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Immunology and Infection

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58244
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

アルボ ウイルス複製とアルボ ウイルス複製を制限する 2) 真核生物の宿主因子を促進する免疫調整物質 1) ウイルス エンコードを識別するためにプロトコルを紹介します。これら蛍光や発光を用いる方法は、急速に量的な読み出し信号対雑音比の低い単純なアッセイのアルボ ウイルス複製を取得する研究者を許可します。

Abstract

RNA 干渉とゲノム編集ベースのスクリーニングのプラットフォームは、ウイルスの複製を制限する宿主細胞因子を識別するために広く使用されています。ただし、これらの画面は自然寛容な検討中のウイルスの病原体が細胞で普通行なわれます。したがって、制御条件下でウイルスの堅牢なレプリケーションはこれらの画面のダイナミック レンジを制限があります。さらに、これらの画面はウイルスがホストによく適応し、抗ウイルス防御に対抗できる場合にウイルスの複製を制限する細胞防御経路を簡単に識別することができないがあります。この記事では当然中止になる感染症の水疱性口内炎ウイルス (VSV) などアルボ ウイルスによるセンター スクリーンを使用してウイルス-宿主間相互作用を探索するための新しいパラダイムをについて説明します。双翅目昆虫と哺乳類のホストの広い範囲で複製 VSV の能力、にもかかわらず VSV はマイマイガ (強マイマイガ) などの鱗翅目昆虫由来細胞株の様々 なポスト エントリ、感染を受けます。しかし、これらの失敗に終わった VSV の感染症救えることができる""ホスト細胞の抗ウイルス防御が危害を受けたとき。便利なレポーター遺伝子と制限・ l ・区の VSV の株について述べるセルラインはアルボ ウイルスの制限に関与する宿主因子を識別するためにセットアップ画面に組み合わせることができます。さらに、VSV レプリケーション重感染中または哺乳類のウイルスによってエンコードされているを含む異所性の表現を救出するバイラル エンコードされた因子の同定にこれらのスクリーニング ツールの有用性をまた示します。L. 区細胞の複製 VSV 自然の制限を監視する単純な発光と蛍光ベースの試金の使用ができ、VSV 救助を促進する条件のスクリーニング時高い信号対雑音比を提供しますVSV レプリケーションに変更。これらの方法は、応答したホストとウイルスの免疫回避要因間の相互作用を理解するため貴重です。

Introduction

生産的、特定のホストに複製するウイルスの機能は、一部ウイルス エントリおよびレプリケーション1をサポートする宿主細胞因子の可用性によって決まります。ウイルス-宿主範囲は、カウンター細胞の抗ウイルス防御ウイルス複製2,3妨げになるそれ以外の場合にウイルスの容量によっても決定することができます。それは最終的にウイルスが特定のホストにそのライフ サイクルを完了できるかどうかを決めるこれらの複雑なウイルス-宿主相互作用の結果です。ウイルス複製のすさまじいホストの可能性がある病原性の結果を与えられて、それは失敗に終わったと生産性のバランスをひっくり返すかもしれないキー ウイルス-宿主間の相互作用の理解を深める実験的戦略を開発する重要です感染症。ウイルス-宿主相互作用の分子の機能を解明新しいと代替の抗ウイルス治療戦略の開発に尽力されます。

RNA 干渉 (RNAi)4,の出現で5とゲノム編集ツール (e.g、CRISPR Cas9、亜鉛指 TALENs 核酸分解酵素)6、7、が可能になりつつ実験を変更する、。ゲノムの細胞因子の発現は拡張し、ウイルスの複製におけるこれらの変化の影響を探索します。確かに、多数の RNAi とゲノム編集による画面のウイルス-宿主間相互作用8,9,10、の新たな側面を明らかにした無脊椎動物と脊椎動物のホスト細胞の種類で行われています。11,12. これらの画面は、通常ウイルス記者、ホタルのルシフェラーゼ (リュック) や蛍光タンパクなどをエンコードを採用 (e.g、GFP、下流)、読み出しとしてウイルス遺伝子発現を定量的に評価するの便利な手段を提供する。ウイルスの複製9,12。この方法により、いずれかを促進するまたはそれぞれ増加または減少、によって証明されるウイルスの複製の反感を買う、ウイルス記者信号9,12ホスト因子を特定する研究者です。ただし、ほとんどの場合で、これらの画面はよく検討されているホスト セルの種類に適応しているウイルスを使用して行われています。この戦略は、ウイルスの病原体の自然宿主と共進化の関係を理解するために重要なことができますが、それは暴く宿主の抗ウイルス因子の使用に関する基本的な懸念を提起します。これらのケースでウイルス記者の向上は RNAi ノックダウンが捜されているまたは通常ウイルスの複製を妨げる細胞因子の不活化に信号を送る。まず、ウイルスがロバスト制御条件下で検討されている宿主細胞で複製することが既にいる場合画面 (すなわち背景と強化されたウイルス記者信号を区別する能力) のダイナミック レンジが制限あります。第二に、この問題はウイルスが宿主細胞によく適応し、画面でターゲットにされているホストの防衛の経路に対抗するに有効である状況によってさらに悪化します。

伝統的なウイルス-宿主相互作用スクリーニング法に関する上記の懸念のため、鱗翅目の昆虫細胞で当然のことながら失敗に終わったアルボ ウイルス感染を悪用するウイルス-宿主間の相互作用を研究するための新たなパラダイムを開発しました。この戦略は、よく研究人間アルボ、VSV がマイマイガ (L. マイマイガ)13由来細胞で失敗に終わった感染を受ける観察から派生します。VSV は自然哺乳類を宿主に双翅目昆虫 (すなわちチョウバエ) によって送信し、の脊椎動物のホスト細胞文化とin vivo14無脊椎動物の広い範囲に感染するのに実験的に示されています。VSV の 11 kb 負意味一本鎖 RNA ゲノムそれぞれはエンベロープ ウイルス粒子を構成するタンパク質に翻訳される 5 つのサブゲノム Mrna をエンコードします。ただし、VSV 逆遺伝系リュックまたは 5 自然 VSV 遺伝子製品15,16,17に加えて、蛍光タンパク質をエンコード レプリケーション主務系統の作成許可されています。これらのレポーター蛋白質は VSV virion に組み込まれません、VSV 遺伝子発現後のエントリに発生する便利な読み出しを実現できます。VSV 系統 GFP などリュックのエンコーディングを使用して、我々 は以前に VSV 遺伝子発現は LD652 セルのエントリ時に厳しく制限されることと、VSV 抗体は感染後 72 時間 (hpi) で増やさない。対照的に、VSV と哺乳類のポックス ウイルス、ワクシニア ウイルス (VACV)、LD652 細胞の重感染は、この時点で VSV 遺伝子発現と抗体の対数の向上につながります。VACV を受ける初期遺伝子発現、DNA 複製と LD652 細胞感染後期遺伝子発現 VACV レプリケーション サイクルが不完全なウイルス粒子の形態形成18のため最終的に失敗に終わった。~ 192 kb DNA ゲノム VACV の多くはホストの免疫反応の19の抑制することによってウイルスの複製を促進する免疫調節プロパティを表示 > 200 タンパク質をエンコードします。したがって、我々 は VACV 重感染による LD652 細胞の複製 VSV「レスキュー」だった通常 VSV の複製を制限するL. 区応答を抑制する免疫調整物質 VACV を介した可能性が高いことを仮定しました。この、サポート ホスト RNA ポリメラーゼ II 阻害剤アクチノマイシン D LD652 細胞の治療はまた VSV レプリケーション LD652 細胞における転写非依存性ホスト応答ブロック VSV レプリケーション後エントリ13のことを示すを救助します。

上記の示唆、LD652 細胞の VSV 感染への当然のことながら制限的な性質があります比較的低バック グラウンド レポーターの VSV でエンコードされた信号 (すなわちホストを阻害するものを強化する条件のスクリーニング抗ウイルス防御)。ここでは、鱗翅目昆虫細胞で VSV 制限を緩和条件の蛍光または画面にリュックに基づく試金を使用するための方法を提供します。まず、これらの試金を使用して破る VSV 制限いずれかの重感染実験中または候補ウイルス因子の異所性発現によってエンコードされたウイルスの免疫調節因子を特定する方法を示します。例として、我々 は我々 は救助その他のポックス ウイルスの要因13の不在で VSV レプリケーション免疫調節因子の新しい家族の一員として A51R のポックス ウイルス符号化された蛋白質を識別するためにこれらのスクリーニング技術を使用する方法を示します。第二に、RNAi 制限 VSV LD652 細胞感染のスクリーニングを使用して直接アルボ制限13真核生物の宿主因子を特定する方法を示しています。

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Protocol

1. 全般的な強区(LD652) 細胞とウイルス培養

  1. LD652 細胞培養とめっき
    1. L. 区の文化-派生 LD652 細胞維持培 (材料表) 通常の雰囲気下で 27 ° C で培養した細胞の単層。10 cm の組織文化扱う料理の細胞を維持し、80% の confluency に達したら細胞を通過します。
    2. プレート、メディア化単分子膜 (これらの細胞には trypsinization を遊離させるのには不要) を繰り返しをピペッティングによるプレートから付着 LD652 細胞を取り除くと 1 x 10 の5セル/mL のおおよそ密度の成長媒体のサンプルを希釈します。24 ウェル プレートの希釈文化/井戸の 1 mL のピペットします。各時間ポイント (最大 8 治療/プレート) 3 つのレプリケートの井戸/トリートメント タイプの最小を種します。
    3. 1 時間の最小値のために解決するために細胞を許可します。
  2. ワクシニア ウイルス作製
    1. VACV の在庫の準備、hela 細胞でウイルスを増幅する細胞20またはアフリカミドリザル腎細胞 (BSC 1 または BSC 40 セル)20,21,22。
      注: VACV ひずみウェスタン リザーブ (VACV WR) は、ここで説明した試金でよくはたらきます。
    2. BSC 1 または BSC 40 セル20,22プラークアッセイを介してVACV ひずみを滴定しなさい。
      注: すべては VACV 多様性感染症 (MOI) のここに記載した LD652 細胞感染、BSC 40 プラクの試金から得られる価に基づいて示されます。
  3. 水疱性口内炎ウイルスの準備
    1. VSV 株式を準備、BHK 細胞23でウイルスを増幅します。
    2. BSC 40 または BHK 細胞膜13,23にプラクの試金で VSV 滴定しなさい。
      注: すべての VSV モアは BSC 40 プラクの試金から得られる抗体に基づく細胞感染症 LD652 のここで説明。

2. 蛍光ベース VSV マーカーレスキューアッセイ共同感染と住セルイメージ投射を使用して

  1. シードと LD652 細胞の伝染
    1. 8 よくチャンバーの 40,000 の LD652 細胞/ウェルをプレートします。
    2. 蛍光ベースの生細胞イメージング、VSV 系統蛍光タンパク質をエンコードを使用します。ここで示した実験は VSV した DsRed17、他の VSV の蛋白質に融合しない無料の下流蛋白質を表現する遺伝子組換え VSV ひずみを使用します。
      注: LD652 細胞の VSV 伝染がない 96 hpi によって変性あり、したがって、細胞死が交絡因子この時間枠内で VSV レプリケーションを評価するとき。
    3. 無血清メディア (SFM で VSV した DsRed と VACV-フロリダ州-GFP を準備します。材料の表)1 の 25、MOI でそれぞれ。
      注: VACV-フロリダ州-GFP は、リュックと GFP の24の融合を表現する組換え VACV 株です。25 以上の慣性モーメントを用いた VACV 系統により感染した13を LD652 のすべてのセルにされます。別の coinfecting ウイルスを使用している場合、MOI はユーザーによって経験的に定められる必要があります。各感染症の治療重複する井戸でセットアップする必要がありますは、モック感染治療のみ SFM がセルに追加されます。
    4. 0.2 ml 接種 27 ° C で 2 時間の細胞をインキュベートします。
    5. 0.5 ml/成長媒体のセルを洗浄します。
    6. 27 ° c. の 45 分の成長媒体の細胞生存性色素 (材料表) の 25 μ M で細胞をインキュベートします。
    7. メディアを吸引し、洗浄 1 x 0.5 ml/余分な染料を取り除くために。
    8. 0.3 mL/成長媒体の細胞を維持します。
  2. セル画像のキャプチャをライブします。
    1. 8 よくチャンバーディッシュを読み込むし、共焦点顕微鏡 30 分事前に入れます。
      注: 部屋の温度 20-25 ° C から視覚化される LD652 細胞が、最適な条件の部屋の温度は 27 ° c. に調整必要があります。
    2. 位相コントラストの画像設定と同様に、イメージを作成する各蛍光マーカー蛋白質の適切な励起/蛍光設定を設定します。
    3. 各チャンネルのレーザーの強さを調整します。
      注: これは最後の実験で使用される時間のコースにおいて蛍光シグナル強度の範囲を決定するためのパイロット実験を実行している必要があります。
    4. 必要な時点までの伝染の持続期間のため各すべての 1-5 h の位相コントラストと蛍光画像をキャプチャ対物レンズ 10 倍を使用して (e.g。、48-72 hpi)。
      注: 各井戸文化全体の感染率を推定するビューの複数のフィールドをキャプチャすることが重要です。
  3. 画像解析
    1. 適切な蛍光チャネルの自動画像解析用の画像解析ソフトウェア (e.g。 405、488 nm nm、568 nm)。
    2. 感染している細胞の割合を計算する除算 VSV 感染を示す蛍光セルの合計数 (e.g、VSV した DsRed 感染した DsRed 陽性細胞) の細胞性色素でラベル付けされた実行可能なセルの合計数で。それぞれのフィールドはビューからすべての治療法の間で

3. 一般的なウイルス感染プロトコル LD652 細胞における発光ベース VSV 救助の試金のため

  1. 接種の準備
    1. 感染する前に 30 分は VSV リュック16 (組換え VSV ひずみ無料ホタル ルシフェラーゼ蛋白質はない任意他の VSV 蛋白質に溶けるその表現) の株式を解凍します。VACV 重感染中 VSV リュック救助のための試金場合も氷の上 VACV WR ウイルスを解凍します。
      注: (WR) VACV 以外にも他のウイルス、重感染中に VSV リュックを救う可能性がありますが、これは各ユーザーによって、経験的に決定する必要があります。
    2. 10 と 25 の MOI は、それぞれ、0.2 mL の合計接種ボリュームを追加するとき達成されるように SFM に VACV WR の存在有無で VSV リュックを希釈して接種の準備/まあ。
  2. 細胞の伝染
    1. 単層の妨害を避けるために慎重に成熟した LD652 メディアを吸引し、ウイルス/ウェルの 0.2 mL を接種します。今回は、0 hpi として定義されます。ネガティブ コントロール治療の「モック感染」として機能する追加の井戸に滅菌 SFM を追加します。
    2. 27 ° C で 2 時間菌の細胞をインキュベートします。
    3. 2 hpi 吸引により接種を削除/1 mL に置き換えると LD652 成長媒体をよきます。
    4. 感染 24-72 hpi を続行するを許可します。

