Summary
달걀 추출 물 물에서 기름 microemulsions에서 Xenopus laevis 의 캡슐화 하 여 방법을 생체 외에서 자기 지속적인된 mitotic 진동 단일 세포 수준에서의 세대를 위한 선물이.
Abstract
단일 셀 수준에서 진동의 실시간 측정 생물 시계의 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 대량 추출 Xenopus laevis 계란에서 준비는 되어 있지만 생화학 네트워크 기본 세포 주기 진행을 해 부에 강력한, 그들의 앙상블 평균 측정 일반적으로 이끌어 각에 불구 하 고 감쇠 진동 지속 되는 개별 발진기 시끄러운 생물 학적 시스템에서 개별 발진기 간의 완벽 한 동기화의 어려움 때문입니다. 검색 하려면 발진기의 단일 셀 역학, 우리 셀 같은 구획 Xenopus laevis 계란의 자전거 세포질 추출 물을 캡슐화에 mitotic 사이클을 다시 구성할 수 있는 물방울 기반 인공 세포 시스템을 개발. 이러한 간단한 세포질 전용 셀 30 사이클에 대 한 지속적인된 진동 전시. 핵을 가진 더 복잡 한 세포를 구축, 우리는 demembranated 정자 염색 질 시스템에서 자기 조립 핵을 방 아 쇠를 추가. 우리 염색체 응축/decondensation의 정기적인 진행을 관찰 하 고 핵 실제 셀에 같은 고장/개혁, 봉투. 이 mitotic 발진기 여러 다운스트림 mitotic 이벤트를 충실 하 게 기능을 나타냅니다. 우리는 동시에 mitotic 발진기 및 다중 채널 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 방울에 다운스트림 프로세스의 역학을 추적 합니다. 양적 조작 및 가능성이 규제 기계와의 기능에 중요 한 통찰력을 제공 하는 단일 셀 해상도, mitotic 진동의 분석을 위한 높은 처리량 프레임 워크를 제공 하는 인공 세포 주기 시스템 시계입니다.
Introduction
Xenopus laevis 계란에서 준비 하는 세포질 추출 물 중 가장 주된 모델 oocytes, 급속 한 세포 주기 진행 및 재구성 하는 능력의 큰 볼륨을 주어 세포 주기의 생화학 연구에 대 한 대표 mitotic 이벤트 체 외에서1,2. 이 시스템 초기 발견과 필수적인 세포 주기 레 귤 레이 터의 기계적 특성 등 다운스트림 mitotic 프로세스 뿐 아니라 성숙 촉진 인자 (MPF) 스핀 들 어셈블리 및 염색체 분리1 같은 수 있다 ,2,3,,45,6,7,8,9,10, 11. Xenopus 달걀 추출 물 또한 세포 주기 시계8,12,,1314 의 규제 네트워크의 상세한 해 부 및 DNA 손상의 연구에 대 한 사용 되었습니다. /replication 검사점15 그리고 mitotic 스핀 들 어셈블리 검사점16,,1718.
Xenopus 달걀 추출 물을 사용 하 여 셀의 이러한 연구는 주로 되었습니다 기반으로 대량 측정 합니다. 그러나, 기존의 대량 반응 분석 실제 셀 동작, 그들의 크기 및 반응 분자의 subcellular 공간 구획에 큰 차이가 주어 모방 하지 않을 수 있습니다. 또한, mitotic 활동의 대량 측정 전에 신속 하 게 감쇠8사이클의 제한 된 수를 주는 경향이 있다. 대량 반응의 이러한 단점 추가 복잡 한 시계 동적 속성 및 기능에 대 한 이해를 제공 하기 위해 추출 시스템을 방지 했습니다. 최근 연구는 셀 무료 cytostatic 요인 체포 (CSF) Xenopus 추출 물19,20 크기 정의 셀 같은 구획에 의해 스핀 들 크기는 변조 하는 방법을 명료 하 게 도운로 캡슐화는 세포질 볼륨입니다. 그러나,이 생체 외에서 시스템은 cytostatic 요소1의 행동에 의해 감수 제 2 분열의 분열에서 체포 하 고 세포 주기의 추가 조사에 대 한 단일 셀 수준에서 장기 지속적인된 진동 수 있는 시스템 필요 발진기입니다.
