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Biochemistry

Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Se presenta un método para la generación de en vitro autosostenido mitotic las oscilaciones en el nivel unicelular encapsulando extractos de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones agua en aceite.

Abstract

Medición en tiempo real de las oscilaciones en el nivel unicelular es importante descubrir los mecanismos de los relojes biológicos. Aunque extractos bulto preparados de huevos de Xenopus laevis han sido poderosos en disección redes bioquímicas subyacentes a la progresión del ciclo celular, su medición promedio del conjunto por lo general conduce a una oscilación amortiguada, a pesar de cada uno cada oscilador está sostenida. Esto es debido a la dificultad de sincronización perfecta entre osciladores individuales en los sistemas biológicos ruidosos. Para recuperar la dinámica unicelular del oscilador, hemos desarrollado un sistema de célula artificial basada en gotas que puede reconstituir ciclos mitóticos en compartimentos de la célula-como encapsular ciclismo extractos citoplásmicos de los huevos de Xenopus laevis . Estas células sólo citoplasmáticas simples exhiben oscilaciones sostenidas durante más de 30 ciclos. Para construir más complicadas las células con los núcleos, agregamos demembranated la cromatina espermática para activar núcleos uno mismo-montaje en el sistema. Observamos una progresión periódica de cromosoma condensación/decondensation y núcleos envuelven descomposición/reforma, como en las células reales. Esto indica que el oscilador mitotic funcione fielmente para conducir varios eventos mitóticos aguas abajo. Simultáneamente realiza un seguimiento la dinámica del oscilador mitotic y procesos posteriores en gotas individuales utilizando microscopía de fluorescencia Time-lapse de multicanal. El sistema de ciclo celular artificial proporciona un marco de alto rendimiento para la manipulación cuantitativa y análisis de oscilaciones mitóticas con resolución unicelular, que probablemente proporciona penetraciones importantes en la maquinaria reguladora y las funciones de el reloj.

Introduction

Citoplásmicos extractos preparados a partir de huevos de Xenopus laevis representan uno de los modelos más predominantes para el estudio bioquímico de los ciclos celulares, dado el gran volumen de ovocitos, la progresión del ciclo celular rápida y la capacidad de reconstituir eventos mitóticos en vitro1,2. Este sistema ha permitido el descubrimiento inicial y caracterización mecanicista de los reguladores de ciclo celular esencial como factor promotor de maduración (MPF) así como procesos mitotic posteriores incluyendo huso Asamblea y cromosoma segregación1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Los extractos de huevos de Xenopus también se han utilizado para la disección detallada de las redes reguladoras del ciclo celular reloj8,12,13,14 y para los estudios de los daños en el ADN /Replication de control15 y huso mitotic Asamblea checkpoint16,17,18.

Estos estudios de los ciclos celulares utilizando los extractos de huevos de Xenopus se han basado principalmente en mediciones masivas. Sin embargo, ensayos de reacción a granel convencional no pueden mímico comportamientos de celular real, dados una discrepancia importante en sus dimensiones y compartimentación subcelular espacial de las moléculas de reacción. Por otra parte, mediciones masivas de actividades mitotic son propensas a dar un número limitado de ciclos antes de amortiguación rápida8. Estas desventajas de reacciones a granel han impedido que el extracto de sistema para proporcionar más comprensión de funciones y propiedades dinámicas complejas de reloj. Estudios recientes han encapsulado citostáticos sin células factor detenido (CFS) Xenopus extractos19,20 en compartimentos de celular-como definido por el tamaño, que han ayudado a dilucidar cómo tamaño de husillo es modulada por el volumen citoplásmico. Sin embargo, este sistema in vitro es detenido en metafase de meiosis II por la acción del factor citostático1, y un sistema capaz de oscilaciones sostenidas a largo plazo en el nivel unicelular es necesaria investigación adicional del ciclo celular oscilador.

Para estudiar las oscilaciones del ciclo celular con una sola célula resolución, hemos desarrollado una escala celular, sistema de alto rendimiento para la reconstitución y la medida simultánea de múltiples procesos oscilatorios mitotic autosostenidos en microemulsión individual gotas. En este detallado video protocolo, demostramos la creación del sistema de oscilación mitotic artificial encapsulando ciclismo citoplasma de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones de tamaños que van desde 10 a 300 μm. En este sistema, fueron mitotic oscilaciones como condensación del cromosoma y la condensación, ruptura de la envoltura nuclear y reforma y la degradación y síntesis de sustratos de la anafase (p. ej., securin-mCherry en este protocolo) reconstituido con éxito.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.

1. preparación de materiales para la reconstitución del ciclo celular y detección

  1. Asamblea de Gibson la clonación para la construcción de ADN de plásmido y purificación de mRNA de mCherry securin
    1. Preparar tres fragmentos de la DNA incluyendo una columna vertebral del vector pMTB2, securin y mCherry mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y gel de purificación21,22.
    2. Medir las concentraciones de fragmentos mediante un fluorospectrometer. Combinar 100 ng de troncales con securin mCherry inserciones en un 1: relación molecular 1:1 y añadir agua desionizada para ajustar el volumen total de reacción a 5 μl.
    3. Preparar 6 mL de 5 x buffer de reacción isotérmica de la Asamblea con 3 mL de 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 300 μL de 1 M de MgCl2, 600 μl de dNTP 10 mM, 300 μL de 1 M TDT, 1.5 g de PEG-8000 y 20 mg de NAD23.
    4. Añadir los fragmentos combinados a 15 μl de 1 Tampón de reacción x Asamblea isotermo alícuota. Incubar la reacción en un tubo de reacción de PCR a 50 ° C durante 15 minutos.
    5. Hacer una agarosa 0.8% gel y funcionan con una tensión de 10 V/cm para verificar la eficiencia recocida de estos fragmentos.
    6. Purificar el plásmido construido y eluir con 15 μl de agua libre de ARNasa. Transformar 1 μl del plásmido purificado ADN en 50 μl de competentes DH5α e. coli las células24 para uso futuro.
    7. Extraer y purificar el plásmido ADN de mCherry securin de los competentes DH5α e. coli las células.
    8. Transcribir el ADN del plásmido linearizado de mCherry securin en mRNA y purificar el mRNA. Utilice un espectrofotómetro para verificar que la concentración de mRNA es más de 100 ng/μl y la relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm es aproximadamente 2.0.
  2. Preparación de demembranated laevis de Xenopus espermatozoides DNA
    Nota: Adaptado de Murray 19911.
    1. Eutanasia de adultos machos Xenopus laevis25 y diseccionar los testículos de cuatro ranas macho26,27.
    2. Coloque los testículos de cuatro ranas en el mismo plato de Petri de 100 mL. Enjuague los testículos tres veces en 50 mL de solución fría 1 x MMR (2 mM KCl, 0.1 M de NaCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0.1 mM EDTA).
    3. Retire el exceso de sangre y la grasa de los testículos en un plato de petri 100 mL y lavar dos veces en tampón frío preparación nuclear (NPB) (250 mM sacarosa, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8.0, trihydrochloride espermidina de 0,5 mM, 0,2 mM tetrahydrochloride de espermina).
    4. Elimine el preparación nuclear de tampón (NPB) y trocear los testículos con longitudes inferiores a 0,2 cm con tijeras de disección agudas en un plato de Petri de 100 mL. Añada 8 mL de NPB frío a los testículos para más descomposición.
    5. Malla de nylon de uso las telas con un tamaño de 70 μm de poro para filtrar los testículos y recoja la muestra de semen en un tubo cónico de 15 mL. Desactivación de los espermatozoides recolectados a 1.730 x g durante 10 minutos a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.
    6. Fuente de las células de la esperma con 1 mL de NPB y 50 μl de 10 mg/mL lysolecithin e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos de demembranate células de la esperma.
    7. Lavar el esperma demembranated ADN con 10 mL de NPB frío con la solución de BSA 3% tres veces.
    8. Medir la densidad de espermatozoides DNA con un hemocitómetro.
    9. Congelar el esperma de ADN en 5 alícuotas μL en nitrógeno líquido y almacenar a-80 ° C. La concentración óptima de DNA de la esperma es aproximadamente 105 núcleos/μl.
  3. Purificación de proteínas de señal de localización Nuclear de GFP (GFP-NLS)
    1. Transformar el plásmido con la GST-etiqueta GFP-NLS BL21 (DE3) competente e. coli las células5.
    2. Incube las células sin antibióticos a 37 ° C por 1 h y luego en una placa de agarosa LB con ampicilina 100 de μg/mL.
    3. Incubar la placa a 37 ° C de 14 a 18 horas crecer las células en colonias individuales. Recoger e inocular las colonias individuales en 4 mL de medio LB con ampicilina 100 de μg/mL. Agitar las células a 37 ° C durante 12 horas.
    4. Preparar la media de YT esterilizado (16 g de Bacto-triptona, 10 g de extracto de Bacto-levadura, 5 g de NaCl) y el calor de la media de YT a 37 ° C.
    5. Inocular 1 mL de las células incubadas durante la noche en medio LB en 250 mL de medio de YT precalentado con 100 ampicilina μg/mL y agitar durante 2 horas para aumentar la densidad celular.
    6. Medir la densidad óptica (OD) de celular cada 30 minutos, utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Añadir 0,1 mM IPTG en células para inducir la expresión de la proteína GFP-NLS una vez que el valor de OD alcanza 0,1.
    7. Agitar las células a 18 ° C durante la noche para reducir la tasa de crecimiento de la célula y permiten la síntesis y la mejor expresión de la proteína.
    8. Desactivación de las células a 34.524 x g a 4 ° C durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
    9. Resuspender el pellet celular en 40 mL de tampón PBS (suministrado con 800 μl de lisozima de 50 mg/mL, 100 μl de PMSF 0,2 M, 13.2 μl de una mezcla de 10 mg/mL de leupeptin, pepstatin y chymostatin y 8 μl de EDTA de 0,5 M) e incubar a 4 ° C durante 20 minutos.
    10. Romper a las células utilizando un sonicador a una frecuencia de 20 kHz para 4 x 30 s, con 30 intervalos s cada sonicación para liberar expresado proteína GFP-NLS.
    11. Gira a 20.000 x g durante 35 minutos para eliminar las células rotas.
    12. Utilizar la cromatografía de afinidad para extraer y purificar la proteína GFP-NLS.
    13. Lavar la mezcla de grano de 1,5 mL tres veces con 15 mL de tampón PBS e incubar 250 mL de lisado con granos durante 4 horas a 4 ° C con la inversión.
    14. Desactivación de las cuentas a 2000 x g durante 5 min y añadir 10 mL de solución de lavado 25 mM Tris base, pH 7.5, 500 mM NaCl y 5 mM (TDT) a los granos. Incubar los granos en 700 μl de tampón de elución (50 mM Tris-HCl pH 8.8, 20 mM reducida glutatión y 5 mM DTT) con rotación de 4 ° c. Recoge una alícuota de la elución con un volumen de 50 μl.
    15. Medir la concentración de proteína recogida al ejecutar una de gel azul de Coomassie28.
    16. Eluir las proteínas utilizando PD-10 columnas con 3 mL de buffer de almacenamiento (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glicerol, pH 7.7) a través del intercambio de búfer.