4. ルシフェラーゼ アッセイ

  1. セル lysates の準備
    1. 慎重に、上清を吸引ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 1 mL を加えて、/まあ。
    2. DPBS に細胞をこすり 1 mL シリンジのプランジャーを使用する。
    3. 遠心チューブ 400 x gで 4 ° C で 20 分間遠心し、細胞を転送します。
    4. 一方、記者の換散バッファー (RLB) 滅菌 H2o ・ x 5 の 1 x 希釈を準備します。
    5. 以下の遠心分離、細胞ペレットを乱すことがなく、DPBS を吸引します。
    6. 1 の 150 μ L でペレットを再懸濁します x RLB。
    7. 凍結融解性常温水お風呂の急速な雪解けに続いて-80 ° C のフリーザーで 5 分孵化を使用して x サンプル 1分析する準備が整うまで-80 ° c lysates を格納します。
  2. ルシフェラーゼ アッセイ
    1. 雪解けの氷の溶解液。
    2. ソリッドの黒または白 96 ウェル マイクロ プレートのウェルに lysate の 20 μ L をピペットします。
    3. 各ウェルに 100 μ L のルシフェラーゼ アッセイ試薬を追加します。
    4. すぐに、ルミノを使用して照度を測定 (特定の luminometers の適切な設定はユーザーによって、経験的に決定する必要が)。
  3. ルシフェラーゼ アッセイ分析
    1. コントロール トリートメント (代表結果) から得られる LU 読みに各治療のため LU 信号を正規化します。少なくとも 3 つの独立した実験が行われた後、適切な統計テストによって LU はそれぞれ治療/対照群から得られた平均を分析できます。

5. イムノブロット

  1. SDS ページの適切な試薬およびインストルメンテーションを使用して、後続のイムノブロット リュックの試金の抽出の lysates を使用します。

6. LD652 細胞培養から VSV の価

  1. 手順 1.1 によると LD652 細胞をプレートします。
  2. ステップ 3 に従って細胞をウイルスに感染します。
  3. 必要な時点で無菌マイクロ遠心チューブ用に培養上清を収集します。
  4. 4 ° C で 10 分間 1,000 x gを使用してセルをペレットし、培養上清を新しいチューブに転送します。
  5. -80 ° C で培養上清を保存または BSC 40 セルのプラクの試金によって滴定を行います。
    注: VACV に含まれている LD652 細胞培養から VSV を滴定は、残留 VACV 粒子が BSC 40 単分子膜13にプラークを形成するを防ぐために、2 の hpi 内 BSC 40 文化メディアに 100 μ g/mL 36. (AraC) を追加することをお勧めします。AraC がウイルスの DNA ポリメラーゼ阻害剤 VACV DNA 複製25をブロックが VSV のレプリケーションには影響しません。

7. 発光ベース VSV のバリエーションを救う LD652 細胞の試金: RNAi とプラスミドのトランスフェクション実験

  1. ウイルスの RNAi によるノックダウンの dsRNA の準備または成績証明書をホスト
    1. T7 プロモーターのいずれかを対象とする (TAATACGACTCACTATAGGG) の 5' 端に設計遺伝子特定のプライマーの尾 coinfecting ウイルス (例えばVACV) または興味のL. 区mrna。これらのプライマーは、効果的な RNAi によるノックダウンの 400-600 bp の PCR の製品を生成する必要があります。ギャモンらを参照してください。13のプライマー シーケンスは LD652 セル dsRNA を介した RNAi による成績証明書下ノックダウンの VACV またはL. 区に使用されます。
      注: L. 区mRNA から成績証明書を識別することができますは、 L. 区トランスクリプトーム データベース26,27,28を公開しました。
    2. で生成、DNA テンプレート経由でRT-PCR (cDNA 合成: 50 ° C の 1 サイクル 30 分;PCR: 94 ° C の 40 のサイクルの 15 s、30 ° C、50 s、および 45 68 ° C それぞれ秒)。
    3. PCR 精製キットを使用して PCR の製品を浄化します。
    4. 精製 PCR の製品を使用すると、テンプレートとして、体外を書き写すし、浄化 dsRNAの in vitro転写と精製キットを使用します。
  2. DsRNA またはプラスミッド DNA LD652 細胞へのトランスフェクション
    1. 種子 1 x 10 の5セル/24 ウェル プレートのウェルとセルを少なくとも 1 時間のために解決しましょう。
    2. 導入するのにも、SFM の 100 μ L にトランスフェクション試薬の 4 μ L を薄くしなさい。最大 15 分室温で孵化させなさい。これは、実行するすべての transfections のマスター ミックスを作るためスケーリングできます。
    3. 導入するためにも、各 SFM の 100 μ dsRNA または合計プラスミド DNA の 1 μ g まで希釈します。最大 15 分室温で孵化させなさい。
      注: 私達は 1 μ g の dsRNA/105 LD652 細胞のトランスフェクションに十分であることを発見した以前 > 80% ノックダウンいずれかのウイルスまたはホスト成績13dsRNA の用量が必要変更実験セット持ち上げる/条件する必要が経験的決定されます。
    4. 1:1 の比率でトランスフェクション試薬と dsRNA/プラスミッド DNA の希釈を組み合わせる (例えば、希薄 dsRNA の 100 μ L は希薄トランスフェクション試薬の 100 μ L を混合) 室温で 20 分間インキュベートし、。
    5. 一方、1 ml/SFM の井戸を洗浄し、各ウェルに SFM の 500 μ L を追加します。
    6. ゆっくりとトランスフェクション試薬 dsRNA (またはプラスミッド DNA) を追加混合物を各ウェルに滴下します。
    7. 5 h の細胞でのトランスフェクション試薬を孵化させなさい。
      1. RNAi の実験成績証明書 (例えばVACV)、coinfecting ウイルスによってエンコードのノックダウンに置き換えますトランスフェクション試薬 5 h トランスフェクション潜伏期間後 VSV リュックを含むウイルスの接種材料 (VACV の有無や別の coinfecting ウイルス) (ステップ 3)。その後、完全な成長メディア 2 hpi VSV リュックを含むウイルスの接種材料を取り付けます。リュックの試金 (ステップ 4) は、ウイルスゲノム転写産物を coinfecting のノックダウンは VSV リュック救助の損失につながるかどうかは、さまざまな時点での抽出の lysates を実行できます。
      2. RNAi 実験L. 区成績の RNAi、トランスフェクション ミックスを完全な成長媒体に置き換えるし、VSV リュック (手順 4) に感染する前に 24 時間の結果として起きるにノックダウン。リュックの試金 (ステップ 4) は、 L. 区成績のノックダウンが VSV リュック救助を促進するかどうかを決定するためのさまざまな時点での抽出の lysates を実行できます。
      3. 実験候補免疫調節薬を表現するプラスミド発現ベクターの transfections、トランスフェクション試薬を置き換えるし、VSV リュック (ステップ 4) で感染前に 24 h の蛋白質の表現を可能にします。リュックの試金 (ステップ 4) は、候補免疫調節タンパクの発現は VSV リュック救助を促進するか判断するための様々 な時点で抽出された lysates を実行できます。
        注: ここでトランスフェクションの効率は 40-6013で 1 μ g/よくプラスミド DNA 結果の説明トランスフェクション条件。

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Representative Results

VACV 重感染時に VSV 救助を監視する生細胞イメージング アプリケーションの例として LD652 セルが 8 ウェル チェンバード皿にメッキ モック感染や VSV 下流に感染 (MOI = 1) VACV-フロリダ州-GFP の有無で (MOI = 25)。VSV した DsRed 無料蛋白質としてした DsRed を表現、VSV 構造蛋白質 (図 1 a) に融合しないため、VSV エントリと遺伝子発現を開始した後のみ検出されます。すべてのセルはセル実行可能性色素標識細胞の蛍光信号の保持を促進する膜非透過性の製品に変換されます、細胞膜を自由に通過すると、標識しました。画像を取得したすべての 5 h 65 hpi、405 を使用最大 488 nm nm、568 nm、およびホワイト光それぞれ細胞生存性染料、VACV FL GFP、VSV 下流、および位相コントラスト (PC) チャンネルをキャプチャするフィルター。単一の感染状況は、LD652 セル制限 VSV した DsRed レプリケーションしたがって、細胞の数が少ない展示した DsRed 信号です。しかし、VACV FL GFP とした DsRed の VSV の重感染は時間コース (図 1 b) の終わりによって下流の信号を表示するほとんどの細胞の結果します。各時点で撮影した画像が画像解析ソフト、405 が施された nm と 568 nm チャンネルの画像は、自動的にそれぞれの合計とした DsRed 陽性細胞数を決定する使用されました。各治療のため下流の信号を表示するセルの割合が 568 nm チャネルでの肯定的な信号でオブジェクト (セル) を 100% 乗算によって続いて各時点の 405 nm チャネルで指定されたオブジェクトの数で除して計算されます。.図 1に示すとおり、VSV した DsRed 単一感染細胞の ~ 2 %65 hpi によってした DsRed 陽性であった。対照的に、VSV した DsRed + VACV-フロリダ州-GFP 西欧のセルの 〜 77% この時点で下流陽性であった。映画 S1 と S2は、それぞれ単独感染と重感染条件で全体の 65 h 時間経過の VSV した DsRed 感染の進行を示しています。VACV-フロリダ州-GFP による GFP 発現が下流の信号は、十分な VACV 遺伝子発現が VSV した DsRed 救助 (表示されません) の前に必要なことを示す前に、10 の hpi によって検出された注意してくださいすることが重要です。総称して、これらの結果は明確に VACV 重感染で VSV した DsRed レプリケーションの救助を示します。Coinfecting ウイルスは VSV した DsRed を救うことができませんでした、我々 は単独感染と重感染治療した DsRed 陽性細胞の等しい割合に期待。

LD652 セルで VSV レプリケーションは、VSV リュック系統 (図 2 a) を使用する場合、発光に基づく試金を使用してまたは定量化できます。例として、図 2 bは、モック感染細胞または VSV リュック感染細胞から 72 時間経過でタンパク リュック アッセイの結果を示しています (MOI = 10) VACV WR の有無で (MOI = 25)。VSV リュック レプリケーションの肯定的な救助は、単一の VSV リュック感染から溶解液と比較して、重感染細胞から調製した溶解液で検出された任意の LU の対数の増加によって示されます。この試金の単一の VSV リュック ・感染症の治療で観察から LU の測定値を変更する、重感染の障害によって示される否定的な結果。必要な準備の lysates も、免疫ブロットので重感染治療で VSV 遺伝子発現を確認する使用できます。たとえば、図 2は、典型的なイムノブロット結果 VSV エンコード リュックと行列の (M) 蛋白質モック、VSV ・ リュックと VSV リュック + VACV WR 治療 72 hpi から調製した溶解液です。VACV I3L 蛋白質の免疫ブロットを務め VACV 感染症のマーカー、細胞のアクチンのイムノブロット ローディング コントロールとして使用されていた。さらに重感染 lysates VSV エンコード リュックと M 蛋白の明確な強化は、VACV で VSV 救助を確認します。最後に、生産的な VSV レプリケーションはこれらの LD652 細胞の培養から培養上清を収集し、BSC 40 単分子膜 (図 2 D) にウイルス感染を滴定によって確認できます。この結果は、VACV の中にのみ、重感染は生産的複製 VSV を示しています。

LD652 細胞で VSV レプリケーションを救出することができる coinfecting のウイルスが表示されると、RNAi スクリーニングは coinfecting ウイルスによってエンコードされた VSV 救助に貢献する要因を識別するために使用できます。この実験では、救出ウイルス VSV リュック重感染中に「救助の損失」表現につながる RNAi 状態の画面。我々 は以前 VACV でエンコードされた成績証明書13の数十の RNAi スクリーニングを通じて VSV 救助因子として VACV A51R タンパク質を同定しました。例としては、小規模のバージョン、この画面 (図 3) の締めくくっているが。体外のトランスフェクションによる RNAi ターゲット エンコード coinfecting ウイルスによって議事録二本を転写。ここに示すデータ、ウイルス性転写 VACV A50R、A51R、および A52R タンパク質をエンコードは RNAi ノックダウンの標的となった。救助の損失のため否定的な制御と細胞も二本 GFP エンコーディングのトラン スクリプトをターゲットを導入させた。表現型救助の損失のためのポジティブ コントロールとして細胞はリュック エンコーディング成績証明書に対して二本を導入させた。この治療法は重感染中に LU 信号の強い損失を生成し、研究者/RNAi トランスフェクション プロトコルが動作していることを確認を役立ちます。VSV リュックに感染された細胞 dsRNA トランスフェクションの 5 h は後、(MOI = 10) と VACV WR (MOI = 25)。LU 信号のバック グラウンド レベルを確立するのみ VSV リュックと別の感染症も行った。Lysates された 72 hpi を収穫し、リュックの試金で使用されます。GFP dsRNA コントロール治療に dsRNA トリートメントで VSV 救助のレベルを比較すると、結果を示す救助表現型の強い損失を VACV A51R のノックダウンに生成 A50R と A52R のノックダウンは否定的な結果を無駄を生成するのに対し救助の GFP dsRNA と比較して)。

RNAi VSV 救助に貢献するウイルスの要因を識別するためにスクリーニングする代わりに、ノザン候補 LD652 細胞におけるウイルス因子と VSV リュック救出のため、試金。これは、p16629など適切な発現ベクターへ興味の候補遺伝子のクローニングと VSV リュック挑戦前に LD652 セルにこれらのプラスミドを株で実現できます。例として、図 4 aは GFP をタグ付きのフラグ (FGFP) またはタグ付きのフラグ A51R レスキュー実験を示しています (FA51R) p166 ベクトルは VSV リュック感染に続いて、様々 な濃度で LD652 セルに導入させた (MO = 10) 24 h 後。VSV 救出のためネガティブ コントロールとして追加文化はモック transfected あったし、プラスミド DNA を受信しませんでした。Lysates 文化 72 hpi から収集されたリュックの試金を受けたとします。FA51R 治療は複数の用量でモック transfected 治療上強化された LU 信号によって示されるように VSV 救助のプラスの結果を生産しました。対照的に、FGFP 治療テストいずれかの用量で VSV 救出のため陰性であった。図 4 aから溶解液の免疫ブロットは、FGFP と FA51R 蛋白質 (図 4 b) のような式を確認しました。

候補者l. マイマイガ要因の RNAi スクリーニングを使用して、我々 は LD652 セルで VSV の制限が抗ウイルスの RNAi の経路に属する様々 な細胞要因によって媒介される示されている (例えば、 AGO2 およびダイサ 2)、核因子カッパ B (NF-κ B)-関連の IMD 経路 (例えば、風味)、ユビキチン-プロテアソーム システム (e.g。、polyubiquitin)13。例として我々 は二本のノックダウンに VSV リュック レプリケーションを強化L. 区成績をターゲットと小規模のバージョン、これらの RNAi 実験を繰り返している (e.g、AGO2、ダイサー 2、薬味、polyubiquitin) または (AGO1 効果がなかった。)13。DsRNA トランスフェクションの 24 時間後のセルが RNAi 治療がネガティブ コントロール GFP dsRNA 治療上 LU 信号を強化されたかどうかは、72 時間の VSV リュックに挑戦しました。LU 信号を高める RNAi 治療は VSV レプリケーションをターゲットのトラン スクリプトでエンコードされた要因に制限を示します。RNAi ノックダウンのポジティブ コントロールとしてリュック エンコーディングのトラン スクリプトをターゲット二本も並列処理の導入させた。LU はそのノックダウン ~ 10 を生成するため、RNAi スクリーニングを使用してホストでエンコードされた制限要因を識別するために比較的簡単だ GFP dsRNA コントロール治療法で検出信号低バック グラウンドに起因-LU 信号 (の 1,000 倍の増加に図 5)。したがって、VSV 制限を和らげる RNAi ノックダウン状態のホストの画面に LD652 セルで VSV 遺伝子発現のレベルを比較的低バック グラウンド利用することが可能です。

Figure 1
図 1: 蛍光ベースの生細胞イメージングを用いた LD652 細胞のウイルスの重感染による VSV 救助の Id 。(A) このパネル下流 (dR) の遺伝子の位置を示す VSV した DsRed ゲノムの模式図を示しています。(B) これらの代表 10 X 共焦点顕微鏡画像は、キャプチャされた 60 hpi です。405 nm チャネルを示します実行可能なセルの汚れ、488 nm チャンネル VACV-フロリダ州-GFP 感染、表し、568 nm チャンネル VSV した DsRed 感染。位相コントラスト (PC) 画像も表示されます。スケール バー = 100 μ m。 このパネル (C) 全体 65 h 感染時間経過した DsRed 正 LD652 細胞の割合を示します。各時点の下流信号を示す細胞の平均 (SD) のパーセンテージが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: リュックの試金を使用して LD652 セルで VSV 救助の評価します。(A) このパネル VSV リュック ゲノムの模式図を示しています。(B) このパネルは (リュック) アッセイ モック感染細胞または VACV WR の有無で VSV リュック、感染細胞からの lysates の任意のライト ユニットを示しています。(C) このパネルのリュック、VSV M、VACV I3L、イムノブロットとパネルAから溶解液で細胞のアクチン蛋白質収集 72 hpi。(D) このパネルは、パネルBから得られた培養上清中 VSV リュック価を示しています。BとDのパネルで定量的なデータは、3 通実験から手段 (± SD) を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: LD652 細胞の重感染中に RNAi スクリーニングを通じてバイラル エンコードの VSV 救助因子の同定します。このパネルは、VSV リュック単独感染細胞から溶解液で検出された LU を基準にして、指定した RNAi 治療後セル VSV リュックと VACV WR 72 hpi から溶解液で検出された LU のフォールドの変更を示しています。データは、3 通実験から手段 (± SD) を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: LD652 細胞におけるウイルス免疫調節剤の過剰発現による VSV の救助します。モック transfected (もどき) または FGFP または FA51R のいずれかの p166 発現プラスミドをトランスフェクトした VSV リュック感染細胞 72 hpi から、リュックを試金 (A) このパネル ショー。それぞれの治療から LU の信号は、モック transfected 制御治療法で検出される信号を正規化されました。データは、3 通実験から手段 (± SD) を表します。(B) このパネルは、パネルはからフラグとアクチン抗体エスディーエス lysates を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: ホストの識別要因 RNAi スクリーニングによる LD652 細胞における制限の VSV レプリケーションします。このパネルは、倍は VSV リュックに GFP dsRNA コントロール治療 72 hpi を基準にして示されている RNAi 治療で LU 信号の変更を示しています。データは、3 通実験から手段 (± SD) を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ムービー S1: 代表的な 405 nm (細胞生存性色素) と 65 h 時間経過とともに撮影した 568 nm (下流) チャネル画像 (各フレーム = 5 時間間隔) LD652 細胞の VSV した DsRed 感染後。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

映画 S2: 代表的な 405 nm (細胞生存性色素) と 65 h 時間経過とともに撮影した 568 nm (下流) チャネル画像 (各フレーム = 5 時間間隔) VSV した DsRed と VACV-フロリダ州-GFP LD652 細胞の重感染後。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

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Discussion

ここで制限の鱗翅目昆虫の細胞培養で VSV レプリケーションを救出条件画面に蛍光・発光ベースのシンプルなアッセイを説明しました。鱗翅目昆虫細胞で VSV の不成功の伝染は、VSV 遺伝子発現のための試金と優れた信号対雑音比を作成します。たとえば、単一の VSV リュック感染から溶解液で検出される LU 信号があった 〜 1,000 倍以上のモック感染 lysates まだこれらの信号のみ 72 h 経過で約 2 倍に変更します。VSV ・ リュック ・ VACV との重感染が LU 信号を強化する一方、〜 300 以上シングル 72 hpi VSV リュック感染症。したがって、VSV 救助アッセイは、桁違いの包含、優れたダイナミック レンジを表示します。

これらのアッセイの設定で重要な手順の 1 つは VSV レスキュー蛍光・発光ベースのアプローチを使用して試金する決定が含まれます。生細胞イメージング技術、救出の有無でした DsRed 陽性細胞の自動定量評価を容易にするソフトウェア パッケージを用いて信号を試金することができますどのように VSV エンコードした DsRed の例を示しています。重感染。これらの試金を設定し唯一注目すべきは、狭い時 VSV 複製の動態の差異の検出に役立つことがあります時間ポイントの広い範囲を捕獲することを許可する高価で研究者が生細胞イメージング機能へのアクセスを有すれば、windows。対照的に、発光ベースのアプローチは、あらかじめ決められた時点でセル lysates の準備を必要とするエンドポイント アッセイ本質的に、lysate の準備は時間のかかることができます。一方、発光に基づく試金を必要としない高度な顕微鏡装置-のみプレート リーダーの発光信号を読み取ることができます。さらに、発光アッセイ感染細胞のパーセンテージを計算する顕微鏡ベースのアッセイより大きいダイナミック レンジがあります。たとえば、顕微鏡試金 (VSV した DsRed 感染を示す) した DsRed 陽性細胞のみの範囲 0-100% の視野で分析された細胞の。対照的に、単一 VSV リュックと重感染条件 (または他の救助条件) 間の信号の LU は、桁違いに及ぶことも。

哺乳類のウイルス免疫の画面ここで示された VSV-L. 区細胞システムを使用しての主な利点は、それが本質的に何が保存される可能性が高いと古代を抑制するウイルス因子の同定のために選択すること脊椎動物に固有のインターフェロン応答をさかのぼる抗ウイルス応答。確かに、予備的観察は A51R 蛋白質が保存された抗ユビキチン ・ プロテアソーム関連細胞応答「ギャモンらを抑制することを示唆する13未発表のデータ)。VSV の VACV A51R 救助の発見は無脊椎動物のホスト13では、脊椎動物のウイルスによる異種ウイルス救助の最初の例であり、これらのスクリーニングのシステムが追加の脊椎動物ウイルス免疫を明らかに可能性があります。.それは宿主免疫を阻害する条件の読み出しは VSV 複製 VSV レスキューを使用するキーこと重く制限 (または失敗に終わった) に注意することが重要で検査されて VSV 複製セル型で。したがって、ほとんどの哺乳類細胞の種類だろうない試金のこれらのタイプに適して VSV を哺乳類の細胞で複製ことを考える。そういうわけでl. 区セルを使用ここでは当然制限ホスト細胞 VSV の種類として。

ショウジョウバエのセルで事前調査を示したウイルス抑制抗ウイルスの RNAi の応答のエンコード候補 RNAi 抑制と自己複製群れ家ウイルスのゲノム RNA 発現プラスミドのによって識別されることをその自然の RNAi サプレッサー30B2 の代わりに GFP をエンコードします。群れ家のゲノム RNA の複製と GFP の生産 cotransfected 候補因子による RNAi の抑制に依存していた、したがって、GFP 発現の救助は RNAi 抑制30を示されています。私たちの著作はウイルス エンコード RNAi 阻害剤の過剰発現がまたのコンテキストでの RNAi の応答の抑制を識別するためにこのシステムが使えることを示唆しているl. マイマイガ細胞における遺伝子発現の VSV リュックを救うことを示しますレプリコンではなく善意ウイルス病原体による感染です。確かに、 L. 区細胞13 VSV レプリケーションの制限に貢献する RNAi、IMD、ユビキチン ・ プロテアソーム関連経路検索をいくつかの抗ウイルス経路のウイルス性拮抗薬、VSV で識別すること示唆しています。ここで紹介の試金を救出します。

ホスト抗ウイルス蛋白質の同定に関してこれらのスクリーニング方法の潜在的な制限は、 L. マイマイガのゲノム シーケンスがまだ利用できないことです。ただし、公開されているl. 区がありますトランスクリプトーム RNAi ノックダウン26,27,28候補ホスト ターゲットを識別するために使用することができます。さらに、私たちが前述 VSV が今公開されているゲノム (例えば、 Manduca sexta) を持つ他の lepidopterans13由来細胞において制限されている31。したがって、シーケンスのゲノムを持つ他の lepidopterans 由来細胞株は、プロトコルをここに記載されているl. 区細胞を代えることができます。

経済成長、アルボ ウイルス32の脅威が公衆衛生を考えると、スクリーニングの試金をここで紹介は新しい抗ウイルス薬の設計値があります。 アルボ ウイルス ホストの相互作用の新しい機能を識別するために新しい戦略を提供可能性があります。治療。さらに、RNA ウイルスの複製を制限する鱗翅目のメカニズムの比較的限られた理解のためここで紹介するツールはこれでエンコードされたホストの防衛メカニズムを調査する新しい機会を提供する経済的に重要な昆虫の順序。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

総局は、テキサス大学南西医療センターの恵まれている学者プログラムからの資金によって支えられました。著者は VSV した DsRed の VSV リュック提供ありがとうマイケル Whitt (テネシー大学保健科学センター) とショーン ・ ウィーラン (ハーバード大学医学部)。著者はまた、VACV FL GFP ひずみの種類のギフトのゲイリー Luker (ミシガン大学医学部) を感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well tissue culture plates CELLTREAT 229106
24-well tissue culture plates CELLTREAT 229124
10 cm tissue culture dishes Corning C430167
Grace’s Insect Medium Sigma G8142
EX-CELL 420 Sigma 14420C
Fetal Bovine Serum - Optima Atlanta Biologicals S12450
Growth medium 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1% antibiotic-antimycotic solution and 10% Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) Sigma A5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Sigma D8662
Serum Free Media (SFM) Thermo Fisher 10902096
Cytosine arabinoside Sigma C1768
Transfection reagent Thermo Fisher 10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Corning 25950CQC
Reporter lysis buffer 5x Promega E3971
Luciferase Assay Reagent Promega E1483
96-Well Microplates Corning 3915
Mouse anti-FLAG antibody Wako 014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibody Abcam ab21176
Mouse anti-actin antibody Sigma A2066
Mouse anti-VSV M N/A N/A Dr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3L N/A N/A Dr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dish Lab-Tek II 155409
Cell viability dye Thermo Fisher C12881
FLUOstar microplate reader BMG Labtech FLUOstar
Confocal microscope Olympus FV10i-LIV
Image analysis software Olympus v1.18 cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge Eppendorf 22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging System Li-COR Biosciences Odyssey Fc
LD652 cells N/A N/A Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cells ATCC CRL-2761
BHK cells ATCC CCL-10
HeLa cells ATCC CCL-2
BSC-1 cells ATCC CCL-26
in vitro transcription and purification kit Thermo Fisher AM1626
PCR purification kit Qiagen 28104

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