Summary
Este protocolo descreve um método baseado em molde líquido para criar tecidos cardíacos livre de andaime tridimensionais com integridade estrutural satisfatória e comportamento batendo síncrono.
Abstract
Este protocolo descreve um romance e método baseado no molde líquido fácil criar tridimensional (3D) cardíaca os tecidos sem material adicional do andaime. Cardiomyocytes de tronco-derivado de células pluripotentes induzidas pelo homem (iPSC-CMs), fibroblastos cardíacos humanos (HCFs) e células endoteliais da veia umbilical humana (HX) são isoladas e usadas para gerar uma suspensão de células com 70% iPSC-CMs, HCFs 15% e 15% HX. Eles são co cultivados em um sistema de fixação ultra baixo "gota de suspensão" que contém microporos para centenas de esferoides de condensação de uma só vez. As células agregam e formam espontaneamente esferoides surra após 3 dias de co-cultura. Os esferoides são colhidas, semeados em uma cavidade do molde de romance e cultivadas num agitador na incubadora. Os esferoides tornar-se um tecido maduro funcional, aproximadamente 7 dias após a semeadura. Os tecidos resultantes de várias camados consistem de esferoides fundidos com integridade estrutural satisfatória e comportamento batendo síncrono. Este novo método tem um potencial promissor como um método reprodutível e de baixo custo para criar tecidos projetados para o tratamento da insuficiência cardíaca no futuro.
Introduction
O objetivo da engenharia de tecido cardíaco atual é desenvolver uma terapia para substituir ou reparar a estrutura e função do tecido lesado do miocárdio1. Métodos para criar modelos 3D de tecido cardíaco, exibindo as propriedades contráteis e eletrofisiológicas importantes do tecido cardíaco nativo tem sido rápida expansão2,3. Uma variedade de estratégias foram explorados e utilizados em estudos de4,5. Esses métodos variam o uso do específico hidrogel bioativos naturais e sintéticas, tais como gelatina, colágeno, fibrina e peptídeos6, a bio-tinta deposição tecnologias2 e bioprinting tecnologias7.
Ficou demonstrado que métodos livre de andaime podem produzir tecidos comparáveis como métodos baseados em biomateriais, sem os inconvenientes de incorporação de material estrangeiro andaimes8. Oren Caspi et al demonstraram que a incorporação de vários tipos de células permite a geração de tecido cardíaco engenharia humano altamente vascularizado9. Chin et al desenvolveram um método de impressão 3D para criação de remendo cardíaca de esferoides. Resultante de patches são compostas de cardiomyocytes, fibroblastos e células endoteliais em uma relação de 70:15:1510. Esferoides foram mostrados para ser eficazes "blocos de construção" da criação de tecido cardíaco andaime-livre, como eles são resistentes contra hipóxia e possuem integridade mecânica suficiente para implantação de11,12. Estudos anteriores têm demonstrado vários métodos de fabricação para criação de esferoide, incluindo o uso do enforcamento soltar método, girador frascos13, microfluidic sistemas14e superfícies não-aderente cultura não revestidos ou revestidos com micromoldes de agarose15. Neste protocolo, usamos o enforcamento gota dispositivo, que contém microporos para centenas de esferoides de condensação de uma só vez.
Este estudo apresenta uma nova e eficiente método de andaime-livre para a criação de tecido cardíaco, que inclui a semeadura manualmente os esferoides em uma cavidade do molde quadrado e incubando o tecido num agitador para maturação. Em condições habituais de cultura estática, difusão de oxigênio é limitada aos aspectos exteriores da construção de tecido, resultando em necrose central. No entanto, com o molde líquido, todos os esferoides semeados no molde estão imersos na mídia com um constante movimento fluídico, permitindo a maior difusão de nutrientes e oxigênio. Além disso, este método baseado em molde permite a criação simultânea de patches de tecido de diferentes tamanhos, com o mínimo de esforço manual e o tecido resultante pode ser facilmente removido do molde. Este novo método permite a criação eficiente e reprodutível de patches cardíacas andaime-livre, em várias camadas.
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Protocol
1. preparação dos Cardiomyocytes
- Placas de 6 boas casaco com membrana basal matriz e cultura induzida por humanos células estaminais pluripotentes (hiPSCs) como descrito anteriormente17.
- Diferencie hiPSCs em hiPSC-CMs usando métodos anteriormente descritos,18.
- Pós-diferenciação d 16-18, suspender a aplicação do cardiomyocytes enxaguando cada poço com 2 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x sem cálcio ou magnésio, seguido de incubação com 1ml/bem de tripsina ou célula reagente de dissociação (ver tabela de de Materiais) por 5 min à temperatura ambiente.
- Neutralizar o reagente de dissociação de tripsina ou célula (veja a Tabela de materiais) usando um volume igual de mídia de célula de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com B-27 (mídia de células RPMI/B-27). Pipete para cima e para baixo para afrouxar as células aderidas.
- Recolher o cardiomyocytes suspenso com uma pipeta sorológica de 10 mL e transfira para um tubo cónico de 50 mL.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente para obter um centrifugado.
- Resuspenda o pellet em 10 mL de RPMI/B-27 mídia de célula.
- Combinar a 20 µ l de suspensão de células com uma quantidade igual de solução de azul de Tripan 0,4% e misture delicadamente.
- Use um hemocytometer manual para contar e obter a concentração e a célula viabilidade da suspensão celular.
2. preparação dos fibroblastos
- Inicie uma cultura de uma linhagem de células humanas fibroblastos cardíacos (HCF) (tipo ventricular adulto) conforme descrito anteriormente,16.
- Suspender os HCFs incubando-os com uma quantidade adequada de tripsina ou célula reagente de dissociação (ver Tabela de materiais) durante 5 min à temperatura ambiente16. Para um balão de T175, utilizou-se 10 mL de reagente de dissociação de tripsina ou célula.
- Neutralizar o reagente de dissociação de tripsina ou célula (veja a Tabela de materiais) usando um volume igual de médio, então transferir a amostra para um tubo cónico de 50 mL e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente para obter uma pelota.
- Resuspenda o pellet em 10 mL de meio de crescimento do fibroblasto (ver Tabela de materiais).
- Combinar a 20 µ l de suspensão de células de HCF com uma quantidade igual de solução de azul de Tripan 0,4% e misture delicadamente.
- Use um contador de célula automatizada ou manual hemocytometer para contar e obter a concentração e célula viabilidade da nova suspensão celular.
3. preparação de células endoteliais
- Inicie uma cultura de uma linhagem de células endoteliais (HUVEC) de veia umbilical humana conforme descrito anteriormente,17. Suspender o HX incubando-os com uma quantidade adequada de tripsina ou célula reagente de dissociação (ver Tabela de materiais) para 3 min a temperatura da sala17. Neutralizar o reagente de dissociação de tripsina ou célula (veja a Tabela de materiais) usando um igual volume de meio, em seguida, transferir para um tubo cónico de 50 mL e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente para obter uma pelota.
Nota: Para um balão de T175, 10 mL de reagente de dissociação de tripsina ou célula foi usado. - Resuspenda o pellet em 10 mL de meio de cultura de células endoteliais (ver Tabela de materiais).
- Combinar a 20 µ l de suspensão de HUVEC e manchá-la com uma quantidade igual de solução de azul de Tripan 0,4% e misture delicadamente.
- Use um contador automatizado de células ou um hemocytometer manual para contar e obter a concentração e a célula viabilidade da suspensão celular.
4. criação de esferoides gota de suspensão
- Coloque o enforcamento gota dispositivo que contém 850 microporos (cada um com um diâmetro de 350 µm) em placas de 6 boas estéril.
- Isolar os três tipos de células, como descrito acima: hiPSC-CMs, HCFs e HX. Combiná-los em uma proporção de 70% de iPSC-CMs, 15% HCFs e HX de 15% em um tubo cónico de 50 mL com mídia de células RPMI/B-27 com uma concentração de 2.475.000 células por mL.
- Dispense a 4 mL de suspensão de célula (2.475.000 células / mL) a cada poço de penhora ultra baixo pendurado sistema da gota, (com um diâmetro de micropore de 350 µm), sentado em uma placa de 6.
- Esferoides formarão espontaneamente dentro de 12 h de dispensar a suspensão de células para o enforcamento dispositivo de gota. Continue a cultura para um total de 72 h (3-d), a 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2para a maturação dos esferoides.
- Após 72 h da cultura, colher os esferoides através dos poros na parte inferior do enforcamento descarta sistema colocando o dispositivo em um prato com médio e rodando-o suavemente para liberar os esferoides de enforcamento dispositivo de gota.
5. 3-d Patch criação usando o molde líquido romance
- A base, placa quadrada de fundo, fundo líquido e 10 lado em camadas, as redes são montadas para criar o romance molde com o auxílio de um par de Pinças esterilizadas. Primeiro, empilhar e alinhe a base, a placa de fundo quadrado e inferior a net usando os bornes de canto. Em seguida, pilha e as redes de 10 lado alternando as direções para criar uma rede de pinos de aço fino de camada.
- Irrigue o enchimento da base com PBS ou meio para reduzir a tensão superficial e, em seguida, transferir o molde montado sobre a base de enchimento.
- Molhe a cavidade do molde líquido com PBS ou médio no mesmo método. Encher lentamente os esferoides na cavidade pressuposta do tamanho desejado (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, ou 6 x 6 x 1 mm).
Nota: Certifique-se que 120% do volume previsto de esferoides é alimentado na cavidade, para que os agregados de células estão em conexão apertada e permanecer estáticos. - Montar a rede top e top placa quadrada sobre os bornes de canto e fixe as rolhas e tubos de exploração para evitar um fiasco dos esferoides.
- Transferi o sistema de molde líquido enchido para uma placa de 6 com 6 mL de RPMI/B-27 mídia de célula ou em um recipiente estéril com suficiente médio para cobrir o molde todo montado.
- Incube a placa com o sistema de molde preenchido num agitador balançando 6 7-10 dias a 3.000-4.000 x g.
Nota: A duração da incubação é decidida pelo tamanho dos patches cardíacos. Com manchas maiores, o tempo de incubação precisará ser aumentada para maturação de remendo cardíaca.
6. remoção do Patch do romance molde líquido
- Remover o sistema de molde da mídia e coloque-o sobre o tapete de manipulação esterilizado em um prato de 10 cm estéril.
- Remova o tubo de exploração, rolhas, a placa superior do quadrado e net top. Cuidadosamente retire as redes de lado em camadas, um a um com um par de Pinças esterilizadas. Após a descanulação, um remendo cardíaco intacto é obtido no topo do líquido do fundo.
- Buscar o fundo líquido com o patch usando pinça estéril e transferir o líquido do fundo em um prato de 35 mm com 5 mL de RPMI/B27 mídia. Afrouxe delicadamente o patch do fundo líquido agitando lentamente na net no prato, ou com um raspador de pilha de estéril. Após o desprendimento do fundo líquido, o tecido cardíaco pode ser cultivado com RPMI/B27 mídia.
- Continue a incubar o patch cardíaco 3D flutuante no prato 35mm. Batendo síncrono funcional pode ser observado logo em 24 h após a remoção do molde.
- Depois de remover o patch do molde líquido, observe que sua forma é mantida com a integridade e a intensidade de espancamento síncrona aumenta com o tempo.
Nota: Os patches cardíacos baseada em molde líquidos 3D exibiram integração elétrica do componente cardiospheres após a descanulação. Observamos uma surra frequência variando de 60 a 80 batimentos por minuto que persistiu por mais de 60 dias.
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Representative Results
Em nossos experimentos, utilizamos uma suspensão de células de iPSC-CMs de 70% e 15% HCFs HX de 15% na mídia de células RPMI/B-27 com uma concentração de 2.475.000 células por mL. Depois de criar a suspensão de eritrócitos, demitiremos 4 mL de suspensão de célula para cada poço de penhora ultra baixo pendurado o sistema de entrega, conforme descrito na etapa 4.3 do protocolo. O uso do enforcamento gota sistema resultou na formação espontânea de centenas de bater esferoides após 3 dias de cultura em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade. Os esferoides observaram-se facilmente para ser batendo sob microscopia de luz em 4x e ampliação de 10x com diâmetro médio de 350 µm após 72 h da cultura (Figura 1).
No final da etapa 6.5 do protocolo, após a colheita os esferoides, molde facilmente foi semeado com métodos simples de pipetagem. Cultivo do molde permitido para uma fusão entre os esferoides; posterior remoção do molde resultou em um patch cardíaco intacto com integridade mecânica. Após a remoção do molde e 24h de cultura, observou-se batendo síncrono e funcional do tecido cardíaco, confirmando a integração mecânica dos esferoides (Figura 2, à esquerda). Observou-se também que as camadas múltiplas de esferoides estavam batendo, espontaneamente, de forma coordenada na microscopia de luz (Figura 2, direita).
Uma análise imuno-histoquímica da rede baseada em molde 3D remendo cardíaco também foi realizado com a marcador cardíaco troponina T. Confocal de imagem mostrou que o cardiomyocytes bem alinhados todos exibiram expressão de troponina T (Figura 3).
Figura 1 : Criação de pendurar gota esferoides. Cardiomyocytes de células-tronco derivadas de pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC-CMs), fibroblastos cardíacos humanos (HCFs) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram isoladas e usadas para gerar uma suspensão de células com 70% de iPSC-CMs, HCFs 15% e 15% HX, em um concentração de 2.475.000 células por mL. Depois de 72 h, os esferoides espontaneamente formadas em cada micropore observaram-se facilmente para ser batendo sob microscopia de luz. A barra de escala no painel esquerdo = 1.000 µm; a barra de escala no painel da direita = 400 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Criação de um tecido cardíaco multicamada exibindo integração de esferoides o componente. Após o desprendimento do molde líquido, o 3-d patch cardíaco manteve sua forma e demonstrou surra síncrona, indicando a integração mecânica dos esferoides, como mostrado no painel a esquerda (onde a barra de escala = 1.000 µm). As empilhados multicamadas de esferoides foram inspecionadas com microscopia de luz, como mostrado no painel da direita (onde a barra de escala = 400 µm) e observados para ser bater espontaneamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Avaliação de imunofluorescência do tecido cardíaco. Na análise de imunofluorescência, o rede baseada no molde 3D tecido cardíaco foi encontrado que consistem de cardiomyocytes bem alinhados com expressão de troponina T. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O significado deste método reside na sua reprodutibilidade e a eficácia do tecido cardíaco resultante em várias camadas. No campo da engenharia de tecido cardíaco, uma das metas do atuais é identificar um método para construir batendo, várias camadas e funcionais patches cardíacas em 3D. Nós relatamos um método eficiente e reprodutível de criação de várias camadas de tecidos cardíacos por sementeira directa manual de esferoides compostas de fibroblastos, células endoteliais e cardiomyocytes num romance molde líquido. O molde líquido usado neste método tem uma variedade de tamanhos diferentes para a criação de tecidos que variam de 2 x 2 x 1 mm a 6 x 6 x 1 mm. As técnicas que descrevemos também podem ser modificadas para molde de diferentes formas e sistemas, dependendo da geometria do tecido desejado. O celular descrito concentrações e proporções foram otimizadas anteriormente para hiPSC-CMs, e modificações para um tipo de célula diferentes exigirá avaliação adicional.
A criação em vitro de tecidos cardíacas em 3D, usando a tecnologia de bioprinter tem sido explorada com a esperança de desenvolver modelos terapêuticos e de diagnósticos. No entanto, atual bioprinting métodos são pesados e exigem um tempo significativo e o uso de estruturas auxiliares de apoio como agulhas ou materiais de andaime. A presença destes auxiliares apoio diminui de estruturas a difusão de nutrientes e oxigênio18. Portanto, necrose central é uma grande preocupação no atuais construções cardíacas 3-d, devido à falta de capilares para fornecer oxigênio e nutrientes19. Sakaguchi et al aplicado o método de imprensa voltada para folhas e utilizando biorreatores de cama vascular para desenvolver uma rede endotelial20células. No sistema de molde líquido apresentado aqui, a cavidade do molde pode permitir suficiente difusão de nutrientes e oxigênio sem necessidade de qualquer apoio estruturas ou andaimes. Além disso, o método baseado em molde líquido é eficiente e não requer habilidades especializadas para ambos a semeadura dos esferoides para o molde e a manutenção do patch subsequente. Como tal, é uma maneira rápida e barata para adquirir sincronicamente batendo e funcionais cardíacas patches.
Para otimizar o diâmetro de esferoide e o número de esferoides usado em cada dispositivo gota de suspensão, realizamos modificações sobre os tipos de células e as quantidades e solução de problemas. Para este método de molde base líquido, o diâmetro de esferoide e o número de esferoides utilizados foram de suma importância para criar um tecido cardíaco funcional de tamanho adequado. Nós tentamos as concentrações de células diferentes para otimizar o melhor tamanho de esferoide para a criação do tecido cardíaco. Três tipos de células foram usados para criar esferoides cardíacas pelo enforcamento dispositivo gota, que incluiu 70% iPSC-CMs, HCFs 15% e 15% HX. Sob microscopia de luz, os esferoides espontaneamente formadas em cada micropore observaram-se facilmente para ser bater após 72 h. Observamos que o diâmetro dos esferoides o aumentou com a concentração celular do enforcamento dispositivo de gota. Nós tentamos diferentes concentrações de esferoides, de 100 esferoides para 300 esferoides em cada dispositivo, com 4 mL de meio RPMI/B27. Com inúmeros ensaios, descobrimos que a concentração de 2.475.000 células por mL rendido um diâmetro ideal de esferoides os resultantes. Com o diâmetro otimizado de esferoides, experimentamos coleção sem esforço e propagação dos esferoides no molde líquido empilhado, que foram passos importantes para o método baseado em molde líquido para criação de várias camadas de tecido cardíaco.
O passo mais importante do protocolo é a otimização do tamanho do esferoide. Vale ressaltar que os esferoides usados neste método são menores que o tamanho dos corpos de esferoide usado em outras técnicas de bioprinting21. Esferoides maiores foram encontrados para ter necrose central devido a insuficiente difusão da nutrição e oxigênio22. Com esferoides com um diâmetro menor, difusão adequada de nutrientes e oxigênio para o centro de cada esferoide é mais facilmente realizada, aumentando a viabilidade celular em todas as áreas do patch resultante. No protocolo apresentado aqui, um diâmetro de esferoide de 350 µm permite a viabilidade celular melhorada e mais área de superfície contato entre os esferoides, que acreditamos que contribuem para a criação bem sucedida do tecido cardíaco usando este molde líquido. Portanto, este é um passo crítico na metodologia descrita. Para adaptar o protocolo para outros tipos de células, experimentos de otimização de tamanho de esferoide adicionais são necessários.
As limitações desta abordagem incluem a incapacidade de controlar com precisão o empilhamento de esferoides. Isso resulta em áreas de não-uniformidade da espessura heterogênea e patches de tecido resultante. Além disso, embora o tempo real de hands-on para a semeadura dos esferoides é mínimo, a criação de grandes manchas de várias camadas requer um tempo de cultura estendido para permitir a fusão entre os esferoides.
Quanto para aplicações futuras, este novo método líquido baseada no molde é um método eficiente e reprodutível para criar tecidos cardíacos 3-d, livre de andaime com o mínimo de esforço manual. Os tecidos resultantes de várias camados consistem de esferoides fundidos com integridade estrutural satisfatória e comportamento batendo síncrono. Este método baseado em molde líquido apresenta uma cost-effective escalável alternativo ao atual bio-fabricação e métodos de engenharia tecidos e tem o potencial para criar tecidos cardíacos clinicamente aplicáveis para o tratamento da insuficiência cardíaca, com o objetivo de substituindo cardiomyocytes isquêmica ou disfuncional23. Além disso, este método pode ser utilizado para criar tecido cardíaco para sessões específicas do paciente de potenciais drogas novas terapias24.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o seguinte fonte de financiamento: o fundo magia que questões de investigação Cardiovascular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
References
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