Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Biz petrol su microemulsions içinde Xenopus laevis yumurta özleri Kapsüllenen tarafından vitro kendini sürekli mitotik salınımlarını tek hücre düzeyinde nesil için bir yöntem mevcut.

Abstract

Gerçek zamanlı ölçüm salınımlarını tek hücre düzeyinde biyolojik saatler mekanizmaları ortaya çıkarmak önemlidir. Xenopus laevis yumurtadan hazırlanan toplu özleri biyokimyasal ağlar hücre döngüsü ilerleme temel anatomi güçlü olmasına rağmen kendi topluluğu ortalama ölçüm genellikle her rağmen damped bir salınım yol açar bireysel osilatör sürekli. Bu bireysel osilatörler arasında mükemmel senkronizasyon zorluk gürültülü biyolojik sistemlerde kaynaklanmaktadır. Osilatör tek hücre dinamiği almak için mitotik döngüleri hücre benzeri bölmeleri Xenopus laevis yumurta Bisiklete binme sitoplazmik özleri Kapsüllenen sulandırmak bir yapay hücre damlacık tabanlı sistem geliştirdi. Bu basit salt sitoplazmik hücreler sürekli salınım 30'dan fazla devredir sergi. Çekirdeği ile daha karmaşık hücreleri oluşturmak için demembranated sperm kromatin çekirdeği, kendinden montajlı sistemdeki tetiklemek için eklendi. Biz kromozom yoğunlaşma/decondensation periyodik bir ilerleme gözlenen ve çekirdek dökümü/reformasyon, gibi gerçek hücrelerde örtmek. Bu mitotik osilatör sadakatle birden çok akış aşağı mitotik olay sürücü çalışmasını gösterir. Aynı anda mitotik osilatör ve bireysel damlacıkları çok kanallı hızlandırılmış floresans mikroskobu kullanarak karşıdan akış süreçlerinde dinamiklerini tespit ettik. Yapay hücre döngüsü sistem yüksek üretilen iş çerçeve nicel manipülasyon ve mitotik salınımlarını ile büyük olasılıkla önemli anlayışlar düzenleyici makine ve fonksiyonları sağlar tek hücreli kararlılık analizi için sağlar saat.

Introduction

Sitoplazmik özleri Xenopus laevis yumurtadan hazırlanan hücre döngüsü, yumurta, Hızlı hücre döngüsü ilerleme ve başlamaktan yeteneğine büyük miktarda verilen biyokimyasal çalışma için en baskın modellerinden birini temsil mitotik olaylar vitro1,2. Derleme ve kromozom ayrımı1 de dahil olmak üzere aşağı akım mitotik işlemlerin yanı sıra faktör (MPF) olgunlaşma teşvik iğ gibi bu sistemi ilk keşif ve mekanik temel hücre döngüsü düzenleyiciler karakterizasyonu izin verdi ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus yumurta özleri da çalışmalar DNA hasarı ve hücre döngüsü saat8,12,13,14 düzenleyici ağların ayrıntılı diseksiyon için kullanılmıştır /Replication denetim noktası15 ve mitotik Milli Meclis denetim noktası16,17,18.

Hücre döngüsü Xenopus yumurta özleri kullanarak bu çalışmaları esas olarak toplu ölçümler dayalı olmuştur. Ancak, geleneksel toplu tepki deneyleri değil taklit gerçek hücre davranışları, kendi boyutları ve reaksiyon moleküller hücre altı kayma compartmentalization büyük bir farklılık göz önüne alındığında. Ayrıca, mitotik aktiviteleri toplu ölçümleri hızlı bir şekilde8sönümleme önce döngüleri sınırlı sayıda vererek yatkındır. Bu dezavantajları toplu tepkiler daha fazla karmaşık saat dinamik özellikler ve işlevler anlayışı sağlamak için özü sistem engellemiş. Son yıllarda yapılan çalışmalarda faktör tutuklandı (CSF) Xenopus içine nasıl iğ boyutu tarafından modüle aydınlatmak yardım boyut tanımlı hücre benzeri bölmeleri,19,20 ayıklar boş hücre sitostatik kapsüllenmiş sitoplazmik birim. Ancak, bu vitro sistem mayoz II metafaz sitostatik faktörü1eylem tarafından tutuklandı ve bir sistemi uzun vadeli sürekli salınım tek hücre düzeyinde daha fazla araştırma yapılması hücre döngüsü için gereklidir osilatör.

Hücre döngüsü salınımlarını tek hücreli çözünürlük ile çalışmak için geliştirdiğimiz bir hücre ölçekli, sulandırma ve aynı anda birden çok kendini sürekli mitotik salınım işlemlerinde bireysel microemulsion ölçümü için yüksek üretilen iş sistem damlacıkları. Bu ayrıntılı video protokol için biz Bisiklete binme Xenopus laevis yumurta sitoplazma microemulsions 10'dan 300 µm arasında değişen boyutlarda Kapsüllenen tarafından yapay mitotik salınım sisteminin oluşturulması göstermektedir. Bu sistemde, mitotik salınımlarını kromozom yoğunlaşma ve de-yoğunlaşma, nükleer zarf arıza ve reform ve bozulma ve anafaz yüzeylerde (Örneğin, securin-mCherry bu protokolü) sentezi gibi olduğunu başarılı bir şekilde yeniden düzenlendi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) University of Michigan tarafından onaylanmıştır.

1. hücre döngüsü sulandırma ve algılama için malzemeler hazırlanması

  1. Gibson plazmid DNA İnşaat ve securin-mCherry mRNA arıtma için klonlama derleme
    1. Bir pMTB2 vektör omurga, securin ve mCherry polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile de dahil olmak üzere üç DNA parçalarının hazırlamak ve arıtma21,22jel.
    2. Bir fluorospectrometer kullanarak parçaları konsantrasyonları ölçmek. Omurgalarına securin ve mCherry ekler bir 1 ile kombine 100 ng: moleküler 1:1 oran ve toplam 5 µL tepki seviyesini ayarlamak için deiyonize su ekleyin.
    3. 5 izotermal derleme tepki arabellek x 6 mL 1 3 mL ile hazırlamak M Tris-HCl (pH 7.5), 1 M MgCl2, 600 10 mM dNTP µL, 1 m DTT 300 µL, PEG-8000 1.5 g ve NAD2320 mg 300 µL.
    4. 1 x izotermal derleme tepki arabellek aliquot bir 15 µL için birleştirilmiş parçaları ekleyin. 15 dakika boyunca bir PCR reaksiyon tüp 50 ° c tepki kuluçkaya.
    5. Bir % 0,8 özel jel ve 10 V/cm bu parçaları tavlama etkinliğini doğrulamak için bir gerilim ile çalıştırmak olun.
    6. İnşa plazmid arındırmak ve su RNase free 15 µL kullanarak elute. Arıtılmış plazmid DNA 1 µL dönüştürmek 50 µL DH5α yetkili E. coli hücreleri24 ileride kullanmak için.
    7. Hulâsa ve plazmid DNA'sı securin-mCherry DH5α yetkili E. coli üzerinden arındırmak hücreleri.
    8. MRNA Doğrusallaştırılmış securin mCherry plazmid DNA uyarlamak ve mRNA arındırmak. MRNA konsantrasyonu fazla 100 ng/µL ve 260 absorbans oranı olduğunu doğrulamak için bir spektrofotometre kullanın nm ve 280 nm olduğunu yaklaşık 2.0.
  2. Demembranated Xenopus laevis sperm DNA hazırlanması
    Not: Murray 19911' den uyarlanmıştır.
    1. Yetişkin erkek Xenopus laevisötenazi25 ve dört erkek kurbağaların26,27den testislerde tanısal yaklaşım incelemek.
    2. Testis dört kurbağaların üzerinden aynı 100 mL Petri kabına yerleştirin. Testis içinde üç kez 50 mL soğuk 1 x MMR çözeltisi (0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA) durulayın.
    3. Aşırı kan ve yağ 100 mL petri kabına testis kaldırın ve sonra iki kez soğuk nükleer hazırlık arabellekte (NEH) (250 mM sükroz, 15 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0,5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride) yıkayın.
    4. Nükleer hazırlık arabellek (NEH) kaldırın ve testis 0.2 cm bir 100 mL Petri kabına keskin diseksiyon makası kullanarak daha küçük uzunlukları ile parçalara kesilmiş. Daha fazla çözümleme için testis 8 mL soğuk neh ekleyin.
    5. Kullanım naylon örgü kumaşlar 70 µm gözenek büyüklüğü ile testis filtre ve 15 mL konik tüp içine sperm örneği almam. Spin aşağı 1.730 x g de toplanan spermlerinin için 4 ° C'de 10 dakika ve süpernatant kaldırın.
    6. Sperm hücreleri neh 1 mL ve 50 µL 10 mg/mL lysolecithin tedarik ve demembranate sperm hücresi için 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    7. Demembranated sperm DNA 10 mL % 3 BSA çözüm ile soğuk neh ile üç kez yıkayın.
    8. Sperm DNA ile bir hemasitometre yoğunluğunu ölçmek.
    9. Sıvı nitrojen içinde 5 µL aliquots sperm DNA donma ve-80 ° C'de depolayın En iyi sperm DNA yaklaşık 105 çekirdek/µL bölgedir.
  3. Protein Saflaştırma GFP nükleer yerelleştirme sinyal (GFP-NLS)
    1. GST öğesini GFP-NLS plazmid BL21 dönüştürmek (DE3) yetkili E. coli hücreleri5.
    2. Antibiyotikler için 1 h 37 ° C'de olmayan hücreler kuluçkaya ve 100 µg/mL ampisilin ile LB özel tabakta yayıldı.
    3. Kalenin tek kolonileri hücreleri büyümek 14-18 saat 37 ° C'de kuluçkaya. Pick ve 4 mL 100 µg/mL ampisilin ile LB medya içine tek kolonileri aşılamak. 37 ° C'de hücreler 12 saat boyunca sallamak.
    4. Autoclaved YT medya (16 g Bacto-tryptone, Bacto-maya ekstresi, 5 gr NaCl 10 g) hazırlamak ve YT medya ile 37 ° c ısı
    5. 250 mL 100 µg/mL ampisilin ile önceden ısıtılmış YT medya içine 1 mL LB medya gecede inkübe hücrelerinin aşılamak ve hücre yoğunluğu artırmak için 2 saat çalkalanır.
    6. Hücre optik yoğunluk (OD) her 30 dakikada bir spektrofotometre dalga boyu 600 kullanarak ölçmek nm. 0,1 mM IPTG OD değeri 0,1 ulaştıktan sonra GFP NLS protein ifade teşvik hücreye ekleyin.
    7. 18 ° C'de hücre büyüme oranını azaltmak ve daha iyi protein ifade ve sentez izin vermek için bir gecede hücreleri sallamayın.
    8. 5 dakika boyunca spin 34,524 x g 4 ° c de hücreleri aşağı ve süpernatant kaldırın.
    9. Hücre topakları 40 ml (50 mg/mL lizozim 800 µL, 100 µL 0.2 M PMSF, leupeptin, pepstatin ve chymostatin 10 mg/mL karışımı 13.2 µL ve 8 µL 0,5 M EDTA ile sağlanan) PBS arabelleği resuspend ve 4 ° C'de 20 dakikadır kuluçkaya.
    10. Break 4 x 30 için 20 kHz frekansta bir sonicator kullanarak hücreleri aşağı GFP NLS protein s, 30 s aralıklarla serbest bırakmak için her sonication arasında dile getirdi.
    11. 20.000 x g 35 dakika kırık hücreleri kaldırmak de spin.
    12. Benzeşme Kromatografi ayıklamak ve GFP NLS protein arındırmak için kullanın.
    13. 1.5 mL boncuk Bulamaç üç kez PBS arabellek 15 mL ile yıkama ve inversiyon ile 4 ° C'de 4 saat boyunca lysate boncuk ile 250 mL kuluçkaya.
    14. Spin aşağı 2000 x g 5 min için de boncuk ve boncuk için 10 mL yıkama çözeltisi (25 mM Tris dingil, pH 7.5, 500 mM NaCl ve 5 mM DTT) ekleyin. Döndürme 4 ° C'de elüsyon arabelleği (50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 20 mM azalmış glutatyon ve 5 mM DTT) 700 µL boncuklar kuluçkaya Elüsyon bir aliquot 50 µL hacmi ile toplamak.
    15. Toplanan protein konsantrasyonu bir Coomassie mavi jel28çalıştırarak ölçmek.
    16. PD-10 sütundan 3 mL depolama arabellek (20 mM HEPES, 150 mM KCl, % 10 gliserol, pH 7,7) arabellek alışverişi yoluyla kullanma protein elute.

2. Hazırlık Xenopus Bisiklet ayıklar

Not: Şekil 1A' özleri hazırlama genel yordam gösterilmektedir. Murray 19911' den uyarlanmıştır.

  1. Üç Olgun kadın Xenopus laevis yumurtaları önce 10 gün 66 IU hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) ile enjekte et.
  2. 18 saat önce özleri Bisiklet hazırlık döşeme yumurta ikna etmek için insan korionik gonadotropin (HCG) 500 IU ile bu Xenopus kurbağalar enjekte.
  3. Atma gecede yumurta bırakırlar. Üzerinde deneyler (veri gösterilmez) bağlı olarak, taze sıkılmış yumurtadan hazırlanan özleri aynı dişi kurbağa koydu yumurta hazırlanan özleri daha uzun süreli aktiviteler oluşturur. Her dişi kurbağa yumurtaları 10 mL 0,2 x MMR arabellek içeren 100 mm Petri yemekler sıkmak ve stereo mikroskop altında incelemek.
  4. Toplu işlemleri hayvan ve bitkisel kutupları arasındaki belirsiz sınırlar veya hayvan direkleri üzerine düzensiz beyaz lekeler var yumurta atmak.
  5. Açıkça farklı hayvan ve bitkisel Polonyalılar ile yumurta homojen bir nüfusa sunan bir dişi kurbağa yumurtaları dizi seçim ve yumurta 600 mL kabı aktarın.
  6. Aşırı 0.2 x MMR arabellek dökmek ve yavaşça ekleyin 250 mL 100 mL başına 2 g sistein (pH 7,7) 1 x ayıklamak arabelleğe yumurta (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50 mM sukroz, pH 7.7).
  7. Yumurta şiddetle el ile çalkalanır ve sistein 800 mL toplam hacmi ile üç yıkama 3 dakika ya da yumurta toplama kadar tampon ve jöle kat kaldırma başarılı olduğunu belirten kabı, alt kısmında yerleşmek yumurta jöle kat kaldırın.
  8. Yumurta 0.2 x MMR çözüm 1 litre ile dört kez yıkayın.
  9. Almak ve bir cam transfer pipet kullanarak beyaz açmak yumurta atın.
  10. MMR arabellek dökmek ve 200 mL 0.1 µg/mL kalsiyum ionophore A23187 çözüm 0.2 x MMR arabelleği için harekete geçirmek ile yumurta verin.
  11. Cam Pipet geniş açılış tarafında yumurta hafifçe karıştırın kadar yumurta aktif hale gelir ve kalsiyum ionophore çözümü kaldırmak için kullanın.
  12. Sonra kabı alt kısmında yumurta sakin harekete geçirmek verimliliği denetleyin. İyi aktif yumurta var yaklaşık % 25'i hayvan pole ve bitkisel direk % 75'i.
  13. Yıkayın 1 proteaz inhibitörleri (10 µg/mL her leupeptin, pepstatin ve chymostatin) ile desteklenmiş özü arabellek x 50 mL ile iki kez aktif yumurta.
  14. Dikkatle yumurta 0.4 mL ek-cap microtube aktarmak ve sonra 200 x g de Santrifüjü 60 saniye için yumurta ve 30 saniye sonra 600 x g paketi.
  15. İlave arabellek üst kısmında yumurta özleri seyreltme azaltmak için bir cam Pasteur pipet kullanarak kaldırın.
  16. 15.000 x g yumurta 4 ° C'de 10 dakika ezmek
  17. Ezilmiş yumurta üç katmandan ayrı ve ham sitoplazma Orta katmanda tutmak bir tıraş bıçağı ile tüplerin kesti.
  18. Ham sitoplazma yeni ultracentrifuge tüpler içine aktarmak ve proteaz inhibitörleri ve cytochalasin B 10 µg/mL her yönü ile ek.
  19. 15.000 x g 4 ° c 5 dakika daha da fazla lipid ve sarısı kaldırarak sitoplazma arındırmak yine de ham sitoplazma santrifüj kapasitesi.
  20. Taze hazırlanmış özleri buz üzerinde tutun.

3. damlacık üretimi

  1. 2D cam odası hazırlama
    Not: Damlacıkları daha kolay gözlem ve veri toplama için izin tek bir 2-boyutlu düzlemde sınırlandırmak chambers dikdörtgen cam tüpler görevi.
    1. 2 mm x 100 µm iç bir boyut ile dikdörtgen Cam tüplerin 4 mm uzun parçalar kesin. Bir whetstone keskin kenar kullanmak, hafif baskısı ile cam tüp dış yüzeyi istenilen sınırları işaretlemek, sonra yavaşça parça cam tüplerin kırmaya izleri her iki tarafında basınç uygulayın.
    2. Kuru banyo kuluçka makinesi ile 95 ° c ön ısı Isıtma bloğun alıp bir polikarbonat vakum desiccator yerleştirin.
    3. Trichloro (1 H, 1 H, 2 H, 2 H-perfluorooctyl) silane Isıtma blok 30 µL içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Yaklaşık 5 cm Isıtma engellemek için kesme cam tüpler vakum desiccator içinde yatıyordu.
    4. Desiccator bir vakum pompası bağlayın. Vakum istenen seviyeye ulaşmak için 1 dakika için pompa açmak, sonra desiccator mühür ve iç duvar Cam tüplerin kat trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane buharı izin için 3-yollu vana kapatın. Bu damlacıkları sabitleme için hidrofobik bir ortam oluşturur.
    5. Cam tüpler gecede kaplama için desiccator içinde bırakın. Tüpler ertesi gün kullanıma hazır olacak.
  2. Damlacık oluşturma ve görüntüleme
    Not: rakamlar 1B ve 1 c damlacıkları üretme ve görüntüleme yordamları gösterilmiştir
    1. Adım 2 ile 10 ng/µL hazırlanan özleri tedarik securin-mCherry mRNA basit salt sitoplazmik hücre döngüsü deneyler için. Alternatif olarak, kaynağı özleri demembranated sperm kromatin (250 µL ekstresinin) ile 10 µM GFP NLS protein ve 10 ng/µL periyodik çekirdek morfoloji sergilenmesi damlacıkları oluşturmak için securin-mCherry mRNA değiştirir.
    2. 1.5 mL microcentrifuge tüp mix 20 µL ekstresinin Rekombinant protein veya mRNA ile %200 2 perfluoropolyether-Polietilen glikol µL ile (PFPE-PEG) fluorosurfactant HFE7500 Fluor yağda sağlanan.
    3. Bir girdap Mikser kullanarak damlacıkları oluşturur. Damlacık boyutu aralığını girdap hız ve süresi tarafından modüle. 50'den 200 µm arasında değişen yarıçapı ile damlacıkları oluşturmak için 56 x g (4.9 mm yarıçaplı 3.200 devir/dakika), girdap hızını ayarlamak ve yavaşça özü içeren microcentrifuge tüp ve yüzey aktif karışımı Mikser üzerinde 3,5 saniye süre ile bas›n. Damlacıkları boyutunda tek tip olup olmadığını kontrol edin.
    4. 20 µL pipet üst ve PFPE-PEG yüzey aktif eşit bir hacmi PCR tüp içine yüzen damlacıkları aktarmak için kullanın. Damlacıkları tüpü yaklaşık % 75'i doldurduktan sonra tüp tamamen doldurulana kadar tüp aşağı yüzey aktif katman itme kadar adım 1.5 mL microcentrifuge tüp ve bir dakika içinde damlacık katmanına hazırlanan cam tüp daldırma. Bu damlacık yoğunluğu düşük ve aşırı kalabalık tarafından neden örtüşen veya şekil bozulma olmadan odası içinde bir tek katman oluşturmak üzere damlacıkları sağlar.
    5. Mineral yağ ile 40 mm çapında bir cam alt tabak doldurun. Damlacık dolu tüpler yağda hafifçe onları iyi bir cımbız kullanarak aşağı iterek bırakın.
    6. Yükledikten sonra tüm örneklerini, kullan bir cam pipet görünür herhangi bir enkaz kaldırmak için veya damlacıklar sızdırılmış. Tüpler veya tamamen görüntüleme sürecinde batırılır değil daha fazla mineral yağ ekleyin.
    7. Görüntüleme bir motorlu x-y sahne ile donatılmış bir epifluorescence mikroskobu üzerinde damlacıkları kuralları ( Tablo malzemelerigörmek). Bir 4 X hava hedefi tüm görüntüleme için kullanın. Floresans görüntüsü için bir 130 W Cıva buharı kısa ark lambası (uyarma 482/35 nm ve emisyon 514/LP nm) floresan aydınlatma ışık kaynağı ve GFP filtre ayarlamak ve görüntüleme için bir mCherry filtre (uyarma 562/40 nm ve emisyon 641/75 nm) kümesi olarak kullanmak, GFP NLS ve securin-mCherry sinyalleri.
    8. Parlak alanını ve birden fazla floresans Kanal 6-9 damlacıkları faaliyetlerini kaybedinceye kadar dakikada kayıt hızlandırılmış videoları.

4. görüntü işleme ve veri analizi

  1. Segmentasyon ve izleme damlacıkları
    1. Görüntü analiz yazılımı ".tif" veya ".oif" biçiminde kaydedilen veri alma ( Tablo malzemelerigörmek).
    2. Tek damlacıkları parlak alan kanal kullanarak kesiminde. Parlak alan görüntü damlacıkları karanlık sınırları olan parlak daireler olarak gösterir. Eşik yansımaya uygulamak. Bir izleme yüzeyi böylece her yüzey karşılık gelen damlacık tüm alanı kaplamaktadır karanlık ve parlak pikseller arasındaki eşik ayarlama tarafından her damla ekleyin.
    3. Otomatik olarak segmentleri autoregressive hareket algoritmasını kullanarak bitişik çerçeveler arasında izleyebilirsiniz. Bir damlacık küçük damlacıklar doğru bir şekilde izlemek için çoğu damlacıkları RADIUS küçük olması için iki bitişik kareleri arasında kabul edilebilir maksimum seyahat mesafesi ayarlayın.
    4. Tüm izler yanlış segmentations algılamak için videonun tamamını karşıdan karşıya bu kesimin boş alanı yerine gerçek damlacıkları damlacıklar arasında görsel olarak kontrol edin. Yanlış parça el ile silin.
    5. Segment ve parça arka plan alanını arka plan floresan yoğunluğu elde etmek için herhangi bir damlacıklar olmadan. Sinyal-gürültü geliştirmek için arka plan yoğunluğu damlacıkları her zaman dilimi, floresan yoğunluğu üzerinden çıkarın.
    6. Zamanla, ortalama ve standart sapma floresan yoğunluğu ve damlacık alan ".csv" dosyaları dahil olmak üzere her parça için ölçülen parametreler verin.
  2. Veri Analizi damlacık boyutu ve salınım dönemi
    1. R floresan yoğunluğu ve araziler her damlacık için zaman içinde oluşturmak için içine ".csv" dosyaları yükleyin. Bir ".csv" dosyasına kayıt damlacık kimliği.
    2. Matlab analiz yazılımı ve ".csv" dosya listesini damlacık kimliği ile ihraç ".csv" dosyalarını içe aktarın ve daha fazla veri analiz ".mat" dosyaları olarak kaydedin.
    3. Segmentasyon ve cam yüksekliği19odası sonra verilen damlacık alan bilgileri temel alarak bir sıkıştırılmış damlacık hacmi hesaplamak. Birimin damlacık bir küre olarak RADIUS hesaplamak için kullanın.
    4. İnişli çıkışlıydı tepe/yalak algılama algoritması kullanarak zaman noktaları ayıklayın. El ile yapılan düzeltmeleri inişli çıkışlıydı doğru bir şekilde tespit edilir emin olmak için konumunu yapmak.
    5. Hücre döngüsü dönemi hesaplamak üzere, iki bitişik tepeler arasındaki aralığı zaman hesaplamak. Tüm aralıkları için her damlacık ortalamasını, hücre döngüsü süresi al.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 2' de, biz bu protokolü hem basit, nükleer özgür hücreleri hem de nereye osilatör çekirdek oluşumu ve deformasyon çevrimsel değişim sürücüler çekirdeği, karmaşık hücrelerle mitotik salınımları üretir gösterir. Çekirdeği-Alerjik damlacıkları mitotik salınımlarını kadar 30 undamped devir için 92 saat, zaman span üzerinden periyodik sentez ve bir floresan muhabir securin-mCherry (Şekil 2A) bozulması tarafından belirtildiği şekilde oluşturun. Securin karmaşık APC/C. teşvik anafaz substrat olduğunu Securin-mCherry yıkımı sırasında anafaz böylece APC/C. aktiviteyi göstermektedir

Mitotik osilatör aşağı akım mitotik olaylar sürücü yeteneği incelemek için biz Ayrıca demembranated sperm kromatin, saf yeşil flüoresan protein-nükleer yerelleştirme sinyal (GFP-NLS) ve Höchst 33342 boyalar sitoplazmik için sağlanan ayıklar. Şekil 2B farklı hücre döngüsü aşamaları, interfaz (Mavi Bar) ve mitoz (kırmızı bar), hangi sırasında nükleer morfoloji değişiklikler kendini sürekli mitotik osilatör tarafından tahrik edilmektedir özerk değişim gösterir. Tüm mitotik olayları, Yani, kromozom decondensation ve yoğunlaşma Höchst tarafından 33342 (Şekil 2B, ilk satır), nükleer oluşumu ve nükleer zarf breakdown GFP-NLS (Şekil 2B, ikinci satır) ve faaliyet rapor hücre döngüsü osilatör sentezi ve securin-mCherry (Şekil 2B, 3. sıra), bozulma birbirleri ile çakıştı. Görüntüleri hızlandırılmış çok kanallı floresan mikroskop kullanarak toplanmıştır. Bizim deneysel sonuçlar yeniden oluşturulan hücre döngüsü sistemi Cdk1 ve aşağı akım olayların nükleer zarf arıza ve reform da dahil olmak üzere bir dizi sürebilirim, APC/C, mitotik bir osilatör yeniden inşa kapasitesine sahip olduğunu göstermek ve kromozom morfolojisi değiştir.

Şekil 3 önce ve gürültü çıkarıldıktan sonra securin-mCherry ortalama floresans yoğunluğunu tarafından belirtilen salınımlar gösterir. İnişli çıkışlıydı daha özellikle gürültü kaldırma sinyal-gürültü daha fazla çözümleme için geliştirmek yardımcı olabilir gösteren ilk iki salınım için arka plan gürültü çıkardıktan sonra belirgin oldu.

Figure 1
Şekil 1. Damlacık tabanlı Mitotik hücre üretmek için deneysel işlemin. A. sitoplazmik özleri ultra-Santrifüjü toplanır. B. özleri başlamaktan ve mitotik salınımlarını raporlama amacıyla birden çok bileşeni ile sağlanır. Vortexing yöntemini kullanarak, özleri ve yüzey aktif yağ damlacıkları üretmek için karıştırılır. C. damlacıkları trichloro (1 H, 1 H, 2 H, 2 H-perfluorooctyl) silane kaplı tüpün içine yüklenir ve bir epi-floresans mikroskobu görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Algılama floresan gazetecilere kullanarak hücre döngüsü dinamiği. A. zaman ders 92 saat boyunca 30 undamped salınım gösteren seçili damlacık ortalama securin mCherry floresan yoğunluğu. INSERT şekil beyaz noktalı çember tarafından çerçeveli seçili damlacık ile floresan görüntü gösterir. Ölçek çubuğu 100 µm. B. olduğunu Zaman serisi anlık görüntülerini bir damlacık floresans kanalları (ilk üç satır) ve parlak alanındaki (son satır). Hücre döngüsü saat ve onun aşağı akım mitotik süreçleri döngüsel ilerlemesini aynı anda birden çok floresan gazeteciler tarafından izleniyor. Anafaz substrat securin-mCherry saat regülatör APC/C etkinliği, Hoescht leke kromozom morfolojisi değişiklik gösterir ve GFP NLS nükleer zarf arıza ve reformations gösterir. Nükleer (Beyaz oklarla vurgulanan) zarflar da parlak alan görüntülerde tespit, GFP NLS lokalizasyonu eşleşen belirtilen çekirdek. Ölçek çubuğu 50 µm. interfaz ve mitotik aşama sırasıyla mavi çubuklar ve belgili tanımlık imge yukarıda kırmızı çubuklar gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Arka plan securin-mCherry ortalama floresans yoğunluğu için çıkarma. A. salınım saat ders arka plan gürültü kaldırma önce. B. salınım saat ders gürültü çıkarıldıktan sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz yüksek üretilen iş yapay hücre sistemi geliştirmek için bir roman yöntemi o olanaklı kılmak içinde vitro sulandırma ve uzun vadeli kendini sürekli hücre döngüsü salınımlarını tek hücre düzeyinde izlenmesine sundu. Bu yöntem başarılı yapmak birkaç kritik adım vardır. İyi bir kalite ile ilk, taze sıkılmış Xenopus yumurta koydu yumurta ile karşılaştırıldığında, özleri ile uzun süreli salınım etkinliğini üretmek eğilimindedir. İkinci olarak, kapsülleme özler yüzey aktif stabilize microenvironments içinde salınım etkinliğini korumak çok önemlidir. İnce bir tüp sınırları daha kolay görüntü işleme ve uzun vadeli izleme için tek bir katman içinde damlacıkları içine üçüncü, kuluçka yağ damlacıkları. Dördüncü olarak, yüzey enerji düşürmek için anti-yapışkan trichloro (1 H, 1 H, 2 H, 2 H-perfluorooctyl) silane ile tüp iç duvar kaplama özü etkinlik korunmasına yardımcı olur. Beşinci olarak, tüpler yağı ile sızdırmazlık damlacık akışını engeller. Petrol-sızdırmazlık yöntemi de buharlaşma önlemek ve daha fazla özü etkinliğini korumak. Bunlar birlikte vitro damlacıkları sağlam salınımlarını yeniden inşası ve izleme bir uzun vadede bu damlacıkları ve segmentasyon doğruluğu başarı oranını artırmak.

Biz her iki basit vortexing Yöntem, birkaç diğer çalışmalar29,30,31yanı sıra daha yaygın olarak kullanılan Havacilik teknikleri19, benzer istihdam microemulsion damlacıkları üretmek için 20 (veri gösterilmez). Her iki yöntem başarılı bir şekilde microemulsions bir yüksek-den geçerek şekilde elde edebilecektir. Vortexing yöntemi ile ilişkili bir damlacık boyutu değil düzgün denetlenir kısıtlamadır. Simge durumuna küçültülmüş boyutu varyasyon ile iyi tanımlanmış bir boyutu gerektiren çalışmalar Havacilik teknikleri damlacık boyutlarının daha iyi kontrol için kullanılır. Burada, iki nedenden mikrosıvısal yöntemi üzerinde vortexing yöntemi seçtiniz. İlk olarak, labs mikrosıvısal teknikleri veya bu yöntem kolayca adapte nanofabrication imkanları erişimi olmayan sağlayacak basit ve kolay takip prosedürleri vardır. İkinci olarak, vortexing yöntemi daha verimli ve ekonomik boyutu bağımlı davranışları osilatör soruşturma için. Damlacık boyutlarda geniş bir dağıtım mikrosıvısal tekniği yalnızca önceden tanımlanmış bir boyutta merkezli dar bir dağıtım oluşturmak iken birkaç mikrometre ilâ 300 Mikroölçerler, değişen yarıçapı ile oluşturabilirsiniz. Bu yöntemle üretilen damlacık boyutu aralığını karakteristik indirgeyici hücre bölümler erken embriyolar Xenopus ve zebra balığı gibi bölünme aşamasında ortaya çıkan hücre boyutlarını çok çeşitli eşleşir.

Mevcut yöntemi salınımlarını sürdürülebilirliği ve karmaşık saat dinamikleri, iyi karma toplu çözüm8biyolojik osilatörler başlamaktan varolan yöntemleri ile karşılaştırıldığında çözümleme işlem hacmi önemli ölçüde iyileşmiştir, hızlı bir şekilde üretmek eğilimi 32, sönümlü titreşimler. Bu yöntem damlacıkları (Şekil 2A) microenvironment 30'dan fazla döngüleri için toplu tepki8 birkaç devir gelen titreşimler ömrünü önemli ölçüde geliştirdi göstermiştir. Ayrıca, toplu tepkiler gerçek hücre boyutları benzerlik eksikliği ve gerçek hücrelerinde fonksiyonel bölünebilme elde mekansal organizasyon özetlemek olamaz. Toplu tepkiler bu sınırlamalarının üstesinden gelir, bizim yapay hücre sistemi bir temel platformu hücresel heterojenite ve osilatörler, aksi takdirde imkansız olan stochasticity gibi zorlu sorular soruşturma için sağlar keşfedin.

Ayrıca, bu yöntem için hücreleri inşa edilebilir karmaşıklık derecesi içinde esneklik sağlar. Karmaşık nükleer dynamics üzerinden herhangi bir girişimi engellemek için hiçbir çekirdek içeren bir minimal, salt sitoplazmik hücre döngüsü sistemi yeniden oluşturmak. Bu basit ve salt sitoplazmik osilatör kendini sürekli salınım varolan bazı sentetik osilatörler önemli ölçüde daha iyi sergiler. Sperm kromatin sağlayarak, biz de daha karmaşık hücreleri arasında kendinden montajlı interfaz ve nükleer deformasyon mitotik faz ritmik bir şekilde alternatif çekirdeği ile yeniden oluşturmak. Etkinlik mitotik osilatör olarak aşağı akım nükleer olaylar çok kanallı floresans görüntüleme ve tek hücreli izleme tarafından ölçülen aynı anda olabilir.

Yöntem de manipülasyon damlacık boyutu ve hücre döngüsü hız yüksek düzeyde sağlar. Hücre boyutu bağımlı hücre döngüsü davranışlarını çalışmanın yararlanacak geniş bir alanda, yarıçapı ile damlacıkları üretimi için vortexing tekniği sağlar. Buna ek olarak, hücre döngüsü hız bize ayar işlevi hücre döngüsü saatin çalışmaya sağlayacak B1 mRNA'ların33, siklin farklı konsantrasyonlarda sağlayarak modülasyonlu.

Bu avantajları ile görselleştirme, işleme ve analiz tek hücre dinamiği, etkinleştirme yeniden vitro hücre döngüsü platformu, büyük olasılıkla daha karmaşık Stokastik davranışlar içine yeni anlayışlar için hücrenin önünü açacak devir saati. Yöntem genelleştirilebilir geleneksel toplu tepkiler üzerinde itimat diğer osilatörleri vitro çalışmalar için de kullanabilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

İfşa etmek yok.

Acknowledgments

Madeleine Lu securin mCherry plazmid, kucak adam Lee, Kenneth Ho ve Allen P Liu damlacık üretimi hakkında tartışmalar için Jeremy B. Chang ve James E. Ferrell Jr GFP NLS oluşturmak sağlamak için inşa için teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (erken kariyer Grant #1553031), Ulusal Sağlık Enstitüleri (MIRA #GM119688) ve Sloan araştırma bursu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. Methods in Enzymology. 91, Academic Press. 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Tags

Kendi kendine Bisiklete binme boş hücre özleri hızlandırılmış floresans mikroskobu vitro tek hücreli analiz yapay hücreler microemulsion salınımları Xenopus laevis biyokimya sayı: 139 Mitotik hücre döngüsü sürekli
Microemulsions boş hücre <em>Xenopus</em> yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., … More

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter