Summary
Denne protokollen beskriver en netto mold-basert metode for å lage tredimensjonale stillaset uten hjerte vev og tilfredsstillende konstruksjonssikkerhet og synkron juling virkemåte.
Abstract
Denne protokollen beskriver en roman og lett netto mold-basert metode for å lage tredimensjonale (3D) hjerte vev uten ekstra stillaset materiale. Menneskeskapte pluripotent stilk-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), menneskelig hjerte fibroblaster (HCFs) og menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs) er isolert og brukes til å generere en celle hjuloppheng med 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, og 15% HUVECs. De er co kulturperler i en svært lav vedlegg "hengende drop" system, som inneholder micropores for kondenserende hundrevis av spheroids samtidig. Cellene samlet og danne spontant slo spheroids etter 3 dager for co kultur. Spheroids er høstet, seeded inn i en ny mugg hulrom og kultivert på en shaker i inkubator. Spheroids blitt en moden funksjonelle vev ca 7 dager etter seeding. Resulterende flerlags vev består av smeltet spheroids med tilfredsstillende strukturelle integritet og synkron slå atferd. Denne nye metoden har lovende potensial som reproduserbare og kostnadseffektiv metode for å opprette utviklet vev for behandling av hjertesvikt i fremtiden.
Introduction
Målet med gjeldende hjerte vev engineering er å utvikle en terapi for å erstatte eller reparere struktur og funksjon av skadde hjerteinfarkt vevet1. Metoder for å lage 3D hjerte vev modeller viser viktige kontraktile og elektrofysiologiske egenskaper av innfødte hjerte vev har blitt raskt voksende2,3. En rekke strategier har vært utforsket og brukt i studier4,5. Disse metodene spenner fra bruk av bestemte syntetiske og naturlige bioaktive hydrogels, for eksempel gelatin, kollagen, fibrin og peptider6, til bio-blekk deponering teknologier2 og bioprinting technologies7.
Det har vist at stillaset-fri metoder kan produsere sammenlignbare vev som biomateriale-baserte metoder, uten ulempene med omfatter utenlandske stillas materiale8. Oren Caspi et al. vist at inkorporering av ulike typer celler kan generering av svært Stangeriaceae menneskelig utvikling hjerte vev9. Haken et al. utviklet en 3D utskriftsmetode for oppretting av cardiac oppdateringen fra spheroids. Resulterende flekker består av cardiomyocytes, fibroblaster og endotelceller i en 70:15:15 forholdet10. Spheroids har vist seg å være effektive "byggeklosser" stillaset uten hjerte vev skapelsen, som de er resistente mot hypoksi og ha tilstrekkelig mekanisk integritet for implantasjon11,12. Tidligere studier har vist flere fabrikasjon metoder for oppretting av spheroid, inkludert bruken av hengende slippe metoden, spinner kolber13, microfluidic systemer14og ikke-tilhenger kultur overflater ubestrøket eller belagt med agarose mikro-muggsopp15. I denne protokollen, bruker vi hengende slipp enhet, som inneholder micropores for kondenserende hundrevis av spheroids samtidig.
Denne studien presenterer en ny og effektiv stillaset-fri metode for oppretting av hjerte vev, som inkluderer manuelt såing til spheroids inn i en firkantet mold hulrom og rugende vevet i en shaker for modning. Under vanlige statisk kultur forhold er oksygen diffusjon begrenset til ytre aspekter av vev Konstruer, noe som resulterer i sentrale nekrose. Men med netto mold, er alle spheroids seeded i mold midt i media med en konstant fluidic bevegelse, slik at økt spredningen av næringsstoffer og oksygen. I tillegg gir denne mold-baserte metoden samtidige etableringen av ulike størrelser vev flekker med minimal håndbok anstrengelse og resulterende vevet kan enkelt fjernes fra mold. Denne romanen metoden gir effektiv og reproduserbar etableringen av stillaset-fri, flerlags cardiac patcher.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av Cardiomyocytes
- Pelsen 6-vel plater med kjelleren membran matrise og kultur menneskeskapte pluripotent stamceller (hiPSCs) som tidligere beskrevet17.
