Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58244
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

نقدم هنا، البروتوكولات لتحديد إيمونومودولاتورس 1) الفيروسات المشفرة التي تروج للنسخ المتماثل المفصليات وعوامل المضيف 2) حقيقية النواة التي تقيد المفصليات النسخ المتماثل. تسمح هذه الأساليب المستندة إلى الأسفار والتلألؤ الباحثين سرعة الحصول على قراءات الكمية من النسخ المتماثل المفصليات في فحوصات التبسيط مع انخفاض نسب الإشارات إلى الضجيج.

Abstract

قد استخدمت على نطاق واسع تحديد العوامل الخلية المضيفة التي تقيد النسخ المتماثل الفيروس تدخل الجيش الملكي النيبالي-والجينوم التحرير على أساس فحص الأنظمة الأساسية. ومع ذلك، وهذه الشاشات تجري عادة في الخلايا التي بطبيعة الحال المتساهلة لمسببات المرض الفيروسي قيد الدراسة. ولذلك، النسخ المتماثل قوية من الفيروسات في ظروف السيطرة قد تحد من النطاق الديناميكي لهذه الشاشات. وعلاوة على ذلك، قد تكون هذه الشاشات غير قادر على التعرف بسهولة على مسارات الدفاع الخلوية التي تقيد فيروس النسخ المتماثل إذا كان الفيروس تكييف جيد للبلد المضيف وقادرة على التصدي للدفاعات المضادة للفيروسات. في هذه المقالة، يصف لنا نموذجا جديداً لاستكشاف التفاعلات الفيروس--المضيف عن طريق استخدام شاشات مركز على العدوى وبطبيعة الحال فاشلة قبل سيتناقش مثل فيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة). وعلى الرغم من قدرة منظمة للنسخ المتماثل في طائفة واسعة من الحشرات ديبتيران والمضيفين الثدييات، يخضع منظمة عدوى بعد الدخول، وفاشلة في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا المستمدة من الحشرات ليبيدوبتيران، مثل العثة الغجرية (Lymantria dispar). ومع ذلك، هذه الالتهابات منظمة فاشلة يمكن أن تكون "إنقاذ" عندما يتم اختراق الدفاعات المضادة للفيروسات الخلايا المضيفة. يصف لنا كيف سلالات منظمة ترميز الجينات مراسل مريحة والتقييدية ديسبار ل. يمكن إقران خطوط الخلايا إلى شاشات الإعداد لتحديد المضيف العوامل الداخلة في تقييد المفصليات. وعلاوة على ذلك، نعرض أيضا أداة أدوات الفحص هذه في تحديد العوامل فيروسي المرمزة أن إنقاذ منظمة النسخ المتماثل أثناء كوينفيكشن أو من خلال التعبير حمل خارج الرحم، بما في ذلك ترميز بفيروسات الثدييات. تقييد النسخ المتماثل منظمة في الخلايا ديسبار لام الطبيعية توفر نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية عند الكشف عن الظروف التي من شأنها أن تعزز منظمة الإنقاذ، مما يتيح استخدام التبسيط التﻷلؤ fluorescence القائم وفحوصات لمراقبة التغييرات في منظمة النسخ المتماثل. هذه المنهجيات قيمة لفهم التفاعل بين المضيف الردود المضادة للفيروسات والعوامل الفيروسية التهرب من الحصانة.

Introduction

قدرة الفيروس على تكرار منتجة في مضيف معين في جزء تحكمها توافر العوامل الخلية المضيفة التي تدعم دخول الفيروسية والنسخ المتماثل1. يمكن أن تمليها مجموعة المضيف الفيروس أيضا قدرة الفيروس للدفاعات المضادة للفيروسات الخلوية العداد بخلاف ذلك من شأنه أن يعرقل النسخ المتماثل الفيروسية2،3. وهو النتيجة لهذه التفاعلات المعقدة الفيروس--المضيف في نهاية المطاف أن تقرر ما إذا كان فيروس سوف تكون قادرة على إكمال دورة الحياة في مضيف معين. نظراً للعواقب المحتملة المسببة للأمراض للمضيف إذا تستتبعه هذه النسخ المتماثل الفيروسية، من الأهمية بمكان وضع استراتيجيات تجريبية لزيادة فهمنا للتفاعلات الرئيسية الفيروسات--المضيف التي يمكن ترجيح كفة الميزان بين فاشل والإنتاجية الالتهابات. توضيح الميزات الجزيئية للفيروس--المضيف التفاعل ستكون مفيدة في وضع الاستراتيجيات العلاجية المضادة للفيروسات الجديدة والبديلة.

مع ظهور الحمض النووي الريبي التدخل ([رني])4،5 وأدوات تحرير الجينوم (مثلاً.، كريسبر-Cas9، والزنك إصبع نوكلياسيس، تالينس)7من6،، فقد أصبح ممكناً تجريبيا لتغيير جداول التعبير عن العوامل الخلوية على نطاق الجينوم واستكشاف أثر هذه التعديلات على فيروس النسخ المتماثل. وفي الواقع، [رني] والجينوم-تحرير-تعتمد شاشات عديدة أجريت في أنواع الخلايا المضيفة اللافقاريات والفقاريات التي قد كشف النقاب عن جوانب جديدة للفيروس--المضيف التفاعلات8،،من910، 11 , 12. عادة ما تستخدم هذه الشاشات الفيروسات ترميز الصحفيين، مثل لوسيفراس اليراع (لوك) أو البروتينات الفلورية (مثلاً.، التجارة والنقل، دسريد)، التي توفر وسيلة مريحة كمياً تقييم التعبير الجيني الفيروسي كقراءات للنسخ المتماثل الفيروسية9،12. هذه الاستراتيجية يسمح للباحثين تحديد العوامل المضيفة التي أما تعزز أو استعداء النسخ المتماثل الفيروسية كما يتضح من الزيادة أو النقصان، على التوالي، في الفيروسية مراسل إشارات9،12. ومع ذلك، في الغالبية العظمى من الحالات، أجريت هذه الشاشات باستخدام الفيروسات التي يتم تكييفها جيدا لنوع الخلية المضيفة التي كانت تجري دراسة. في حين أن هذه الاستراتيجية يمكن أن تكون هامة لفهم العلاقات كوفولوتيوناري بين مسببات الأمراض الفيروسية ومضيفيهم الطبيعية، أنها تشكل شواغل أساسية بشأن استخدامها في الكشف عن العوامل المضادة للفيروسات المضيف. وفي هذه الحالات، إشارة تحسينا في مراسل الفيروس عند [رني] هو ينظر ضربة قاضية ل، أو المنظمة من عامل الهاتف الخلوي عادة ما يحول دون تكرار الفيروسية. أولاً، إذا كان فيروس بالفعل قادرة على تكرار قوة في الخلية المضيفة يجري بحثها بموجب شروط مراقبة، مجموعة ديناميكية من الشاشة (أي، القدرة على التمييز بين الخلفية وإشارات مراسل الفيروسية المعززة) قد تكون محدودة. ثانيا، هذه المسألة تتفاقم الأوضاع فيها الفيروس تكييف جيدا للخلية المضيفة وفعالة في التصدي لسبل الدفاع المضيف مستهدفون في الشاشة.

نظراً للشواغل المذكورة أعلاه فيما يتعلق بتفاعل الفيروسات التقليدية-المضيف فحص أساليب، قمنا بتطوير نموذج جديد لدراسة التفاعلات المضيف الفيروسات التي تستغل التهابات المفصليات فاشل بطبيعة الحال في خلايا الحشرات ليبيدوبتيران. هذه الاستراتيجية مستمدة من ملاحظة أن المفصليات البشرية مدروسة، منظمة، يخضع لعدوى فاشلة في الخلايا المشتقة من العثة الغجرية (L. dispar)13. منظمة وبطبيعة الحال المنقولة بواسطة الحشرات ديبتيران (أي، ذباب الرمل) للمضيفين الثدييات، وقد ثبت تجريبيا لتصيب مجموعة واسعة من اللافقاريات وخلية المضيفين الفقاريات على حد سواء في الثقافة و في فيفو14. 11-ك. بايت سلبي بمعنى واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الجينوم من منظمة ترميز مرناس سوبجينوميك الخمسة التي تترجم كل إلى البروتينات التي تشكل virion المغلفة. ومع ذلك، أتاحت منظمة عكس النظم الوراثية إنشاء النسخ المتماثل المختصة سلالات ترميز لوك أو البروتينات الفلورية، بالإضافة إلى خمسة الطبيعية منظمة الجينات المنتجات15،،من1617. لأن هذه البروتينات مراسل لا تدمج virion منظمة، أنها توفر قراءات مريحة للتعبير الجيني منظمة التي تحدث بعد الدخول. استخدام سلالات منظمة ترميز بروتينات فلورية خضراء أو لوك، لقد سبق بينا أن التعبير الجيني منظمة قيودا صارمة على دخول الخلايا LD652 وأن التتر منظمة لا تزيد مدة 72 ساعة بعد الإصابة (hpi). وفي المقابل، كوينفيكشن الخلايا LD652 مع بوكسفيروس الثدييات، فيروس اللقاحية (فاكف)، ومنظمة يؤدي إلى زيادات لوغاريتمي في التعبير الجيني منظمة والتتر من هذه النقطة الزمنية. فاكف يخضع التعبير الجيني المبكر وتكرار الحمض النووي، والتعبير الجيني المتأخر في LD652 الخلية الالتهابات، ولكن دورة النسخ المتماثل فاكف فاشلة في نهاية المطاف بسبب virion غير مكتملة morphogenesis18. جينوم الحمض النووي ~ 192 كيلو بايت كبيرة فاكف ترميز البروتينات > 200، كثير منها عرض خصائص إيمونومودولاتوري التي تروج للنسخ المتماثل الفيروسية عن طريق قمع المضيف الاستجابات المناعية19. ولذلك، افترضنا أن المرجح إيمونومودولاتورس فاكف التي تحول دون ردود ديسبار L. عادة تقييد النسخ المتماثل لمنظمة وساطة "الإنقاذ" للنسخ المتماثل لمنظمة في خلايا LD652 التي كوينفيكشن فاكف. ودعما لذلك، تنقذ معاملة الخلايا LD652 مع المانع الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي المضيف والاكيتنوميسين د أيضا منظمة النسخ المتماثل في الخلايا LD652، مما يشير إلى أن الاستجابات المضيف النسخ المعتمدة على كتلة منظمة النسخ المتماثل بعد الدخول13.

الملاحظات المذكورة أعلاه تشير إلى أن الطابع التقييدي الطبيعي للخلايا LD652 للإصابة بمنظمة قد توفر خلفية منخفضة نسبيا عند الكشف عن الظروف التي من شأنها أن تعزز إشارات مرمزة بمنظمة مراسل (أي، تلك التي تمنع المضيف الدفاعات المضادة للفيروسات). هنا، نحن نقدم الطرق لاستخدام الفلورية أو فحوصات لوك المستندة إلى الشاشة لظروف تخفيف قيود منظمة في الخلايا ليبيدوبتيران. أولاً، نحن إظهار كيف يمكن استخدام هذه الاختبارات لتحديد العوامل immunomodulatory فيروسي المرمزة التي كسر قيود منظمة أثناء أما تجارب كوينفيكتيون أو من خلال التعبير حمل خارج الرحم العوامل الفيروسية المرشح. على سبيل مثال، نحن لتوضيح كيف استخدمنا هذه تقنيات الفحص لتحديد ترميز poxvirus البروتينات A51R كأسرة جديدة من العوامل إيمونومودولاتوري التي إنقاذ منظمة النسخ المتماثل في الغياب عوامل poxvirus الأخرى13. ثانيا، نحن لتوضيح كيف يمكن استخدام [رني] الفحص في التهابات خلية منظمة LD652 تقييداً لتحديد المضيف التوكسينات العوامل الداخلة في المفصليات تقييد13مباشرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-العام Lymantria dispar (LD652) خلية والثقافة الفيروس

  1. خلية LD652 استزراع وتصفيح
    1. لثقافة ديسبار لام-المشتقة من الخلايا LD652، الحفاظ على أحادي الطبقة خلايا في نمو متوسطة (جدول المواد) المحتضنة في 27 درجة مئوية تحت الغلاف الجوي العادي. الحفاظ على الخلايا في أطباق الأنسجة-الثقافة-تعامل 10 سم وممر الخلايا عند الوصول إلى كونفلوينسي 80%.
    2. للوحة، وإزاحة الخلايا LD652 ملتصقة من اللوحة التي بيبيتينج وسائل الإعلام مرارا وتكرارا على أحادي الطبقة (لا تتطلب هذه الخلايا تريبسينيزيشن إلى إزاحة)، وتمييع العينة في وسائط النمو كثافة تقريبية 1 × 105 خلايا/مل. "الماصة؛" 1 مل من الثقافة/بئر المخفف من صفيحة 24-جيدا. البذور على الأقل نوع الآبار ثلاث نسخ متماثل في المعاملة لكل نقطة الوقت (بحد أقصى ثمانية معالجات/اللوحة).
    3. السماح للخلايا بتسوية للحد ني ح 1.
  2. إعداد فيروس اللقاحية
    1. لإعداد المخزون فاكف، وتضخيم الفيروس في الحلة خلايا20 أو كلية "القرد الأخضر الأفريقي" الخلايا (الخلايا 1 بكالوريوس العلوم أو بكالوريوس العلوم-40)20،،من2122.
      ملاحظة: فاكف سلالة Western Reserve (فاكف-WR) يعمل جيدا في الاختبارات الموصوفة هنا.
    2. تيتراتي سلالة فاكف عن طريق البلاك المقايسة 1 بكالوريوس العلوم أو بكالوريوس العلوم-40 خلايا20،22.
      ملاحظة: جميع أشارت إلى تعدد فاكف للعدوى (وزارة الداخلية) الموصوفة هنا عن LD652 التهابات خلية تستند التتر التي تم الحصول عليها من فحوصات البلاك BSC-40.
  3. إعداد فيروس التهاب الفم الحويصلي
    1. إعداد مخزون منظمة، تضخيم الفيروس في الخلايا BHK23.
    2. تيتراتي منظمة بمقايسة البلاك على بكالوريوس العلوم-40 أو BHK خلية مونولاييرس13،23.
      ملاحظة: كل "منظمة أشهر" الموصوفة هنا عن LD652 التهابات خلية تستند التتر التي تم الحصول عليها من فحوصات البلاك BSC-40.

2. المستندة إلى الأسفار منظمة الإنقاذ المقايسة تستخدم الإصابة المشتركة وتصوير خلية يعيش

  1. البذر والعدوى من الخلايا LD652
    1. لوحة 40,000 LD652 الخلايا/البئر دائرة 8-جيدا.
    2. لتصوير خلية يعيش المستندة إلى الأسفار، استخدام سلالات منظمة ترميز البروتينات الفلورية. استخدام التجارب التي عرضت هنا منظمة-دسريد17، سلالة منظمة المؤتلف الذي يعبر عن البروتين دسريد الحرة التي هي لا تنصهر فيها أي بروتين منظمة أخرى.
      ملاحظة: منظمة العدوى من الخلايا LD652 لا سيتوباثيك من 96 hpi، وثم موت الخلية ليس عاملاً من عوامل التباس عند تقييم النسخ المتماثل منظمة داخل هذا الإطار الزمني.
    3. تعد منظمة دسريد وفاكف-فلوريدا-التجارة والنقل في وسائل الإعلام الحرة المصل (الإدارة المستدامة للغابات؛ جدول المواد) وزارة الداخلية في 1 و 25، على التوالي.
      ملاحظة: فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل هو سلالة فاكف المؤتلف الذي يعبر عن التحام بين لوك وبروتينات فلورية خضراء24. استخدام موي من 25 أو أكبر لسلالات فاكف يضمن أن جميع LD652 الخلايا المصابة13. إذا كان استخدام فيروس كوينفيكتينج مختلفة، ووزارة الداخلية سيكون يحددها المستخدم تجريبيا. يجب أن تقام في الآبار مكررة كل علاج العدوى وتشمل العلاجات موك المصابة التي يتم إضافة فقط الإدارة المستدامة للغابات إلى الخلايا.
    4. احتضان الخلايا في 0.2 مل العدوى ح 2 في 27 درجة مئوية.
    5. تغسل الخلايا مع 0.5 مل/جيدا من وسائط النمو.
    6. احتضان الخلايا في 25 ميكرومترات خلية صلاحية صبغ (جدول المواد) في وسائط النمو لمدة 45 دقيقة في 27 درجة مئوية.
    7. نضح وسائط الإعلام وغسل الآبار 1 x مع 0.5 مل/جيدا لإزالة الصبغة الزائدة.
    8. الحفاظ على الخلايا في 0.3 مل/جيدا من وسائط النمو.
  2. يعيش خلية التقاط الصور
    1. تشغيل مجهر [كنفوكل] 30 دقيقة في وقت مبكر وتحميل طبق دائرة 8-جيدا.
      ملاحظة: يمكن تصويرها الخلايا LD652 في درجة حرارة الغرفة تتراوح ما بين 20-25 درجة مئوية، ولكن للظروف المثلى، ينبغي تعديل درجة حرارة الغرفة إلى 27 درجة مئوية.
    2. إعداد الإعدادات المناسبة الإثارة/الانبعاثات لكل البروتين علامة مضيئة لتصويرها، فضلا عن إعدادات الصورة التباين المرحلة.
    3. ضبط كثافة الليزر لكل قناة.
      ملاحظة: قد يتطلب تشغيل تجربة رائدة لتحديد نطاق شدة الفلورسنت إشارة لاحظت طوال الوقت لاستخدامها في التجربة الأخيرة.
    4. استخدام الهدف العاشر 10، التقاط الصور المرحلة الأسفار وعلى النقيض من كل ح 1 – 5 كل مدة العدوى تصل إلى نقطة في وقت المطلوب (على سبيل المثال-، hpi 48 – 72).
      ملاحظة: من المهم التقاط عرض من حقول متعددة في كل بئر دقة تقدير معدلات الإصابة في جميع أنحاء الثقافة.
  3. تحليل الصور
    1. استخدام برمجيات تحليل الصورة لتحليل الصورة الآلي للقنوات الفلورسنت المناسب (مثلاً.، 405 نانومتر، 488 نانومتر، 568 nm).
    2. لحساب النسبة المئوية للخلايا التي يتم المصابة، بتقسيم العدد الإجمالي للخلايا الفلورسنت التي تشير إلى الإصابة بمنظمة (مثلاً.، الخلايا دسريد الإيجابية لمنظمة دسريد العدوى) من العدد الكلي لخلايا قابلة للتطبيق المسمى بالخلية صلاحية صبغ ل كل حقل من عرض عبر جميع العلاجات.

3-العامة بروتوكول العدوى الفيروسية لفحوصات الإنقاذ منظمة على أساس التﻷلؤ في الخلايا LD652

  1. إعداد العدوى
    1. 30 دقيقة قبل الإصابة، تحسن مخزونات منظمة-لوك16 (سلالة المؤتلف منظمة تعرب عن هذا البروتين لوسيفراس اليراع الحر لا تنصهر فيها أي بروتين منظمة أخرى). إذا المعايرة للإنقاذ منظمة-لوك خلال كوينفيكتيون فاكف، أيضا ذوبان فيروس فاكف-WR على الجليد.
      فيروسات أخرى (إلى جانب فاكف-WR) ملاحظة: قد إنقاذ منظمة-لوك خلال كوينفيكشن، ولكن هذا سيكون يحدد تجريبيا قبل كل مستخدم.
    2. إعداد العدوى عن طريق إضعاف منظمة-لوك في وجود أو عدم وجود فاكف-WR في الإدارة المستدامة للغابات أن يتحقق وزارة الداخلية من 10 و 25، على التوالي، عند إضافة وحدة تخزين إجمالي العدوى من 0.2 مل/حسنا.
  2. عدوى الخلايا
    1. نضح ناضجة LD652 الإعلام بعناية لتجنب الإخلال أحادي الطبقة وتلقيح مع 0.2 مل من الفيروسات/جيدا. ويعرف هذا الوقت 0 hpi. إضافة SFM العقيمة إلى آبار إضافية لتكون بمثابة علاجات التحكم السلبي "إصابة صورية".
    2. احتضان الخلايا في العدوى ح 2 في 27 درجة مئوية.
    3. في hpi 2، إزالة العدوى عن طريق الاستنشاق واستبدال مع 1 مل/حسنا وسائط النمو LD652.
    4. السماح بالعدوى إلى المضي قدما hpi 24 – 72.

4-لوسيفراس بالانزيم

  1. إعداد خلية ليساتيس
    1. عناية نضح المادة طافية وإضافة 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس)/حسنا.
    2. استخدام المكبس لحقنه 1 مل، كشط الخلايا في دببس.
    3. نقل الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي، وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    4. ومن ناحية أخرى، تعد 1 تمييع x 5 x مراسل تحلل المخزن المؤقت (رلب) في العقيمة H2o.
    5. وعقب الطرد المركزي، نضح دببس دون إزعاج بيليه الخلية.
    6. ريسوسبيند كل بيليه في 150 ميليلتر من 1 x RLB.
    7. تجميد أذاب العينات 1 x باستخدام حضانة 5-دقيقة في ثلاجة-80 درجة مئوية متبوعاً ذوبان سريع في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة. تخزين ليساتيس في-80 درجة مئوية حتى على استعداد لتحليل.
  2. تحليل لوسيفراس
    1. ذوبان الجليد ليساتيس على الجليد.
    2. "الماصة؛" 20 ميكروليتر من في بئر الميكروسكوبية 96-بئر سوداء أو بيضاء صلبة.
    3. إضافة 100 ميكروليتر من كاشف الإنزيم لوسيفراس لكل بئر.
    4. قياس شدة الضوء باستخدام لومينوميتير الفور (وسيكون الإعدادات المناسبة للومينوميتيرس معينة يحددها المستخدم تجريبيا).
  3. تحليل الإنزيم لوسيفراس
    1. تطبيع لو إشارات لكل معاملة للقراءات لو تم الحصول عليها من مراقبة العلاج (نتائج الممثل). بعد أن تم إجراء تجارب مستقلة على الأقل ثلاثة، يمكن تحليل يعني لو تم الحصول عليها من كل مجموعة العلاج/التحكم بالاختبارات الإحصائية المناسبة.

5-إيمونوبلوت

  1. استخدام ليساتيس استخراج لفحوصات لوك للحزب الديمقراطي الصربي صفحة و immunoblotting اللاحقة، باستخدام الكواشف المناسبة والأجهزة.

6. عيار منظمة من الثقافات الخلية LD652

  1. لوحة LD652 الخلايا وفقا للخطوة 1، 1.
  2. الفيروسية تصيب الخلايا وفقا للخطوة 3.
  3. في النقاط الزمنية المرغوبة، جمع في supernatants في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة.
  4. بيليه الخلايا باستخدام 1,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية ونقل سوبيرناتانتس بأنابيب جديدة.
  5. تخزين سوبيرناتانتس في-80 درجة مئوية أو المضي قدما في المعايرة بمقايسة البلاك على الخلايا BSC-40.
    ملاحظة: إذا المعايرة منظمة من الثقافات الخلية LD652 يحتوي على فاكف، فإنه من المستحسن إضافة 100 ميكروغرام/مل السيتوزين أرابينوسيدي (أراك) إلى بكالوريوس العلوم-40 ثقافة وسائل الإعلام داخل hpi 2، للحيلولة دون تشكيل لويحات على بكالوريوس العلوم-40 مونولاييرس13المتبقية فاكف الجسيمات. أراك هو مثبط فيروسية دنا بوليميريز كتل "الحمض النووي فاكف" النسخ المتماثل25 ولكن لا يؤثر على النسخ المتماثل لمنظمة.

7-اختلافات منظمة على أساس التﻷلؤ إنقاذ فحوصات في الخلايا LD652: [رني] وتجارب تعداء بلازميد

  1. إعداد دسرنا لوساطة [رني] ضربة قاضية لفيروسي أو استضافة المحاضر
    1. التصميم الخاصة بالجينات الإشعال الذيل في نهاية 5 ' مع تسلسل المروج T7 (تاتاكجاكتكاكتاتاجج) لاستهداف أما الفيروس كوينفيكتينج (مثلاً، فاكف) أو ديسبار L. مرناً المحاضر للفائدة. كبسولة تفجير هذه ينبغي أن إنتاج منتج PCR من 400 – 600 شركة بريتيش بتروليوم لفعاله [رني] بوساطة ضربة قاضية. انظر مرس et al. استخدام 13 لمتواليات التمهيدي أدناه إلى ضربة قاضية فاكف أو ديسبار ل. النصوص بوساطة دسرنا [رني] في الخلايا LD652.
      ملاحظة: نشرت ديسبار L. مرناً يمكن التعرف على النصوص من ديسبار L. الترنسكربيتوم قواعد بيانات26،،من2728.
    2. تولد من دنا قالب عبر RT-PCR (توليف كدنا: دورة 1 من 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ بكر: دورات 40 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 50 درجة مئوية لمدة 30 s، و 68 درجة مئوية ل 45 s كل).
    3. تنقية المنتج PCR باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR.
    4. استخدام المنتج بكر المنقي كقالب، المختبر في تدوين وتنقية دسرنا تستخدم في المختبر وتدوين وتنقية مجموعة.
  2. تعداء دسرنا أو بلازميد الحمض النووي في الخلايا LD652
    1. البذور 1 × 105 خلايا/جيدا صفيحة 24-جيدا وترك الخلايا تسوية على الأقل 1 ح.
    2. لكل بئر تكون ترانسفيكتيد، يضعف 4 ميكروليتر من تعداء الكاشف إلى 100 ميكروليتر من الإدارة المستدامة للغابات. احتضان لمدة تصل إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يمكن تغيير هذا جعل مزيج رئيسي لجميع ترانسفيكشنز التي يتعين القيام بها.
    3. إضعاف ما يصل إلى 1 ميكروغرام دسرنا أو مجموع بلازميد الحمض النووي مع 100 ميكروليتر من الإدارة المستدامة للغابات لكل بئر يكون ترانسفيكتيد. احتضان لمدة تصل إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: قد سبق وجدنا أن تعداء من 1 ميكروغرام من الخلايا دسرنا/105 LD652 كافية > ضربة قاضية 80% أما الفيروسية أو استضافة محاضر13، لكن جرعة دسرنا اللازمة لتعديل التجريبية الإطار ups/الظروف سيتعين يجب تحديد تجريبيا.
    4. الجمع بين تخفيف تعداء الكاشف ودسرنا/بلازميد الحمض النووي بنسبة 1:1 (مثلاً، 100 ميكروليتر من دسرنا المخفف مختلطة مع 100 ميكروليتر من كاشف تعداء المخفف) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. في الوقت نفسه، غسل الآبار مع 1 مل/بشكل جيد للإدارة المستدامة للغابات، ثم قم بإضافة 500 ميكروليتر من الإدارة المستدامة للغابات لكل بئر.
    6. أضف ببطء تعداء دسرنا كاشف (أو بلازميد الدنا) خليط دروبويسي في كل بئر.
    7. احتضان الكاشف تعداء مع الخلايا ح 5.
      1. ل [رني] استبدال التجارب التي تنطوي على ضربة قاضية للنصوص المشفرة بواسطة فيروس كوينفيكتينج (مثلاً، فاكف)، الكاشف تعداء بعد فترة الحضانة تعداء 5-ح مع فيروس العدوى تتضمن منظمة-لوك (مع أو بدون فاكف أو فيروس كوينفيكتينج آخر) (الخطوة 3). بعد ذلك، استبدال العدوى الفيروس تتضمن منظمة-لوك مع hpi الإعلام 2 كاملة النمو. يمكن إجراء فحوصات لوك (خطوة 4) ثم على ليساتيس المستخرج في نقاط زمنية مختلفة تحديد إذا كان ضربة قاضية من كوينفيكتينج نسخ الفيروس تؤدي إلى خسارة في لوك منظمة الإنقاذ.
      2. لتجارب [رني] مع [رني] النصوص ديسبار L. ، استبدال هذا المزيج تعداء مع وسائط النمو الكامل والسماح بضربه قاضية تنجم عن 24 ساعة قبل الإصابة مع منظمة-لوك (الخطوة 4). يمكن إجراء فحوصات لوك (خطوة 4) ثم على ليساتيس المستخرج في نقاط زمنية مختلفة لتحديد إذا كان ضربة قاضية النصوص ديسبار L. يعزز لوك منظمة الإنقاذ.
      3. للتجارب التي تنطوي على ترانسفيكتيونس ناقلات التعبير بلازميد معربا عن إيمونومودولاتورس مرشح، استبدال الكاشف تعداء والسماح للبروتين التعبير عن 24 ساعة قبل العدوى مع منظمة-لوك (الخطوة 4). يمكن إجراء فحوصات لوك (خطوة 4) ثم على ليساتيس المستخرج في نقاط زمنية مختلفة تحديد ما إذا كان التعبير عن البروتينات immunomodulatory مرشح يعزز لوك منظمة الإنقاذ.
        ملاحظة: الشروط تعداء الموضحة هنا باستخدام 1 ميكروغرام/بئر نتيجة الحمض النووي بلازميد في الكفاءة تعداء من 40 – 60%13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كمثال لخلية يعيش تطبيقات التصوير لمراقبة منظمة الإنقاذ عند كوينفيكشن فاكف، الخلايا LD652 كانت مطلي في طبق غرف 8-جيدا وثم إصابة صورية أو المصابين بمنظمة دسريد (موي = 1) في وجود أو عدم وجود فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل (موي = 25). نظراً لأن منظمة دسريد تعرب عن دسريد بروتين حرة وهي لا تنصهر بهيكلية منظمة البروتينات (الشكل 1A)، يتم الكشف عن فقط بعد أن يبدأ التعبير منظمة الدخول والجينات. ثم كانت وصفت كافة الخلايا مع صبغة بقاء الخلية بحرية يمر عبر غشاء البلازما للخلايا، حيث يتم تحويلها إلى منتج غشاء إيمبيرميانت، الذي يعزز الاحتفاظ بإشارة مضيئة في الخلايا المسماة. الصور تم الحصول عليها كل ح 5 حتى hpi 65، تستخدم في 405 نانومتر، 488 شمال البحر الأبيض المتوسط، وشمال البحر الأبيض المتوسط 568، والأبيض الضوء على مرشحات لالتقاط صبغ بقاء الخلية، فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل، ومنظمة دسريد، ومرحلة التباين (PC) قنوات، على التوالي. تحت ظروف الإصابة وحيدة، وتقييد الخلايا LD652 النسخ المتماثل منظمة-دسريد؛ ولذلك، سوى عدد صغير من الخلايا يحمل إشارة دسريد. ومع ذلك، النتائج كوينفيكشن من منظمة-دسريد مع فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل في معظم الخلايا بعرض الإشارات دسريد بنهاية دورة الوقت (الشكل 1B). الصور التي تم التقاطها في كل نقطة الوقت تعرضوا لبرنامج تحليل الصور، حيث 405 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 568 قناة الصور استخدمت تلقائياً تحديد إجمالي وأرقام الخلية دسريد إيجابية، على التوالي. النسبة المئوية لعرض إشارة دسريد لكل معاملة الخلايا يحسب بتقسيم الكائنات (الخلايا) مع إشارة إيجابية في قناة 568-شمال البحر الأبيض المتوسط على عدد الكائنات التي تم تحديدها في 405 نانومتر قناة كل الوقت نقطة، تليها تضاعف بنسبة 100% . كما هو مبين في الشكل 1، ~ 2 ٪ الخلايا من التهابات دسريد منظمة واحدة بإيجابية دسريد 65 hpi. على النقيض من ذلك، كانت ~ 77% الخلايا في منظمة دسريد + كوينفيكشنز فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل دسريد الإيجابية في هذه المرحلة الزمنية. أفلام S1 و S2 إظهار تطور الإصابة دسريد منظمة على مدى الوقت 65-ح كله في الإصابة واحدة وظروف كوينفيكتيون، على التوالي. من المهم أن نلاحظ أن تعبير بروتينات فلورية خضراء فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل أصبحت قابلة للكشف من hpi 10، قبل إشارة دسريد، تشير إلى أن التعبير الجيني فاكف كافية مطلوب قبل الإنقاذ منظمة دسريد (غير معروضة). مجتمعة، هذه النتائج تشير بوضوح إلى عملية إنقاذ للنسخ المتماثل لمنظمة دسريد من كوينفيكتيون فاكف. إذا لم يستطع فيروس كوينفيكتينج لإنقاذ منظمة دسريد، ونتوقع نسب متساوية من الخلايا دسريد الإيجابية بين الإصابة بمفرده والعلاجات كوينفيكشن.

ويمكن بدلاً من ذلك كمياً منظمة النسخ المتماثل في الخلايا LD652 استخدام الاختبارات المستندة إلى التﻷلؤ عند استخدام سلالات منظمة-لوك (الشكل 2A). على سبيل مثال، يظهر الشكل 2B نتائج المقايسة لوك استخدام ليساتيس التي أعدت على مدى دورة وقت ح 72 من الخلايا المصابة وهمية أو الخلايا المصابة مع منظمة-لوك (موي = 10) في وجود أو عدم وجود فاكف-WR (موي = 25). يتم الإشارة إلى إنقاذ إيجابية لمنظمة-لوك النسخ المتماثل زيادة لوغاريتمي التعسفي لو اكتشفت مع ليساتيس إعداد من الخلايا المصحوبة، مقارنة مع ليساتيس من التهابات لوك منظمة واحدة. أن الإشارة إلى نتيجة سلبية في هذا التحليل بعدم كوينفيكتيون لتغيير لو قراءات من تلك التي لوحظت في علاج العدوى لوك منظمة واحدة. إذا رغبت في ذلك، يمكن أيضا استخدام ليساتيس استعداد إيمونوبلوتينج، لتأكيد تعزيز التعبير الجيني منظمة في العلاجات كوينفيكشن. على سبيل المثال، يظهر الشكل 2 نتيجة immunoblot نموذجية لترميز منظمة لوك ومصفوفة البروتينات (M) في ليساتيس إعداد من موك-ومنظمة-لوك، ومنظمة-لوك + فاكف-WR العلاجات hpi 72. إيمونوبلوتينج للبروتين I3L فاكف بمثابة علامة للإصابة فاكف، واستخدمت إيمونوبلوتينج أكتين الخلوية كعنصر تحكم تحميل. تعزيز واضح من البروتينات المرمزة بمنظمة لوك وم في ليساتيس كوينفيكشن كذلك تأكيد منظمة الإنقاذ من فاكف. وأخيراً، يمكن تأكيد النسخ المتماثل الإنتاجية لمنظمة بجمع سوبيرناتانتس من هذه الثقافات الخلية LD652 والمعايرة فيروسات معدية على بكالوريوس العلوم-40 مونولاييرس (الشكل 2D). هذه النتيجة توضح أن فقط أثناء فاكف لا كوينفيكتيون منظمة منتجة نسخ متماثل.

متى يظهر فيروس كوينفيكتينج قادرة على إنقاذ منظمة النسخ المتماثل في الخلايا LD652، يمكن استخدام الفرز [رني] لتحديد العوامل مرمزة بواسطة الفيروس كوينفيكتينج التي تساهم في إنقاذ منظمة. في هذه التجربة، شاشة لشرط [رني] الذي يؤدي إلى النمط الظاهري "خسارة للإنقاذ" خلال منظمة-لوك كوينفيكشن مع فيروس إنقاذ. سبق حددنا البروتين A51R فاكف كعامل إنقاذ منظمة من خلال فحص [رني] العشرات من النصوص المرمزة فاكف13. على سبيل مثال، أننا قد لخص إصدار مقياس أصغر من هذه الشاشة (الشكل 3). [رني] هو توسط تعداء من المختبر نسخها دسرناس التي تستهدف النصوص المشفرة بواسطة الفيروس كوينفيكتينج. واستهدفت النصوص الفيروسية ترميز البروتينات A50R فاكف، A51R، و A52R في البيانات المعروضة هنا، ضربة قاضية [رني]. كعنصر تحكم سلبية للخسارة للإنقاذ، كما كانت transfected الخلايا مع دسرناس تستهدف التجارة والنقل-ترميز النصوص. كعنصر تحكم إيجابية لخسارة في النمط الظاهري الإنقاذ, تم transfected الخلايا مع دسرناس ضد لوك-ترميز النصوص. تنتج خسارة لو إشارة قوية خلال كوينفيكشن هذا العلاج ويساعد الباحثين تؤكد أن تعمل البروتوكولات تعداء/[رني]. بعد 5 ساعات تعداء دسرنا، خلايا تم المصحوبة مع منظمة-لوك (موي = 10) وفاكف-WR (موي = 25). التهابات منفصلة مع منظمة لوك فقط أجريت أيضا تحديد مستوى خلفية لو إشارة. ليساتيس ثم تحصد 72 hpi والمستخدمة في مقايسة لوك. مقارنة مستوى منظمة الإنقاذ عبر العلاجات دسرنا معاملة السيطرة دسرنا التجارة والنقل، وتشير النتائج إلى أن ضربة قاضية من A51R فاكف وتنتج خسارة قوية للإنقاذ النمط الظاهري، حين ضربة قاضية ل A50R و A52R وتنتج نتيجة سالبة (أي خسارة من الإنقاذ مقارنة بالتجارة والنقل دسرنا).

كبديل للفحص لتحديد العوامل الفيروسية التي تساهم في إنقاذ منظمة [رني]، أوفيريكسبريس مرشح عوامل فيروسية في الخلايا LD652 والاعتداء ثم لإنقاذ منظمة-لوك. يمكن أن يتحقق هذا باستنساخ الجينات المرشحة للفائدة في ناقلات التعبير المناسب مثل p16629 وترانسفيكتينج هذه البلازميدات إلى خلايا LD652 قبل تحدي منظمة-لوك. على سبيل مثال، يوضح الشكل 4A تجربة إنقاذ في معلم علم "التجارة والنقل" (فجفب) أو معلم العلم A51R التي تم transfected ناقلات p166 (FA51R) إلى الخلايا LD652 بتركيزات مختلفة، تليها منظمة-لوك العدوى (مو = 10) 24 ساعة في وقت لاحق. كعنصر تحكم سلبية لمنظمة الإنقاذ، ثقافات إضافية تم transfected وهمية ولم يتلق بلازميد الحمض النووي. وجمعت من hpi 72 الثقافات ليساتيس وتعرضوا لفحوصات لوك. علاجات FA51R أنتجت منظمة إنقاذ نتيجة إيجابية كما يتضح من زيادة لو إشارات أكثر من العلاجات transfected وهمية في جرعات متعددة. وفي المقابل، علاجات فجفب كانت سلبية للإنقاذ منظمة في أي جرعة اختبار. وأكد إيمونوبلوتينج ليساتيس من الشكل 4A تعبير مماثل للبروتينات فجفب و FA51R (الشكل 4 باء).

استخدام فحص [رني] العوامل L. dispar مرشح، أظهرنا أن تقييد منظمة في الخلايا LD652 هو توسط مختلف العوامل الخلوية المنتمين للأدوية المضادة للفيروسات [رني] مسارات (مثلاً، AGO2 وديسير-2)، و "العامل النووي" كابا ب (NF-κB)-مسار IMD ذات الصلة (مثلاً، المذاق)، ونظام ubiquitin-بروتوزوم (مثلاً.، بوليوبيكويتين)13. على سبيل مثال، لقد كررنا إصدار مقياس أصغر من هذه التجارب [رني] مع دسرناس استهداف ديسبار L. النصوص التي عززت منظمة-لوك النسخ المتماثل عند ضربة قاضية (مثلاً.، AGO2، ديسير-2، المذاق، بوليوبيكويتين) أو لم يكن لها تأثير (AGO1 )13. بعد 24 ساعة تعداء دسرنا، طعن الخلايا مع منظمة-لوك ح 72 لتحديد إذا العلاجات [رني] تعزيز إشارات لو أكثر من العلاجات دسرنا بروتينات فلورية خضراء المراقبة السلبية. [رني] العلاجات التي تعزز إشارات لو تشير إلى أن العامل مرمزة بواسطة النسخة المستهدفة يقيد النسخ المتماثل منظمة. كعنصر إيجابي لضربة قاضية [رني]، ترانسفيكتيد دسرناس استهداف لوك-ترميز النصوص كانت أيضا في علاجات موازية. نظراً للخلفية منخفضة إشارات لو اكتشفت في التجارة والنقل دسرنا التحكم العلاجات، كان بسيطاً نسبيا تحديد العوامل ترميز المضيف تقييد استخدام الفحص [رني] لأنه ينتج عن ضربة قاضية ~ 10--إلى زيادة لو إشارات ( 1,000-fold الشكل 5). وبالتالي، فمن الممكن أن تستفيد الخلفية منخفضة نسبيا مستوى التعبير الجيني منظمة في الخلايا LD652 الشاشة للمضيف [رني] ضربة قاضية ظروف تخفيف قيود منظمة.

