Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En netto mögel-baserade metod byggnadsställning-fri tredimensionella hjärtvävnad skapelsens

doi: 10.3791/58252 Published: August 5, 2018

Summary

Det här protokollet beskriver en netto mögel-baserad metod för att skapa tredimensionella byggnadsställning-fri hjärt vävnader med tillfredsställande strukturell integritet och synkron stryk beteende.

Abstract

Det här protokollet beskriver en ny och enkel netto mögel-baserad metod för att skapa tredimensionella (3D) hjärtats vävnader utan ytterligare byggnadsställning material. Människans pluripotenta stamceller-cell-derived hjärtmuskelcellerna (iPSC-CMs), mänskliga hjärt fibroblaster (HCF) och mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) har isolerats och används för att generera en cellsuspension med 70% iPSC-CMs, 15% HCF och 15% HUVECs. De är tillsammans odlade i en extremt låg ”hängande droppe” fästsystem, som innehåller mikroporer för kondenserande hundratals spheroids i taget. Cellerna aggregerade och bilda spontant stryk spheroids efter 3 dagar av samtidig kultur. Spheroids skördas, seedade i en roman mögel hålighet och odlade på en shaker i inkubatorn. Spheroids blivit en mogen funktionell vävnad cirka 7 dagar efter sådd. De resulterande multilayered vävnaderna består av smält spheroids med tillfredsställande strukturell integritet och synkron stryk beteende. Denna nya metod har lovande potential som en reproducerbar och kostnadseffektiv metod för att skapa bakåtkompilerade vävnader för behandling av hjärtsvikt i framtiden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Syftet med aktuell hjärt vävnadsteknik är att utveckla en terapi för att ersätta eller reparera struktur och funktion av skadade hjärtinfarkt vävnad1. Metoder för att skapa 3D-hjärtvävnad modeller uppvisar infödda hjärtvävnad viktigt kontraktila och elektrofysiologiska egenskaper har expanderat snabbt2,3. Olika strategier har utforskats och används i studier4,5. Dessa sträcker sig från användningen av särskilda syntetiska och naturliga bioaktiva hydrogels, såsom gelatin, kollagen, fibrin och peptider6, till bio-bläck nedfall teknik2 och bioprinting teknik7.

Det har visats att byggnadsställning-fria metoder kan producera jämförbara vävnader som biomaterial-baserade metoder, utan nackdelarna med införliva utländska byggnadsställningar materiella8. Oren Caspi et al. visade att införlivandet av olika typer av celler möjliggör generering av högt vaskulariserad mänskliga bakåtkompilerade hjärtvävnad9. Hakan et al. utvecklat en 3D-utskrift metod för hjärt patch skapelse från spheroids. Resulterande fläckar består av hjärtmuskelceller, fibroblaster och endotelceller i ett 70:15:15 baserat på10. Spheroids har visat sig vara effektiva ”byggstenar” av byggnadsställning-fri hjärtvävnad skapelse, eftersom de är resistenta mot hypoxi och besitter tillräcklig mekanisk integritet för implantation11,12. Tidigare studier har visat flera framställningsmetoder för sfäroid skapande, inklusive användning av hängande släpp metoden, spinner kolvar13, ultrakalla system14och icke-anhängare kultur ytor olackerad eller lackerad med agaros mikro-formar15. I detta protokoll, vi använder hängande droppe enhet, som innehåller mikroporer för kondenserande hundratals spheroids i taget.

Denna studie presenterar en ny och effektiv byggnadsställning-fri metod för hjärtvävnad skapelse, som inkluderar manuellt sådd spheroids i en fyrkantig mögel hålighet och ruvning vävnaden på en shaker för mognad. Under vanliga statiska odlingsbetingelser är syre diffusion begränsad till de yttersta aspekterna av den vävnad bygga, vilket resulterar i central nekros. Dock med netto mögel, är alla de spheroids seedade i formen nedsänkta i media med en ständig fluidic rörelse, vilket möjliggör ökad diffusion av näringsämnen och syre. Dessutom detta mögel-baserad metod möjliggör samtidiga skapandet av olika storlek vävnad fläckar med minimal manuellt arbete och den resulterande vävnaden kan enkelt tas ur formen. Denna nya metod möjliggör effektiv och reproducerbara skapandet av byggnadsställning-fri, multilayered hjärt patchar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. beredning av hjärtmuskelceller

