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Biochemistry

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240

Summary

Wir präsentieren eine Methode zur Erzeugung von in-vitro- autarken mitotischen Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle durch Verkapselung Ei Extrakte von Xenopus Laevis in Wasser-in-Öl-Mikroemulsionen.

Abstract

Echtzeit-Messung von Schwingungen auf die einzelne Zelle Ebene ist wichtig, die Mechanismen der biologischen Uhren entdecken. Obwohl Bulk Extrakte aus Xenopus Laevis Eier zubereitet mächtig in biochemischen Netzwerken zugrunde liegt die Zellzyklus Progression seziert wurden, führt deren Ensemble durchschnittliche Messung typischerweise zu einer gedämpften Schwingung, trotz jeder einzelnen Oszillator wird aufrechterhalten. Dies ist aufgrund der Schwierigkeiten der perfekte Synchronisation zwischen einzelnen Oszillatoren in laut biologischer Systeme. Die einzelligen Dynamik des Oszillators abzurufen, entwickelten wir ein Droplet-basierten künstlichen Zellsystem, die mitotische Zyklen in zellähnliche Fächer Verkapselung Radsport zytoplasmatischen Extrakte von Xenopus Laevis Eier rekonstruieren kann. Diese einfachen nur cytoplasmatische Zellen weisen nachhaltige Schwingungen für über 30 Zyklen. Um kompliziertere Zellen mit Kernen zu bauen, haben wir Demembranated Spermien Chromatin Kerne Selbstmontage im System ausgelöst. Wir beobachteten eine periodische Abfolge von Chromosom Kondensation/enttauung und Kerne umhüllen Aufschlüsselung/Reformation wie in realen Zellen. Dies bedeutet, dass der mitotische Oszillator treu dient dazu um mehrere nachgeschaltete mitotischen Ereignisse zu fahren. Wir haben gleichzeitig die Dynamik der mitotischen Oszillator und nachgelagerte Prozesse in einzelnen Tröpfchen mit Multi-Channel-time-lapse-Fluoreszenz-Mikroskopie. Das künstliche Zellzyklus-System bietet einen Hochdurchsatz-Rahmen für quantitative Manipulation und Analyse der mitotischen Schwingungen mit einzelligen Entschließung, die wahrscheinlich wichtige Erkenntnisse über die regulatorischen Maschinen und Funktionen des liefert die Uhr.

Introduction

Zytoplasmatischen Extrakte aus Xenopus Laevis Eier zubereitet repräsentieren eines der vorherrschenden Modelle für die biochemische Untersuchung der Zelle Zyklen, angesichts der großen Anzahl der Eizellen, die schnelle Zellzyklus Progression und die Fähigkeit der Neuaufbau mitotische Veranstaltungen in-vitro-1,2. Dieses System ermöglichte die erste Entdeckung und mechanistischen Charakterisierung der wesentlichen Zellzyklus Regulierungsbehörden wie Förderung der Reifung Faktor (MPF) sowie nachgelagerte mitotische Prozesse einschließlich Montage und Chromosom Segregation1 Spindel ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus -Ei-Extrakte haben auch verwendet worden, für detaillierte Dissektion der regulationsnetzwerke des Zellzyklus Uhr8,12,13,14 und Studien von DNA-Schäden /Replication Checkpoint15 und der mitotischen Spindel Baugruppe Checkpoint16,17,18.

Diese Studien der Zelle Zyklen mit Xenopus -Ei-Extrakte haben hauptsächlich basiert auf Masse Messungen. Jedoch können konventionelle Masse Reaktion Assays nicht echte Zelle Verhalten, gegeben eine große Diskrepanz in ihren Dimensionen und subzelluläre räumliche Abschottung der Reaktion Moleküle imitieren. Darüber hinaus sind lose Messungen der mitotischen Aktivitäten anfällig für eine begrenzte Anzahl von Zyklen vor der Dämpfung schnell8geben. Diese Nachteile der Masse Reaktionen verhindert haben das Extrakt System um weitere Verständnis der komplexen Uhr dynamische Eigenschaften und Funktionen bereitzustellen. Jüngste Studien haben gekapselt zellfreie Zytostatika Faktor verhaftet (CSF) Xenopus extrahiert19,20 in Größe definiert zellähnliche Fächer, die dazu beigetragen haben, aufzuklären, wie Spindel Größe durch moduliert wird die zytoplasmatischen Volumen. Jedoch dieses in-vitro- System ist durch die Wirkung der Zytostatika Faktor1in Metaphase der Meiose II verhaftet, und ein System in der Lage, langfristige nachhaltige Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle zur weiteren Untersuchung des Zellzyklus erforderlich Oszillator.

Zellzyklus Schwingungen mit einzelligen Auflösung studieren, entwickelten wir eine Zelle-Skala, Hochdurchsatz-System zur Rekonstitution und gleichzeitige Messung mehrerer selbsttragenden mitotischen oszillierende Prozesse in einzelnen Mikroemulsion Tröpfchen. In diesem ausführlichen video Protokoll zeigen wir die Schaffung eines künstlichen mitotischen Schwingung durch Kapselung von Radsport Xenopus Laevis Ei Zytoplasma in Mikroemulsionen Größen von 10 bis 300 µm. In diesem System wurden mitotische Schwingungen einschließlich Chromosom Kondensation und de-Kondensation, Kernhülle Aufschlüsselung und Reformation, und der Abbau und Synthese von Anaphase Substrate (z. B. securin-mCherry in diesem Protokoll) erfolgreich wieder hergestellt.

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Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Michigan genehmigt.

1. Vorbereitung der Materialien für Zellzyklus Rekonstitution und Erkennung

  1. Gibson-Assembly für den Plasmid DNA-Bau und mRNA Reinigung des securin mCherry Klonen
    1. Bereiten Sie drei DNA-Fragmente, darunter ein pMTB2 Vektor Rückgrat, securin und mCherry durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und gel Reinigung21,22.
    2. Die Konzentrationen der Fragmente mit Hilfe eines Fluorospectrometer zu messen. Kombinieren 100 ng des Backbones mit securin und mCherry-Einsätze bei einer 1: Molekulare Verhältnis 1:1 und fügen deionisiertes Wasser um das Gesamtvolumen der Reaktion auf 5 µL anzupassen.
    3. Bereiten Sie 6 mL 5 x Isothermen Montage Reaktion Puffer mit 3 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 300 µL 1 M MgCl2, 600 µL 10 mM dNTP 300 µL 1 m DTT, 1,5 g der PEG-8000 und 20 mg NAD23.
    4. Ein 15 µL 1 X Isothermen Montage Reaktion Puffer aliquoten kombinierten Fragmente hinzufügen. Inkubieren Sie die Reaktion in einer PCR-Reaktion-Röhre bei 50 ° C für 15 Minuten.
    5. Machen Sie eine 0,8 % Agarose-gel und laufen mit einer Spannung von 10 V/cm um das Glühen Effizienz dieser Fragmente zu überprüfen.
    6. Reinigen Sie das konstruierte Plasmid und eluieren mit 15 µL RNase-freies Wasser. Verwandeln Sie 1 µL gereinigtes Plasmid DNA in 50 µL DH5α kompetente E. Coli Zellen24 für die zukünftige Verwendung.
    7. Extrahieren und zu reinigen das Plasmid DNA securin mCherry aus den DH5α kompetente E. Coli Zellen.
    8. Die linearisierte securin mCherry Plasmid DNA in mRNA transkribieren und reinige die mRNA. Ein Spektralphotometer zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Konzentration der mRNA mehr als 100 ng/µL und das Verhältnis der Absorption bei 260 ist nm und 280 nm ist etwa 2.0.
  2. Vorbereitung der Demembranated Xenopus Laevis Samenzellen DNA
    Hinweis: Adaptiert von Murray 19911.
    1. Erwachsene männliche Xenopus Laeviseinschläfern25 und sezieren Hoden aus vier männliche Frösche26,27.
    2. Platzieren Sie Hoden aus vier Frösche in der gleichen 100 mL Petrischale. Spülen Sie die Hoden dreimal in 50 mL kalten 1 X MMR-Lösung (0,1 M NaCl, KCl 2 mM, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA).
    3. Entfernen Sie überschüssiges Blut und Fett aus den Hoden in einer Petrischale 100 mL und dann zweimal in kalten nuklearen Vorbereitung Puffer (NPB) (250 mM Saccharose, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0,5 mM Spermidine Trihydrochloride 0,2 mM Spermin Tetrahydrochloride) waschen.
    4. Entfernen des nuklearen Vorbereitung Puffers (NFB) und Hoden in Stücke mit einer Länge kleiner als 0,2 cm mit scharfen sezierenden Schere in eine 100 mL Petrischale. 8 mL kalte NPB an den Hoden für weitere Aufschlüsselung hinzugeben.
    5. Verwendung Nylon mesh-Gewebe mit einer Porengröße von 70 µm filtern die Hoden und spermaprobe in ein 15 mL konische Röhrchen zu sammeln. Spin-down die gesammelten Spermien bei 1.730 x g für 10 Minuten bei 4 ° C und überstand zu entfernen.
    6. Liefern die Samenzellen mit 1 mL NFB und 50 µL 10 mg/mL Lysolecithin und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min zu Demembranate Spermien.
    7. Waschen Sie das Demembranated Sperma DNA mit 10 mL kalte NPB mit 3 % BSA Lösung dreimal.
    8. Die Dichte der Spermien-DNA mit einem Hemocytometer zu messen.
    9. Die Samenzellen DNA in 5 µL-Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c Lagern Die optimale Konzentration der Spermien-DNA ist ca. 105 Kerne/µL.
  3. Proteinreinigung von GFP-nuklearen Lokalisierung Signal (GFP-NLS)
    1. Verwandeln Sie das GST-Tags GFP-NLS-Plasmid in BL21 (DE3) kompetente E. Coli Zellen5.
    2. Brüten die Zellen ohne Antibiotika bei 37 ° C für 1 h und breitete sich dann auf eine LB-Agarose-Platte mit 100 µg/mL Ampicillin.
    3. Brüten Sie die Platte bei 37 ° C für 14 bis 18 Uhr die Zellen wachsen in einzelnen Kolonien. Wählen Sie und impfen Sie einzelne Kolonien in 4 mL LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin zu. Schütteln Sie die Zellen bei 37 ° C für 12 Stunden.
    4. Bereiten Sie die autoklaviert YT-Medien (Bacto-Tryptone 16 g, 10 g Bacto-Hefeextrakt, 5 g NaCl) und Erhitzen Sie die YT-Medien auf 37 ° c
    5. Impfen Sie 1 mL der Nacht inkubierten Zellen in LB Medien in 250 mL vorgewärmten YT-Medien mit 100 µg/mL Ampicillin zu und schütteln Sie 2 Stunden Zelldichte erhöhen.
    6. Messen Zelle optische Dichte (OD) alle 30 Minuten mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm. Fügen Sie 0,1 mM IPTG in Zellen, GFP-NLS-Protein-Expression zu induzieren, sobald die OD-Wert 0,1 erreicht.
    7. Schütteln Sie die Zellen bei 18 ° C über Nacht reduzieren Zelle Wachstum und ermöglichen bessere Protein-Expression und Synthese.
    8. Spin-down der Zellen bei 34.524 x g bei 4 ° C für 5 Minuten und überstand zu entfernen.
    9. Aufschwemmen Sie der Zelle Pellets in 40 mL PBS-Puffer (mit 800 µL 50 mg/mL Lysozym, 100 µL 0,2 M PMSF 13.2 µL einer 10 mg/mL Mischung aus Leupeptin, Pepstatin und Chymostatin und 8 µL 0,5 M EDTA geliefert) und 20 Minuten bei 4 ° C inkubieren.
    10. Brechen, Zellen mit einem sonikator mit einer Frequenz von 20 kHz für 4 x 30 s, 30 s Intervallen zwischen jeder Beschallung freizugebende ausgedrückt GFP-NLS-Protein.
    11. Drehen Sie mit 20.000 x g für 35 Minuten, um die defekten Zellen zu entfernen.
    12. Verwenden Sie Affinitätschromatographie zu extrahieren und zu reinigen GFP-NLS Protein.
    13. 1,5 mL Wulst Gülle dreimal mit 15 mL PBS-Puffer waschen und 4 Stunden bei 4 ° C mit Inversion 250 mL mit Perlen lysate inkubieren.
    14. Spin-down der Perlen bei 2000 X g für 5 min und 10 mL Waschlösung (25 mM Tris Basis, pH 7.5, NaCl, 500 mM und 5 mM DVB-t), Perlen. Inkubieren Sie Perlen in 700 µL Elution Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM reduziert Glutathion und 5 mM DVB-t) mit Drehung bei 4 ° c Ein Aliquot der Elution mit einem Volumen von 50 µL zu sammeln.
    15. Messen der Konzentration des erfassten Proteins durch Ausführen einer Coomassie blau Gel28.
    16. Mit PD-10 Spalten mit 3 mL Puffer speichern (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 % Glycerin, pH 7,7) durch Buffer Tausch Proteine eluieren.

2. Vorbereitung des Radsports Xenopus -Extrakte

Hinweis: Das gesamte Verfahren der Vorbereitung die Extrakte ist in Figur 1Adargestellt. Adaptiert von Murray 19911.

  1. Injizieren Sie drei ältere weibliche Xenopus Laevis mit 66 IU trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG) 10 Tage vor der Eiablage.
  2. Spritzen Sie diese Xenopus -Frösche mit 500 IU humanes Choriongonadotropin (HCG) zur Eiablage 18 Stunden vor der Präparation des Radsports Extrakte zu induzieren.
  3. Gelegten Eier über Nacht zu verwerfen. Basierend auf Experimente (Daten nicht gezeigt), Auszüge aus den frisch gepressten Eiern zubereitet generieren länger andauernde Aktivitäten als Extrakte aus gelegten Eier aus den gleichen fröschin vorbereitet. Drücken Sie die Eier von jeder fröschin in 100 mm Petrischalen mit 10 mL 0,2 X MMR Puffer und unter einem Stereomikroskop untersuchen.
  4. Die Chargen von Eiern, die unklare Grenzen zwischen Tier und Vegetal Pfosten oder unregelmäßige weiße Flecken auf Tier Pole zu verwerfen.
  5. Wählen Sie die Ladung von Eiern aus eine fröschin präsentiert eine homogene Bevölkerung von Eiern mit klar differenzierten Tier- und Vegetal Pfosten und übertragen Sie die Eier in einem 600 mL-Becherglas.
  6. Gießen Sie überschüssige 0,2 X MMR Puffer und sanft 250 mL Cystein (pH 7,7) 1 x Extrahieren von 2 g pro 100 mL Puffer (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50 mM Saccharose, pH 7,7), Eier.
  7. Schütteln Sie die Eier mit der Hand kräftig und entfernen Sie die Gelee-Mäntel von Eiern über drei Waschungen mit einem Gesamtvolumen von 800 mL Cystein Puffer für 3 Minuten oder bis Sie Eier aggregieren und siedeln am Boden des Bechers, darauf hinweist, dass Gelee Mantel entfernen erfolgreich verläuft.
  8. Waschen Sie Eier mit 1 L 0,2 X MMR Lösung mehr als das Vierfache.
  9. Holen Sie ab und entsorgen Sie Eier, die weiß mit einer Glaspipette Transfer.
  10. Gießen Sie die MMR-Puffer und liefern Sie Eier mit 200 mL 0,1 µg/mL Kalzium Ionophore A23187 Lösung in 0,2 X MMR Puffer für die Aktivierung.
  11. Verwenden Sie die weite Öffnungsseite von einer Glaspipette die Eier vorsichtig rühren, bis die Eier aktiviert werden und Kalzium Ionophore Lösung zu entfernen.
  12. Überprüfen Sie die Aktivierungs-Effizienz, nachdem Eier an der Unterseite des Bechers niederzulassen. Gut aktivierten Eier haben ca. 25 % der Tier-Pole und 75 % der Vegetal-Stange.
  13. Waschen Sie die aktivierten Eier zweimal mit 50 mL 1 x Extrakt Puffer mit Protease-Inhibitoren (10 µg/mL Leupeptin, Pepstatin und Chymostatin) ergänzt.
  14. Übertragen Sie Eier sorgfältig auf eine 0,4 mL Snap-Cap reaktionscup und dann packen Sie Eier durch Zentrifugation bei 200 X g für 60 Sekunden und dann 600 X g für 30 Sekunden.
  15. Entfernen Sie zusätzliche Puffer oben auf Eier mit einem Glas Pasteurpipette, um die Verdünnung der Extrakte zu reduzieren.
  16. Crush Eier bei 15.000 x g für 10 Minuten bei 4 ° C.
  17. Schneiden Sie die Rohre mit einer Rasierklinge zu drei Lagen zerkleinerte Eier trennen Rohöl Zytoplasma in der mittleren Schicht.
  18. Grobe Zytoplasma in neuen Ultrazentrifugen Röhren übertragen, und ergänzen mit Protease-Inhibitoren und Cytochalasin B 10 µg/ml.
  19. Zentrifugieren Sie grobe Zytoplasma wieder bei 15.000 x g bei 4° C für 5 Minuten zum Zytoplasma weiter zu reinigen, indem überschüssige Lipid und Eigelb.
  20. Halten Sie frisch zubereitete Auszüge auf Eis.

(3) Droplet-Generation

  1. 2D Glasbearbeitung Kammer
    Hinweis: Die Rechteck-Glasröhren dienen als Kammern, die die Tröpfchen in einer 2-dimensionalen Ebene, zulassend einfacher Beobachtung und Sammlung von Daten zu beschränken.
    1. Schneiden Sie Rechteck-Glasröhren mit innere Dimension von 2 mm x 100 µm in 4 mm lange Stücke. Verwenden Sie die scharfe Kante einen Schleifstein, markieren Sie die gewünschten Grenzen auf der äußeren Oberfläche des Glasrohrs mit leichten Radierungen, dann üben Sie sanft Druck auf beiden Seiten der Radierungen, Stücke von Glasröhren abzubrechen.
    2. Einen Trockenbad-Inkubator auf 95 ° c vorheizen Nehmen Sie den Heizblock und legen Sie sie in eine Polycarbonat-Vakuum-Exsikkator.
    3. Legen Sie einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 30 µL Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silan in den Heizblock. Geschliffenes Glasrohre innerhalb der Vakuum Exsikkator ca. 5 cm zu den Heizblock lag.
    4. Verbinden Sie den Exsikkator mit einer Vakuumpumpe. Schalten Sie die Pumpe für 1 Minute, um das gewünschte Vakuumniveau erreichen, dann schließen Sie die 3-Wege-Ventil zu versiegeln der Exsikkator und lassen den Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silan Dampf die Innenwand der Glasröhren zu beschichten. Dadurch entsteht eine hydrophobe Umgebung zur Stabilisierung der Tröpfchen.
    5. Lassen Sie die Glasröhren im Exsikkator über Nacht Beschichtung. Die Rohre werden am nächsten Tag einsatzbereit.
  2. Tröpfchen-Generation und Bildgebung
    Hinweis: Die Verfahren der Erzeugung von Tröpfchen und imaging sind in Figuren 1 b und 1 C. dargestellt.
    1. Extrakte, die in Schritt 2 mit 10 ng/µL zubereitet liefern securin mCherry mRNA für die einfach nur cytoplasmatische Zellzyklus-Experimente. Alternativ ändert Versorgung Extrakte mit Demembranated Spermien Chromatin (250 pro Mikroliter-Extrakt), 10 µM GFP-NLS Protein und 10 ng/µL securin mCherry mRNA Tröpfchen ausstellenden periodische Kerne Morphologie zu erstellen.
    2. In einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch geliefert Mischung 20 µL des Extraktes mit rekombinanten Proteins oder mRNA mit 200 µL 2 % Perfluoropolyether-Polyethylenglykol (PFPE-PEG) Fluorosurfactant in HFE7500 fluorierten Öl.
    3. Tröpfchen mit einem Vortex-Mixer zu generieren. Das Spektrum der tröpfchengrößen kann durch Wirbel Geschwindigkeit und Dauer moduliert werden. Erstellen Sie Tröpfchen mit Radien von 50 bis 200 µm, die Wirbel Geschwindigkeit 56 X g (3.200 u/min mit einem Radius von 4,9 mm) und drücken Sie vorsichtig die Microcentrifuge Schlauch mit dem Extrakt und Tensid Mischung am Mischpult für 3,5 Sekunden. Überprüfen Sie, wenn die Tröpfchen einheitlich groß sind.
    4. Mithilfe einer 20 µL Pipette die Tröpfchen schweben auf Oberseite und ein gleiches Volumen an PFPE-PEG Tensid in ein PCR-Rohr übertragen. Tauchen Sie das Glasrohr, vorbereitet vom Schritt in die Tröpfchen-Schicht in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und warten, bis Tropfen ca. 75 % des Rohres ausgefüllt haben, dann schieben Sie den Schlauch nach unten in die Tensid-Schicht, bis der Schlauch vollständig gefüllt ist. Dies senkt die Tröpfchen-Dichte und ermöglichen die Tröpfchen einer einzige Schicht im Inneren der Kammer ohne Überlappung oder Form Verzerrungen durch Überbelegung zu bilden.
    5. Füllen Sie eine Glasschale unten mit einem Durchmesser von 40 mm mit Mineralöl. Tauchen Sie die Tröpfchen-gefüllte Schläuche in Öl, indem man sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette.
    6. Nach dem laden alle Proben, mit einem Glas pipette entfernen Sie sichtbare Fremdkörper oder Tröpfchen zugespielt. Fügen Sie weitere Mineralöl, wenn die Röhren nicht oder nicht in den imaging-Prozess vollständig werden.
    7. Bildgebung der Tropfen auf einem Epifluoreszenz-Mikroskop, ausgestattet mit einer motorisierten X-y-Bühne zu führen (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie ein 4 X Luft-Ziel für alle Bildgebung. Verwenden Sie für die Fluoreszenz-Bildgebung eine 130 W Quecksilber Dampf kurz Bogenlampe Fluoreszenz Lichtquelle zur Beleuchtung und einen GFP-Filter gesetzt (Erregung 482/35 nm und Emission 514/LP nm) sowie ein mCherry-Filter setzen (Erregung 562/40 nm und Emission 641/75 nm) für die Bildgebung GFP-NLS und securin mCherry Signale.
    8. Time-Lapse Videos aufnehmen in das Hellfeld und mehrere Fluoreszenz Kanäle alle 6 bis 9 Minuten, bis die Tropfen ihre Aktivität verlieren.

4. Bild-Verarbeitung und Datenanalyse

  1. Segmentierung und Verfolgung von Tröpfchen
    1. Aufgezeichnete Daten in das Format "TIF" oder ".oif" in Bildanalyse-Software importieren (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Segmentieren Sie einzelne Tröpfchen mit dem Hellfeld-Kanal. Das Hellfeld-Bild zeigen Tröpfchen als helle Kreise mit dunklen Grenzen. Schnittstellenüberwachung auf das Bild anwenden. Jeder Tropfen fügen Sie eine Tracking-Oberfläche durch tuning die Schwelle zwischen dunklen und hellen Pixel, so dass jede Fläche den gesamten Bereich der entsprechenden Tropfen deckt hinzu.
    3. Verfolgen Sie die Segmente automatisch zwischen angrenzenden Frames mit dem autoregressiven Bewegung Algorithmus. Optimieren der akzeptabel Reisen Maximalabstand eines Tropfens zwischen zwei benachbarten Frames kleiner als der Radius der meisten Tröpfchen, kleine Tröpfchen genau zu verfolgen.
    4. Eine Sichtkontrolle alle Titel über das gesamte Video, falsche Segmentierungen erkennen dieses Segment der leere Raum zwischen Tröpfchen anstatt tatsächliche Tröpfchen. Löschen Sie falsche Titel manuell.
    5. Segment und Track Hintergrundbereich ohne irgendwelche Tröpfchen, die Hintergrund-Fluoreszenz-Intensität zu erhalten. Verbesserung des Signal-Rausch, subtrahieren Sie hintergrundintensität aus der Fluoreszenzintensität von Tröpfchen bei jedem Zeitrahmen.
    6. Gemessenen Parameter für jede Spur im Laufe der Zeit, einschließlich der Mittelwert und die Standardabweichung der Fluoreszenzintensität und Tröpfchen in ".csv" Dateien zu exportieren.
  2. Datenanalyse der Tröpfchen Größe und Schwingung
    1. Laden Sie die ".csv" Dateien in R Grundstücke der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit für jede Droplet erstellen. Rekord Droplet-ID in eine Datei "CSV".
    2. Importieren Sie aus der Analyse-Software und die ".csv" Datei mit einer Liste von Tröpfchen ID in Matlab exportiert ".csv"-Dateien und speichern Sie als ".mat" Dateien für weitere Datenanalyse.
    3. Berechnen Sie das Volumen eines komprimierten Tropfens basierend auf den exportierten Tröpfchen Bereichsinformationen nach Segmentierung und die Höhe des Glases19Kammer. Verwenden Sie das Volumen, um den Radius der Tröpfchen als Kugel berechnen.
    4. Extrahieren Sie die Zeitpunkte der Höhen und tiefen mit Spitze/Trog Erkennungsalgorithmus. Durchführen Sie manuelle Korrekturen, auf die Position der Maxima und Minima um sicherzustellen, dass sie genau ermittelt werden.
    5. Um den Zellzyklus Zeitraum zu berechnen, berechnen Sie die Intervallzeit zwischen zwei benachbarten Gipfeln. Nehmen Sie den Durchschnitt aller Intervalle für jedes Tröpfchen als der Zellzyklus Zeit.

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Representative Results

In Abbildung 2zeigen wir, dass dieses Protokoll mitotische Schwingungen in einfache, atomwaffenfreien Zellen sowie komplizierte Zellen mit Kernen produziert, wo der Oszillator den zyklischen Wechsel von Kernen Bildung und Verformung treibt. Die Kerne frei Tröpfchen erzeugen mitotische Schwingungen bis zu 30 ungedämpften Zyklen über die Zeitspanne von 92 Stunden, wie durch den periodischen Synthese und Abbau von einem Fluoreszenz-Reporter securin-mCherry (Abbildung 2A). SecurIn ist ein Substrat aus der Anaphase Förderung komplexer APC/C. Der Abbau der securin mCherry während Anaphase zeigt somit die Aktivität des APC/C.

Um die Fähigkeit der mitotischen Oszillator nachgeschaltete mitotische Veranstaltungen fahren zu untersuchen, lieferten wir zusätzlich Demembranated Spermien Chromatin, gereinigten grün fluoreszierendes Protein-nuklearen Lokalisierung Signal (GFP-NLS) und Hoechst 33342 Farbstoffe in den zytoplasmatischen Extrakte. Abbildung 2 b zeigt den autonomen Wechsel von unterschiedlichen Zellzyklus Phasen, Interphase (blaue Balken) und Mitose (roter Balken), in dem die Änderungen der nuklearen Morphologie von der selbsttragenden mitotischen Oszillator angetrieben werden. Alle mitotischen Ereignisse, d. h. die Chromosom-enttauung und Kondensation berichtet von Hoechst 33342 (Abb. 2 b, erste Zeile), die nukleare Bildung und Kernhülle Aufschlüsselung nach GLP-NLS (Abb. 2 b, zweite Zeile) und die Aktivität der der Zellzyklus Oszillator durch die Synthese und Abbau von securin mCherry (Abb. 2 b, dritte Reihe), fiel mit einander. Bilder wurden mittels Zeitraffer Mehrkanal Fluoreszenzmikroskop erhoben. Unsere experimentellen Ergebnisse zeigen, dass das rekonstruierte Zellzyklus-System in der Lage eine mitotische Oszillator Cdk1 und APC/C, die eine Reihe von nachgelagerten Veranstaltungen einschließlich der Kernhülle Aufschlüsselung und Reformation fahren kann ist, zu rekonstruieren und Chromosom Morphologie ändern.

Abbildung 3 zeigt die Schwingungen durch die mittlere Fluoreszenzintensität der securin mCherry angegeben, vor und nach dem Entfernen von Bildrauschen. Höhen und tiefen wurde deutlicher, nach dem Entfernen von Hintergrundgeräuschen, vor allem für die ersten beiden Schwingungen, darauf hinweist, dass die Rauschunterdrückung Signal-Rausch für weitere Analysen zur Verbesserung beitragen kann.

Figure 1
Abbildung 1: Experimentelle Verfahren zur Erzeugung von Tröpfchen basierenden mitotischen Zellen. A. zytoplasmatischen Extrakte werden durch Ultra-Zentrifugation gesammelt. B. die Extrakte werden mit mehreren Komponenten zum Zwecke der Neuaufbau und Berichterstattung mitotische Schwingungen geliefert. Eine bewegende-Methode werden die Extrakte und Tensid-Öl gemischt, um Tröpfchen erzeugen. C. Tröpfchen sind in einem Trichloro (1 H, 1 H, 2 H, 2 H-Perfluorooctyl) Silan beschichteten Rohr geladen und dann durch ein Epi-Fluoreszenz-Mikroskop abgebildet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Die Erkennung des Zellzyklus Dynamics mit fluoreszierenden Reporter. A. den zeitlichen Verlauf der mittleren securin mCherry Fluoreszenzintensität der ausgewählten Tropfen, 30 ungedämpfte Schwingungen über einen Verlauf von 92 Stunden angibt. Die einfügen-Abbildung zeigt die fluoreszenzbild mit der ausgewählten Tropfen umrahmt von weißen gestrichelten Kreis. Der Maßstab ist 100 µm. B. Zeitreihen von Momentaufnahmen eines Tropfens in Fluoreszenz-Kanäle (drei Zeilen) und Hellfeld (letzte Zeile). Die zyklische Progression der Zellzyklus-Uhr und die nachgeschalteten mitotische Prozesse sind gleichzeitig durch mehrere fluoreszierende Reportern verfolgt. Die Anaphase Substrat securin-mCherry zeigt die Aktivität des Reglers Uhr APC/C, der Hoechst-Fleck kennzeichnet chromosomalen Morphologie Änderungen und die GFP-NLS Kernhülle Pannen und Reformationen. Nukleare Umschläge (hervorgehoben durch weiße Pfeile) sind auch im Hellfeld Bilder nachweisbar, passend die Lokalisierung von GFP-NLS angegeben Kerne. Der Maßstab ist 50 µm. Interphase und mitotischen Phase werden jeweils durch den blauen Balken und roten Balken über den Bildern bezeichnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Hintergrund-Subtraktion für die mittlere Fluoreszenzintensität von securin mCherry. A. die Oszillation zeitlichen Verlauf vor dem Hintergrund entfernen von Bildrauschen. B. die Oszillation zeitlichen Verlauf nach Entfernen von Bildrauschen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Wir haben einer neuartigen Methode zur Entwicklung eines künstlichen Zelle Hochdurchsatz-Systems, ermöglicht in Vitro Rekonstitution und langfristige Verfolgung von selbsttragenden Zellzyklus Schwingungen auf der Ebene der einzelligen vorgelegt. Es gibt mehrere wichtige Schritte, mit denen diese Methode erfolgreich. Erste, frisch gepresste Xenopus Eiern mit einer guten Qualität verglichen mit gelegten Eier, tendenziell Extrakte mit länger anhaltende Schwingung Aktivität zu produzieren. Zweitens ist die Kapselung von Extrakten innerhalb der Tensid-stabilisierten Mikroumgebungen entscheidend für die Oszillation Aktivität zu erhalten. Dritte, Inkubation der Öltröpfchen in einem dünnen Schlauch Grenzen die Tröpfchen in einer einzigen Schicht, Bildverarbeitung und langfristige Verfolgung erleichtert. Viertens: hilft Beschichtung der inneren Rohrwand mit Silan Trichloro (1 H, 1 H, 2 H, 2 H-Perfluorooctyl) als Anti-Adhäsiv die Oberflächenenergie zu senken die Extrakt-Aktivität zu erhalten. Fünftens würde Abdichtung der Rohre mit Öl Tröpfchen verhindern. Die Öldichtungen Methode kann auch verhindern, dass Verdunstung und weiter bewahren die Extrakt-Aktivität. Die Erfolgsrate von in-vitro- Rekonstruktion der robuste Schwingungen in Tröpfchen und die Genauigkeit der Segmentierung und Verfolgung dieser Tröpfchen in einer langfristigen verbessern zusammen.

Mikroemulsion Tröpfchen erzeugen, haben wir beide eine einfach aufschütteln Methode, ähnlich wie ein paar andere Studien29,30,31, sowie die häufig verwendeten Mikrofluidik Techniken19, eingesetzt. 20 (Daten nicht gezeigt). Beide Methoden konnten erfolgreich Mikroemulsionen Hochdurchsatz-zu generieren. Eine Einschränkung der Vortexen Methode zugeordnet ist, dass die Tropfengröße nicht einheitlich geregelt ist. Für Studien, die eine klar definierte Größe mit minimierten Größe Variante benötigen, sollten zur besseren Steuerung der tröpfchengrößen Mikrofluidik Techniken verwendet werden. Hier haben wir die Vortexen Methode gegenüber der Mikrofluidik-Methode aus zwei Gründen gewählt. Erstens hat es einfache und leicht zu befolgende Verfahren, die Labors ohne Zugang zu mikrofluidischen Techniken oder Nanofabrikation Einrichtungen diese Methode einfach anpassen lassen würde. Zweitens ist das aufschütteln Verfahren effizienter und wirtschaftlicher für die Untersuchung von größenabhängige Verhaltensweisen des Oszillators. Es kann eine weite Verbreitung von tröpfchengrößen erzeugen, mit Radien, variierend von mehreren Mikrometern bis zu 300 Mikrometer, während die mikrofluidischen Technik nur eine enge Verteilung zentriert auf eine vordefinierte Größe erzeugen kann. Das Spektrum der tröpfchengrößen erzeugt mit dieser Methode entspricht den unterschiedlichsten Zellgrößen infolge der charakteristischen reduktive Zellteilungen in der Spaltung des frühen Embryos wie Xenopus und Zebrafisch.

Das vorliegende Verfahren hat die Nachhaltigkeit der Schwingungen und den Durchsatz der Analyse von komplexen Uhr Dynamik, im Vergleich mit bisherigen Verfahren der biologischen Oszillatoren in gut durchmischten Masse Lösung8Neuaufbau wesentlich verbessert, 32, die dazu neigen, schnell zu produzieren gedämpfte Schwingungen. Wir haben gezeigt, dass diese Methode sich deutlich die Lebensdauer der Schwingungen von ein paar Zyklen in loser Schüttung Reaktion8 über 30 Zyklen in der Mikroumgebung von Tröpfchen (Abbildung 2A verbessert hat). Darüber hinaus Bulk Reaktionen fehlt die Ähnlichkeit zu den tatsächlichen Zellengröße und können nicht rekapitulieren die räumliche Organisation durch funktionale Aufteilung in realen Zellen erreicht. Diese Einschränkungen der Masse Reaktionen zu überwinden, bietet unsere künstlichen Zellsystem eine unverzichtbare Plattform für die Untersuchung von schwierigen Fragen wie die zelluläre Heterogenität und die scnd Oszillatoren, die sonst unmöglich sind zu erkunden.

Darüber hinaus bietet diese Methode Flexibilität in den Grad der Komplexität, die Zellen aufgebaut werden können. Zur Vermeidung von Störungen der komplizierten nuklearen Dynamik können wir ein minimal, nur cytoplasmatische Zellzyklus-System wiederherzustellen, die keine Kerne enthält. Dieser einfache und nur cytoplasmatische Oszillator Exponate selbsttragenden Schwingungen deutlich besser als einige bestehende synthetische Oszillatoren. Durch Versorgung Spermien Chromatin, können wir auch komplexere Zellen mit Kernen rekonstruieren, die zwischen Selbstmontage in Interphase und nukleare Verformung bei der mitotischen Phase in einer rhythmischen Weise abwechseln. Die Aktivität der mitotischen Oszillator sowie die nachgeschalteten nukleare Ereignisse kann gleichzeitig erfolgen durch Multi-Channel-Fluoreszenz-Bildgebung und einzellige Tracking gemessen.

Die Methode ermöglicht auch ein hohes Maß an Manipulation in Tröpfchen Größe und Zellzyklus Geschwindigkeit. Die Bereich Technik ermöglicht Erstellung von Tröpfchen mit Radien in einem breiten Spektrum, das das Studium der Zellengröße abhängige Verhalten der Zelle Zyklen profitieren. Darüber hinaus kann die Zellzyklus Geschwindigkeit moduliert werden, durch die Bereitstellung unterschiedlicher Konzentrationen von cyclin B1 mRNAs33, die uns erlauben würde, die Einstellbarkeit Funktion der Zellzyklus Uhr zu untersuchen.

Mit diesen Vorteilen wird der in-vitro- rekonstruiert Zellzyklus Plattform, Visualisierung, Manipulation und Analyse der einzelligen Dynamik, wahrscheinlich ebnen den Weg für neue Einblicke in die komplizierteren stochastischen Verhalten der Zelle Zyklus-Uhr. Die Methode möglicherweise auch verallgemeinerbare zu den in-vitro- Studien der anderen Oszillatoren, die traditionell auf Masse Reaktionen beruhen.

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Disclosures

Wir haben nichts zu veröffentlichen.

Acknowledgments

Wir danken Madeleine Lu für den Bau von securin mCherry Plasmid, Runde Mann Lee, Kenneth Ho und Allen P Liu für Diskussionen über Tröpfchen-Generation, Jeremy B. Chang und James E. Ferrell Jr für die Bereitstellung, GFP-NLS zu konstruieren. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation unterstützt (frühe Karriere Grant #1553031), die National Institutes of Health (MIRA #GM119688) und ein Forschungsstipendium Sloan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

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References

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Biochemie Ausgabe 139 mitotischen Zellzyklus tragendes selbst Schwingungen Xenopus Laevis Radfahren zellfreie Extrakte Time-Lapse Fluoreszenz-Mikroskopie in Vitro einzellige Analyse künstliche Zellen Mikroemulsion
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Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

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