Figure 1
رقم 1: تعريف منظمة الإنقاذ من الفيروسات كوينفيكشن من الخلايا LD652 باستخدام التصوير خلية يعيش المستندة إلى الأسفار. (أ) هذا الفريق يظهر التخطيطي الجينوم دسريد منظمة تشير إلى الموقع دسريد (dR) الجينات. (ب) ممثل هذه 10 X مجهرية [كنفوكل] الصور هي hpi 60 تم التقاطها. قناة 405 نانومتر يشير إلى وصمة عار لخلايا قابلة للحياة، القناة 488 نانومتر يشير إلى الإصابة فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل، والقناة نانومتر 568 يشير إلى الإصابة دسريد منظمة. وترد أيضا مرحلة التباين (PC) الصور. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. (ج) هذا الفريق يوضح النسبة المئوية للخلايا LD652 دسريد-إيجابية طوال الوقت العدوى ح 65 أسرة. ويبين متوسط (SD) النسبة المئوية للخلايا تظهر إشارة دسريد لكل نقطة في الوقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تقييم لمنظمة الإنقاذ في الخلايا LD652 باستخدام فحوصات لوك- (أ) هذا الفريق يظهر التخطيطي لوك منظمة الجينوم. (ب) يظهر هذا الفريق الوحدات الخفيفة التعسفي فحوصات (لوك) من ليساتيس من الخلايا المصابة وهمية أو الخلايا المصابة مع منظمة-لوك، في غياب أو وجود فاكف-WR. (ج) هذا الفريق يظهر immunoblot لوك، م منظمة، I3L فاكف، والبروتينات أكتين الخلوية في ليساتيس من الفريق جمع 72 hpi. (د) يظهر هذا الفريق التتر منظمة-لوك في supernatants ثقافة تم الحصول عليها من الفريق ب. تمثل البيانات الكمية في لوحات ب ود الوسائل (± SD) من تجارب أجريت في ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تحديد ترميز فيروسي عامل الإنقاذ منظمة من خلال الفحص [رني] أثناء كوينفيكتيون للخلايا LD652- يظهر هذا الفريق تغييرات حظيرة في لو اكتشفت في ليساتيس من الخلايا hpi 72 مع منظمة-لوك وفاكف-WR بعد العلاج [رني] المشار إليه، بالنسبة إلى لو اكتشفت في ليساتيس من الخلايا المصابة منفردة مع منظمة-لوك. وتمثل البيانات الوسائل (± SD) من تجارب أجريت في ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: إنقاذ منظمة قبل overexpression immunomodulator الفيروسية في الخلايا LD652- (أ) هذا الفريق يظهر الاعتداء لوك من hpi خلايا منظمة-لوك-إصابة 72 التي تم transfected موك (صورية) أو transfected مع البلازميدات التعبير p166 فجفب أو FA51R. تم تطبيع لو إشارات من كل معاملة للإشارات التي اكتشفت في علاجات التحكم transfected وهمية. وتمثل البيانات الوسائل (± SD) من تجارب أجريت في ثلاث نسخ. (ب) هذا الفريق يظهر ليساتيس من الفريق ألف، إيمونوبلوتيد مع الأجسام المضادة للعلم واكتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تحديد المضيف عوامل النسخ المتماثل منظمة تقيد في الخلايا LD652 من خلال الفحص [رني]. ويبين هذا الفريق تغيير الحظيرة في إشارات LU في العلاجات [رني] المشار إليه بالنسبة التجارة والنقل دسرنا التحكم علاجات 72 hpi مع منظمة-لوك. وتمثل البيانات الوسائل (± SD) من تجارب أجريت في ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

S1 الفيلم: الممثل 405 نانومتر (خلية السلامة الصبغة) و 568 شمال البحر الأبيض المتوسط (دسريد) قناة الصور الملتقطة خلال دورة وقت ح 65 (كل إطار = فاصل ح 5) بعد الإصابة دسريد منظمة للخلايا LD652. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

S2 الفيلم: الممثل 405 نانومتر (خلية السلامة الصبغة) و 568 شمال البحر الأبيض المتوسط (دسريد) قناة الصور الملتقطة خلال دورة وقت ح 65 (كل إطار = 5 ح الفاصل الزمني) بعد كوينفيكشن خلايا LD652 مع منظمة دسريد وفاكف-فلوريدا-التجارة والنقل- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا لقد قمنا بوصف فحوصات بسيطة على الأسفار والتلألؤ الشاشة للظروف التي إنقاذ منظمة النسخ المتماثل في الثقافات الخلية ليبيدوبتيران التقييدية. العدوى فاشل من منظمة في الخلايا ليبيدوبتيران يخلق نسبة الإشارة إلى الضوضاء ممتازة عند المعايرة للتعبير الجيني منظمة. على سبيل المثال، كانت الإشارات لو اكتشفت في ليساتيس من التهابات لوك منظمة واحدة ~ 1,000-fold أعلى من ليساتيس المصابة بصورية، بعد تغيير هذه الإشارات فقط تقريبا من شقين مر وقت ح 72. وفي المقابل، عزز كوينفيكشن من منظمة-لوك مع فاكف إشارات لو ~ أكثر 300-fold واحد التهابات لوك منظمة من 72 hpi. وهكذا، تعرض منظمة الإنقاذ فحوصات مجموعة ديناميكية ممتازة، تشمل عدة أوامر من ضخامة.

إحدى الخطوات الحاسمة في إعداد هذه الاختبارات ينطوي على قرار بالاعتداء لمنظمة الإنقاذ باستخدام النهج القائم على الأسفار أو التﻷلؤ. وقد أظهرنا أمثلة على كيفية ترميز منظمة دسريد يمكن جزيئي إشارات كمياً باستخدام تقنيات التصوير خلية يعيش وحزم البرامج التي تيسر الآلي التقدير الكمي للخلايا دسريد-الإيجابية في غياب أو وجود إنقاذ كوينفيكتيون. إذا كان الباحثون الوصول إلى قدرات التصوير خلية يعيش، هذه فحوصات غير مكلفة لإعداد وتسمح لهم بالتقاط مجموعة واسعة من النقاط الزمنية التي يمكن أن تساعد في الكشف عن الاختلافات في منظمة حركية النسخ المتماثل التي يمكن ملاحظتها فقط في وقت الضيق ويندوز. وفي المقابل، النهج المستندة إلى التﻷلؤ أساسا فحوصات نقطة النهاية التي تتطلب إعداد ليساتيس الخلية عند نقطة زمنية محددة مسبقاً، وإعداد ليساتي يمكن أن تكون مضيعة للوقت. من ناحية أخرى، لا تتطلب فحوصات على أساس التﻷلؤ معدات مجهرية متطورة — فقط قارئ لوحة قادرة على قراءة الإشارات التﻷلؤ. وعلاوة على ذلك، قد يستند التﻷلؤ فحوصات أكبر مجموعة ديناميكية من فحوصات مجهرية-على أساس أن حساب النسبة المئوية للخلايا المصابة. على سبيل المثال، في فحوصات مجهرية، دسريد-إيجابية الخلايا (التي تشير إلى الإصابة بمنظمة دسريد) فقط تتراوح من 0-100% من خلايا تم تحليلها في مجال رؤية. وفي المقابل، يمكن أن تتراوح إشارات لو بين لوك منظمة واحدة وظروف كوينفيكتيون (أو شروط الإنقاذ الأخرى) على عدة أوامر من ضخامة.

هي ميزة رئيسية لاستخدام نظام خلية منظمة-L. dispar المقدمة هنا للشاشة للثدييات إيمونومودولاتورس المرمزة بالفيروس فإنه يحدد طبيعته للتعرف على عوامل فيروسية التي تقمع ما هي القديمة ويحتمل أن تكون حفظت الردود المضادة للفيروسات التي تسبق الاستجابة الخاصة بفقاريات انترفيرون. في الواقع، تشير الملاحظات الأولية أن تمنع البروتينات A51R حفظت المضادة للفيروسات ubiquitin-بروتوزوم-الاستجابات فيما يتصل الخلوية (انظر مرس et al. 13 ومعطيات غير منشورة). اكتشاف الإنقاذ A51R فاكف من منظمة كانت أول مثال للإنقاذ الفيروس مغايرة بفيروس فقاريات في اللافقاريات مضيف13، ومن المرجح أن هذه النظم الفحص سوف تكشف إضافية إيمونومودولاتورس الفقاريات المرمزة بالفيروس . من المهم ملاحظة أن المفتاح لاستخدام منظمة الإنقاذ كما هو قراءات للظروف التي تمنع الحصانة المضيف النسخ المتماثل منظمة يجب أن تكون مقيدة بشكل كبير (أو فاشل) في نوع الخلية التي يجري دراسة منظمة النسخ المتماثل في. ولذلك، الثدييات معظم أنواع الخلايا يرجح غير مناسب لهذه الأنواع من الاختبارات، نظراً لأن منظمة يتطابق تماما في خلايا الثدييات. وهذا السبب في الخلايا ديسبار L. استخدمت هنا كنوع خلية المضيفة مقيدة بطبيعة الحال لمنظمة.

أظهرت دراسة سابقة في الخلايا المورفولوجية أن المكثفات الفيروسية للأدوية المضادة للفيروسات [رني] استجابات يمكن أن يحددها كوترانسفيكشن للتعبير والبلازميدات ترميز المكثفات [رني] مرشح وذاتية "البيت قطيع" فيروس رنا الجينوم أن يشفر بروتينات فلورية خضراء بدلاً من B2, [رني] الطبيعية القامع30. النسخ المتماثل للجيش الملكي النيبالي الجينوم "قطيع البيت" وإنتاج بروتينات فلورية خضراء تعتمد على قمع [رني] على عامل مرشح cotransfected و، وبالتالي، إنقاذ تعبير بروتينات فلورية خضراء أشار إلى قمع [رني]30. ويشير عملنا غير منشورة إلى أن overexpression من الفيروسات المشفرة [رني] مثبطات تنقذ أيضا منظمة-لوك التعبير الجيني في الخلايا ديسبار L. ، مما يوحي بأن هذا النظام يمكن استخدامها أيضا لتحديد المكثفات ردود [رني] في سياق الإصابة ممرض فيروسية حسن النية بدلاً ريبليكون. في الواقع، استنتاج مفاده أن [رني] IMD، ومسارات أوبيكويتين بروتوزوم ذات الصلة بالمساهمة في تقييد النسخ المتماثل منظمة في الخلايا ديسبار ل 13 يوحي بأن الخصوم الفيروسية مسارات المضادة للفيروسات عدة قد يحددها منظمة فحوصات الإنقاذ المقدمة هنا.

حد محتملة من هذه الأساليب الفحص فيما يتعلق بتحديد هوية المضيف البروتينات المضادة للفيروسات أن تسلسل الجينوم L. dispar ليست متاحة بعد. ومع ذلك، هناك متاحة ديسبار ل. ترانسكريبتوميس التي يمكن استخدامها لتحديد أهداف المضيف المرشح [رني] ضربة قاضية26،،من2728. بالإضافة إلى ذلك، أثبتنا سابقا أن منظمة مقيد في خطوط الخلايا المستمدة من غيرها lepidopterans13 التي تحتوي الآن جينوم متاحة للجمهور (مثل، سيكستا منداكا)31. ولذلك، يمكن أن تحل محل خطوط الخلايا المستمدة من lepidopterans الأخرى مع تسلسل الجينوم الخلايا ديسبار L. الموصوفة في البروتوكول هنا.

نظراً للنمو الاقتصادي وتهديد الصحة العامة سيتناقش32، فحوصات الكشف المقدمة هنا قد توفر استراتيجيات جديدة التعرف على الميزات الجديدة من التفاعلات المفصليات-المضيفة التي قد تكون لها قيمة في تصميم الأدوية الجديدة المضادة المداواة. علاوة على ذلك، توفر الأدوات المعروضة هنا بسبب فهمنا المحدود نسبيا لآليات ليبيدوبتيران لتقييد النسخ المتماثل فيروسات الرنا، فرصاً جديدة للتحقيق في آليات الدفاع المضيف مرمزة بواسطة هذا مهم اقتصاديا ترتيب للحشرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الإدارة العامة كانت مدعومة بتمويل من جامعة تكساس جنوب غرب مركز طبي "برنامج الباحثين وهبت". يشكر المؤلفون مايكل ويت (مركز العلوم الصحية جامعة تينيسي) وشون ويلان (مدرسة هارفارد الطبية) لتوفير منظمة دسريد ومنظمة-لوك. كما يشكر المؤلفون غاري Luker (جامعة ولاية ميشيغان كلية الطب) لهدية نوع من سلالة فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well tissue culture plates CELLTREAT 229106
24-well tissue culture plates CELLTREAT 229124
10 cm tissue culture dishes Corning C430167
Grace’s Insect Medium Sigma G8142
EX-CELL 420 Sigma 14420C
Fetal Bovine Serum - Optima Atlanta Biologicals S12450
Growth medium 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1% antibiotic-antimycotic solution and 10% Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) Sigma A5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Sigma D8662
Serum Free Media (SFM) Thermo Fisher 10902096
Cytosine arabinoside Sigma C1768
Transfection reagent Thermo Fisher 10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Corning 25950CQC
Reporter lysis buffer 5x Promega E3971
Luciferase Assay Reagent Promega E1483
96-Well Microplates Corning 3915
Mouse anti-FLAG antibody Wako 014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibody Abcam ab21176
Mouse anti-actin antibody Sigma A2066
Mouse anti-VSV M N/A N/A Dr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3L N/A N/A Dr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dish Lab-Tek II 155409
Cell viability dye Thermo Fisher C12881
FLUOstar microplate reader BMG Labtech FLUOstar
Confocal microscope Olympus FV10i-LIV
Image analysis software Olympus v1.18 cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge Eppendorf 22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging System Li-COR Biosciences Odyssey Fc
LD652 cells N/A N/A Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cells ATCC CRL-2761
BHK cells ATCC CCL-10
HeLa cells ATCC CCL-2
BSC-1 cells ATCC CCL-26
in vitro transcription and purification kit Thermo Fisher AM1626
PCR purification kit Qiagen 28104

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).
  2. Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
  3. McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
  4. Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
  5. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  6. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
  7. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
  8. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
  9. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), Maywood, NJ. 962-967 (2011).
  10. Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
  11. Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
  12. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
  13. Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
  14. Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera,, J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
  15. Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
  16. Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394 (2009).
  17. Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
  18. Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
  19. Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
  20. Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
  21. Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
  22. Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
  23. Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  24. Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
  25. Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522 (2014).
  26. Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
  27. Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190 (2013).
  28. Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
  29. Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
  30. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  31. Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
  32. Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 139، المفصليات، فيروس التهاب الفم الحويصلي، التفاعلات المضيف الفيروس، فيروس اللقاحية، poxvirus، مجموعة المضيف، الحصانة المضادة للفيروسات، الشاشة، ليبيدوبتيران، Lymantria dispar
التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rex, E. A., Seo, D., Gammon, D. B.… More

Rex, E. A., Seo, D., Gammon, D. B. Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors. J. Vis. Exp. (139), e58244, doi:10.3791/58244 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter