы экстракты. Рисунок 2B показывает автономной чередование фаз собственный цикл клетки, межфазные (синие столбики) и митоз (красные столбики), во время которых изменения Ядерное словотолкование движет хозрасчетных митотическая осциллятор. Все митотическая события, то есть, decondensation хромосомы и конденсации сообщает Hoechst 33342 (Рисунок 2Б, первая строка), ядерной формирования и ядерная оболочка разбивка GFP-NLS (Рисунок 2Б, вторая строка) и деятельность осциллятор цикла клетки путем синтеза и деградации securin-mCherry (Рисунок 2Б, третья строка), совпадали друг с другом. Изображения были собраны с помощью микроскопа замедленной флуоресценции многоканальный. Наши экспериментальные результаты показывают, что реконструированный цикла клетки система способна реконструкции митотическая осциллятора Cdk1 и APC/C, который может управлять серии течению мероприятий, включая разбивку ядерная оболочка и Реформации, и хромосома изменения морфологии.

Рисунок 3 показывает колебания, обозначается среднее флуоресценции интенсивность securin-mCherry до и после удаления шума. Пики и спады стал более выраженным после удаления фонового шума, особенно для первых двух колебаний, указав, что удаление шума может помочь улучшить сигнал-шум для дальнейшего анализа.

Figure 1
Рисунок 1. Экспериментальная процедура создания на основе капелька митотическая клетки. A. цитоплазматических экстракты собираются с помощью ультра центрифугирования. B. выдержки поставляются с несколькими компонентами в целях воссоздания и отчетности митотическая колебания. С помощью метода vortexing, экстракты и масла ПАВ смешиваются для создания капель. C. капельки загружаются в трубку силана покрытием трихлор (1 H, 1 Ч, 2 Ч, 2 H-perfluorooctyl) и затем образ через epi флуоресцентным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Обнаружение клеточного цикла динамики с использованием флуоресцентных репортеры. A. время курс интенсивности флуоресценции средняя securin-mCherry выбранного капелька, указанием 30 undamped колебания курса 92 часа. Вставить рисунок показывает изображение флуоресценции с выбранной капелька, обрамленная белым пунктирным кругом. Линейки шкалы — 100 мкм. б. Временных рядов снимков капли в флуоресценции каналов (тройку строк) и светлые области (последняя строка). Циклические прогрессирование часы клеточного цикла и его вниз по течению mitotic процессов одновременно отслеживаются несколько флуоресцентные журналистам. Анафазе субстрата securin-mCherry указывает на активность регулятора будильник APC/C, Hoescht пятно показывает изменения хромосом морфологии и GFP-NLS указывает ядерная оболочка поломок и преобразований. Ядерное конверты (выделена белыми стрелками) обнаруживаются также в светлые области изображения, соответствующий локализации GFP-NLS указал ядер. Бар масштаба 50 µm. межфазные и митотического фазы обозначаются соответственно синий и красный панелей выше изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Фон Вычитание среднего флуоресценции интенсивности securin-mCherry. А. курс время колебаний до удаления фонового шума. B. колебания время курс после удаления шума. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представили новый метод для разработки высокопроизводительных искусственных клеток системы, что позволяет в пробирке растворения и долгосрочного отслеживания колебаний хозрасчетных цикла клетки на уровне одной ячейки. Есть несколько важных шагов, которые делают этот метод успешно. Во-первых, свежевыжатый Xenopus яйца с хорошим качеством, по сравнению с установленными яйца, как правило, производят экстрактов с longerее lasting колебаний активности. Во-вторых инкапсуляции экстрактов в рамках микросреды ПАВ стабилизированный имеет решающее значение для сохранения колебаний активности. Третий, инкубации капельки масла в пределы тонкая трубка капли в один слой, что делает его легче для долгосрочного отслеживания и обработки изображений. В-четвертых покрытие внутренней стенки трубы с силана трихлор (1H, 1 Ч, 2 Ч, 2H-perfluorooctyl) как антиадгезионными снизить поверхностной энергии помогает сохранить действие экстракта. В-пятых герметизации труб с маслом предотвратит капелька потока. Нефть уплотнения методом может также предотвратить испарение и далее сохранять активность экстракта. Они вместе улучшить успеха в vitro реконструкция надежное осцилляций в капельки и точности сегментации и отслеживания этих капель в долгосрочной перспективе.

Чтобы создать микроэмульсия капельки, мы использовали оба метода простой vortexing, похож на несколько других исследований29,30,31, а также более широко используемых микрофлюидика методы19, 20 (данные не показаны). Оба метода смогли успешно генерировать микроэмульсий в духе высокой пропускной способности. Одно ограничение, связанное с методом vortexing является, что размер капельки не контролируется равномерно. Для исследований, которые требуют четко определенных размер с минимизировать размер вариации микрофлюидика методы должны использоваться для лучшего контроля размеров капли. Здесь мы выбрали метод vortexing над метод microfluidic по двум причинам. Во-первых она имеет простой и easy-to последующие процедуры, которые позволили бы лаборатории без доступа к методам microfluidic или нанотехнологические услуги легко адаптировать этот метод. Во-вторых метод vortexing является более эффективным и экономические расследования зависит от размера поведение осциллятора. Он может генерировать широкого распределения размеров капли с радиусами, колеблется от нескольких микрон до 300 мкм, в то время как метод microfluidic можно создавать только узкое распределение сосредоточено на стандартного размера. Диапазон размеров капли, созданные с помощью этого метода соответствует широкий спектр размеров ячеек, результате характерной редуктивной клеточных делений на расщепление стадии раннего зародыши Xenopus и данио рерио.

Нынешний метод значительно улучшилась устойчивости колебаний и пропускная способность анализировать сложные часы динамика, по сравнению с существующими методами восстановления биологических осцилляторов в перемешанных массовых решения8, 32, которые имеют тенденцию производить быстро затухают колебания. Мы показали, что этот метод значительно улучшилось продолжительность жизни колебаний от нескольких циклов в массовых реакции8 до более чем 30 циклов в микроокружения капель (рис. 2A). Кроме того массовая реакции не имеют сходство с фактической ячейки размеры и нельзя охарактеризовать пространственной организации, достигнутый функциональных разобщенности в реальном клеток. Преодолев эти ограничения сыпучих реакций, наша система искусственных клеток обеспечивает необходимым платформу для изучения сложных вопросов, как гетерогенность клеточных и stochasticity осцилляторов, которые иначе невозможно Исследуйте.

Кроме того этот метод обеспечивает гибкость в степени сложности, в который может быть построен клетки. Чтобы избежать каких-либо помех от сложной динамики ядерного, мы можно восстановить систему минимально, только цитоплазматических клеточного цикла, содержащий без ядер. Этот простой и только цитоплазматических осциллятор экспонатов хозрасчетных колебания значительно лучше, чем некоторые существующие синтетических осцилляторов. Предоставляя хроматина спермы, мы также можно восстановить более сложные клетки с ядрами, которые чередуются между самостоятельной сборки в интерфазе и ядерных деформации на стадии митотического в художественной манере. Деятельность митотическая осциллятор, так и вниз по течению ядерных событий может быть одновременно измеряется флуоресценции многоканальных изображений и одноклеточного отслеживания.

Метод позволяет также высокую степень манипуляции в размер и клеточного цикла скорость капли. Метод vortexing позволяет для поколения капель с радиусом в широком диапазоне, который принесет пользу изучения размер ячейки зависит от поведения клеток циклов. Кроме того можно модулировать скорость клеточного цикла, поставляя различные концентрации циклин B1 mRNAs33, которая позволит нам изучать перестройки функции часов клеточного цикла.

С этими преимуществами, в пробирке реконструирован клеточного цикла платформы, позволяя визуализации, обработки и анализа динамики одноклеточных, вероятно проложит путь для новой идеи в более сложных стохастических поведение ячейки цикла часы. Этот метод также может быть обобщению в vitro исследования других генераторов, которые традиционно полагаются на массовых реакций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У нас есть ничего не разглашать.

Acknowledgments

Мы благодарим Lu Мадлен для построения securin mCherry плазмиды, коленях человек ли, Кеннет Хо и Аллен P Лю для дискуссий о поколении капелька, Джереми б. Чанг и Джеймс э. Ferrell Jr для предоставления GFP-NLS построить. Эта работа была поддержана национального научного фонда (начало карьеры Грант #1553031), национальные институты здравоохранения (MIRA #GM119688) и Слоун исследовательских стипендий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. Methods in Enzymology. 91, Academic Press. 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Tags

Биохимия выпуск 139 митотический клеточный цикл самообеспечения колебания Xenopus laevis Велоспорт свободных клеток экстрактов покадровой флуоресцентной микроскопии в пробирке анализ одной ячейки искусственные клетки микроэмульсия
Восстановление клеточного цикла колебаний в микроэмульсий свободных клеток <em>Xenopus</em> яйцо экстрактов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., … More

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter