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Bioengineering

Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung

doi: 10.3791/58252 Published: August 5, 2018

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine net Schimmel basierende Methode um dreidimensionale Gerüst-freie kardialen Gewebe mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten zu erstellen.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige und einfache net Schimmel-basierte Methode, dreidimensionale (3D) kardialen Gewebe ohne zusätzliche Gerüst-Material. Human-induzierte pluripotente Stammzellen-Zelle abgeleitet Kardiomyozyten (iPSC-CMs), menschliche kardialen Fibroblasten (TREIBGASEN) und menschliche nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) zu isolieren und verwendet, um eine Zellsuspension mit 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel generieren. Sie sind in eine extrem niedrige Befestigungssystem "hängenden Tropfen", die Mikroporen für Hunderte von Sphäroide gleichzeitig kondensiert enthält Co kultiviert. Die Zellen aggregieren und spontan schlagende Sphäroide nach 3 Tagen der kokultur bilden. Die Sphäroide werden geerntet, in einen Roman Formhohlraum entkernt und auf einen Shaker im Brutschrank kultiviert. Die Sphäroide werden Reife Funktionsgewebe ca. 7 Tage nach der Aussaat. Die daraus resultierende mehrschichtige Gewebe bestehen aus verschmolzenen Sphäroide mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten. Diese neue Methode hat viel versprechende Potenzial als eine reproduzierbare und kostengünstige Methode, um technische Gewebe für die Behandlung der Herzinsuffizienz in der Zukunft zu schaffen.

Introduction

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Das Ziel des aktuellen Herzgewebe Engineering ist, eine Therapie zu ersetzen oder zu reparieren, die Struktur und Funktion des verletzten Herzmuskelgewebe1zu entwickeln. Methoden zum Erstellen von 3-d-Herzgewebe Modelle präsentiert die wichtigeren kontraktilen und elektrophysiologischen Eigenschaften des nativen Herzgewebe haben2,3rasch ausgedehnt. Eine Vielzahl von Strategien haben erforscht und in Studien4,5verwendet worden. Diese Methoden reichen von den Einsatz von speziellen synthetischen und natürlichen bioaktiven Hydrogele, wie Gelatine, Kollagen, Fibrin und Peptide6, auf Bio-Tinte Ablagerung Technologien2 und Bioprinting Technologien7.

Es hat sich gezeigt, dass Gerüst-freie Methoden als Biomaterial-basierte Methoden, ohne die Nachteile der Einbeziehung ausländischer Gerüst Material8vergleichbare Gewebe produzieren können. Oren Caspi Et Al. zeigten, dass die Einbeziehung der verschiedenen Arten von Zellen die Generation stark vaskularisierte menschlichen entwickelt Herzgewebe9ermöglicht. Kinn Et Al. entwickelt eine 3-d-Druckverfahren für kardiale Patch Kreation aus Sphäroide. Daraus resultierende Patches bestehen aus Herzzellen, Fibroblasten und Endothelzellen in einem 70:15:15 Verhältnis10. Sphäroide nachweislich wirksame "Bausteine" der Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung, wie sie sind resistent gegen Hypoxie und verfügen über ausreichende mechanische Integrität für Implantation11,12. Frühere Studien haben gezeigt, verschiedene Herstellungsmethoden für Sphäroid Schöpfung, einschließlich der Verwendungdes der hängenden drop-Methode, Spinner Fläschchen13, mikrofluidische Systeme14und nicht anhaftende Kultur Oberflächen unbeschichtet oder beschichtet mit Agarose Mikro-Gußformen15. In diesem Protokoll verwenden wir die hängenden Tropfen Gerät, enthält Mikroporen für Hunderte von Sphäroide gleichzeitig kondensiert.