  1. Coat 6-väl plattor med basalmembranet matris och kultur mänskliga-inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) som tidigare beskrivna17.
  2. Differentiera hiPSCs i hiPSC-CMs med tidigare beskrivna metoder18.
  3. Vid 16-18 d efter differentiering, avbryta hjärtmuskelcellerna genom att skölja varje brunn med 2 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan kalcium eller magnesium, följt av inkubation med 1 mL/väl av trypsin eller cell dissociation reagens (se tabellen Material) under 5 minuter i rumstemperatur.
  4. Neutralisera trypsin eller cell dissociation reagens (se Tabell för material) med en lika stor volym av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) cell media kompletteras med B-27 (RPMI/B-27 cell media). Pipettera upp och ned för att lossa något vidhäftat celler.
  5. Samla svävande hjärtmuskelcellerna med pipett 10 mL serologiska och överföra dem till en 50 mL konisk slang.
  6. Centrifugera cellsuspension på 250 x g för 5 min i rumstemperatur att erhålla en cellpelleten.
  7. Återsuspendera pelleten i 10 mL RPMI/B-27 cell media.
  8. Kombinera 20 µL cellsuspension med en lika stor mängd 0,4% Trypan blå lösning och blanda försiktigt.
  9. Använda en manuell hemocytometer att räkna och få den koncentration och cell bärkraften av cellsuspensionen.

2. beredning av fibroblaster

  1. Initiera en kultur av en mänsklig hjärt fibroblast (HCF) (adult ventrikulära typ) cellinje som tidigare beskrivits16.
  2. Avbryta HCF genom inkubering med en lämplig mängd trypsin eller cell dissociation reagens (se Tabell för material) för 5 min vid rumstemperatur16. För en T175 kolv användes 10 mL av trypsin eller cell dissociation reagens.
  3. Neutralisera trypsin eller cell dissociation reagens (se Tabell för material) med en lika stor volym av medium, sedan överför provet till en 50 mL konisk rör och centrifugera cellsuspension på 250 x g för 5 min i rumstemperatur att erhålla en pellet.
  4. Återsuspendera pelleten i 10 mL av fibroblast odlingsmedium (se Tabell för material).
  5. Kombinera 20 µL av HCF cellsuspension med en lika stor mängd 0,4% trypan blå lösning och blanda försiktigt.
  6. Använda en automatiserad cell counter eller manuell hemocytometer att räkna och få nya cellsuspensionen koncentration och cell livskraft.

3. beredning av endotelceller

  1. Initiera en kultur av en mänsklig navel ven endotelceller (HUVEC) linje som tidigare beskrivits17. Avbryta HUVECs av inkubering med en lämplig mängd trypsin eller cell dissociation reagens (se Tabell för material) under 3 minuter vid rumstemperatur17. Neutralisera trypsin eller cell dissociation reagens (se Tabell för material) med en lika stor volym av medium, sedan överföra till en 50 mL konisk rör och centrifugera cellsuspension vid 250 x g i 5 min i rumstemperatur att erhålla en pellet.
    Obs: För en T175 kolv användes 10 mL av trypsin eller cell dissociation reagenset.
  2. Återsuspendera pelleten i 10 mL av endotelceller odlingsmedium (se Tabell för material).
  3. Kombinera 20 µL av HUVEC upphängning och färga den med en lika stor mängd 0,4% Trypan blå lösning och blanda försiktigt.
  4. Använda en automatiserad cell räknare eller en manuell hemocytometer att räkna och få den koncentration och cell bärkraften av cellsuspensionen.

4. skapande av hängande droppe Spheroids

  1. Placera hängande droppe enhet som innehåller 850 mikroporer (vardera med en diameter på 350 µm) i steril 6-väl plattor.
  2. Isolera de tre typerna av celler som beskrivs ovan: hiPSC-CMs, HCF och HUVECs. Kombinera dem i förhållandet 70% iPSC-CMs, 15% HCF och 15% HUVECs i en 50 mL konisk slang med RPMI/B-27 cell medier vid en koncentration av 2,475,000 celler per mL.
  3. Fördela 4 mL cellsuspension (2,475,000 celler per mL) till varje brunn av bifogad extremt lågt hängande droppe system (med en mikaeljacobsson diameter 350 µm) sittande i en 6-bra platta.
  4. Spheroids kommer att spontant bilda inom 12 h av dispenseras cellsuspensionen i hängande droppe enhet. Fortsätt till kultur för sammanlagt 72 h (3 d) vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet för mognaden av spheroids.
  5. Efter 72 h av kultur, skörda spheroids genom porerna på botten av hängande drop system genom att placera enheten i en skål med medium och virvlande det försiktigt för att frigöra spheroids från hängande droppe enhet.