2. preparación de ciclismo Xenopus extractos

Nota: El procedimiento general de preparación de los extractos se ilustra en la figura 1A. Adaptado de Murray 19911.

  1. Se inyectan tres mujer madura Xenopus laevis con IU 66 gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) 10 días antes de la puesta de huevos.
  2. Se inyectan estas ranas Xenopus con 500 UI de gonadotropina coriónica humana (HCG) para inducir la ponedora 18 horas antes de la preparación de extractos de ciclismo.
  3. Descarte de huevos durante la noche. Basado en experimentos (datos no mostrados), extractos preparados a partir de los huevos recién exprimidos generan actividades de mayor duración que extractos preparados a partir de huevos puestos desde la misma rana hembra. Apriete los huevos de cada hembra rana en platos de Petri de 100 mm que contiene 10 mL de tampón de x MMR 0,2 y examinar bajo un microscopio estéreo.
  4. Deshágase de las tandas de huevos que tienen límites confusos entre animal y vegetal postes o tienen manchas blancas irregulares sobre postes de animal.
  5. Elegir el lote de huevos de una rana hembra que presenta una población homogénea de huevos con polos de vegetal y animal claramente diferenciada y transferir los huevos en un vaso de precipitados de 600 mL.
  6. Vaciar el exceso de tampón de x MMR 0,2 y suavemente Agregar 250 mL de 2 g por 100 mL extracto de cisteína (pH 7.7) en 1 x buffer (100 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, sacarosa de 50 mM, pH 7.7) a los huevos.
  7. Agitar enérgicamente los huevos con la mano y quitar las capas de gelatina de huevos en tres lavados con un volumen total de 800 mL de cisteína de búfer durante 3 minutos o hasta que el agregado de huevos y colocan en el fondo del vaso, indicando que el retiro de capa de la jalea es exitosa.
  8. Lavado de huevos con 1 L de solución de x MMR 0.2 más de cuatro veces.
  9. Recoger y desechar huevos que utilice una pipeta de vidrio blancos.
  10. Vaciar el búfer MMR y huevos con 200 mL de ionóforo de calcio de 0.1 μg/mL solución A23187 en buffer de x MMR 0,2 para la activación de la fuente.
  11. Use el lado de la abertura de una pipeta de cristal para revolver los huevos suavemente hasta que los huevos se activan y retire la solución de ionóforo de calcio.
  12. Comprobar la eficacia de la activación después de huevos colocan abajo en la parte inferior del vaso. Huevos bien activados tienen aproximadamente el 25% del polo animal y el 75% del polo vegetal.
  13. Lavar los huevos activados dos veces con 50 mL de 1 x extracto buffer suplementado con los inhibidores de proteasa (10 μg/mL cada leupeptin, pepstatin y chymostatin).
  14. Transferir cuidadosamente huevos a un microtubo de casquillo rápido de 0,4 mL y luego empacar huevos mediante centrifugación a 200 x g durante 60 segundos y luego 600 x g durante 30 segundos.
  15. Quitar extra amortiguación en la parte superior de huevos usando un pipeta Pasteur de vidrio para reducir la dilución de los extractos.
  16. Aplastar huevos a 15.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
  17. Cortar los tubos con una cuchilla de afeitar para separar las tres capas de huevos machacadas y mantener el citoplasma crudo en la capa media.
  18. Transferir el citoplasma crudo a nuevos tubos de la ultracentrífuga y complementar con inhibidores de la proteasa y citocalasina B en 10 μg/mL de cada una.
  19. Centrifugue el citoplasma crudo otra vez a 15.000 x g a 4° C durante 5 minutos para purificar más citoplasma mediante la eliminación de la yema y el exceso de lípidos.
  20. Mantener extractos recién preparados en el hielo.

3. gota generación

  1. Preparación de la cámara de cristal 2D
    Nota: Los tubos de vidrio de rectángulo sirven como cámaras que confinan las gotitas en un solo plano de 2 dimensiones, lo que permite más fácil observación y recopilación de datos.
    1. Cortar tubos de vidrio rectangular con una dimensión interna del μm 2 mm x 100 mm 4 piezas largas. Utilice el borde afilado de una piedra de afilar, marcar los límites deseados en la superficie externa del tubo de vidrio con grabados de luz y suavemente aplique presión en ambos lados de los grabados a romper pedazos de tubos de vidrio.
    2. Precalentar una incubadora de baño seco a 95 ° C. Sacar el bloque de calefacción y colóquelo en un desecador de vacío de policarbonato.
    3. Coloque un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL conteniendo 30 μl de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silano en el bloque calefactor. Montar los tubos de vidrio de corte dentro del desecador de vacío aproximadamente a 5 cm para el bloque de calefacción.
    4. Conecte el desecador a una bomba de vacío. Encienda la bomba durante 1 minuto para alcanzar el nivel de vacío deseado, luego cierre la válvula de 3 vías para sellar el desecador y dejar que el vapor de silano de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) recubrir la pared interna de los tubos de vidrio. Esto creará un ambiente hidrofóbico para estabilizar las gotitas.
    5. Dejar los tubos de vidrio dentro del desecador para la capa durante la noche. Los tubos estarán listos para usar al día siguiente.
  2. La proyección de imagen y la generación de gotas
    Nota: Los procedimientos de generación de gotas y la proyección de imagen se ilustran en las figuras 1B y 1C.
    1. Suministro de extractos preparados en el paso 2 con 10 ng/μl mCherry securin mRNA para los experimentos simples sólo citoplasmática de ciclo celular. Por otra parte, fuente de extractos con cromatina de esperma demembranated (250 μl de extracto), proteína de GFP-NLS de 10 μm y 10 ng/μl mCherry securin mRNA para crear gotas que morfología de núcleos periódica cambia.
    2. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, mezcla 20 μl del extracto había provisto de proteína recombinante o ARNm con 200 μL de perfluoropoliéter 2%-polietilenglicol (PFPE-PEG) fluorosurfactant en HFE7500 fluorados aceite.
    3. Generar gotitas usando un mezclador de tipo vórtex. La gama de tamaños de gota puede ser modulada por la duración y la velocidad del vórtice. Para crear las gotas con radios que van desde 50 a 200 μm, ajustar la velocidad del vórtice a 56 x g (3.200 rpm con un radio de 4,9 mm) y presione suavemente el tubo de microcentrífuga con el extracto y la mezcla de surfactante en el mezclador durante 3,5 segundos. Inspeccione visualmente si las gotitas son uniformes en tamaño.
    4. Use una pipeta de 20 μl para transferir las gotitas flotando en la parte superior y un volumen igual de PFPE PEG surfactante en un tubo PCR. Sumergir el tubo de cristal preparado en el paso en la capa de gotas en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y esperar hasta que las gotas han llenado aproximadamente el 75% del tubo, luego empuje el tubo hacia abajo en la capa de surfactante hasta que el tubo esté lleno. Esto baja la densidad de la gota y permitir que las gotitas formar una sola capa dentro de la cámara sin superposición o forma de distorsión causado por el hacinamiento.
    5. Llenar un plato de fondo de cristal con un diámetro de 40 mm con aceite mineral. Sumerja los tubos llenos de gotas en aceite empujándolas suavemente hacia abajo usando una pinza fina.
    6. Después de cargar todas las muestras, uso un vaso pipeta para remover cualquier suciedad visible o gotas de filtrado. Añadir más aceite mineral si los tubos no son o no estar completamente inmerso en el proceso de proyección de imagen.
    7. Realizar la proyección de imagen de gotas en un microscopio de epifluorescencia equipado con una platina x-y motorizado (véase Tabla de materiales). Utilice un objetivo de aire X 4 para la proyección de imagen de todos. Para imágenes de fluorescencia, utilice 130 W vapor corto arco lámpara de mercurio como fuente de luz de fluorescencia para la iluminación y un filtro GFP (excitación 482/35 nm y emisión 514/LP nm) y un filtro mCherry (excitación 562/40 nm y emisión 641/75 nm) para la proyección de imagen Señales NLS GFP y mCherry securin.
    8. Grabar vídeos Time-lapse en el campo luminoso y múltiples canales de fluorescencia cada 6 a 9 minutos hasta que las gotas pierden su actividad.

4. tratamiento y análisis de datos de imágenes

  1. Segmentación y seguimiento de las gotas
    1. Importar datos en formato ".tif" o ".oif" en software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales).
    2. Segmento de gotitas individuales utilizando el canal de campo brillante. La imagen de campo claro mostrará gotitas como círculos brillantes con límites oscuros. Aplicar el umbral a la imagen. Añadir una superficie de seguimiento a cada gotita templando el umbral entre los píxeles oscuros y brillantes, para que cada superficie cubre toda el área de la gota correspondiente.
    3. Seguir automáticamente los segmentos entre fotogramas adyacentes utilizando el algoritmo de movimiento autorregresivo. Ajustar la distancia máxima aceptable de una gota entre dos marcos adyacentes sea menor que el radio de gotas más para un seguimiento preciso de pequeñas gotitas.
    4. Revise visualmente todas las pistas en todo el video entero para detectar segmentaciones incorrecto ese segmento el espacio vacío entre las gotas en lugar de gotitas reales. Elimine manualmente las pistas incorrectas.
    5. Segmento y área de fondo sin cualquier gotas para obtener la intensidad de la fluorescencia de fondo de pista. Para mejorar la señal a ruido, restar intensidad de fondo de la intensidad de fluorescencia de gotitas en cada marco de tiempo.
    6. Exportación de parámetros medidos para cada pista con el tiempo, incluyendo la media y desviación estándar de la intensidad de fluorescencia y de la zona de gota en archivos ".csv".
  2. Análisis de datos de gota tamaño y oscilación período
    1. Cargar los archivos ".csv" en R para crear parcelas de intensidad de fluorescencia con el tiempo de cada gotita. ID. gotita de registro en un archivo ".csv".
    2. Importar los archivos de ".csv" exportados desde el software de análisis y el archivo ".csv" con una lista de ID de gota en Matlab y guardar como archivos de "MAT" para su posterior análisis de datos.
    3. Calcular el volumen de una gota comprimido basado en la información de zona de gota exportados después de segmentación y la altura de vidrio cámara de19. Utilizar el volumen para calcular el radio de la gota como una esfera.
    4. Extracto de los puntos de picos y valles utilizando el algoritmo de detección de pico a través del tiempo. Realizar correcciones manuales en la posición de los picos y valles para asegurar que se detectan con precisión.
    5. Para calcular el período del ciclo celular, calcular el intervalo de tiempo entre dos picos adyacentes. Tomar el promedio de todos los intervalos para cada gotita como su período del ciclo celular.

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Representative Results

En la figura 2, mostramos que este protocolo produce oscilaciones mitóticas en células simples, libre de nucleares así como complicadas células con núcleo, donde el oscilador conduce la alternancia cíclica de la formación de núcleos y deformación. Las gotas libres de núcleos generan oscilaciones mitóticas hasta a 30 ciclos undamped sobre la duración de 92 horas, según lo indicado por el periódico síntesis y la degradación de una fluorescencia reportero securin-mCherry (figura 2A). Securin es un sustrato de la anafase promoción complejo APC/C. La degradación de mCherry securin durante anafase así indica la actividad de APC/C.

Para examinar la capacidad del oscilador mitotic para conducir eventos mitóticos aguas abajo, Además suministramos cromatina de esperma demembranated, señal de localización nuclear de la proteína fluorescente verde purificado (GFP-NLS) y colorantes Hoechst 33342 a la citoplasmática extractos. Figura 2B muestra la autónoma alternancia de fases de ciclo celular distinta, interfase (barras azules) y mitosis (barras rojas), durante el cual los cambios de la morfología nuclear son conducidos por el oscilador mitotic autosostenido. Todos los eventos de mitosis, es decir, la decondensation del cromosoma y condensación divulgado por Hoechst 33342 (figura 2B, primera fila), la nuclear formación y ruptura de la envoltura nuclear por GFP-NLS (figura 2B, segunda fila) y la actividad de el oscilador de ciclo celular por la síntesis y degradación de mCherry securin (figura 2B, tercera fila), coincidió con los demás. Se obtuvieron imágenes mediante microscopio de fluorescencia Time-lapse de multicanal. Nuestros resultados experimentales demuestran que el sistema de ciclo celular reconstruido es capaz de reconstruir un oscilador mitótico Cdk1 y APC/C, que puede conducir a una serie de eventos posteriores como la ruptura de la envoltura nuclear y la reforma, y cambio de la morfología del cromosoma.

La figura 3 muestra las oscilaciones indicadas por la intensidad de fluorescencia media de mCherry securin antes y después de eliminación de ruido. Picos y valles llegó a ser más pronunciados después de quitar el ruido de fondo, especialmente para las dos primeras oscilaciones, indicando que el retiro del ruido puede ayudar a mejorar la señal a ruido para su posterior análisis.

Figure 1
Figura 1. Procedimiento experimental para generar las células mitotic basada en gota. A. extractos citoplásmicos son recogidos mediante ultra centrifugación. B. los extractos están provistos de varios componentes con el fin de reconstituir y reporting oscilaciones mitotic. Usando un método de Vortex, los extractos y aceite surfactante se mezclan para generar las gotitas. C. gotas son cargadas en un tubo de recubrimiento silano de tricloro (1 H, 1 H, 2 H, 2 H-perfluorooctyl) y luego reflejadas a través de un microscopio de epi-fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. La detección de la dinámica del ciclo celular utilizando reporteros fluorescentes. A. el curso del tiempo la intensidad de fluorescencia media de mCherry securin de la gota seleccionada, indicando 30 undamped oscilaciones sobre un curso de 92 horas. La figura inserto muestra la imagen de fluorescencia con la gota seleccionada enmarcada por el círculo punteado blanco. La barra de escala es 100 μm. B. Serie de tiempo de instantáneas de una gota en campo brillante (la última fila) y canales de fluorescencia (filas de tres). La progresión cíclica del reloj del ciclo celular y sus procesos mitotic aguas abajo al mismo tiempo se realiza un seguimiento por varios reporteros fluorescentes. El securin-mCherry de la substrato de la anafase indica actividad del regulador reloj APC/C, la mancha de Hoescht indica cambios de la morfología cromosómica y la GFP-NLS indica reformas y averías de la envoltura nuclear. Sobres nucleares (resaltados en flechas blancas) también son detectables en las imágenes de campo claro, que empareja la localización de GFP-NLS indica núcleos. Es la barra de escala 50 μm. interfase y fase mitotic son denotadas respectivamente por las barras azules y las barras rojas por encima de las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Resta de la intensidad de fluorescencia media de mCherry securin de fondo. A. el curso del tiempo oscilación antes de eliminación de ruido de fondo. B. el curso del tiempo oscilación después de eliminación de ruido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hemos presentado un nuevo método para el desarrollo de un sistema celular artificial de alto rendimiento permite vitro en reconstitución y seguimiento a largo plazo de las oscilaciones de ciclo celular autosuficiente a nivel unicelular. Hay varios pasos fundamentales que hacen que este método exitoso. Huevos de Xenopus de primera, recién exprimidos con una buena calidad, en comparación con huevos establecidas, tienden a producir extractos con actividad de oscilación de mayor duración. En segundo lugar, encapsulación de extractos en los microambientes de estabilizado de surfactante es crucial para preservar la actividad de la oscilación. Tercero, incubación de las gotitas de aceite en un tubo delgado confines las gotitas dentro de una sola capa, lo que es más fácil para el procesamiento de imágenes y seguimiento a largo plazo. En cuarto lugar, la capa de la pared interna del tubo con tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silano como un antiadhesivo para disminuir la energía superficial ayuda a preservar la actividad del extracto. En quinto lugar, sellar los tubos con aceite evitaría flujo de gotas. El método de sellado-aceite puede también prevenir la evaporación y conservar aún más la actividad del extracto. Estos juntos mejoran la tasa de éxito de la reconstrucción en vitro de oscilaciones robustas en gotitas y la precisión de la segmentación y seguimiento de estas gotas en un largo plazo.

Para generar las gotitas de la microemulsión, hemos empleado tanto un Vortex simple método, similar a algunos otros estudios29,30,31, así como la microfluídica más utilizadas técnicas19, 20 (datos no mostrados). Ambos métodos eran capaces de generar con éxito microemulsiones en un modo de alto rendimiento. Una limitación asociada al método de Vortex es que el tamaño de la gotita no es uniformemente controlado. Para estudios que requieren un tamaño bien definido con variación de tamaño mínimo, deben utilizarse técnicas de microfluídica para un mejor control de tamaños de gota. Aquí, hemos elegido el método Vortex sobre el método de microfluidos por dos razones. En primer lugar, tiene procedimientos simples y fácil de seguir, lo que permitirían a los laboratorios sin acceso a técnicas de microfluidos o servicios de nanofabricación para adaptar este método fácilmente. En segundo lugar, el método de Vortex es más eficiente y económica para investigar comportamientos dependen de tamaño del oscilador. Puede generar una amplia distribución de tamaños de gota con radios que varían de varios micrómetros hasta 300 micrómetros, mientras que la técnica de microfluidos sólo puede generar una distribución estrecha centrada en un tamaño predefinido. La gama de tamaños de gota generado con este método coincide con la amplia gama de tamaños de célula resultantes de las divisiones de célula reductivas características en la etapa de la división de embriones tempranos como Xenopus y pez cebra.

El presente método ha mejorado significativamente la sostenibilidad de las oscilaciones y la capacidad de analizar la dinámica del complejo reloj, en comparación con los métodos existentes de reconstituir osciladores biológicos bien mezclado a granel solución8, 32, que tienden a producir rápidamente humedecido oscilaciones. Hemos demostrado que este método ha mejorado considerablemente la vida útil de las oscilaciones de algunos ciclos de mayor reacción8 a más de 30 ciclos en el microambiente de gotas (figura 2A). Además, a granel reacciones carecen de la similitud con las dimensiones reales de la célula y no pueden recapitular la organización espacial mediante la compartimentación funcional en células reales. Haber superado estas limitaciones de reacciones a granel, nuestro sistema celular artificial ofrece una plataforma esencial para investigar preguntas difíciles tales como la heterogeneidad celular y la estocasticidad de osciladores, que de lo contrario son imposibles de explorar.

Además, este método proporciona flexibilidad en el grado de complejidad a la que se pueden construir las células. Para evitar cualquier interferencia de la complicada dinámica nuclear, podemos reconstituir un sistema de ciclo celular mínimo, sólo citoplasmática que no contiene núcleos. Este oscilador simple y sólo citoplasmático exhibe autosostenidas oscilaciones significativamente mejores que algunos osciladores sintético existentes. Mediante el suministro de la cromatina espermática, también podemos reconstituir más complejas células con los núcleos que se alternan entre uno mismo-Asamblea en interfase y deformación nuclear en la fase de mitosis de manera rítmica. La actividad del oscilador mitotic así como los eventos nucleares aguas abajo puede ser simultánea medidos por proyección de imagen de varios canales de fluorescencia y seguimiento unicelular.

El método también permite un alto grado de manipulación en la velocidad de gota tamaño y ciclo celular. La técnica de Vortex permite para la generación de gotitas con radios en una amplia gama, que beneficiará el estudio de comportamientos dependientes de tamaño de celda de ciclos celulares. Además, la velocidad del ciclo celular se puede modular mediante el suministro de diferentes concentraciones de ciclina B1 mRNAs33, que nos permita estudiar la función de afinabilidad del reloj del ciclo celular.

Con estas ventajas, la de vitro reconstruido ciclo celular plataforma, permitiendo la visualización, manipulación y análisis de dinámica de unicelulares, probablemente allanará el camino para nuevas penetraciones en el comportamiento estocástico más complicado de la célula ciclo de reloj. El método también puede ser generalizable a los estudios en vitro de otros osciladores que tradicionalmente dependen de reacciones a granel.

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Disclosures

No tenemos nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Madeleine Lu para construir mCherry securin plásmido, vuelta hombre Lee, Kenneth Ho y Allen P Liu para los debates sobre la generación de gotas, Jeremy B. Chang y James E. Ferrell Jr para proporcionar la que construcción de GFP-NLS. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (carrera temprana Grant #1553031), los institutos nacionales de salud (MIRA #GM119688) y una beca de investigación de Sloan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

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References

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Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

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