Summary
이 프로토콜 만족 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 3 차원 비 계 없는 심장 조직을 만들 순 형 기반 방법을 설명 합니다.
Abstract
이 프로토콜 고 추가 비 계 자료 없이 3 차원 (3 차원) 심장 조직을 만들 쉬운 그물 형 기반 방법에 설명 합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes (iPSC-CMs), 인간의 심장 섬유 아 세포 (HCFs), 그리고 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)는 격리 하 고 70 %iPSC-CMs, 15 %HCFs, 및 15 %HUVECs 세포 현 탁 액을 생성 하는 데 사용. 그들은 spheroids의 수백을 한 번에 집 광을 위한 micropores를 포함 하는 매우 낮은 첨부 파일 "걸기 하락" 시스템에서 공동 경작. 셀 집계 하 고 자발적으로 공동 문화의 3 일 후 구타 spheroids를 형성 한다. spheroids 수확, 새로운 금형 캐비티에 시드 고 인큐베이터에 통에 경작. spheroids가 성숙한 기능 조직 시드 후 약 7 일. 만족 스러운 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 융합된 spheroids 결과 다층된 조직에 의하여 이루어져 있다. 이 새로운 메서드는 나중에 심장 마비의 치료에 대 한 설계 조직 만들기를 재현 하 고 비용 효율적인 방법으로 유망 가능성이 있다.
Introduction
현재 심장 조직 공학의 목표는 대체 또는 손상 된 심근 조직1의 기능과 구조를 복구 하는 치료를 개발 하는 것입니다. 기본 심장 조직의 중요 한 수축 및 electrophysiological 속성을 전시 하는 3 차원 심장 조직 모델을 만드는 방법 급속 하 게 확대 되어 있다2,3. 다양 한 전략을 탐험 하 고 연구4,5에서 사용 되었습니다. 이 방법에서에서 범위 특정 합성 및 천연 생리 활성 hydrogels, 젤라틴, 콜라겐, 섬유 소, 그리고 펩 티 드6, 같은 사용 하 여 바이오 잉크 증 착 기술2 및 bioprinting 기술7.
그것은 비 자유로운 방법 외국 비 계 소재8통합의 단점 없이 소재 기반 방법으로 유사한 조직 생산할 수 표시 되었습니다. 오 렌 Caspi 외. 셀의 다양 한 종류의 매우 vascularized 인간의 조작된 심장 조직9의 세대 수는 설명 했다. 턱 외. spheroids에서 심장 패치 생성을 위한 3 차원 인쇄 방법을 개발. 결과 패치 cardiomyocytes, 섬유 아 세포, 내 피 세포는 70:15:15 비율10에 구성 됩니다. Spheroids 하 여 효과적인 "빌딩 블록" 비 계 없는 심장 조직 창조의 그들은 저 산소 증에 대 한 저항으로 이식11,12에 대 한 충분 한 기계적 무결성을가지고 표시 되었습니다. 이전 학문은 회전 타원 체 생성에 대 한 여러 가지 제작 방법을 설명 했다, 교수형의 사용을 포함 하 여 방법, 스피너 플라스 크13, 미세 시스템14및 비 점착 문화 표면 코팅 또는 코팅 agarose 마이크로 금형15. 이 프로토콜을 사용 하 여 교수형 드롭 장치, spheroids의 수백을 한 번에 집 광을 위한 micropores를 포함.
이 연구는 소설 평방 금형 캐비티에는 spheroids를 수동으로 시드 및 성숙에 대 한 통에 조직 배양 포함 심장 조직 창조에 대 한 효율적인 비 계 없는 방법을 선물 한다. 일반적인 정적 문화 조건 하에서 산소 보급 조직 구조, 중앙 괴 사 발생의 외부 측면에 제한 됩니다. 그러나, 그물 형 금형에 시드 모든 spheroids 영양분과 산소의 증가 보급에 대 한 수 있도록 지속적인 유체 운동, 미디어에 몰두. 또한,이 형 기반 방법 수동 최소의 노력으로 다른 크기의 조직 패치의 동시 생성 가능 하며 결과 조직 형에서 쉽게 제거 될 수 있습니다. 이 새로운 메서드는 비 계, 다층 심장 패치의 효율적이 고 재현 가능한 창조에 대 한 수 있습니다.
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Protocol
1입니다. Cardiomyocytes의 준비
- 앞에서 설명한17지하실 멤브레인 매트릭스와 문화 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)와 6 잘 플레이트 코트.
- 앞에서 설명한 방법18을 사용 하 여 hiPSC CMs로 hiPSCs를 구분 합니다.
- 16-18 d 후 차별화에서 일시 중지는 cardiomyocytes 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 2 mL와 함께 각 잘 헹 궈 서 칼슘 또는 마그네슘, 인큐베이션 1 mL/트립 신 또는 셀 분리 시 약 (참조 테이블의의 뒤에 없이 재료) 실 온에서 5 분.
- 트립 신 또는 셀 분리 시 중화 ( 재료의 표참조) 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 셀 미디어 B-27 (RPMI/B-27 셀 미디어)와 보완의 동일한 볼륨을 사용 하 여. 위쪽 및 아래쪽 준수 셀을 풀고 플라스틱.
- 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 정지 cardiomyocytes 수집 하 고 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.
- 세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 얻기 위해 상 온에서 5 분 동안 250 x g 에서 원심
- RPMI/B-27 셀 미디어 10 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 20 µ L 세포 현 탁 액의 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 동일한 금액으로 결합 하 고 부드럽게 혼합.
- 수동 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 세포 현 탁 액의 농도 세포 생존 능력을 구하십시오.
2입니다. 섬유 아 세포의 준비
- 앞에서 설명한16인간의 심장 섬유 아 세포 (HCF) (성인 심 실 타입) 셀 라인의 문화를 시작 합니다.
- 트립 신 또는 셀 분리 시의 적절 한 금액으로 그들을 배양 하 여는 HCFs 일시 중단 ( 재료의 표참조) 실내 온도16시 5 분. T175 플라스 크에 10 mL의 트립 신 또는 셀 분리 시 약 사용 되었다.
- 트립 신 또는 셀 분리 시 중화 ( 재료의 표참조) 다음 50 mL 원뿔 튜브에 샘플을 전송 매체의 동일한 볼륨을 사용 하 여, 고를 실 온에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심을 펠 릿입니다.
- 섬유 아 세포 성장 매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend ( 재료의 표참조).
- 20 µ L HCF 세포 현 탁 액의 0.4 %trypan 블루 솔루션의 동일한 금액으로 결합 하 고 부드럽게 혼합.
- 자동된 셀 카운터 또는 수동 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 새로운 세포 현 탁 액의 농도 세포 생존 능력을 구하십시오.
3입니다. 내 피 세포의 준비
- 앞에서 설명한17인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC) 라인의 문화를 시작 합니다. 트립 신 또는 셀 분리 시의 적절 한 금액으로 그들을 배양 하 여는 HUVECs를 일시 중단 ( 재료의 표참조) 실내 온도17시 3 분. 트립 신 또는 셀 분리 시 중화 ( 재료의 표참조) 다음 50 mL 원뿔 튜브에 전송 매체의 동일한 볼륨을 사용 하 여, 및 펠 릿을 실 온에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심.
참고: T175 플라스 크에 10 mL의 트립 신 또는 셀 분리 시 약 사용 되었다. - 내 피 세포 성장 매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend ( 재료의 표참조).
- HUVEC 서 스 펜 션의 20 µ L를 결합 하 여 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 동일한 금액으로 그것을 얼룩 하 고 부드럽게 혼합.
- 자동된 셀 카운터 또는 수동 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 세포 현 탁 액의 농도 세포 생존 능력을 구하십시오.
4입니다. 드롭 Spheroids 매달려의 창조
- 교수형 장소 살 균 6 잘 플레이트에 (각각 350 µ m의 직경) 850 micropores를 포함 하는 드롭 장치.
- 위에서 설명한 세 가지 종류의 세포를 분리: hiPSC CMs, HCFs, 및 HUVECs. ML 당 2,475,000 세포의 농도에 RPMI/B-27 셀 미디어 70 %iPSC-CMs, 15% HCFs 50 mL 원뿔 튜브에서 15 %HUVECs 비율에 그들을 결합.
- 드롭 시스템 (350 µ m의 작은 직경) 6 잘 플레이트에 매달려 매우 낮은 첨부 파일의 각 음에 세포 현 탁 액 (mL 당 2,475,000 세포)의 4 mL를 분배.
- Spheroids는 교수형에 세포 현 탁 액을 분배의 12 h 이내 저절로 형성 드롭 장치. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도에서 72 h (3 d)의 총에 대 한 문화는 spheroids의 성숙에 대 한 계속.
- 문화의 72 h 후 수확 교수형의 바닥에 숨 구멍을 통해 spheroids 매체와 접시에 장치를 배치 하 고 소용돌이 그것 부드럽게 교수형에서 spheroids를 해제 하 여 시스템을 드롭 드롭 장치.
5. 3 차원 패치 창조 소설 그물 형을 사용 하 여
- 기지, 평방 바닥판, 바닥 그물, 및 10 층된 측면 그물은 소독 집게의 쌍의 원조와 함께 소설 몰드를 만드는 조립 첫째, 스택 및 기지, 바닥판 평방, 정렬 하단 코너 게시물을 사용 하 여 net. 그런 다음 스택과 고급 스테인레스 스틸 접지 단자의 그물을 만드는 방향으로 번갈아에 10 쪽 그물 레이어.
- 플러시 PBS 또는 매체를 표면 장력을 감소, 다음, 전송 충전 베이스에 조립된 형 기본 작성.
- PBS와 같은 방법에 있는 매체 그물 금형 캐비티에 젖은. 천천히 원하는 크기의 전제 된 구멍에는 spheroids를 입력 (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 m m, 또는 6 x 6 x 1 m m).
참고: 셀 집계에 꽉 연결 하 고 정적 유지 구멍에 spheroids의 예상된 하는 볼륨의 120% 공급 있는지 확인 합니다. - Net 상단과 상단 스퀘어 플레이트 코너 게시물에 어셈블합니다 및 stoppers 및 지주 튜브는 spheroids의 유실을 방지 하기 위해 보안.
- 6 잘 플레이트 RPMI/B-27 셀 미디어 또는 전체 조립된 형을 충당 하기 위해 충분 한 매체와 멸 균 용기에 6 mL와 채워진된 그물 형 시스템 전송.
- 3000-4000 x g에 7-10 일 동안 스윙 통에 채워진된 금형 시스템 6 잘 플레이트를 품 어.
참고:는 인큐베이션 기간 심장 패치의 크기에 의해 결정 됩니다. 큰 패치, 보육 시간 심장 패치 성숙에 대 한 증가 합니다.
6. 소설 그물 형에서 패치 제거
- 미디어에서 금형 시스템을 제거 하 고 소독된 처리 매트 살 균 10 cm 접시에에 놓습니다.
- 지주 관, stoppers, 상단 사각 접시 및 최고 그물을 제거 합니다. 신중 하 게 살 균 집게의 쌍을 가진 계층된 측면 그물 하나에 의해 밖으로 슬라이드. Decannulation, 후 그대로 심장 패치 하단의 그물 위에 얻을 수 있다.
- 소독 집게를 사용 하 여 패치 순 하단을 선택 하 고 하단의 net RPMI/B27 미디어의 5 mL와 함께 35 mm 접시에 전송. 부드럽게 천천히 접시, 또는 살 균 세포 스 크레이 퍼와 함께 그물을 소용돌이 의해 그물 아래에서 패치를 풉니다. 그물 아래에서 초연, 후 심장 조직 RPMI/B27 미디어 양식 수 있습니다.
- 35 mm 접시에 부동성 3 차원 심장 패치를 품 어 계속. 금형에서 제거 후 빠르면 24 시간 기능 동기 박동을 관찰할 수 있습니다.
- 그물 형에서 패치를 제거한 후 모양을 무결성 및 시간 동기 박동 증가의 강도 유지는 관찰 합니다.
참고: 3 차원 그물 형 기반 심장 패치 전시 decannulation 후 구성 요소 cardiospheres의 전기 통합. 우리는 60에서 80 분당 60 일 이상 유지 하는 구타 주파수를 관찰.
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Representative Results
우리의 실험에 우리는 70 %iPSC-CMs, 15% HCFs RPMI/B-27 셀 미디어 mL 당 2,475,000 세포의 농도에 15 %HUVECs 세포 현 탁 액을 활용. 세포 현 탁 액을 만든 후 우리는 프로토콜의 4.3 단계에서 설명한 대로 드롭 시스템에 매달려 매우 낮은 첨부 파일의 각 음에 세포 현 탁 액 4 mL 적절. 교수형의 사용 문화 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도에서 3 일 후에 spheroids를 치고 수백의 자발적인 형성 귀착되 었 다 드롭 시스템. Spheroids는 쉽게 4 배와 10 배 확대 한 평균 직경 350 µ m의 문화 (그림 1)의 72 h 후에 가벼운 현미경 아래 박동을 관찰 했다.
Spheroids, 수확 후 프로토콜의 6.5 단계의 끝에 금형 쉽게 간단한 pipetting 방법 시드 했다. Spheroids;의 융합에 대 한 허용 하는 곰 팡이의 배양 기계적 무결성 그대로 심장 패치 형의 후속 제거 결과. 제거 후 금형 및 문화의 24 시간에서 심장 조직의 기능과 동기 박동 확인 spheroids (그림 2, 왼쪽)의 기계적 통합 관찰 되었다. 우리는 또한 spheroids의 여러 레이어 조정 패션 가벼운 현미경 검사 법 (그림 2, 오른쪽)에 자발적으로 구타 했다 관찰 했다.
그물 형 기반 3 차원 심장 패치 또한 심장 마커 분 토니 공초점 영상과 수행의 immunohistochemical 분석 잘 정렬된 cardiomyocytes 보여주는 모든 전시 분 T 식 (그림 3).
그림 1 : 매달려 드롭 spheroids의 창조. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes (hiPSC-CMs), 인간의 심장 섬유 아 세포 (HCFs), 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs) 절연 그리고에 70 %iPSC-CMs, 15 %HCFs 15 %HUVECs, 세포 현 탁 액을 생성 하는 데 사용 되는 mL 당 2,475,000 세포의 농도입니다. 72 h 후 각 작은 세공에 자발적으로 형성된 spheroids 가벼운 현미경 검사 법에서 박동 수를 쉽게 관찰 되었다. 왼쪽된 패널에서 눈금 막대 = 1000 µ m; 오른쪽 패널에서 눈금 막대 = 400 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 다층된 심장 조직 구성 요소 spheroids의 통합 표시의 창조. 그물 형에서 분리, 후 3 차원 심장 패치 그 모양을 유지 하 고 동기 박동, 왼쪽된 패널에 표시 된 것 처럼, spheroids의 기계적 통합을 나타내는 설명 (어디 눈금 막대 = 1000 µ m). 오른쪽 패널에 표시 된 대로 spheroids의 누적된 다층 가벼운 현미경 검사 법, 검사 했다 (어디 눈금 막대 = 400 µ m), 그리고 자발적으로 박동을 관찰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 심장 조직 면역 형광 검사 평가. 면역 형광 분석에는 그물 형 기반 3 차원 심장 조직 분 T 식으로 잘 정렬 된 cardiomyocytes 이루어져 발견 됐다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 방법의 중요성의 재현성 및 결과 다층 심장 조직의 효율성에 있다. 심장 조직 공학 분야에서 현재 목표 중 하나는 치는, 다층, 고 기능 3 차원 심장 패치를 생성 하는 방법을 식별 하입니다. 우리는 spheroids 소설 그물 형으로 cardiomyocytes, 내 피 세포, 섬유 아 세포의 구성의 직접 수동 시드 다층된 심장 조직 만들기의 효율적이 고 재현 가능한 방법 보고. 이 방법에 사용 되는 그물 형 6 x 6 x 1 m m 2 x 2 x 1 밀리미터에서 배열 하는 조직의 창조에 대 한 서로 다른 크기의 다양 한 있다. 우리가 설명 또한 다른 금형 셰이프 및 원하는 조직 형상에 따라 시스템을 수정할 수 있습니다. HiPSC-CMs에 대 한 설명된 셀 농도 및 비율 이전 최적화 했다 하 고 다른 셀 형식에 대 한 수정 추가 평가 요구할 것 이다.
생체 외에서 의 창조 bioprinter 기술을 사용 하 여 3 차원 심장 조직 치료 및 진단 모델 개발의 희망으로 탐험 되었습니다. 그러나, 현재 bioprinting 메서드는 복잡 하 고 상당한 시간과 바늘 또는 비 계 자료 등 보조 지원 구조를 사용 하 여 필요. 이러한 보조의 존재 구조 감소 영양분 및 산소18의 보급을 지원 합니다. 따라서, 중앙 괴 사는19산소와 영양분을 공급 하는 모세 혈관의 부족으로 인해 현재 3 차원 심장 구조에 중요 한 관심사 이다. 사 카 구치 외. 지향 끼우기의 방법을 적용 시트와20내 피 네트워크 개발 하기 위해 혈관 침대 생물 반응 기를 사용 하 여 셀. 여기에 제시 된 그물 형 시스템에서 금형 캐비티 영양분과 지원 구조 또는 공중 발판의 요구 사항 없이 산소의 충분 한 보급을 허용할 수 있습니다. 또한, 그물 형 기반 메서드는 효율적 이며 모두 뿌리기는 spheroids의 금형 및 후속 패치의 유지 보수에 대 한 전문된 기술이 필요로 하지 않습니다. 이와 같이, 그것은 신속 하 고 저렴 한 방식으로 동기적으로 꺾고 취득 고 기능 심장 패치입니다.
회전 타원 체 지름과 각각에 사용 되는 spheroids의 수를 최적화 하기 위해 매달려 드롭 장치, 실시 문제 해결 및 세포 유형 및 수량에 관한 수정. 이 순 형 기반 방법에 대 한 회전 타원 체 직경 및 spheroids 사용의 수를 적절 한 크기의 기능 심장 조직을 만드는 가장 중요 했다. 우리는 심장 조직의 창조에 대 한 최고의 회전 타원 체 크기를 최적화 하기 위해 다른 셀 농도 했어요. 세 가지 유형의 셀 교수형에 의해 심장 spheroids를 만드는 데 사용 된 70 %iPSC-CMs, 15 %HCFs, 및 15 %HUVECs 포함 드롭 장치. 가벼운 현미경 검사 법, 아래 각 작은 세공에 자발적으로 형성된 spheroids 쉽게 치기 72 h 후에 관찰 되었다. 우리는 spheroids의 직경 교수형의 세포 농도 함께 증가 관찰 드롭 장치. 우리 시도 RPMI/B27 매체의 4 mL와 각 장치에서 300 spheroids 100 spheroids에서 spheroids의 다른 농도. 수많은 시험, 우리 발견 그 결과 spheroids의 최적 직경 나왔고 mL 당 2,475,000 세포의 농도. Spheroids의 최적화 된 직경, 우리는 어려움 컬렉션 및 다층 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법에 중요 한 단계는 누적된 순 형에 spheroids의 시드를 경험 했다.
프로토콜의 가장 중요 한 단계는 회전 타원 체 크기의 최적화 이다. Spheroids이이 메서드에서 사용 되는 다른 bioprinting 기술21에서 사용 하는 회전 타원 체 시체의 크기 보다 작은 언급 가치가 있다. 더 큰 spheroids 영양 및 산소22의 부족 한 보급으로 인해 중앙 괴 사를 발견 되었습니다. 으로 작은 직경을 가진 spheroids, 영양분과 산소를 각 회전 타원 체의 중심의 적절 한 보급은 더 쉽게 달성, 결과 패치의 모든 분야에서 세포 생존 능력을 증가. 여기에 제시 된 프로토콜에서 350 µ m의 회전 타원 체 직경은 향상 된 세포 생존 능력 및 spheroids, 사이 더 접촉 표면적 우리가 믿는 심장 조직 순 곰 팡이를 사용 하 여의 성공적인 창조에 기여 합니다. 따라서, 이것은 기술된 방법론에 중요 한 단계 이다. 다른 셀 형식 프로토콜에 맞게 추가 회전 타원 체 크기 최적화 실험이 필요 합니다.
이 방법의 한계는 정확 하 게는 spheroids의 스태킹 제어를 포함 합니다. 이 결과 조직 패치 및 이기종 두께의 균일도의 지역에서 발생합니다. 또한, 최소는 spheroids의 시드를 위한 실제 실습 시간 이지만, 큰 다중된 패치의 창조는 spheroids의 융합에 대 한 있도록 확장된 문화 시간을 필요 합니다.
미래 응용 프로그램,이 소설 그물 형 기반 방법은 수동 최소의 노력으로 3 차원, 비 계 없는 심장 조직 만들기의 효율적이 고 재현 가능한 방법이입니다. 만족 스러운 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 융합된 spheroids 결과 다층된 조직에 의하여 이루어져 있다. 이 순 형 기반 선물 비용 효율적이 고 확장 가능한 현재 대체 바이오-제조 방법의 설계 조직 방법과의 목표와 함께 심장 마비의 치료에 대 한 임상 적용 가능한 심장 조직을 만들 가능성이 있다 허 혈 성 또는 역 기능 cardiomyocytes23교체. 또한,이 방법은 잠재적인 새로운 약물 치료24의 환자 관련 검 진에 대 한 심장 조직을 만드는 데 활용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 다음 자금 출처 인정: 심혈 관 연구에 대 한 마술을 문제 기금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
References
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