Diese Studie stellt eine neuartige und effiziente Gerüst-freie Methode für Herzgewebe Erstellung, manuell die Sphäroide in einen quadratischen Formhohlraum Aussaat und Inkubation des Gewebes auf einen Shaker für Reifung. Unter üblichen statischen Kulturbedingungen ist Sauerstoffdiffusion beschränkt sich auf die äußeren Aspekte der Gewebe-Konstrukt, was zentrale Nekrose. Mit der net Form Tauchen alle Sphäroide ausgesät in die Form jedoch in Medien mit einer Konstanten fluidische Bewegung, so dass für die verstärkte Verbreitung von Nährstoffen und Sauerstoff. Darüber hinaus diese Form-basierte Methode ermöglicht die gleichzeitige Erstellung von unterschiedlich großen Gewebe Patches mit minimalem manuellen Aufwand und das resultierende Gewebe kann leicht aus der Form entfernt werden. Diese neuartige Methode ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Erstellung von Gerüst-frei, vielschichtigen kardiale Patches.

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Protocol

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1. Vorbereitung von Kardiomyozyten

  1. 6-Well-Platten mit Basalmembran Matrix und Kultur Mensch-induzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs) wie zuvor beschrieben17zu beschichten.
  2. HiPSCs in HiPSC-CMs mit der zuvor beschriebenen Methoden18zu unterscheiden.
  3. 16-18 d Post-Differenzierung aussetzen der Herzmuskelzellen durch Spülen jedes gut mit 2 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Kalzium und Magnesium, gefolgt von Inkubation mit 1 mL/auch von Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz (siehe Tabelle des Materialien) für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Das Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz zu neutralisieren (siehe Tabelle der Materialien) über ein gleiches Volumen von Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Zelle Medien mit B-27 (RPMI/B-27 Zelle Medien) ergänzt. Pipette rauf und runter um alle eingehalten Zellen zu lockern.
  5. Sammeln Sie die abgehängten Herzzellen mit einer serologischen 10-mL-Pipette und übertragen Sie sie auf eine 50 mL konische Rohr.
  6. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur einen Zelle Pellet zu erhalten.
  7. Das Pellet in 10 mL RPMI/B-27 Zelle Medien aufzuwirbeln.
  8. Kombinieren Sie 20 µL Zellsuspension mit einer gleichen Menge von 0,4 % Trypan blau Lösung und mischen Sie vorsichtig.
  9. Verwenden Sie eine manuelle Hemocytometer zu zählen und erhalten die Konzentration und Zelle Tragfähigkeit der Zellsuspension.

2. Vorbereitung der Fibroblasten

  1. Initiieren einer Kultur einer menschlichen kardialen Fibroblasten (HCF) (Erwachsene ventrikuläre Typ)-Zelllinie wie zuvor16beschrieben.
  2. Aussetzen der TREIBGASEN durch Inkubation mit einer entsprechenden Menge an Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) für 5 min bei Raumtemperatur16. Für ein T175 Fläschchen wurde 10 mL Trypsin oder Zelle Dissoziation-Reagenz verwendet.
  3. Das Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz zu neutralisieren (siehe Tabelle der Materialien) ein gleiches Volumen des Mediums mit, dann übertragen Sie die Probe auf eine 50 mL konische Rohr und Zentrifugieren die Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur zu erhalten eine Pellet.
  4. Das Pellet in 10 mL von Fibroblasten Wachstumsmedium Aufschwemmen (siehe Tabelle der Materialien).
  5. 20 µL der HCF Zellsuspension mit einer gleichen Menge von 0,4 % Trypan blau Lösung kombinieren und vorsichtig mischen.
  6. Verwenden Sie eine automatisierte Zelle Zähler oder manuelle Hemocytometer zu zählen und erhalten die Konzentration und Zelle Tragfähigkeit des neuen Zellsuspension.

3. Vorbereitung der Endothelzellen

  1. Initiieren Sie eine Kultur der menschlichen nabelader Endothelzellen (HUVECS) Zeile wie oben beschrieben17. Aussetzen der Mediumwechsel durch Inkubation mit einer entsprechenden Menge an Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) für 3 min bei Zimmertemperatur17. Das Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz zu neutralisieren (siehe Tabelle der Materialien) ein gleiches Volumen des Mediums verwenden, übertragen Sie dann auf eine 50 mL konische Rohr und Zentrifugieren die Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur ein Pellet zu erhalten.
    Hinweis: Für eine Flasche T175 war 10 mL Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz verwendet.
  2. Das Pellet in 10 mL von Endothelzellen Wachstumsmedium Aufschwemmen (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Kombinieren Sie 20 µL der HUVECS Suspension zu und Färben Sie es mit einer gleichen Menge von 0,4 % Trypan blau Lösung und mischen Sie vorsichtig.
  4. Verwenden Sie eine automatisierte Zelle Zähler oder eine manuelle Hemocytometer zu zählen und erhalten die Konzentration und Zelle Tragfähigkeit der Zellsuspension.

4. Schaffung von hängenden Tropfen Sphäroide

  1. Legen Sie die hängenden Tropfen Gerät enthält 850 Mikroporen (jeweils mit einem Durchmesser von 350 µm) in sterilen 6-Well-Platten.
  2. Die drei Arten von Zellen zu isolieren, wie oben beschrieben: HiPSC-CMs und TREIBGASEN Mediumwechsel. Kombinieren sie in einem Verhältnis von 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel in einem 50 mL konische Röhrchen mit RPMI/B-27 Zelle Medien in einer Konzentration von 2.475.000 Zellen pro mL.
  3. 4 mL Zellsuspension (2.475.000 Zellen pro mL) in jede Vertiefung einer ultra-niedrigen Anlage hängen Drop-System (mit Zusammenarbeit von 350 µm Durchmesser) sitzt in einem 6-Well-Platte zu verzichten.
  4. Sphäroide bilden sich spontan innerhalb von 12 h der Verzicht auf der Zellsuspension in den hängenden Tropfen Gerät. Kultur für eine Gesamtmenge von 72 h (3 d) bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit für die Reifung der Sphäroide weiter.
  5. Nach 72 h Kultur, Ernte der Sphäroide durch die Poren an der Unterseite der hängenden System indem das Gerät in eine Schale mit Medium und wirbelnden es sanft um die Sphäroide aus der hängenden freizugeben fallen Tropfen Gerät.

5. 3-d-Patch-Erstellung unter Verwendung neuartige Net Form

  1. Die Basis, quadratische Bodenplatte Bodennetz und 10 geschichteten Seite Netze montiert sind, um die neuartige Form mit Hilfe von ein paar sterilen Pinzette zu erstellen. Zuerst, stapeln Sie und richten Sie die Base, quadratische Bodenplatte, und unten Sie Netz mit den Eckpfosten. Dann Stapeln und Schicht 10 Seite Netze in wechselnden Richtungen um ein Netz von feinen Edelstahl-Zinken zu erstellen.
  2. Spülen Sie die Füllung mit PBS oder Medium zu reduzieren die Oberflächenspannung und übertragen Sie anschließend die zusammengebaute Form auf die Füllung-Basis.
  3. Befeuchten Sie die net Kavität mit PBS oder Medium in der gleichen Methode. Füllen Sie langsam die Sphäroide in vorausgesetzten Hohlraum der gewünschten Größe (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm oder 6 x 6 x 1 mm).
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass 120 % des erwarteten Volumens der Sphäroide in den Hohlraum zugeführt wird, so dass die Zelle Aggregate in engen Zusammenhang stehen und statisch bleiben.
  4. Montieren Sie die obere Netz und quadratische Deckplatte auf die Eckpfosten und sichern Sie den Stopper und Holding Röhren eine Auswaschung der Sphäroide zu verhindern.
  5. Übertragen Sie gefüllte net Schimmel-System auf eine 6-Well-Platte mit 6 mL RPMI/B-27 Zelle Medien oder in einen sterilen Behälter mit genügend Mittel zur Deckung der gesamten zusammengesetzten Form.
  6. 7-10 Tage bei 3.000-4.000 X ginkubieren Sie 6-Well-Platte mit dem gefüllten Schimmel-System auf einen schwingenden Shaker.
    Hinweis: Die Dauer der Inkubation wird durch die Größe der kardialen Patches entschieden. Mit größeren Patches müssen die Inkubationszeit für kardiale Patch Reifung erhöht werden.

6. Entfernen des Patches aus der neuartigen Net Form

  1. Entfernen Sie das Schimmel-System aus den Medien und legen Sie es auf die sterilisierten Umgang mit Matte in eine sterile 10-cm-Schüssel.
  2. Entfernen Sie das halteröhrchen, Stopper, quadratische Deckplatte und im besten Netz. Schieben Sie vorsichtig mit einer sterilen Pinzette heraus die geschichteten Seite Netze eins nach dem anderen. Nach Decannulation wird ein intakter Herz Patch oben auf das Bodennetz erhalten.
  3. Das Bodennetz mit dem Patch mit sterilen Pinzette Abholung und transfer das Bodennetz in eine 35-mm-Schale mit 5 mL RPMI/B27 Medien. Lösen Sie vorsichtig den Patch von net unten durch das Netz langsam umschwenken, in der Schale oder mit einem sterilen Zelle Schaber. Nach der Loslösung von der Bodennetz kann das Herzgewebe mit RPMI/B27 Medien kultiviert werden.
  4. Weiter zu den frei schwebenden 3-d-kardiale Patch in der 35-mm-Schale zu inkubieren. Funktionale synchron schlagen kann bereits 24 Stunden nach der Entnahme aus der Form beobachtet werden.
  5. Nach dem Entfernen des Patchs aus dem net Werkzeug, zu beobachten, dass seine Form mit Integrität und der Intensität der synchron schlagen steigt mit der Zeit erhalten bleibt.
    Hinweis: Die 3-d-net Schimmel-basierte kardiale Patches ausgestellt elektrische Integration der Komponente Cardiospheres nach Decannulation. Wir beobachteten eine Tracht Prügel-Frequenz von 60 bis 80 Schlägen pro Minute, die länger als 60 Tage beibehalten.

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Representative Results

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In unseren Experimenten haben wir eine Zellsuspension 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel in RPMI/B-27 Zelle Medien in einer Konzentration von 2.475.000 Zellen pro mL verwendet. Nach dem Erstellen der Zellsuspension, verzichtet wir 4 mL Zellsuspension in jede Vertiefung der Dateianhang Ultra low Drop Aufhängesystem, wie unter Punkt 4.3 des Protokolls beschrieben. Die Verwendung des Behangs fundsystem führte die spontane Bildung von Hunderten Sphäroide nach 3 Tagen der Kultur bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit zu schlagen. Die Sphäroide beobachtet leicht um unter Lichtmikroskopie bei 4 X und 10 X Vergrößerung mit einem mittleren Durchmesser von 350 µm nach 72 h Kultur (Abbildung 1) zu schlagen.

Am Ende von Schritt 6.5 des Protokolls, nach der Ernte die Sphäroide war die Form leicht mit einfachen Mitteln pipettieren ausgesät. Kultivierung der Form für eine Fusion der Sphäroide erlaubt; nachträgliche Entfernung des Schimmels resultierte in einem intakten kardiale Patch mit mechanischen Integrität. Nach Entnahme aus der Form und 24 h Kultur wurde funktional und synchron schlagen das Herzgewebe beobachtet, Bestätigung der mechanischen Integration der Sphäroide (Abbildung 2, Links). Wir beobachten auch, dass die verschiedenen Schichten der Sphäroide spontan in koordinierter Form auf Lichtmikroskopie (Abbildung 2, rechts) schlugen.

Eine immunhistochemische Analyse des Netzes Schimmel-basierte 3-d-kardiale Patch auch mit der kardialen Marker Troponin T. konfokale Bildgebung erfolgte zeigte, dass die gut abgestimmten Kardiomyozyten Troponin T Ausdruck (Abbildung 3) ausgestellt.

Figure 1
Abbildung 1 : Erstellung von hängenden Tropfen Sphäroide. Human-induzierte pluripotente Stammzellen abgeleitete Herzmuskelzellen (HiPSC-CMs), menschliche kardialen Fibroblasten (TREIBGASEN) menschlichen nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) isoliert und wurden verwendet, um eine Zellsuspension mit 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel zu erzeugen eine Konzentration von 2.475.000 Zellen pro mL. Nach 72 h beobachtet die spontan gebildeten Sphäroide in jeder Zusammenarbeit leicht um unter Lichtmikroskopie zu schlagen. Der Maßstab in der linken Leiste = 1.000 µm; die Maßstabsleiste auf der rechten Seite = 400 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Erstellung einer vielschichtigen Herzgewebe anzeigen Integration der Komponente Sphäroide. Nach der Loslösung von der net Schimmel, der 3-d-kardiale Patch gepflegt seine Form und demonstriert synchron schlagen, die mechanische Integration der Sphäroide angibt, wie in der linken Leiste gezeigt (wo die Maßstabsleiste = 1.000 µm). Die gestapelten Multilayern Sphäroide wurden mit Lichtmikroskopie, untersucht, wie auf der rechten Seite gezeigt (wo die Maßstabsleiste = 400 µm), und beobachteten, spontan zu schlagen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Immunfluoreszenz Auswertung der das Herzgewebe. Immunfluoreszenz-Analyse fand das net Schimmel-basierte 3-d-Herzgewebe gut abgestimmten Herzzellen mit Troponin T Ausdruck bestehen. Die Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Die Bedeutung dieser Methode liegt in ihrer Reproduzierbarkeit und die Wirksamkeit der daraus resultierenden vielschichtigen Herzgewebe. Im Bereich der kardialen Gewebetechnik ist eines der aktuellen Ziele zu identifizieren, eine Methode um schlagen, vielschichtig und funktionale 3-d-kardiale Patches zu konstruieren. Wir berichten über eine effiziente und reproduzierbare Methode vielschichtigen kardialen Gewebe durch manuelle Direktsaat der Sphäroide bestehend aus Herzzellen, Endothelzellen und Fibroblasten in eine neuartige net Form zu schaffen. Die net Form in diese Methode verwendet hat eine Vielzahl von unterschiedlichen Größen für die Erstellung von Geweben von 2 x 2 x 1 mm bis 6 x 6 x 1 mm. Die Techniken, die wir beschrieben haben können auch für verschiedene Schimmel Formen und Systemen abhängig von der gewünschten Gewebe Geometrie geändert werden. Die beschriebenen Zelle Konzentrationen und Verhältnisse waren zuvor für HiPSC-CMs optimiert, und Änderungen an einem anderen Zelltyp erfordern zusätzliche Bewertung.

Die in-vitro- Erstellung von 3-d-kardialen Gewebe mit Bioprinter Technologie ist mit der Hoffnung auf die Entwicklung von therapeutischer und diagnostischer Models untersucht worden. Jedoch aktuelle Bioprinting Methoden sind umständlich und erfordert viel Zeit und den Einsatz von zusätzlicher Unterstützungsstrukturen wie Nadeln oder Gerüstmaterial. Das Vorhandensein von diesen Nebenleistungen unterstützen Strukturen verringert die Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff-18. Zentrale Nekrose ist daher ein wichtiges Anliegen im aktuellen 3-d-kardiale Konstrukte, aufgrund des Fehlens von Kapillaren, Sauerstoff und Nährstoffe19zu liefern. Sakaguchi Et Al. verwendet die Methode der sandwiching orientierte Zell-Blätter und mit vaskulären Bett Bioreaktoren um eine endotheliale Netzwerk20zu entwickeln. Im hier vorgestellten net Schimmel-System können die Kavität ausreichend Diffusion mit Nährstoffen und Sauerstoff ohne das Erfordernis eines unterstützenden Strukturen oder Gerüste. Darüber hinaus die net Schimmel-basierte Methode ist effizient und erfordert keine spezielle Fähigkeiten für beide die Aussaat von der Sphäroide in die Form und die Wartung des nachfolgenden Patches. Als solches ist es eine schnelle und kostengünstige Weise zu erwerben, synchron schlagen und funktionelle kardiale Patches.

Zur Optimierung der Sphäroid-Durchmesser und die Anzahl der Sphäroide verwendet in jedem Tropfen Gerät hängend, führten wir Fehlersuche und Änderungen bezüglich der Zelle Arten und Mengen. Für diese net Schimmel-basierte Methode waren der Sphäroid-Durchmesser und die Anzahl der Sphäroide verwendet von größter Bedeutung für eine funktionale Herzgewebe von ausreichender Größe zu erstellen. Wir haben versucht verschiedene Zelle Konzentrationen um die beste Sphäroid Größe für die Schaffung von Herzgewebe zu optimieren. Drei Arten von Zellen wurden zur kardialen Sphäroide erstellen durch die hängenden Tropfen Gerät, die 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel enthalten. Unter Lichtmikroskopie beobachtet die spontan gebildeten Sphäroide in jeder Zusammenarbeit leicht um nach 72 h zu schlagen. Wir beobachteten, dass die Sphäroide Durchmesser mit der Zellkonzentration der hängenden vergrößert Tropfen Gerät. Wir haben versucht verschiedene Konzentrationen der Sphäroide, von 100 Sphäroide zu 300 Sphäroide in jedes Gerät mit 4 mL RPMI/B27 Medium. Mit zahlreichen Studien fanden wir, dass die Konzentration von 2.475.000 Zellen pro mL ergab einen optimalen Durchmesser des daraus resultierenden Sphäroide. Mit der optimierten Durchmesser der Sphäroide erlebten wir mühelos Sammlung und Aussaat von der Sphäroide in gestapelten net Schimmel, die wichtige Schritte, um die net Schimmel-basierte Methode für mehrschichtige Herzgewebe Erstellung waren.

Der wichtigste Schritt des Protokolls ist die Optimierung der Sphäroid Größe. Es ist erwähnenswert, dass die Sphäroide verwendet in dieser Methode kleiner als die Größe der Sphäroid Körpern in andere Bioprinting Techniken21verwendet sind. Größere Sphäroide wurden zentrale Nekrose durch unzureichende Diffusion von Nahrung und Sauerstoff22haben gefunden. Mit Sphäroide mit kleinerem Durchmesser angemessene Verbreitung von Nährstoffen und Sauerstoff in die Mitte des einzelnen Sphäroid wird leichter erreicht, erhöht die zelluläre Lebensfähigkeit in allen Bereichen des daraus resultierenden Patches. Im hier vorgestellten Protokoll Sphäroid Durchmesser von 350 µm ermöglicht eine verbesserte Zellviabilität und mehr Kontaktfläche zwischen der Sphäroide, die unserer Meinung nach trägt zur die erfolgreiche Schaffung das Herzgewebe unter Verwendung dieser net Form. Daher ist dies ein entscheidender Schritt in der beschriebenen Methodik. Um das Protokoll zu anderen Zelltypen anzupassen, sind zusätzliche Sphäroid Größe Optimierung Experimente erforderlich.

Die Grenzen dieses Ansatzes sind die Unfähigkeit, genau zu steuern, das Stapeln der Sphäroide. Dies führt in den Bereichen der Ungleichförmigkeit der das resultierende Gewebe Patches und heterogenen Dicke. Obwohl die aktuelle Hands-on-Zeit für die Aussaat der Sphäroide minimal ist, erfordert die Schaffung große vielschichtige Patches darüber hinaus eine längere Kulturzeit ermöglicht die Verschmelzung von der Sphäroide.

Für zukünftige Anwendungen ist diese neuartige net Schimmel-basierte Methode eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Erstellung von 3-d, Gerüst-freie kardialen Gewebe mit minimalem manuellen Aufwand. Die daraus resultierende mehrschichtige Gewebe bestehen aus verschmolzenen Sphäroide mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten. Diese net Schimmel-basierte Methode stellt eine kostengünstige und skalierbare alternative zum aktuellen Bio-Fertigung Methoden von technischen Geweben und hat das Potenzial zur klinisch einsetzbaren kardialen Gewebe für die Behandlung von Herzinsuffizienz mit dem Ziel der Schaffung ischämischen oder dysfunktionalen Kardiomyozyten23zu ersetzen. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um Herzgewebe für Patienten-spezifischen Vorführungen von potenziellen neuartiges Medikament Therapien24zu erstellen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen die folgende Finanzierungsquelle: Magie, dass Angelegenheiten Fonds für Herz-Kreislauf-Forschung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Cardiac fibroblasts (HCF) Sciencell 6310
FM-2 Consists of Basal Medium Sciencell 2331 HCF culture medium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2935
EGM+Bullet Kit  Lonza CC5035 HUVEC culture medium
E8 media  Invitrogen A1517001 HiPSC culture medium
Geltrex  Invitrogen A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher 12604013 Trypsin and Cell dissociation reagent
RPMI media Invitrogen 11875093 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher 17504044 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Novel net mold  TissueByNet Co.,Ltd NM25-1
Hanging drop plate Kuraray Co.,Ltd MPc350
6 well plates  Sigma-Aldrich CLS-3516

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References

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Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).More

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