Summary
Questo protocollo descrive un metodo basato su stampo netto per creare tessuti cardiaci senza impalcatura tridimensionale con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio.
Abstract
Questo protocollo descrive un romanzo e facile metodo basato su stampo netto per creare tessuti cardiaci di tridimensionale (3D) senza materiale aggiuntivo impalcatura. Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CMs), fibroblasti cardiaci umani (HCF) e cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) sono isolate e utilizzate per generare una sospensione cellulare con 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs. Sono co-coltivate in un sistema di "appendere goccia" attacco ultra-basso, che contiene micropori per condensazione centinaia di sferoidi in una sola volta. Le cellule di aggregazione e spontaneamente formano sferoidi pestaggio dopo 3 giorni di co-coltura. Sferoidi sono raccolte, seminati in una cavità dello stampo novello e coltivate su un agitatore in incubatrice. Sferoidi diventano un tessuto funzionale maturo circa 7 giorni dopo la semina. I tessuti multistrati risultanti è costituito da sferoidi fusi con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio. Questo nuovo metodo ha un potenziale promettente come un metodo riproducibile ed economico per creare tessuti ingegnerizzati per il trattamento dello scompenso cardiaco in futuro.
Introduction
L'obiettivo di ingegneria del tessuto cardiaco attuale è quello di sviluppare una terapia per sostituire o riparare la struttura e la funzione del tessuto del miocardio danneggiato1. Metodi per creare modelli 3D del tessuto cardiaco che esibiscono le importanti proprietà contrattili ed elettrofisiologiche del tessuto cardiaco nativo sono stati rapidamente in espansione2,3. Una varietà di strategie sono stati esplorati e utilizzati in studi4,5. Questi vanno di metodi dall'uso di specifici idrogeli bioattivi naturali e sintetici, come gelatina, collagene, fibrina e peptidi6, a bio-inchiostro deposizione tecnologie2 e multimateriali tecnologie7.
È stato dimostrato che senza impalcatura metodi possono produrre tessuti paragonabile come metodi basati su biomateriale, senza gli svantaggi di incorporare ponteggi stranieri materiale8. Oren Caspi et al hanno dimostrato che l'incorporazione di vari tipi di cellule consente la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano altamente vascularized9. Mento et al ha sviluppato un metodo di stampa 3D per la creazione di patch cardiaci di sferoidi. Le patch risultante sono composte di cardiomiociti, fibroblasti e cellule endoteliali in un rapporto di 70:15:1510. Sferoidi sono stati indicati per essere efficaci "building blocks" della creazione del tessuto cardiaco senza impalcatura, come essi sono resistenti contro ipossia e possedere sufficiente integrità meccanica per l'impianto11,12. Gli studi precedenti hanno dimostrato parecchi metodi di fabbricazione per la creazione di sferoide, compreso l'uso dell'impiccagione drop metodo, spinner boccette13, di sistemi microfluidici14e antiaderente cultura superfici non rivestite o rivestite con agarosio micro-stampi15. In questo protocollo, usiamo l'impiccagione dispositivo di discesa, che contiene micropori per condensazione centinaia di sferoidi in una sola volta.
Questo studio presenta un romanzo e l'efficiente metodo senza impalcatura per la creazione di tessuto cardiaco, che comprende il seeding manualmente sferoidi in una cavità dello stampo quadrato e incubando il tessuto su un agitatore per maturazione. In condizioni di coltura statica usuale, diffusione dell'ossigeno è limitato agli aspetti esterni del costrutto del tessuto, con conseguente necrosi centrale. Tuttavia, con la muffa netta, tutte le sferoidi seminati nello stampo sono immersi nei media con un costante movimento fluidico, consentendo per la maggiore diffusione di sostanze nutritive e di ossigeno. Inoltre, questo metodo basato su stampo consente la creazione simultanea di patch di tessuto di diverse dimensioni con il minimo sforzo manuale e il tessuto risultante può essere facilmente rimosso dallo stampo. Questo nuovo metodo consente la creazione efficiente e riproducibile di patch cardiache senza impalcatura, multistrata.
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Protocol
1. preparazione dei cardiomiociti
- Piastre da 6 pozzetti cappotto con membrana basale matrix e cultura umana indotta cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) come precedentemente descritto17.
- Differenziarsi hiPSCs in hiPSC-CMs utilizzando metodi precedentemente descritti18.
- Alla post-differenziazione 16-18 d, sospendere i cardiomiociti risciacquando ogni pozzetto con 2 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x senza calcio o magnesio, seguita da incubazione con 1 mL/bene di tripsina o cella reagente di dissociazione (Vedi tabella di Materiali) per 5 min a temperatura ambiente.
- Neutralizzare il reagente di dissociazione tripsina o cella (Vedi Tabella materiali) utilizzando un volume uguale di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) cell supporti completati con B-27 (27/B-RPMI cell supporti). Pipettare su e giù per allentare eventuali cellule aderite.
- Raccogliere i cardiomiociti sospesi con una pipetta sierologica di 10 mL e trasferirli in una provetta conica da 50 mL.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente per ottenere un pellet cellulare.
- Risospendere il pellet in 10 mL di RPMI/B-27 cell supporti.
- 20 µ l di sospensione cellulare si combinano con una quantità uguale di soluzione di blu di Trypan 0,4% e mescolare delicatamente.
- Utilizzare un emocitometro manuale per contare e ottenere la vitalità delle cellule e di concentrazione della sospensione delle cellule.
2. preparazione dei fibroblasti
- Avviare una coltura di una linea cellulare di (tipo adulto ventricolare) fibroblasti cardiaci umani (HCF) come descritto in precedenza16.
- Sospendere il HCF incubando li con una quantità appropriata di tripsina o cella reagente di dissociazione (Vedi Tabella materiali) per 5 min a temperatura ambiente16. Per un pallone T175, 10 mL di reagente di dissociazione di tripsina o cella è stato usato.
- Neutralizzare il reagente di dissociazione tripsina o cella (Vedi Tabella materiali) utilizzando un volume uguale di mezzo, quindi trasferire il campione in una provetta conica da 50 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente per ottenere una pellet.
- Risospendere il pellet in 10 mL di mezzo di sviluppo del fibroblasto (Vedi Tabella materiali).
- 20 µ l di sospensione cellulare HCF si combinano con una quantità uguale di soluzione di blu di trypan 0,4% e mescolare delicatamente.
- È possibile utilizzare un contatore di cellule automatizzato o manuale emocitometro per contare e ottenere la vitalità delle cellule e di concentrazione della sospensione delle cellule nuove.
3. preparazione delle cellule endoteliali
- Avviare una coltura di una linea di cellule endoteliali (HUVEC) di vena ombelicale umana come descritto in precedenza17. Sospendere il HUVECs incubando li con una quantità appropriata di tripsina o cella reagente di dissociazione (Vedi Tabella materiali) per 3 min a temperatura ambiente17. Neutralizzare il reagente di dissociazione tripsina o cella (Vedi Tabella materiali) utilizzando un volume uguale di mezzo, poi il trasferimento in una provetta conica da 50 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente per ottenere una pallina.
Nota: Per un pallone T175, 10 mL di reagente di dissociazione di tripsina o cella è stato usato. - Risospendere il pellet in 10 mL di mezzo di crescita delle cellule endoteliali (Vedi Tabella materiali).
- Combinare 20 µ l della sospensione HUVEC e macchia con una pari quantità di soluzione di blu di Trypan 0,4% e mescolare delicatamente.
- È possibile utilizzare un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro manuale per contare e ottenere la vitalità delle cellule e di concentrazione della sospensione delle cellule.
4. creazione di appendere goccia sferoidi
- Posizionare l'impiccagione dispositivo di discesa che contiene 850 micropori (ciascuna con un diametro di 350 µm) in piastre da 6 pozzetti sterili.
- Isolare i tre tipi di cellule, come descritto in precedenza: hiPSC-CMs, HCF e HUVECs. Combinarle in un rapporto di 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs in una provetta conica da 50 mL con RPMI/B-27 media delle cellule ad una concentrazione di 2.475.000 cellule per mL.
- Dispensare 4 mL della sospensione delle cellule (2.475.000 cellule / mL) in ciascun pozzetto di un bassissimo allegato sistema goccia, (con un diametro di micropori di 350 µm), seduto in una piastra a 6 pozzetti d'attaccatura.
- Sferoidi formeranno spontaneamente entro 12 h di erogazione la sospensione cellulare nell'impiccagione dispositivo goccia. Continuare alla cultura per un totale di 72 h (3 d) a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità per la maturazione di sferoidi.
- Dopo 72 h di cultura, raccogliere le sferoidi attraverso i pori nella parte inferiore dell'impiccagione goccia sistema posizionando il dispositivo in un piatto con il mezzo e agitando delicatamente per rilasciare le sferoidi da appendere goccia dispositivo.
5. 3D Patch creazione usando il romanzo muffa netta
- La base, piatto quadrato fondo, fondo netto e 10 lato a strati le reti vengono assemblate per creare lo stampo romanzo con l'aiuto di un paio di pinze sterili. In primo luogo, impilare e allineare la base, piatto quadrato fondo e fondo rete utilizzando i paletti d'angolo. Quindi, stack e le reti di 10 lato in direzione per creare una rete di fine acciaio inossidabile rebbi alternata di strato.
- Sciacquare il ripieno base con PBS o mezzo per ridurre la tensione superficiale e, quindi, trasferire lo stampo montato sulla base di riempimento.
- Bagnare la cavità dello stampo netto con PBS o mezzo nello stesso metodo. Riempire lentamente gli sferoidi nella cavità presupposta della dimensione desiderata (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, o 6 x 6 x 1 mm).
Nota: Assicurarsi che il 120% del volume previsto di sferoidi è alimentato nella cavità affinché gli aggregati di cellule sono in stretto collegamento e rimanere statici. - Assemblare la parte superiore netto e piastra superiore quadrata sul post di angolo e fissare i tappi e tubi di detenzione per prevenire un washout di sferoidi.
- Trasferire il sistema di stampo netto riempito su una piastra a 6 pozzetti con 6 mL di RPMI/B-27 cell supporti o in un contenitore sterile con abbastanza medio per coprire lo stampo intero assemblato.
- Incubare la piastra a 6 pozzetti con il sistema di stampo riempito con un agitatore oscillante per 7-10 giorni a 3.000-4.000 x g.
Nota: La durata dell'incubazione è decisa dalle dimensioni delle patch cardiaci. Con le patch più grande, il tempo di incubazione dovrà essere aumentato per maturazione di patch cardiaci.
6. rimozione del cerotto dallo stampo netto romanzo
- Rimuovere il sistema di stampo dal supporto e posizionarlo sulla stuoia di movimentazione sterilizzati in un piatto di 10 cm sterile.
- Rimuovere il tubo di supporto, tappi, la piastra superiore quadrata e la rete superiore. Sfilare con attenzione le reti di lato a strati uno con un paio di pinze sterili. Dopo il decannulation, è ottenere un patch cardiaci intatto in cima a fondo netto.
- Pick up il fondo netto con la patch utilizzando pinze sterili e trasferire il fondo netto in un piatto di 35 mm con 5 mL di terreno RPMI/B27. Allentare leggermente la patch dal fondo netto agitando lentamente la rete nel piatto, o con un raschietto di cellule sterili. Dopo il distacco dal fondo netto, il tessuto cardiaco possa essere coltivato con RPMI/B27 media.
- Continuare a incubare la patch cardiaca 3D digalleggiante nel piatto 35 mm. Pestaggio sincrono funzionale può essere osservato più presto 24 h dopo la rimozione dallo stampo.
- Dopo aver rimosso la patch dallo stampo netto, osservare che la sua forma è mantenuta con l'integrità e l'intensità del battito sincrono aumenta con il tempo.
Nota: Il netto 3D basati su stampo cardiaco patch ha esibito integrazione elettrica della componente cardiosfere dopo il decannulation. Abbiamo osservato una frequenza di battito che variano da 60 a 80 battiti al minuto che ha persistito per più di 60 giorni.
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Representative Results
Nei nostri esperimenti, abbiamo utilizzato una sospensione cellulare di 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs in RPMI/B-27 media delle cellule ad una concentrazione di 2.475.000 cellule per mL. Dopo aver creato la sospensione cellulare, abbiamo erogato 4 mL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di un bassissimo allegato blocco sistema goccia, come descritto al punto 4.3 del protocollo. L'uso dell'impiccagione goccia sistema ha provocato la formazione spontanea di centinaia di battere sferoidi dopo 3 giorni di coltura a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità. Sferoidi facilmente sono stati osservati per essere battendo nell'ambito di microscopia a 4x e ingrandimento 10x con un diametro medio di 350 µm dopo 72 h della cultura (Figura 1).
Alla fine del passaggio 6.5 del protocollo, dopo la raccolta le sferoidi, lo stampo è stato seminato facilmente con semplici metodi di pipettaggio. Coltura della muffa ammessi per una fusione di sferoidi; successiva rimozione della muffa è provocato da un'intatta patch cardiaci con integrità meccanica. Dopo la rimozione dalla muffa e 24h di cultura, è stata osservata pestaggio sincrono e funzionale del tessuto cardiaco, confermando l'integrazione meccanica di sferoidi (Figura 2, sinistra). Inoltre abbiamo osservato che i vari strati di sferoidi stavano battendo spontaneamente in modo coordinato su microscopia chiara (Figura 2, destra).
Un'analisi di immunohistochemical della rete patch cardiaci 3D basata su muffa inoltre è stata effettuata con l'imaging confocale di marcatori cardiaci troponina T. ha dimostrato che i cardiomiociti ben allineati tutti hanno esibito la espressione di troponina T (Figura 3).
Figura 1 : Creazione di appendere goccia sferoidi. Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CMs), fibroblasti cardiaci umani (HCF) e cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) sono sono isolate e utilizzate per generare una sospensione cellulare con 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs, presso un concentrazione di 2.475.000 cellule per mL. Dopo 72 h, sferoidi spontaneamente formate in ogni micropore facilmente sono stati osservati per essere battendo sotto microscopia chiara. La barra della scala nel pannello di sinistra = 1.000 µm; la barra della scala nel pannello di destra = 400 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Creazione di un tessuto cardiaco multistrato visualizzati da integrazione di sferoidi componente. Dopo il distacco dallo stampo netto, la patch cardiaca 3D mantenuto la sua forma e ha dimostrato di pestaggio sincrono, che indica l'integrazione meccanica di sferoidi, come mostrato nel pannello di sinistra (dove la barra della scala = 1.000 µm). Il multistrato in pila di sferoidi sono stati controllati con microscopia chiara, come mostrato nel pannello di destra (dove la barra della scala = 400 µm) e osservati per essere battendo spontaneamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Valutazione di immunofluorescenza del tessuto cardiaco. Sull'analisi di immunofluorescenza, netto tessuto cardiaco 3D basati su stampo è stato trovato per consistere dei cardiomiociti ben allineati con l'espressione di troponina T. La barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il significato di questo metodo risiede nella sua riproducibilità e l'efficacia del tessuto cardiaco multistrato risultante. Nel campo dell'ingegneria del tessuto cardiaco, uno degli attuali obiettivi è quello di identificare un metodo per costruire palpitante, multistrata e funzionale 3D patch cardiache. Segnaliamo un metodo efficace e riproducibile di creare tessuti cardiaci multistrati di semina diretta manuale di sferoidi composti di cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti in un romanzo stampo netto. Lo stampo netto utilizzato in questo metodo ha una varietà di diverse dimensioni per la creazione di tessuti che vanno da 2 x 2 x 1 mm a 6 x 6 x 1 mm. Le tecniche che abbiamo descritto possono anche essere modificate per stampo diverse forme e sistemi a seconda della geometria del tessuto desiderato. Le concentrazioni di cella descritto ed i rapporti sono stati ottimizzati in precedenza per hiPSC-CMs, e le modifiche a un tipo di cella diversa richiederà ulteriore valutazione.
La creazione in vitro di tessuti cardiaci 3D utilizzando la tecnologia bioprinter è stata esplorata con la speranza di sviluppare modelli terapeutici e diagnostici. Tuttavia, gli attuali metodi di multimateriali sono ingombranti e richiedono molto tempo e l'uso di strutture di supporto ausiliari quali aghi o impalcatura materiali. La presenza di questi accessori supporto diminuzioni di strutture la diffusione di sostanze nutritive e ossigeno18. Pertanto, necrosi centrale è delle principali preoccupazioni nei costrutti di cardiaci 3D corrente, a causa della mancanza dei capillari per la fornitura di ossigeno e sostanze nutritive19. Sakaguchi et al applicato il metodo di interposizione orientato fogli e utilizzando bioreattori letto vascolare per sviluppare un network endoteliale20celle. Nel sistema di netto stampo qui presentato, la cavità dello stampo può consentire sufficiente diffusione di sostanze nutritive e ossigeno senza la necessità di eventuali strutture di sostegno o impalcature. Inoltre, il metodo di base di stampo netto è efficiente e non richiede competenze specialistiche per entrambi la semina di sferoidi nello stampo e la manutenzione della patch successive. Come tale, è un modo rapido ed economico per acquisire in modo sincrono battendo e patch cardiache funzionali.
Per ottimizzare il diametro della sferoide e il numero di sferoidi utilizzati in ciascuna sospensione dispositivo di discesa, abbiamo effettuato modifiche riguardanti i tipi di cellule e le quantità e di risoluzione dei problemi. Per questo metodo di base di stampo netto, il diametro di sferoide e il numero di sferoidi utilizzati erano di fondamentale importanza per creare un tessuto cardiaco funzionale di dimensioni adeguate. Abbiamo provato le concentrazioni cellulari differenti per ottimizzare la dimensione della sferoide migliore per la creazione del tessuto cardiaco. Tre tipi di cellule sono stati utilizzati per creare sferoidi cardiaci per l'impiccagione dispositivo di discesa, che comprendeva 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs. Nell'ambito di microscopia, sferoidi spontaneamente formate in ogni micropore facilmente sono stati osservati per essere battendo dopo 72 h. Abbiamo osservato che il diametro degli sferoidi aumentato con la concentrazione cellulare dell'impiccagione dispositivo goccia. Abbiamo provato diverse concentrazioni di sferoidi, da 100 sferoidi a 300 sferoidi in ogni dispositivo, con 4 mL di terreno RPMI/B27. Con numerose prove, abbiamo scoperto che la concentrazione di 2.475.000 cellule per mL ha reso un diametro ottimo di sferoidi risultante. Con il diametro ottimizzato di sferoidi, abbiamo vissuto insieme senza sforzo e semina di sferoidi nello stampo netto impilato, che erano punti importanti per il metodo basato su stampo netto per la creazione di più strati di tessuto cardiaco.
La fase più critica del protocollo è l'ottimizzazione della dimensione della sferoide. Vale la pena ricordare che le sferoidi utilizzati in questo metodo sono più piccole rispetto alle dimensioni dei corpi della sferoide utilizzato in altre tecniche di multimateriali21. Sferoidi più grandi sono stati trovati per avere necrosi centrale a causa della insufficiente diffusione di ossigeno e nutrizione22. Con sferoidi con un diametro più piccolo, un'adeguata diffusione delle sostanze nutrienti e ossigeno al centro di ogni sferoide è più facilmente realizzabile, aumentando la vitalità cellulare in tutte le aree della patch risultante. Nel protocollo presentato qui, un diametro di sferoide di 350 µm permette di attuabilità delle cellule migliorata e più di area di superficie di contatto tra gli sferoidi, che crediamo contribuisce a creare successo del tessuto cardiaco utilizzando questo stampo netto. Pertanto, questo è un passaggio fondamentale nella metodologia descritta. Per adattare il protocollo ad altri tipi di cella, sferoide ulteriori dimensioni ottimizzazione esperimenti sono richiesti.
Le limitazioni di questo approccio includono l'impossibilità di controllare con precisione l'impilamento di sferoidi. In questo modo aree di disomogeneità delle patch di tessuto risultante e spessore eterogeneo. Inoltre, anche se l'effettivo tempo di hands-on per la semina di sferoidi è minimo, la creazione di grandi macchie multistrati richiede un tempo di cultura estesa per consentire la fusione di sferoidi.
Per quanto riguarda le applicazioni future, questo metodo di base di stampo netto novello è un metodo efficace e riproducibile di creare tessuti cardiaci 3D, senza impalcatura con il minimo sforzo manuale. I tessuti multistrati risultanti è costituito da sferoidi fusi con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio. Questo metodo di base di stampo netto presenta un flessibile ed economicamente vantaggiosa alternativa alla corrente bio-fabbricazione metodi di tessuti ingegnerizzati e ha il potenziale per creare tessuti cardiaci clinicamente applicabile per il trattamento dell'insufficienza cardiaca con l'obiettivo di sostituzione di cardiomiociti ischemici o disfunzionale23. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per creare il tessuto cardiaco per le proiezioni del paziente-specifici di potenziali nuovi farmaci terapie24.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono la seguente fonte di finanziamento: il fondo di questioni che magia per ricerca cardiovascolare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
References
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