5. 3D-Patch skapande med romanen netto mögel

  1. Basen, fyrkantiga bottenplattan, botten netto och 10 lager sida nät ihop för att skapa nya mögel med hjälp av ett par steril pincett. Först stack och justera de base, fyrkantiga bottenplattan och botten net använder hörnstolparna. Sedan stack och lager 10 sida näten i omväxlande riktningar för att skapa ett nät av fina rostfria stift.
  2. Spola fyllningen bas med PBS eller medium för att minska ytspänningen och överför sedan monterade mögel på fyllning basen.
  3. Våt netto mögel hålighet med PBS eller medium i samma metod. Fyll långsamt spheroids förutsätts hålighet i önskad storlek (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, eller 6 x 6 x 1 mm).
    Obs: Kontrollera att 120% av den förvänta mängden spheroids matas in i hålrummet så att cellen aggregaten är tät anslutning och bo statisk.
  4. Montera övre netto och övre fyrkantiga plattan på hörnstolparna och säkra proppar och innehav rören för att förhindra en Wash-out av spheroids.
  5. Överföra fyllda netto mögel systemet till en 6-well platta med 6 mL RPMI/B-27 cell media eller i en steril behållare med tillräckligt medium att täcka hela sammansatta mögel.
  6. Inkubera 6-väl plattan med fyllda mögel systemet på en svängig shaker i 7-10 dagar vid 3000-4000 x g.
    Obs: Varaktigheten av inkubering bestäms av storleken på hjärt patchar. Med större patchar, kommer att inkubationstiden behöva höjas för hjärt patch mognad.

6. avlägsnande av plåstret från romanen netto mögel

  1. Ta bort mögel systemet från media och placera den på steriliserade hantering mattan i en steril 10-cm skål.
  2. Ta bort innehav röret, proppar, fyrkantig topplattan och topp nätet. Försiktigt glida ut skiktad sida förtjänar en efter en med ett par steril pincett. Efter decannulation erhålls en intakt hjärt patch ovanpå botten netto.
  3. Plocka upp botten netto med patch med steril pincett och överföra botten netto i en 35 mm skål med 5 mL RPMI/B27 media. Lossa försiktigt plåstret från botten netto genom långsamt virvlande nätet i skålen, eller med en steril cell skrapa. Efter avskiljandet från botten net, kan hjärtvävnad vara odlade med RPMI/B27 media.
  4. Fortsätta att Inkubera friflytande 3-D hjärt plåstret i 35-mm skålen. Funktionella synkron misshandeln kan observeras så tidigt som 24 h efter avlägsnande från mögel.
  5. Efter bort plåstret från netto mögel, Observera att dess form bibehålls med integritet och intensiteten av synkron misshandeln ökar med tiden.
    Obs: 3D-net mögel-baserade hjärt patchar utställda elektriska integration av komponenten cardiospheres efter decannulation. Vi observerade en stryk frekvens mellan 60 och 80 slag per minut som pågått i mer än 60 dagar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I vårt experiment utnyttjade vi en cellsuspension av 70% iPSC-CMs, 15% HCF och 15% HUVECs i RPMI/B-27 cell medier vid en koncentration av 2,475,000 celler per mL. Efter skapa cellsuspension, dispenseras vi 4 mL cellsuspension till varje brunn av bifogad extremt lågt hängande droppe system, som beskrivs i steg 4,3 i protokollet. Användning av hängande droppe system resulterade i spontana bildandet av hundratals slå spheroids efter 3 dagar av kultur vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet. Spheroids observerades lätt för att slå under ljusmikroskop på 4 X och 10 X förstoring med en genomsnittlig diameter 350 µm efter 72 h av kultur (figur 1).

I slutet av steg 6,5 i protokollet, efter skörd spheroids, var mögel enkelt seedade med enkla pipettering metoder. Odling av mögel tillåtet för en fusion av spheroids; efterföljande avlägsnandet av mögel resulterade i en intakt hjärt patch med mekanisk integritet. Efter borttagning från mögel och 24 h av kultur observerades funktionella och synkron misshandeln av hjärtvävnad, bekräftar mekaniska integrationen av spheroids (figur 2, vänster). Vi noterade också att flera lager av spheroids slår spontant på ett samordnat sätt på ljusmikroskopi (figur 2, höger).

En immunhistokemisk analys av nätet mögel-baserade 3D-hjärt patch utfördes också med av hjärt markören troponin T. Confocal imaging visade att väl överens hjärtmuskelcellerna alla utställda troponin T uttryck (figur 3).

Figure 1
Figur 1 : Skapelsen av hängande droppe spheroids. Människans pluripotenta stamceller-derived hjärtmuskelcellerna (hiPSC-CMs), mänskliga hjärt fibroblaster (HCF) och mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) var isolerade och används för att generera en cellsuspension med 70% iPSC-CMs, 15% HCF och 15% HUVECs, på en koncentrationen av 2,475,000 celler per mL. Efter 72 h observerades de spontant bildade spheroids i varje mikaeljacobsson lätt för att slå under ljusmikroskop. Skalstapeln i den vänstra panelen = 1.000 µm; skalstapeln i den högra panelen = 400 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Skapelsen av ett multilayered hjärtvävnad som visar integration av de komponent spheroids. Efter avskiljandet från netto mögel, 3-D hjärt plåstret vidhöll sin form och visat synkron slå, vilket indikerar en mekanisk integrering av spheroids, som visas i den vänstra panelen (där skalstapeln = 1.000 µm). De staplade multilayers av spheroids inspekterades med ljusmikroskop, som visas i den högra panelen (där skalstapeln = 400 µm), och observerade att slå spontant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Immunofluorescens utvärdering av hjärtvävnad. På immunofluorescens analys befanns den netto mögel-baserade 3D-hjärtvävnad bestå av väl överens hjärtmuskelceller med troponin T uttryck. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Betydelsen av denna metod ligger i dess reproducerbarhet och effektiviteten av den resulterande multilayered hjärtvävnad. I fältet för hjärt vävnadsteknik är en av de nuvarande mål att identifiera en metod för att konstruera klappande, mångbottnad och funktionell 3D-hjärt patchar. Vi rapporterar en effektiv och reproducerbar metod att skapa multilayered hjärt vävnader genom manuell direktsådd av spheroids består av hjärtmuskelceller, endotelceller och fibroblaster i en roman netto mögel. Den netto mögel som används i denna metod har en mängd olika storlekar för att skapa vävnader sträcker sig från 2 x 2 x 1 mm till 6 x 6 x 1 mm. Teknikerna vi har beskrivit kan också modifieras för olika mögel former och system beroende på önskad vävnad geometri. De beskrivna cell koncentrationer och nyckeltal var optimerad tidigare för hiPSC-CMs, och ändringar till en annan celltyp kommer att kräva ytterligare utvärdering.

In vitro- skapandet av 3D-hjärtats vävnader med bioprinter teknik har undersökts med hopp om att utveckla terapeutiska och diagnostiska modeller. Men nuvarande bioprinting metoder är besvärliga och kräver betydande tid och användningen av kompletterande stödstrukturer såsom nålar eller byggnadsställning material. Förekomsten av dessa underordnade stödja strukturer minskar diffusion av näringsämnen och syre18. Därför är central nekros ett stort problem i nuvarande 3D-hjärt konstruktioner, på grund av kapillärerna att leverera syre och näringsämnen19. Sakaguchi et al. tillämpas metoden för sandwiching orienterade cell ark och använder vaskulär säng bioreaktorer för att utveckla en endothelial nätverk20. I det netto mögel systemet presenteras här, kan mögel hålighet tillåta tillräckligt diffusion av näringsämnen och syre utan krav på någon stödjande strukturer eller ställningar. Dessutom netto mögel-baserade metoden är effektiv och kräver inte specialkunskaper för både odling av spheroids i mögel och underhåll av efterföljande plåstret. Som sådan, är det ett snabbt och billigt sätt att förvärva synkront slog och funktionella hjärt patchar.

Att optimera sfäroid diameter och antalet spheroids används i varje hängande droppe enhet, vi utfört felsökning och ändringar angående de celltyper och kvantiteter. För detta mögel-baserade nettometoden var sfäroid diameter och antalet spheroids används av största vikt att skapa en fungerande hjärtvävnad av lagom storlek. Vi försökte olika cell koncentrationer för att optimera den bästa sfäroid storleken för hjärtvävnad skapandet. Tre typer av celler används för att skapa hjärt spheroids av hängande droppe enhet, som omfattade 70% iPSC-CMs, 15% HCF och 15% HUVECs. Under ljusmikroskop observerades de spontant bildade spheroids i varje mikaeljacobsson lätt för att slå efter 72 h. Vi observerade att de spheroids' diameter ökad med cellkoncentrationen av hängande droppe enhet. Vi försökte olika koncentrationer av spheroids, från 100 spheroids till 300 spheroids i varje enhet, med 4 mL RPMI/B27 medium. Med många prövningar fann vi att koncentrationen av 2,475,000 celler per mL gav en optimal diameter av de resulterande spheroids. Med optimerad diameter spheroids upplevt vi obesvärad insamling och sådd av de spheroids i staplade netto mögel, som var viktiga steg till netto mögel-baserade metoden för skapande av multilayer hjärtvävnad.

Det mest kritiska steget i protokollet är optimering av sfäroid storlek. Det är värt att nämna att de spheroids som används i denna metod är mindre än storleken på sfäroid organ används i andra bioprinting tekniker21. Större spheroids har befunnits ha central nekros på grund av otillräcklig diffusion av näring och syre22. Med spheroids med mindre diameter åstadkoms adekvat diffusion av näringsämnen och syre till mitten av varje sfäroid lättare, öka cellulär livskraft inom alla områden av den resulterande patchen. I protokollet presenteras här, en sfäroid diameter 350 µm möjliggör förbättrad cellernas viabilitet och mer kontakt yta mellan spheroids, som vi anser bidrar till skapande av den hjärtvävnad som använder detta netto mögel. Detta är därför ett viktigt steg i den beskrivna metoden. För att anpassa protokollet till andra celltyper, krävs ytterligare sfäroid storlek optimering experiment.

Begränsningarna i detta synsätt inkluderar oförmåga att kontrollera exakt stapling av spheroids. Detta resulterar i områden av icke-enhetlig resulterande vävnad patchar och heterogen tjocklek. Dessutom även om den faktiska hands-on tid för odling av spheroids är minimal, kräver skapandet av stora multilayered fläckar en utökad kulturtid för fusion av spheroids.

När det gäller framtida tillämpningar är denna roman netto mögel-baserade metod en effektiv och reproducerbar metod för att skapa 3D-, byggnadsställning-fri hjärt vävnader med minimal manuell ansträngning. De resulterande multilayered vävnaderna består av smält spheroids med tillfredsställande strukturell integritet och synkron stryk beteende. Detta mögel-baserade nettometoden presenterar en kostnadseffektiv och skalbar alternativ till nuvarande bio-tillverkning metoder av bakåtkompilerade vävnader och har potential att skapa kliniskt tillämpliga hjärt vävnader för behandling av hjärtsvikt med målet att ersätta ischemisk eller dysfunktionella hjärtmuskelcellerna23. Dessutom kan denna metod användas för att skapa hjärtvävnad för patientspecifika filmvisningar av potentiella nya drogen terapier24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner följande finansiering källa: Magic att frågor fonden för kardiovaskulär forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Cardiac fibroblasts (HCF) Sciencell 6310
FM-2 Consists of Basal Medium Sciencell 2331 HCF culture medium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2935
EGM+Bullet Kit  Lonza CC5035 HUVEC culture medium
E8 media  Invitrogen A1517001 HiPSC culture medium
Geltrex  Invitrogen A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher 12604013 Trypsin and Cell dissociation reagent
RPMI media Invitrogen 11875093 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher 17504044 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Novel net mold  TissueByNet Co.,Ltd NM25-1
Hanging drop plate Kuraray Co.,Ltd MPc350
6 well plates  Sigma-Aldrich CLS-3516

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120, (8), 1318-1325 (2017).
  2. Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120, (1), 150-165 (2017).
  3. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, (2), 155-173 (2009).
  4. Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66, (1), 53-62 (2018).
  5. Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
  6. Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11, (8), 683-694 (1997).
  7. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23, (3), 237-244 (2017).
  8. Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11, (1), 163 (2016).
  9. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100, (2), 263-272 (2007).
  10. Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7, (1), 4566 (2017).
  11. Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148, (1), 46-55 (2010).
  12. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35, (1), 137-145 (2016).
  13. Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863, (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
  14. Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6, (11), 1726-1735 (2011).
  15. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31, (2), 108-115 (2013).
  16. Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288, (1), 87-93 (1997).
  17. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2, (3), 481-485 (2007).
  18. Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
  19. Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20, (6), 708-710 (2006).
  20. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  21. Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125, (e55438), (2017).
  22. Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
  23. Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127, (2), 427-436 (2017).
  24. Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10, (8), 814-822 (2005).
En netto mögel-baserade metod byggnadsställning-fri tredimensionella hjärtvävnad skapelsens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).More

Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter