Summary
Este protocolo describe un método neto basado en el molde para crear los tejidos cardiacos libre de andamio tridimensionales satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza.
Abstract
Este protocolo describe un novedoso y fácil método neto basado en el molde para crear tejidos cardiacos de tridimensional (3D) sin material de andamio adicional. Cardiomiocitos de derivados de células madre humanas pluripotentes (iPSC-CMs), fibroblastos cardiacos humanos (HCF) y las células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs) son aisladas y utilizadas para generar una suspensión con 70% iPSC-CMs, HCF de 15% y 15% HUVECs. Son cultivadas conjuntamente en un sistema de fijación ultra baja "gota colgante", que contiene microporos para cientos de esferoides de condensación a la vez. Las células agregan y espontáneamente forman esferoides paliza después de 3 días de cocultivo. Los esferoides son cosechadas, sembrados en una cavidad de molde novela y cultivadas en un agitador en la incubadora. Los esferoides se convierten en un tejido funcional maduro aproximadamente 7 días después de la siembra. Los tejidos resultantes de varias capas consisten en esferoides fusionadas con satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza. Este nuevo método tiene potencial prometedor como un método reproducible y rentable para crear tejidos diseñados para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca en el futuro.
Introduction
El objetivo de la actual ingeniería de tejido cardiaco es desarrollar una terapia para reemplazar o reparar la estructura y función del tejido miocárdico lesionado1. Métodos para crear modelos 3D tejido cardiaco exhibe las propiedades importantes de contráctiles y electrofisiológicas del tejido cardiaco nativa han estado ampliando rápidamente2,3. Una variedad de estrategias han sido exploradas y utilizadas en los estudios4,5. Estos métodos entre el uso de específicos hidrogeles bioactivos naturales y sintéticos, tales como gelatina, colágeno, fibrina y péptidos6, y deposición del bio-tinta tecnologías tecnologías2 y bioprinting7.
Se ha demostrado que métodos libres de andamio pueden producir tejidos comparables como métodos basados en el biomaterial, sin los inconvenientes de la incorporación de material de andamio exterior8. Oren Caspi et al demostraron que la incorporación de varios tipos de células permite la generación de tejido cardiaco ingeniería humana altamente vascularizado9. Chin et al. desarrolló un método de impresión 3-d para la creación del parche cardiaco de esferoides. Parches que se componen de cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales en un cociente de 70:15:1510. Esferoides han demostrado ser eficaces "building blocks" de la creación de tejido cardíaco libre de andamios, ya que son resistentes contra la hipoxia y poseen suficiente integridad mecánica para la implantación de11,12. Estudios anteriores han demostrado varios métodos de fabricación para la creación de esferoide, incluyendo el uso de las que cuelgan de la gota método, spinner frascos13, sistemas de microfluidos14y cultura no adherente superficies sin revestir o revestidos con micro-moldes de agarosa15. En este protocolo, se utiliza el colgante gota dispositivo, que contiene microporos para cientos de esferoides de condensación a la vez.
Este estudio presenta un novedoso y eficaz método de andamio-libre para la creación de tejido cardíaco, que incluye siembra manualmente los esferoides en la cavidad de un molde cuadrado y el tejido en un agitador de incubación para la maduración. Bajo condiciones de cultivo estático habitual, difusión de oxígeno está limitada a los aspectos exteriores de la construcción de tejido, resultando en necrosis central. Sin embargo, con el molde de red, todos los esferoides sembradas en el molde están inmersos en los medios de comunicación con un constante movimiento fluídico, permitiendo para la mayor difusión de nutrientes y oxígeno. Además, este método basado en el molde permite la creación simultánea de parches de tejido de diferentes tamaños con el mínimo esfuerzo manual y el tejido resultante se puede quitar fácilmente del molde. Este novedoso método permite la creación eficiente y reproducible de parches cardíacos libre de andamio, de varias capas.
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Protocol
1. preparación de cardiomiocitos
- Placas de 6 pocillos capa con membrana del sótano matriz y cultura humanas pluripotentes células (hiPSCs) como describieron anteriormente17.
- Se diferencian hiPSCs en hiPSC-CMs usando métodos previamente descritos18.
- En la diferenciación posterior de 16-18 d, suspender los cardiomiocitos aclarando cada pocillo con 2 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) sin calcio ni magnesio, seguido por la incubación con 1 mL/pozo de tripsina o celular reactivo de disociación (ver tabla de Materiales) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Neutralizar el reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) con un volumen igual de los medios de comunicación celular de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complementado con B-27 (media de células RPMI/B-27). Pipetee hacia arriba y hacia abajo para aflojar las células adheridas.
- Recoger los cardiomiocitos suspendidos con una pipeta serológica de 10 mL y transferir a un tubo cónico de 50 mL.
- Centrifugue la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un precipitado de células.
- Resuspender el precipitado en 10 mL de RPMI/B-27 celular medio.
- 20 μl de la suspensión celular se combinan con una cantidad igual de solución de azul de tripano 0.4% y mezclar suavemente.
- Usar un hemocitómetro manual para contar y obtener la viabilidad concentración y celular de la suspensión de células.
2. preparación de los fibroblastos
- Iniciar una cultura de una línea de células del fibroblasto cardiaco humano (HCF) (tipo ventricular adulto) como se describe anteriormente16.
- Suspender el HCF por incubación con una cantidad apropiada del reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) durante 5 minutos a temperatura ambiente16. Para un frasco T175, 10 mL de reactivo de disociación tripsina o célula se utilizó.
- Neutralizar el reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) con un volumen igual de medio, luego transferir la muestra a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un pelotilla.
- Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de crecimiento del fibroblasto (véase Tabla de materiales).
- 20 μl de la suspensión de células HCF se combinan con una cantidad igual de solución de azul de tripano 0.4% y mezclar suavemente.
- Usar un contador de células automatizado o manual hemocitómetro para contar y obtener la viabilidad concentración y celular de la suspensión de células nuevas.
3. preparación de células endoteliales
- Iniciar una cultura de una línea de células endoteliales (HUVEC) de la vena umbilical humana tal como se describe anteriormente17. Suspender las HUVECs por incubación con una cantidad apropiada del reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) por 3 min a temperatura ambiente17. Neutralizar el reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) con un volumen igual de medio, luego se transfieren a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un pellet.
Nota: Para un matraz T175, 10 mL de reactivo de disociación tripsina o célula se utilizó. - Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de cultivo de células endoteliales (véase Tabla de materiales).
- 20 μl de la suspensión HUVEC se combinan y la mancha con una cantidad igual de solución de azul de tripano 0.4% y mezclar suavemente.
- Usar un contador de células automatizado o un hemocitómetro manual para contar y obtener la viabilidad concentración y celular de la suspensión de células.
4. creación de colgante gota esferoides
- Colocar el colgante gota dispositivo que contiene 850 microporos (cada uno con un diámetro de 350 μm) en placas de 6 pocillos estériles.
- Aislar los tres tipos de células como se describe anteriormente: hiPSC CMs, HCF y HUVECs. Combinar en una proporción de 70% iPSC-CMs, 15% de HCF y HUVECs 15% en un tubo cónico de 50 mL con RPMI/B-27 los medios de comunicación de la célula a una concentración de 2.475.000 células por mL.
- Pipetear 4 mL de la suspensión celular (2.475.000 células por mL) a cada pocillo de un accesorio ultra bajo colgante sistema (con un diámetro del microporo de 350 μm) en una placa de 6 pozos.
- Esferoides se forman espontáneamente dentro de 12 h de dispensar la suspensión de células en el colgante gota dispositivo. Continuar a la cultura para un total de 72 h (3 d) a 37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad para la maduración de los esferoides.
- Después de 72 h de cultivo, cosecha de los esferoides a través de los poros en la parte inferior de las que cuelgan gota sistema colocando el dispositivo en un plato con medio y girando suavemente para soltar los esferoides de colgar dispositivo gotas.
5. creación de parche 3D utilizando el nuevo molde neto
- La base, plato cuadrado inferior, red de fondo y 10 capas lado redes se ensamblan para crear el molde de la novela con la ayuda de un par de pinzas estériles. En primer lugar, pila de alinear la base, plato cuadrado inferior y fondo net usando los postes esquineros. Luego, la pila y las redes 10 lado alternando direcciones para crear una red de finas patas de acero inoxidable de la capa.
- Eliminar el relleno base con PBS o medio para reducir la tensión superficial y, a continuación, transferir el molde montado en la base del relleno.
- Húmeda la cavidad del molde neto con PBS o medio en el mismo método. Llenar lentamente los esferoides en la cavidad presupuesta del tamaño deseado (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 m, o 6 x 6 x 1 mm).
Nota: Asegúrese de que el 120% del volumen esperado de esferoides se alimenta en la cavidad para que los agregados de la célula están en estrecha conexión y permanecer estáticos. - Montar el top red placa superior y cuadrada en los postes esquineros y asegure los tapones y tubos de retención para prevenir el lavado de los esferoides.
- Transferir el sistema de llenado de molde neta a una placa de la pozo de 6 con 6 mL de RPMI/B-27 medios de célula o en un recipiente estéril con suficiente medio para cubrir el molde montado todo.
- Incubar la placa de la pozo de 6 con el sistema de llenado del molde en un agitador oscilante durante 7-10 días a 3.000-4.000 x g.
Nota: La duración de la incubación se decide por el tamaño de los parches cardíacos. Con los parches más grandes, el tiempo de incubación deberá aumentarse para maduración de parche cardiaco.
6. eliminación de la versión de la novela neta molde
- Desmontar el molde de los medios de comunicación y colóquelo en la estera de esterilizados manejo en un recipiente estéril de 10 cm.
- Retire el tubo, tapones, la placa superior del cuadrado y la red superior. Cuidadosamente Deslice el lado capas redes uno por uno con un par de pinzas estériles. Después de la decanulación, se obtiene un parche cardiaco intacto encima de la red de fondo.
- Coge la red de fondo con el parche utilizando pinzas estériles y transferir la red de fondo en una placa de 35 mm con 5 mL de Medio RPMI/B27. Aflojar el parche de la red de fondo suavemente agitando lentamente la red en el plato, o con un raspador estéril de la célula. Después de la separación de la red de fondo, el tejido cardiaco puede ser cultivado con medios RPMI/B27.
- Seguir a incubar el parche cardiaco 3D flotan libremente en el plato de 35 mm. Paliza sincrónica funcional puede observarse tan pronto como 24 horas después del retiro del molde.
- Después de quitar el parche del molde de red, tenga en cuenta que su forma se mantiene con la integridad y la intensidad del latido sincrónico aumenta con el tiempo.
Nota: Los parches cardiacos basados en molde red 3D exhibieron la integración eléctrica de componente cardiospheres después del decannulation. Se observó una frecuencia de golpeo que van de 60 a 80 pulsaciones por minuto que persistió por más de 60 días.
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Representative Results
En nuestros experimentos, se utilizó una suspensión de iPSC-CMs 70%, 15% HCF y HUVECs 15% en medios de comunicación de células RPMI/B-27 a una concentración de 2.475.000 células por mL. Después de crear la suspensión de células, nos dispensa 4 mL de la suspensión celular en cada pocillo de un accesorio ultra bajo suspensión sistema, tal como se describe en el paso 4.3 del protocolo. El uso de colgar sistema dio lugar a la formación espontánea de cientos de vencer a esferoides después de 3 días de cultivo a 37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad. Los esferoides fueron observadas fácilmente para batir bajo microscopia ligera en 4 X y 10 aumentos con un diámetro promedio de 350 μm después de 72 h de cultivo (figura 1).
Al final del paso 6.5 del Protocolo, después de la cosecha de los esferoides, el molde fue sembrado fácilmente con métodos sencillos de pipeteo. Cultivo del molde permitido una fusión de los esferoides; retiro posterior del molde dio lugar a un parche cardiaco intacto con integridad mecánica. Después del retiro del molde y 24 h de cultivo, se observa latido sincrónico y funcional del tejido cardiaco, confirmando la integración mecánica de los esferoides (figura 2, izquierda). También observamos que las múltiples capas de esferoides estaban golpeando espontáneamente de manera coordinada en microscopia ligera (figura 2, derecha).
El análisis de immunohistochemical de la red basada en molde 3D parche cardiaco también se realizó con lo marcadores cardíacos troponina T. proyección de imagen Confocal demostró que los cardiomiocitos bien alineados todos exhibieron expresión de troponina T (figura 3).
Figura 1 : Creación de colgante gota esferoides. Cardiomiocitos de derivados de células madre humanas pluripotentes (hiPSC-CMs), fibroblastos cardiacos humanos (HCF) y las células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs) fueron aisladas y utilizadas para generar una suspensión de células iPSC-CMs 70%, 15% HCF y HUVECs 15%, en un concentración de 2.475.000 células por mL. Después de 72 h, los esferoides espontáneamente formados en cada microporo fácilmente fueron observadas para ser latiendo bajo microscopia ligera. La barra de escala en el panel izquierdo = 1.000 μm; la barra de escala en el panel derecho = 400 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Creación de un tejido cardiaco varias capas mostrando la integración de los esferoides componente. Después de la separación del molde neto, el parche cardiaco 3D mantiene su forma y demostró latido sincrónico, indicando la integración mecánica de los esferoides, como se muestra en el panel izquierdo (donde la barra de escala = 1.000 μm). El apilado multicapas de esferoides fueron inspeccionados con microscopía de luz, como se muestra en el panel derecho (donde la barra de escala = 400 μm) y observado a ser superando a espontáneamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Evaluación de la inmunofluorescencia de tejido cardiaco. En el análisis de inmunofluorescencia, el tejido cardiaco 3-d basada en molde neto fue encontrado para consisten en cardiomiocitos bien alineada con la expresión de troponina T. La barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La importancia de este método radica en su reproducibilidad y la eficacia del tejido cardiaco resultante de varias capas. En el campo de la ingeniería de tejido cardiaco, uno de los objetivos actuales es identificar un método para crear parches cardíacos 3D golpes, varias capas y funcionales. Divulgamos un método eficiente y reproducible de la creación de varias capas de tejidos cardiacos por siembra manual directa de esferoides compuestos de cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos en un nuevo molde neto. El molde neto utilizado en este método tiene una variedad de diferentes tamaños para la creación de tejidos que van desde 2 x 2 x 1 mm hasta 6 x 6 x 1 mm. Las técnicas que hemos descrito pueden modificarse para moldes diferentes formas y sistemas dependiendo de la geometría del tejido deseado. El celular descrito concentraciones y proporciones fueron optimizadas previamente para hiPSC CMs, y modificaciones en un tipo de células diferentes requieren evaluación adicional.
La creación en vitro de los tejidos cardiacos 3D utilizando la tecnología bioprinter ha sido explorada con la esperanza de desarrollo de modelos terapéuticos y de diagnósticos. Sin embargo, los métodos actuales de bioprinting son engorrosos y requieren mucho tiempo y el uso de estructuras de apoyo auxiliares tales como agujas o materiales del andamio. La presencia de estos auxiliares de apoyo disminuye las estructuras la difusión de nutrientes y oxígeno18. Por tanto, necrosis central es una preocupación importante en construcciones cardiacas 3D actuales, debido a la falta de capilares para suministrar oxígeno y nutrientes19. Sakaguchi et al. aplicó el método de intercalando orientada a la célula de hojas y la utilización de biorreactores de lecho vascular para desarrollar una red endotelial20. En el sistema de molde neto presentado aquí, la cavidad del molde puede permitir suficiente difusión de nutrientes y el oxígeno sin el requerimiento de apoyo estructuras o andamios. Además, el método neto basado en el molde es eficiente y no requiere conocimientos especializados para ambos la siembra de los esferoides en el molde y el mantenimiento de la revisión posterior. Como tal, es una manera rápida y barata para adquirir batir sincrónicamente y parches cardíacos funcionales.
Para optimizar el diámetro del esferoide y el número de esferoides utilizado en cada colgante gota dispositivo, se llevó a cabo la solución de problemas y modificaciones con respecto a los tipos de la célula y las cantidades. Para este método neto basado en el molde, el diámetro del esferoide y el número de esferoides utilizados fueron de vital importancia para crear un tejido cardíaco funcional del tamaño adecuado. Probamos las concentraciones celulares diferentes para optimizar el tamaño esferoidal para la creación de tejido cardiaco. Tres tipos de células se utilizaron para crear esferoides cardiacas por el colgante gota dispositivo, iPSC-CMs 70%, 15% de HCF y HUVECs 15%. Bajo microscopia ligera, fácilmente se observaron los esferoides espontáneamente formados en cada microporo a golpes después de 72 h. Observamos que diámetro de los esferoides aumentó con la concentración de células de las que cuelgan dispositivo gotas. Probamos diferentes concentraciones de esferoides, de 100 esferoides 300 esferoides en cada dispositivo, con 4 mL de Medio RPMI/B27. Con numerosos ensayos, encontramos que la concentración de 2.475.000 células por mL rindió un diámetro óptimo de los esferoides resultantes. Con el diámetro optimizado de esferoides, experimentamos una colección y la siembra de los esferoides en el molde apilado de neto, que eran pasos importantes para el método neto basado en el molde para la creación de múltiples capas de tejido cardiaco.
El paso más crítico del protocolo es la optimización del tamaño del esferoide. Cabe mencionar que los esferoides que se utiliza en este método son más pequeños que el tamaño de cuerpo esferoide utilizado en otras técnicas bioprinting del21. Esferoides más grandes se han encontrado para tener necrosis central debido a la insuficiente difusión de la nutrición y el oxígeno22. Con esferoides con un diámetro más pequeño, difusión adecuada de nutrientes y oxígeno al centro de cada esferoide se logra más fácilmente, aumentando la viabilidad celular en todas las áreas de la revisión resultante. En el protocolo presentado aquí, de 350 μm de diámetro esferoide permite viabilidad celular mejorada y más superficie área de contacto entre los esferoides, que creemos que contribuyen a la creación exitosa del tejido cardiaco usando este molde de red. Por lo tanto, este es un paso crítico en la metodología descrita. Para adaptar el protocolo a otros tipos de células, experimentos de optimización de tamaño esferoidal adicionales se requieren.
Las limitaciones de este enfoque incluyen la incapacidad para controlar con precisión el apilamiento de los esferoides. Esto resulta en áreas de falta de uniformidad del grueso heterogénea y parches de tejido resultante. Por otra parte, aunque el tiempo real de práctico para la siembra de los esferoides es mínimo, la creación de grandes manchas varias capas requiere un tiempo de la cultura extendido para permitir la fusión de los esferoides.
En cuanto a futuras aplicaciones, este novedoso método de molde base neto es un método eficiente y reproducible de la creación de tejidos cardiacos 3-d, libre de andamios con el mínimo esfuerzo manual. Los tejidos de varias capas que consisten en esferoides fusionadas con satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza. Este método de molde base neta presenta una escalable y rentable alternativa a la corriente bio-fabricación de métodos de ingeniería tejidos y tiene el potencial para crear tejidos cardiacos clínicamente aplicables para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca con el objetivo de sustitución de cardiomiocitos isquémicos o disfuncional23. Además, este método puede ser utilizado para crear tejido cardiaco de exámenes específico para cada paciente de posibles drogas novedosas terapias24.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen la siguiente fuente de financiamiento: la magia que cuestiones de fondo para la Investigación Cardiovascular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
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