공부 하 고 단일 셀 해상도 세포 주기 진동, 우리 셀 규모, 재구성 및 개별 아사카에 여러 자기 지속적인된 mitotic 진동 프로세스의 동시 측정을 위한 높은 처리량의 시스템 개발 작은 물방울. 이 상세한 비디오 프로토콜에 10에서 300 µ m에 배열 하는 크기의 microemulsions에서 자전거 Xenopus laevis 계란 세포질을 캡슐화 하 여 인공 mitotic 진동 시스템의 창조를 설명 합니다. 이 시스템에서는, 염색체 응축과 드 응축, 핵 붕괴와 개혁, 그리고 저하 고 anaphase 기판 (예: securin-mCherry이 프로토콜에서)의 합성 등 mitotic 진동 했다 성공적으로 재구성 된다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 세포 주기 재구성 및 탐지에 대 한 자료의 준비
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플라스 미드 DNA 건설과 securin mCherry의 mRNA 정화에 대 한 복제 깁슨 어셈블리
- PMTB2 벡터 백본, securin, 그리고 연쇄 반응 (PCR)을 통해 mCherry를 포함 하 여 3 개의 DNA 조각을 준비 하 고 정화21,22젤.
- fluorospectrometer을 사용 하 여 파편의 농도 측정 합니다. 백본 1에서 securin 및 mCherry 삽입과의 결합 100 ng: 1:1 분자 비율 5 µ L에 대 한 반응의 총 볼륨 조절 이온된 수를 추가 하 고.
- 1의 3 mL와 함께 등온 어셈블리 반응 버퍼 x 5의 6 mL 준비 M Tris-HCl (pH 7.5), 1 M MgCl2, 600 10 mM dNTP의 µ L, 1 M DTT의 300 µ L, 페그-8000, 1.5 g 및 나드23의 20 밀리 그램의 300 µ L.
- 1 x 등온선 어셈블리 반응 버퍼 aliquot의 15 µ L를 결합된 조각을 추가 합니다. 15 분 동안 50 ° C에서 PCR 반응 관에 반응을 품 어.
- 0.8 %agarose 젤과 전압 10 V/cm이이 파편의 어 닐 링 효율 확인의 실행을 확인 합니다.
- 생성 된 플라스 미드를 정화 하 고 elute RNase 무료 물 15 µ L를 사용 하 여. 50 순화 된 플라스 미드 DNA의 1 µ L 변환 µ L DH5α 유능한 대장균 의 세포24 미래 사용을 위해.
- 추출 및 securin mCherry DH5α 유능한 대장균 에서 DNA 플라스 미드 정화 셀.
- MRNA에 선형화 securin mCherry 플라스 미드 DNA를 transcribe 고 정화는 mRNA. MRNA의 농도가 100 ng / µ L 이며 260에서 흡 광도의 비율을 확인 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm 및 280 nm은 약 2.0.
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Demembranated Xenopus laevis 정자 DNA의 준비
참고: 머 레이 19911에서 적응.- 성인 남성 Xenopus laevis안락사25 와 4 개의 남성 개구리26,27testes를 해 부.
- 4 개구리에서 testes 동일한 100 mL 페 트리 접시에에서 놓습니다. 감기 1 x MMR 솔루션 (0.1 M NaCl, KCl 2mm, MgCl2, 2mm CaCl2, 5 mM HEPES, 0.1 m m EDTA의 1 mM) 50 mL에 세 번 testes를 씻어.
- 100 mL 페 트리 접시에 testes에서 과잉 혈액과 지방 제거 하 고 찬 핵 준비 버퍼 (일) (250 m m 자당, 15 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.5 m m spermidine trihydrochloride, 0.2 m m spermine tetrahydrochloride)에 두 번 세척.
- 핵 준비 버퍼 (일)을 제거 하 고 0.2 cm 100 mL 페 트리 접시에에서 해 날카로운가 위를 사용 하 여 보다 작은 길이 조각으로 testes를 잘라. 추가 분석에 대 한 고환에 찬 일의 8 mL를 추가 합니다.
- 사용 나일론 메시 직물 70 µ m의 기 공 크기와 testes를 필터링 하 고 15 mL 원뿔 관으로 정자 샘플을 수집. 4 ° C에서 10 분 동안 1,730 x g에서 수집된 sperms 아래로 회전 시키십시오 고 상쾌한을 제거 합니다.
- 일의 1 mL 및 50 µ L 10 mg/mL lysolecithin의 정자 세포를 공급 하 고 demembranate 정자 세포를 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- Demembranated 정자 DNA 3 %BSA 솔루션 감기 일의 10 mL로 세 번 세척.
- DNA는 hemocytometer와 정자의 밀도 측정 합니다.
- 액체 질소에 5 µ L aliquots에 정자 DNA를 동결 하 고-80 ° c.에 저장 정자 DNA의 최적 농도 약 105 핵 / µ L.
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GFP 핵 지 방화 신호 (NLS GFP)의 단백질 정화
- BL21 GST 태그 GFP NLS 플라스 미드를 변환 (DE3) 유능한 대장균 세포5.
- 1 시간 동안 37 ° C에서 항생제 없이 셀을 품 어 하 고 있는 파운드 agarose 판 100 µ g/mL 암 피 실린에 확산.
- 셀 단일 식민지로 성장 14 ~ 18 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품 어. 선택 하 고 단일 식민지 파운드 미디어 100 µ g/mL 암 피 실린의 4 mL에 접종. 12 시간 동안 37 ° C에서 세포를 흔들어.
- 압력가 YT 미디어 (Bacto tryptone의 16 g, Bacto-효 모 추출 물, NaCl의 5 g의 10 g)를 준비 하 고 37 ° c YT 미디어 열
- 100 µ g/mL 암 피 실린 preheated YT 미디어의 250 mL에 파운드 미디어에서 하룻밤 incubated 셀의 1 mL를 접종 하 고 셀 밀도 높이기 위해 2 시간 동안 흔들어.
- 측정 셀 광학 밀도 (OD) 30 분 마다 600의 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm. 0.1 m m IPTG OD 값에 도달 하면 0.1 GFP NLS 단백질 발현을 유도 하는 셀에 추가 합니다.
- 18 ° C 하룻밤 세포 성장 율을 더 나은 단백질 식 및 합성에서 세포를 흔들어.
- 5 분 동안 4 ° C에서 34,524 x g에서 셀 아래로 회전 시키십시오 고 상쾌한을 제거 합니다.
- 셀 펠 릿 40 ml PBS 버퍼 (50 mg/mL lysozyme의 800 µ L, leupeptin, pepstatin, 및 chymostatin, 10mg/mL 혼합의 13.2 µ L PMSF 0.2 M, 0.5 M EDTA의 8 µ L의 100 µ L 함께 제공 됨)의 resuspend와 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.
- 휴식 4 x 30 20 kHz의 주파수는 sonicator를 사용 하 여 셀 아래로 출시 각 쥡니다 사이 30 s 간격으로 s GFP NLS 단백질 표현.
- 깨진된 세포를 제거 하는 35 분 20000 x g에서 회전 합니다.
- 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 추출 하 여 GFP NLS 단백질 정화.
- 1.5 mL 비드 슬러리 PBS 버퍼의 15 mL로 세 번 세척 하 고 반전 4 ° C에서 4 시간 동안 구슬 lysate의 250 mL를 품 어.
- 5 분 x g 2000에서 구슬 아래로 회전 시키십시오 고 구슬에 세척 솔루션 (25mm Tris 기본, pH 7.5, 500 mM NaCl, 그리고 5 mM DTT) 10 mL를 추가 합니다. 차입 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 8.8, 20 m m 감소 티, 그리고 5mm DTT) 4 ° c.에 회전의 700 µ L에서 구슬을 품 어 50 µ L의 양으로 차입의 약 수를 수집 합니다.
- Coomassie 파란 젤28을 실행 하 여 수집 된 단백질의 농도 측정 합니다.
- 버퍼 교환을 통해 스토리지 버퍼 (20 mM HEPES, 150 m m KCl, 10% 글리세롤, pH 7.7) 3 mL와 PD-10 열을 사용 하 여 단백질 elute
2. 준비 Xenopus 사이클링의 추출
참고: 추출 준비의 전반적인 절차 그림 1A에서 보여 줍니다. 머 레이 19911에서 적응.
- 10 일 전에 알 66 IU 임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG)와 3 성숙 여성 Xenopus laevis 을 주사.
- 18 시간 추출 물 순환의 준비 전에 누워 계란을 유도 하기 위해 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (HCG)의 500 IU와 이러한 Xenopus 개구리를 주사.
- 밤새 누워 계란을 삭제 합니다. 실험 (데이터 표시 되지 않음)에 따라, 갓된 알에서 준비 된 추출 물 같은 여성 개구리에서 누워 계란에서 준비 된 추출 물 보다 더 긴 지속 활동을 생성 합니다. 각 여성 개구리의 알을 쥐 어 짜기 100 mm 페 트리 요리 0.2 x MMR 버퍼의 10 mL로 하 고 스테레오 현미경 검사.
- 동물과 식물성 극 사이의 불분명 한 경계 또는 동물 기둥 위에 불규칙 한 흰 반점이 계란의 일괄 처리를 삭제 합니다.
- 명확 하 게 차별화 된 동물과 식물성 폴란드와 계란의 균질 인구를 제시 하는 한 여성 개구리에서 계란의 배치를 선택 하 고 600 mL 비 커에 계란을 전송.
- 초과 0.2 x MMR 버퍼에 밖으로 부 어 하 고 부드럽게 추가 250 mL 100 mL 당 2g의 시스테인 (pH 7.7) 1 x 추출 버퍼 (100 m m KCl, 0.1 m m CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50mm 자당, pH 7.7) 계란.
- 손으로 계란을 적극적으로 악수 하 고 계란 시스테인의 800 mL의 총 볼륨 3 세척 3 분 또는 계란 집계까지 버퍼와 젤리 코트 제거 성공을 나타내는 비 커의 하단에 정착의 젤리 코트를 제거 합니다.
- 워시 계란 0.2 x MMR 솔루션의 1 리터와 4 시간 이상.
- 선택 하 고 흰색 유리 전송 피 펫을 사용 하 여 설정 하는 계란을 삭제.
- MMR 버퍼에 밖으로 부 어와 0.1 µ g/mL 칼슘 ionophore 활성화를 위한 0.2 x MMR 버퍼에 A23187 솔루션의 200 mL와 함께 계란을 공급.
- 유리 피 펫의 넓은 개방 면을 사용 하 여 부드럽게 계란 활성화 되 고 칼슘 ionophore 솔루션을 제거할 때까지 계란을 저 어 줍니다.
- 계란 비 커의 하단에 정착 후 활성화 효율성을 확인 하십시오. 잘 활성화 된 알 약 25%는 동물 극과 식물성 극의 75%의.
- 두 번 추출 버퍼 protease 억제제 (10 µ g/mL 각 leupeptin, pepstatin, 및 chymostatin)와 보충 x 1의 50 mL와 함께 활성화 된 계란 세척.
- 계란 0.4 mL 스냅 캡 microtube 신중 하 게 전송 하 고 다음 600 x g 30 초 60 초 동안 200 x g에서 원심 분리를 통해 달걀 팩.
- 계란을 추출의 희석을 줄이기 위해 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 위에 여분의 버퍼를 제거 합니다.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 15000 x g에 계란을 분쇄
- 짓 눌린된 달걀의 3 개의 층을 분리 하 고 중간 계층에서 원유 세포질을 유지 하는 면도날으로 튜브를 잘라.
- 새로운 ultracentrifuge 튜브, 원유 세포질을 전송 하 고 protease 억제제와 cytochalasin B 10의 µ g/mL 각 보충.
- 다시 더 세포질 노른자위 초과 지질을 제거 하 여 정화를 5 분간 4 ° C에서 15000 x g에서 원유 세포질 원심
- 계속 갓 준비 얼음에 추출 합니다.
3. 물방울 생성
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2D 유리 챔버 준비
참고: 사각형 유리 튜브 챔버 쉽게 관찰 및 데이터 수집에 대 한 수 있도록 하나의 2 차원 평면에서 방울을 제한 하는 역할을 합니다.- 잘라 2 m m x 100 µ m의 내부 차원 가진 직사각형 유리 튜브 4mm 긴 조각. 숫 돌의 날카로운 가장자리를 사용 하 여, 빛 조각으로 유리 튜브의 외부 표면에 원하는 경계 표시 다음 부드럽게 유리 튜브의 조각 끊다 에칭의 양쪽에 압력을 적용 합니다.
- 95 ° c.에 건조 목욕 인큐베이터가 열 사전 열 블록을 꺼내와 폴 리카 보 네이트 진공 desiccator에 배치.
- Trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 난방 블록에서의 30 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 배치 합니다. 열 블록을 약 5 cm에서 진공 desiccator 내부 컷 유리 튜브를 하다.
- 진공 펌프는 desiccator를 연결 합니다. 원하는 진공 수준에 도달 하는 1 분 동안 펌프를 켭니다 다음 유리 튜브의 내부 벽 코트 trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 란 증기 하는 desiccator 인감 3 방향 밸브를 닫습니다. 이 방울을 안정화에 대 한 소수 성 환경을 만들 것입니다.
- 하룻밤 코팅 desiccator 내부 유리 튜브를 둡니다. 튜브 사용 다음 날을 위해 준비 될 것입니다.
-
작은 물방울 생성 및 이미징
참고: 작은 물방울을 생성 하 고 이미징 절차는 그림 1B 및 1 c.에서 설명- 10 ng / µ L을 2 단계에서 준비 된 추출 물 공급 securin mCherry mRNA 간단한 세포질 전용 세포 주기 실험에 대 한. 또는, demembranated 정자 염색 질 (추출의 µ L 당 250)와 전원 추출, 10 µ M GFP NLS 단백질, 그리고 10 ng / µ L securin mCherry mRNA 정기적인 핵 형태학을 전시 하는 작은 물방울을 만들을 변경 합니다.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 추출의 믹스 20 µ L 재조합 단백질 이나 mRNA와 함께 제공 2 %perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜의 200 µ L (PFPE-PEG) fluorosurfactant HFE7500 불 기름에.
- 와 동 믹서를 사용 하 여 방울을 생성 합니다. 방울 크기의 범위 소용돌이 속도 및 기간에 의해 변조 될 수 있습니다. 만들 방울 반지름 50에서 200 µ m에 이르기까지, 56 x g (4.9 m m의 반경으로 3200 rpm)에서 소용돌이 속도 설정 하 고 부드럽게 눌러 추출 포함 하는 microcentrifuge 튜브 및 계면 활성 제 혼합물 믹서에 3.5 초에 대 한. 시각적으로 작은 물방울은 크기가 균일 경우 검사 합니다.
- 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 PCR 관으로 가기 고 PFPE 못 계면의 동일한 볼륨에 떠 있는 물방울을 전송. 유리 튜브 1.5 mL microcentrifuge와 대기 물방울 레이어로 단계에서 준비 하는 방울 튜브의 약 75% 가득 튜브 완전히 채워집니다 때까지 계면 활성 제 층으로 튜브를 밀어 때까지 찍어. 드롭릿 밀도 낮은과 밀로 인 한 중복 또는 모양 왜곡 없이 챔버 내부에 한 층을 형성 방울 허용 됩니다.
- 미네랄 오일 40 m m의 직경을 가진 유리 하단 접시를 채우십시오. 부드럽게 좋은 트위터를 사용 하 여 내려 그들을 추진 하 여 오일에서 방울 채워진 튜브를 담가.
- 후 모든 샘플, 유리를 사용 하 여 표시 모든 파편을 제거 하는 플라스틱 또는 방울을 유출. 더 많은 미네랄 오일 추가 튜브 또는 이미징 프로세스에 완전히 몰입 될 것입니다.
- 자동화 한 x-y 무대를 갖춘 epifluorescence 현미경에 방울의 이미지를 실시 ( 재료의 표참조). 4 X 어 목표를 사용 하 여 모든 이미지에 대 한. 형광 이미징, 형광 조명, 광원 및 GFP 필터 (여기 482/35 nm 및 방출 514/LP nm)를 설정 하 고 mCherry 필터 (여기 562/40 nm 및 방출 641/75 nm) 이미징 130 W 수은 증기 짧은 아크 램프를 사용 GFP NLS 및 securin mCherry 신호입니다.
- 밝은 분야 및 여러 형광 채널 방울 그들의 활동을 잃을 때까지 6-9 분 마다 기록 시간 경과 비디오.
4. 이미지 프로세싱 및 데이터 분석
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세분화와 방울의 추적
- 이미지 분석 소프트웨어 ".tif" 또는 ".oif"의 형식으로 기록된 데이터를 가져오기 ( 재료의 표참조).
- 밝은 필드 채널을 사용 하 여 단일 방울 세그먼트. 밝은 분야 이미지 어두운 경계와 밝은 원으로 물방울 표시 됩니다. 이미지에 임계 처리를 적용 합니다. 각 표면 해당 물방울의 전체 면적을 어둡고 밝은 픽셀 사이의 임계값을 조정 하 여 추적 표면 각 방울을 추가 합니다.
- 자동으로 자동 회귀 모션 알고리즘을 사용 하 여 인접 프레임 사이의 세그먼트를 추적 합니다. 정확 하 게 추적 하는 작은 작은 물방울을 대부분 방울의 반지름 보다 작아야 두 인접 프레임 사이 작은 물방울의 허용 최대 여행 거리를 조정 합니다.
- 시각적으로 모든 잘못 된 세그먼트를 검색 하는 전체 비디오 세그먼트 빈 공간 간의 추적 대신 실제 방울 방울을 확인 합니다. 수동으로 잘못 된 트랙을 삭제 합니다.
- 배경 형광 강도를 한 방울 없이 세그먼트 및 트랙 배경 영역입니다. 신호 노이즈를 개선 하기 위해, 각 시간 프레임에서 물방울의 형광 강도에서 배경 강도를 뺍니다.
- 시간이 지나면서, 평균 및 표준 편차 형광 강도 및 드롭릿 지역을 포함 하 여 ".csv" 파일로 각 트랙에 대 한 측정 된 매개 변수를 내보냅니다.
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방울 크기와 진동의 데이터 분석
- 각 작은 물방울에 대 한 시간이 지나면서 형광 강도 플롯 하려면 R로 ".csv" 파일을 로드 합니다. ".Csv" 파일로 기록 방울 ID입니다.
- Matlab으로 분석 소프트웨어와 방울 ID의 목록이 ".csv" 파일에서 내보낸 ".csv" 파일을 가져올 하 고 추가 데이터 분석을 위해 ".mat" 파일로 저장 합니다.
- 세분화와 유리의 높이 챔버19후 내보낸된 드롭릿 지역 정보에 따라 압축 된 물방울의 볼륨을 계산 합니다. 볼륨을 사용 하 여 구체로 작은 물방울의 반지름을 계산.
- 시간 지점의 봉우리와 골짜기 피크/물마루 탐지 알고리즘을 사용 하 여 압축을 풉니다. 봉우리와 골짜기 그들은 정확 하 게 감지 되도록의 위치에 수동 수정 수행 합니다.
- 세포 주기 기간을 계산 하기 위해 두 개의 인접 한 봉우리 사이의 간격 시간을 계산 합니다. 그것의 세포 주기 기간으로 각 방울에 대 한 모든 간격의 평균을 가져가 라.
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Representative Results
그림 2, 우리는이 프로토콜 모두 간단 하 고, 핵 없는 세포로 핵, 복잡 한 셀 어디 발진기 핵 형성과 변형의 주기적 교체 드라이브 mitotic 진동 생산 표시 됩니다. 핵 없는 물방울 생성 mitotic 진동 최대 30 undamped 사이클에 92 시간의 기간 동안 정기적인 합성 한 형광 기자 securin-mCherry (그림 2A)의 저하에 의해 표시 된 대로. 복잡 한 APC/c. 홍보 anaphase의 기판은 securin Anaphase 동안 securin mCherry의 저하는 따라서 APC/c.의 활동을 나타냅니다.
다운스트림 mitotic 이벤트를 mitotic 발진기의 능력 검사, 우리 또한 공급 demembranated 정자 염색 질, 순화 된 녹색 형광 단백질-핵 지 방화 신호 (NLS GFP), 그리고는 세포질에 Hoechst 33342 염료 추출합니다. 그림 2B 뚜렷한 세포 주기 단계, 핵 형태학의 변화는 자기 지속적인된 mitotic 발진기를 힘입어 interphase (파란색 막대)와 유사 분열 (빨간색 막대)의 자치 교체를 보여줍니다. 즉, 염색체 decondensation 및 응축 모든 mitotic 이벤트 보고 Hoechst 33342 (그림 2B, 첫 번째 행), 핵 형성 및 GFP NLS (그림 2B, 두 번째 행) 하 여 핵 붕괴의 활동 합성 securin mCherry (그림 2B, 3 행)의 저하에 의해 세포 주기 발진기 서로 일치 합니다. 이미지는 시간 경과 다채널 형광 현미경을 사용 하 여 수집 되었다. 우리의 실험 결과 입증 복원된 셀-사이클 시스템 Cdk1 및 송출/C, 핵 붕괴와 개혁 등 다운스트림 이벤트의 시리즈를 운전할 수, mitotic 발진기를 재구성 할 수 있고 염색체 형태 변화입니다.
그림 3 진동 소음 제거 전후 securin mCherry의 평균 형광 강도 표시를 보여준다. 봉우리와 골짜기 특히 처음 두 진동, 소음 제거 추가 분석을 위해 소음에 신호를 향상 시킬 수 있습니다 나타내는 대 한 배경 잡음을 제거한 후 더 발음 되었다.
그림 1입니다. 드롭릿 기반 mitotic 세포 생성에 대 한 실험 절차. A. 세포질 추출 울트라 원심 분리를 통해 수집 됩니다. B. 추출 재구성 및 보고 mitotic 진동 위해 여러 구성 요소와 함께 제공 됩니다. Vortexing 메서드를 사용 하 여 추출 물과 계면 활성 제 석유는 작은 물방울을 생성 하기 위해 혼합 됩니다. C. 방울 trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 란 코팅 된 튜브에 로드 되며 다음 피 형광 현미경을 통해 몇 군데. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 세포 주기 역학 형광 기자를 사용 하 여 감지. A. 30 undamped 진동 92 시간의 과정을 통해 나타내는 선택 된 물방울의 평균 securin mCherry 형광 강도의 시간 코스. 삽입 그림 흰색 점선 원으로 프레임 선택한 물방울과 형광 이미지를 보여 줍니다. 눈금 막대는 100 µ m. b. 형광 채널 (3 행) 및 밝은 분야 (마지막 행) 물방울의 스냅샷의 시간 시리즈. 세포 주기 클록 및 다운스트림 mitotic 프로세스의 주기적 진행 동시에 여러 명의 형광 성 취재 원에 의해 추적 됩니다. Anaphase 기판 securin mCherry 시계 레 귤 레이 터 APC/C의 활동을 나타냅니다, 그리고 Hoescht 얼룩 염색체 형태 변경, 나타내고 GFP NLS 핵 고장 및 reformations를 나타냅니다. 표시 일치 하는 GFP NLS의 지역화 핵 봉투 (흰색 화살표에 의해 강조)는 또한 밝은 필드 이미지에서 감지, 핵. 눈금 막대는 50 µ m. Interphase 고 mitotic 단계 각각 이미지 위에 빨간색 바 파란색 막대에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 배경 securin mCherry의 평균 형광 강도 대 한 빼기. A. 발진 시간 과정 배경 잡음 제거 하기 전에. B. 발진 시간 과정 잡음 제거 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 그 수에 체 외 재구성 및 단일 세포 수준에서 자체 지속적인된 세포 주기 진동의 장기 추적 높은 처리량 인공 세포 시스템을 개발 하기 위한 새로운 방법을 제시 했습니다. 이 메서드를 성공 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 좋은 품질을 가진 첫 번째, 갓 Xenopus 달걀 누워 계란에 비해, 오래 지속 진동 활동 추출 물을 생산 하는 경향이 있다. 둘째, 계면 안정화 microenvironments에서 추출 물 캡슐은 진동 활동을 유지 하기 위해 중요 합니다. 얇은 튜브 굴레 쉽게 이미지 프로세싱 및 장기 추적을 위한 단일 레이어 내에서 물방울에 기름 방울의 세 번째, 보육 넷째, 낮은 표면 에너지를 반대로 접착제로 trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 란과 튜브 내벽을 코팅 추출 활동을 유지 도움이 됩니다. 다섯째, 오일 튜브 씰링 방울 흐름을 방지할 것. 오일 밀봉 방법 또한 증발을 방지 하 고 더 추출 활동을 보존 수 있습니다. 이 함께 방울에 강력한 진동의 생체 외에서 개조와 세분화의 정확도 장기에 이러한 방울의 추적의 성공률을 향상 시킵니다.
우리 모두는 간단한 vortexing 방법, 몇 가지 다른 연구29,,3031로 더 일반적으로 사용 되는 마이크로 기술19, 와 유사한 고용 아사카 방울을 생성 하려면 20 (데이터 표시 되지 않음)입니다. 두 방법 모두 성공적으로 microemulsions을 생성 하는 높은 처리량 방법으로 할 수 있었다. Vortexing 메서드와 관련 된 한 가지 한계는 작은 물방울 크기 균일 하 게 제어 하지는. 최소화 된 크기 변형을 잘 정의 된 크기를 필요로 하는 연구에 대 한 작은 물방울 크기의 더 나은 제어를 위한 마이크로 기술을 사용 해야 합니다. 여기, 우리는 두 가지 이유로 미세 메서드를 통해 vortexing 메서드를 선택 했습니다. 첫째, 그것은 간단 하 고 따라 하기 쉬운 절차, 미세 기술 또는이 메서드를 쉽게 적응 nanofabrication 시설에 액세스 하지 않고 실험실 시키는데 있다. 둘째, vortexing 메서드는 보다 효율적이 고 조사는 발진기의 크기-종속 동작에 대 한 경제. 그것은 반지름의 몇 마이크로미터에서 다양 한 최대 300 마이크로미터, 미세 기술만 미리 정의 된 크기를 중심으로 하는 좁은 분포를 생성할 수와 물방울 크기의 넓은 분포를 생성할 수 있습니다. 이 방법으로 생성 된 작은 물방울 크기의 범위 Xenopus zebrafish 등 초기 배아의 분열 단계에 특성 감소 셀 부문에서 발생 하는 셀 크기의 넓은 범위와 일치 합니다.
현재 방법은 크게 진동의 지속 가능성과 잘 혼합된 대량 솔루션8, 생물학 발진기 재구성의 기존 방법에 비해 복잡 한 시계 역학 분석의 처리량을 개선 했습니다. 32, 신속 하 게 생산 하는 경향이 감쇠 진동. 우리는이 방법의 물방울 (그림 2A)는 microenvironment에 30 주기를 대량 반응8 에 몇 사이클에서 진동의 수명을 크게 개선 했습니다 나타났습니다. 또한, 대량 반응 실제 셀 크기에 유사성 부족과 실제 셀에 기능 구획에 의해 달성 공간 조직 정리 수 없습니다. 대량 반응의 이러한 한계를 극복 하는 데, 우리의 인공 셀 시스템은 필수 플랫폼을 세포질이 고 그렇지 않으면 가능 하지 않은 발진기의 stochasticity 같은 도전적인 질문을 조사 찾아보기.
또한,이 메서드는 셀 만들어질 수 있다 복잡성의 정도에 유연성을 제공 합니다. 복잡 한 핵 역학에서 어떤 방해를 피하기 위해, 없는 핵을 포함 하는 최소한의 세포질 전용 세포 주기 시스템에 다시 구성할 수 있습니다. 이 간단 하 고 세포질 발진기 자체 지속적인된 진동 일부 기존 합성 발진기 보다 훨씬 더 전시 한다. 정자 염색 질을 제공 하 여 우리 또한 핵 사이 대체 자기 집합 interphase와 mitotic 단계에서 핵 변형 리듬 방식에서으로 더 복잡 한 셀을 다시 구성할 수 있습니다. 다운스트림 핵 이벤트 mitotic 발진기의 활동 동시 다중 채널 형광 이미징 및 단일 셀 추적에 의해 측정 될 수 있습니다.
메서드는 또한 작은 물방울 크기와 세포 주기 속도에서 조작의 높은 수준의 수 있습니다. Vortexing 기술은 다양 한 셀의 셀 크기 의존 행동의 연구 혜택에 반지름으로 방울의 생성에 대 한 수 있습니다. 또한, 세포 주기 속도 B1 mRNAs33, 세포 주기 시계의 tunability 함수 공부를 시키는데 의 다양 한 농도 제공 하 여 변조 될 수 있습니다.
이러한 장점으로 생체 외에서 재건 세포 주기 플랫폼, 시각화, 조작, 및 단일 셀 역학의 분석 길을 것 입 가능성이 더 복잡 한 확률 동작에 새로운 통찰력에 대 한 셀의 클록 주기. 메서드는 전통적으로 대량 반응에 의존 하는 다른 발진기의 생체 외에서 연구를 일반화할 수도 있습니다.
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Disclosures
공개 하는 것이 없다.
Acknowledgments
우리 감사 마들렌 루 securin mCherry 플라스 미드, 무릎 남자 리, 케네스 호 및 물방울 생성에 대 한 토론을 위한 알 렌 P Liu, 제레미 B. 장과 제임스 E. Ferrell Jr GFP NLS 구성 제공 하기 위한 건설. 이 작품은 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다 (이른 경력 그랜트 #1553031), 건강의 국가 학회 (미 라 #GM119688), 및 슬론 연구 장학금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher (Ambion) | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
References
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