- Skille hiPSCs i hiPSC-CMs med tidligere beskrevet metoder18.
- På 16-18 d etter differensiering, suspendere cardiomyocytes av skylling hver brønn med 2 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) uten kalsium og magnesium, etterfulgt av inkubasjon med 1 mL/vel av trypsin eller celle dissosiasjon reagensen (se tabell av Materialer) i 5 minutter ved romtemperatur.
- Nøytralisere trypsin eller celle dissosiasjon reagensen (se Tabell for materiale) med en lik mengde Roswell Park Memorial Institute (RPMI) cellen media med B-27 (RPMI/B-27 cellen media). Pipetter opp og ned for å løsne adhered celler.
- Samle den suspendert cardiomyocytes med en 10-mL serologisk pipette og overføre dem til en 50-mL konisk rør.
- Sentrifuge celle suspensjon på 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur å få celle pellets.
- Resuspend pellet i 10 mL av RPMI/B-27 cellen media.
- Kombiner 20 µL av cellen suspensjon med en lik mengde 0,4% Trypan blå løsning og bland forsiktig.
- Bruke en manuell hemocytometer å telle og få konsentrasjon og celle levedyktigheten til celle suspensjon.
2. forberedelse av fibroblaster
- Starte en kultur av en menneskelig hjerte fibroblast (HCF) (voksen ventrikkel type) cellen linje som beskrevet tidligere16.
- Suspendere HCFs av rugende dem med en passende mengde trypsin eller celle dissosiasjon reagens (se Tabell for materiale) i 5 minutter ved romtemperatur16. For en T175 kolbe, ble 10 mL av trypsin eller celle dissosiasjon reagens brukt.
- Nøytralisere trypsin eller celle dissosiasjon reagensen (se Tabell for materiale) bruker en like volum av medium, deretter overføre prøven til en 50-mL konisk rør og sentrifuge celle suspensjon på 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur å få en pellets.
- Resuspend pellet i 10 mL av fibroblast vekst medium (se Tabell for materiale).
- Kombiner 20 µL av HCF celle suspensjon med en lik mengde 0,4% trypan blå løsning og bland forsiktig.
- Bruk en automatisert celle teller eller manuell hemocytometer å telle og få konsentrasjon og celle levedyktigheten til ny cellen suspensjon.
3. forberedelse av endotelceller
- Starte en kultur av en menneskelig umbilical blodåre endothelial celle (HUVEC) linje som beskrevet tidligere17. Suspendere HUVECs av rugende dem med en passende mengde trypsin eller celle dissosiasjon reagens (se Tabell for materiale) for 3 min romtemperatur17. Nøytralisere trypsin eller celle dissosiasjon reagensen (se Tabell for materiale) bruker en like volum av medium, deretter overføre til en 50-mL konisk rør og sentrifuge celle suspensjon 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur å få pellets.
Merk: For en T175 kolbe, 10 mL av trypsin eller celle dissosiasjon reagens ble brukt. - Resuspend pellet i 10 mL av endothelial celle vekst medium (se Tabell for materiale).
- Kombiner 20 µL av HUVEC suspensjon og flekker med en lik mengde 0,4% Trypan blå løsning og bland forsiktig.
- Bruke en automatisert celle teller eller en manuell hemocytometer å telle og få konsentrasjon og celle levedyktigheten til celle suspensjon.
4. opprette hengende slipp Spheroids
- Plasser hengende slipp enhet som inneholder 850 micropores (hver med en diameter på 350 µm) i sterilt 6-vel platene.
- Isolere tre typer celler som beskrevet ovenfor: hiPSC-CMs, HCFs og HUVECs. Kombinere dem i forholdet 70% iPSC-CMs, 15% HCFs og 15% HUVECs i et 50-mL konisk rør med RPMI/B-27 cellen media i en konsentrasjon av 2,475,000 celler per mL.
- Dispensere 4 mL av cellen suspensjon (2,475,000 celler per mL) hver brønn av ultra-lav vedlegg hengende slipp system (med micropore diameter på 350 µm) sitter i en 6-vel plate.
- Spheroids vil spontant danne innen 12 timer med dispensing celle suspensjon i hengende slipp enhet. Fortsette å kultur for totalt 72 h (3 d) på 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet for modning av spheroids.
- Etter 72 h kultur, høste spheroids gjennom porene nederst på hengende slipp systemet ved å plassere enheten i et fat med medium og virvler forsiktig å slippe spheroids fra hengende slipp enhet.
5. 3D Patch etableringen ved hjelp av romanen netto Mold
- Basen, firkantet bunnplaten, bunnen net og 10 lag siden garn sammen til romanen mold ved hjelp av et par sterilt tang. Først, stable og justere base, firkantet bunnplaten og bunn nettet ved hjelp av hjørnet innlegg. Deretter stable og lag på 10 siden nett skiftende retninger for å skape et nett av fine rustfritt stål liggende.
- Tømme fylling base med PBS eller medium for å redusere overflatespenningen, og deretter overføre sammensatte formen på fylle bunnen.
- Våt netto mold hulrom med PBS eller medium i samme metode. Langsomt fyller spheroids inn i forutsatte hulrommet i ønsket størrelse (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, eller 6 x 6 x 1 mm).
Merk: Kontroller at 120% av den forventede mengden spheroids mates inn i hulrommet slik at celle aggregater er i tett forbindelse og bo statisk. - Sett sammen øverst net og firkantet topplate på hjørnet innlegg og sikre stoppers og holde rør for å hindre en utvasking av spheroids.
- Overføre fylt netto mold systemet til en 6-vel plate med 6 mL av RPMI/B-27 cellen media eller i en steril beholder med nok medium å dekke hele sammensatte mold.
- Inkuber 6-vel platen med fylt mold systemet på en svingende shaker 7-10 dager 3,000-4,000 x g.
Merk: Varigheten av inkubering avgjøres av størrelsen på cardiac patcher. Med større patcher må inkubasjon tiden økes for cardiac oppdateringen modning.
6. fjerning av oppdateringen fra romanen netto Mold
- Fjerne mugg systemet fra media og plasser den på sterilisert håndtering matten i sterilt 10 cm parabol.
- Fjerne holder røret, propper, firkantet topplaten og topp nettet. Nøye Skyv ut lagdelt siden garn ettall med en bakteriefri tang. Etter decannulation hentes en intakt cardiac oppdatering på bunnen netto.
- Plukke opp bunnen netto med oppdateringen ved hjelp av sterile pinsett og overføre bunnen netto i en 35 mm parabolen med 5 mL av RPMI/B27 media. Forsiktig løsne oppdateringen fra bunnen netto av sakte virvlende nettet i retten eller med sterilt celle skraper. Etter løsgjøring fra bunnen netto, kan hjerte vev kultivert med RPMI/B27 medier.
- Fortsette å ruge frittflytende 3D cardiac oppdateringen i 35 mm parabolen. Funksjonell synkron juling kan observeres så tidlig som 24 timer etter fjerning fra mold.
- Etter fjerner oppdateringen fra netto mold, observere at formen opprettholdes med integritet og intensiteten av synkron juling øker med tiden.
Merk: 3D netto mold-baserte cardiac patcher utstilt elektrisk integrering av komponenten cardiospheres etter decannulation. Vi observerte en juling frekvens spenner fra 60 til 80 slag per minutt som varte i mer enn 60 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vårt forsøk utnyttet vi en celle suspensjon av 70% iPSC-CMs, 15% HCFs og 15% HUVECs i RPMI/B-27 cellen media i en konsentrasjon av 2,475,000 celler per mL. Når du har opprettet celle suspensjon, utlevert vi 4 mL av cellen suspensjon i hver brønn av ultra-lav vedlegg hengende slipp-system, som beskrevet i trinn 4.3 protokollen. Bruk av hengende slipp systemet resultert i spontane dannelsen av hundrevis av slo spheroids etter 3 dager for kultur på 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet. Spheroids var lett observeres å bli slått under * lys på 4 X og 10 X forstørrelse med en gjennomsnittlig diameter på 350 µm etter 72 h kultur (figur 1).
På slutten av trinn 6.5 av protokollen, etter høsting spheroids, var mold lett plantet med enkle pipettering metoder. Dyrking av mold tillatt for en blanding av spheroids; påfølgende fjerning av mold resulterte i en intakt cardiac patch med mekanisk integritet. Etter fjerning fra mold og 24 h kultur, ble funksjonelle og synkron juling av hjerte vev observert, bekrefter mekanisk integrering av spheroids (figur 2, venstre). Vi har også observert at flere lag av spheroids var slo spontant på en koordinert måte på * lys (figur 2, høyre).
En immunohistochemical analyse av nettet mold-basert 3D cardiac oppdateringen ble også fremført med hjerte markør troponin T. AC Confocal imaging viste at det godt justert cardiomyocytes alle utstilt troponin T uttrykk (Figur 3).
Figur 1 : Etablering av hengende slipp spheroids. Menneskeskapte pluripotent Stamcelle-avledet cardiomyocytes (hiPSC-CMs), menneskelig hjerte fibroblaster (HCFs) og menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs) ble isolert og brukes til å generere en celle hjuloppheng med 70% iPSC-CMs, 15% HCFs og 15% HUVECs, på en konsentrasjon av 2,475,000 celler per mL. Etter 72 timer, var de spontant dannet spheroids i hver micropore lett observeres å bli slått under * lys. Baren skala i informasjonsvinduet = 1000 µm; baren skala i panelet til høyre = 400 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Lage en flerlags hjerte vev vise integrering av komponenten spheroids. Etter løsgjøring fra netto mold, 3D cardiac oppdateringen opprettholdt sin form og viste synkron juling, indikerer mekanisk integrering av spheroids, som vist i panelet til venstre (der baren skala = 1000 µm). Stablet multilayers av spheroids var kontrolleres med * lys, som vist i panelet til høyre (der baren skala = 400 µm), og observert å bli slått spontant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Immunofluorescence evaluering av hjerte vev. Immunofluorescence analyse, ble netto mold-basert 3D hjerte vev funnet av godt justert cardiomyocytes troponin T-uttrykk. Baren skala = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydningen av denne metoden ligger i sin reproduserbarhet og effektiviteten av resulterende flerlags hjerte vev. I feltet av cardiac tissue engineering er en av gjeldende mål å identifisere en metode å konstruere slagene, flerlags og funksjonelle 3D cardiac patcher. Vi rapporterer en effektiv og reproduserbar metode for å opprette flere lag hjerte vev ved direkte manuell såing av spheroids består av cardiomyocytes og endotelceller fibroblaster i romanen netto mold. Netto mold brukes i denne metoden har en rekke forskjellige størrelser for etableringen av vev, fra 2 x 2 x 1 mm til 6 x 6 x 1 mm. Teknikkene vi har kan også endres for ulike mugg figurer og systemer avhengig av ønsket vev geometrien. Beskrevet cellen konsentrasjoner og forholdstall var optimalisert tidligere for hiPSC-CMs, og endringer i en annen celle type vil kreve ekstra evaluering.
I vitro etablering av 3-D hjerte vev med bioprinter teknologi har blitt utforsket med håp om å utvikle terapeutiske og diagnostiske modeller. Imidlertid gjeldende bioprinting metoder er tungvint og krever betydelig tid og bruk av hjelpeutstyr støttestrukturer som nåler eller stillaset materialer. Tilstedeværelsen av disse hjelpeutstyr støtte strukturer reduserer spredningen av næringsstoffer og oksygen18. Derfor er sentrale nekrose et stort problem i gjeldende 3D kardial konstruksjoner, på grunn av manglende kapillærer å levere oksygen og næringsstoffer19. Sakaguchi et al. brukes metoden sandwiching orientert ark og bruke vaskulær seng bioreaktorer for å utvikle en endothelial nettverk20. I net mold systemet presenteres her, kan mold hulrom tillate tilstrekkelig spredningen av næringsstoffer og oksygen uten behovet av støtte strukturer eller stillaser. Videre mold-baserte nettometoden er effektiv og krever ikke spesialferdigheter for både den såing av spheroids i mold og vedlikehold av påfølgende oppdateringen. Som sådan, er det en kjapp og billig måte å skaffe synkront slo og funksjonelle cardiac patcher.
Å optimalisere formet diameter og antall spheroids brukes i hver hengende slipp enhet, vi gjennomført feilsøking og modifikasjoner om celletyper og mengder. For denne netto mold-basert metode var formet diameter og antall spheroids brukt av avgjørende betydning å opprette en funksjonell hjerte vev av tilstrekkelig størrelse. Vi prøvde ulike celle konsentrasjoner for å optimalisere den beste spheroid størrelsen for hjerte vev etablering. Tre typer celler ble brukt til å opprette cardiac spheroids av hengende slipp enhet, som inkluderte 70% iPSC-CMs, 15% HCFs og 15% HUVECs. Under * lys, ble de spontant dannet spheroids i hver micropore lett observert å bli slått etter 72 h. Vi observerte at spheroids' diameter økt med cellen konsentrasjonen av hengende slipp enhet. Vi prøvde ulike konsentrasjoner av spheroids, fra 100 spheroids til 300 spheroids i hver enhet, med 4 mL av RPMI/B27 medium. Med mange studier fant vi at konsentrasjonen av 2,475,000 celler per mL gitt en optimal diameteren på de resulterende spheroids. Med optimalisert diameteren på spheroids opplevde vi uanstrengt samling og såing av spheroids i stablet netto mold, som var betydelig skritt å mold-baserte nettometoden for oppretting av flerlags hjerte vev.
Det viktigste trinnet av protokollen er optimalisering av spheroid størrelsen. Det er verdt å nevne at spheroids brukes i denne metoden er mindre enn størrelsen på formet organer i andre bioprinting teknikker21. Større spheroids har blitt funnet for å ha sentrale nekrose på grunn av utilstrekkelig spredning ernæring og oksygen22. Med spheroids med mindre diameter oppnås tilstrekkelig spredningen av næringsstoffer og oksygen til midten av hver spheroid lettere, øke cellulære levedyktigheten i alle områder av resulterende oppdateringen. I protokollen presenteres her, en spheroid diameter på 350 µm gir forbedret celle levedyktighet og mer kontakt areal mellom spheroids, som vi tror bidrar til vellykket oppretting av hjerte vev bruker denne netto formen. Dette er derfor en avgjørende skritt i beskrevet metodikk. For å tilpasse protokollen til andre celletyper, kreves det ekstra spheroid størrelse optimalisering eksperimenter.
Begrensninger av denne tilnærmingen inkluderer manglende evne til å kontrollere nøyaktig stabling av spheroids. Dette resulterer i områder av ingen-enhetlighet resulterende vev oppdateringene og heterogene tykkelse. Videre, selv om den faktiske hands-on tiden for såing av spheroids er minimal, etableringen av store flerlags oppdateringer krever en utvidet kultur tid å tillate blanding av spheroids.
Som for framtidige applikasjoner er denne romanen netto mold-basert metode en effektiv og reproduserbar metode for å opprette 3D, stillas-fri hjerte vev med minimal håndbok anstrengelse. Resulterende flerlags vev består av smeltet spheroids med tilfredsstillende strukturelle integritet og synkron slå atferd. Dette mugg-baserte nettometoden presenterer en kostnadseffektiv og skalerbar alternativ til gjeldende bio-fabrikasjon metoder utviklet vev og kan opprette klinisk gjeldende hjerte vev for behandling av hjertesvikt med mål om erstatte iskemiske eller dysfunksjonelle cardiomyocytes23. Denne metoden kan i tillegg benyttes for å lage hjerte vev for pasient-spesifikke screenings av potensielle roman stoff terapier24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter følgende finansieringskilde: Magic at saker fondet for hjerte forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
References
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).
- Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).
- Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
- Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).
- Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163 (2016).
- Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).
- Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7 (1), 4566 (2017).
- Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).
- Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
- Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).
- Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
- Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).
- Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
- Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).
- Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
- Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).
- Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).
