Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

אפיון פיסי ברזולוציה גבוהה של חלקיקים מתכתיים בודדים

Published: June 28, 2019 doi: 10.3791/58257
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,3
1Physical Measurement Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemical Engineering, Columbia University, 3Department of Applied Physics and Applied Math, Columbia University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות אשכולות בעלי חמצן מתכת דיסקרטית, polyoxometalates (פופונים), במגבלת המולקולה היחידה באמצעות פלטפורמה אלקטרונית מבוססת nanopore ביולוגי. השיטה מספקת גישה משלימה לכלי כימיה אנליטיים מסורתיים המשמשים בחקר מולקולות אלה.

Abstract

מולקולות בודדות ניתן לזהות מאופיין על ידי מדידת התואר שבו הם להפחית את הזרם יונית זורם דרך נקבובית אחת בקנה מידה של ננו. האות אופייני לתכונות הפיסיוכימיות של המולקולה ולאינטראקציות עם הנקבובית. אנו מדגימים כי הnanopore שנוצר על ידי חלבון חיידקי אקסוטוקסין סטייהילוקוקוס אלפא המוליזה (αHL) יכול לזהות polyoxometalates (האתר, מתכת אנייונית אשכולות חמצן), על גבול המולקולה היחידה. יתר על כן, מוצרים השפלה מרובים של 12-phosphotungstic חומצה פום (וועד ההורים, H3pw12O40) בפתרון מדודים בו. הרגישות של המולקולה היחידה של השיטה הnanopore מאפשרת להפונים להיות מאופיינים בריכוזים נמוכים באופן משמעותי מהנדרש לתהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיית. טכניקה זו יכולה לשמש ככלי חדש עבור כימאים כדי ללמוד את התכונות המולקולריות של פוליוקסונים או אשכולות מתכתיים אחרים, כדי להבין טוב יותר את התהליכים הסינתטיים של פום, ואולי לשפר את התשואה שלהם. באופן היפותטי, המיקום של אטום נתון, או סיבוב של רסיס במולקולה, ואת המצב חמצון מתכת יכול להיות נחקר עם שיטה זו. בנוסף, טכניקה חדשה זו יש את היתרון של המאפשר ניטור בזמן אמת של מולקולות בפתרון.

Introduction

מזהה אנליטים ביוקולריות ברמת המולקולה היחידה ניתן לבצע באמצעות nanopores ומדידת הנוכחי מודולים יוניים. בדרך כלל, nanopores מחולקים לשתי קטגוריות מבוסס על הייצור שלהם: ביולוגי (המורכב עצמית מחלבון או DNA אוריגמי)1,2,3, או מוצק מדינה (למשל, מיוצר עם כלי עיבוד מוליך למחצה)4,5. בעוד מוצק מדינה nanopores הוצעו ככל האפשר חזק יותר פיזית וניתן להשתמש באמצעות מגוון רחב של תנאי פתרון, nanopores החלבון עד כה להציע רגישות יותר, התנגדות יותר להתמוך, רוחב פס גדול יותר, כימיה טובה יותר בסלקטיביות, וסימן גדול יותר ליחס הרעש.

מגוון של ערוצי יון החלבון, כגון האחד שנוצר על ידי האוראוס של סטיילוקוקוס α-המוליזה (αHL), ניתן להשתמש כדי לזהותמולקולות יחיד, כולל יונים (למשל, H+ D+)2,3, פולינונודים (DNA ו-RNA)6,7,8, נזק ל-DNA9, פוליפפטידים10, חלבונים (מקופלים ונפרשו)11, פולימרים (פוליאתילן גליקול ואחרים)12,13 , 14, זהב חלקיקים15,16,17,18,19, ועוד מולקולות סינתטי20.

הדגמנו לאחרונה כי αHL nanopore יכול גם בקלות לזהות ולאפיין אשכולות מתכתיים, polyoxometalates (הפונים), ברמת המולקולה היחידה. פופון הם אשכולות בדידים של חמצן ננו-סקאלה מתכת שהתגלו ב 182621, ומאז, סוגים רבים יותר כבר מסונתז. בגדלים שונים, מבנים, קומפוזיציות אלמנטלים של polyoxometalates כי הם זמינים כעת מוביל מגוון רחב של מאפיינים ויישומים כולל כימיה22,23, זרז24, חומר המדע25 ,26, ומחקר ביו-רפואי27,28,29.

הסינתזה של פום היא תהליך של הרכבה עצמית הנעשית בדרך כלל במים על ידי ערבוב כמויות נדרשות של מלחי מתכת של monomeric. לאחר הקמתה, מציגה מגוון גדול של גדלים וצורות. לדוגמה, מבנה הקגין פוליאניב, XM12O40q- מורכב מאחד הטרואטום (X) מוקף בארבעה אוקסיגנס כדי ליצור טטרהדרון (q הוא החיוב). הטרואטום ממוקם במיקום מרכזי בתוך כלוב שנוצר על ידי 12 מעבר ה, מתכות המעבר במצב החמצון הגבוה שלהם, אשר מקושרים זה לזה על ידי אטומי חמצן השכנה משותף. בעוד מבנה הטונגסטן polyoxometalates יציב בתנאים חומציים, יוני הידרוקסיד להוביל את המחשוף הידרוליטי של חמצן מתכת (M-O) איגרות חוב30. תהליך מורכב זה מביא לאובדן של אחד או יותר משני מבני-האדם, המובילים להיווצרות מינים חד-שלריים ומלאים, ובסופו של דבר לפירוק המלא של הפופון. הדיון שלנו כאן יהיה מוגבל למוצרי פירוק חלקי של חומצה 12-phosphotungstic ב-pH 5.5 ו 7.5.

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות אשכולות חמצן דיסקרטית מתכת במגבלת המולקולה היחידה באמצעות פלטפורמה אלקטרונית מבוססת nanopore ביולוגית. שיטה זו מאפשרת זיהוי אשכולות מתכתיים בפתרון. מינים רבים בתמיסה יכולים להיות מופלים ברגישות רבה יותר מאשר שיטות אנליטיות קונבנציונליות33. עם זאת, הבדלים עדינים במבנה פום ניתן להבהיר, ובריכוזים נמוכים במידה ניכרת מאלה הנדרשים עבור ספקטרוסקופיית NMR. חשוב מכך, גישה זו אפילו מאפשרת את האפליה של צורות איזואריק של Na8hpw9O341.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול שלהלן הוא ספציפי למערכת הביו-Nanopatch DC. עם זאת, זה יכול להיות מותאם בקלות אחרים אלקטרופיזיולוגיה מכשירים המשמשים למדוד את הזרם באמצעות מישורי bilayer השומנים המקובל (תקן השומנים bilayer ממברנה קאמרית, U-tube הגיאומטריה, הוציא microcapillaries, וכו '). הזיהוי של חומרים מסחריים ומקורותיו ניתן לתאר את התוצאות הנסיוניות. בשום מקרה לא משתמע הזהות הזאת המלצה על ידי המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה, וגם לא רומז כי החומרים הם הטובים ביותר הזמינים.

1. הכנה לפתרון ואנליטה

  1. להכין את כל הפתרונות אלקטרוליט עם 18 MΩ ס"מ מים ממערכת טיהור מים סוג 1 כדי להסיר מעקב מינים אורגניים ולאחר מכן לסנן את כל פתרונות אלקטרוליט באמצעות מסנן ואקום 0.22 יקרומטר מיד לפני הקלטות הערוץ יון.
    הערה: איכות המים היא גורם קריטי עבור היציבות ואריכות החיים של מערכת nanopore קרום.
  2. פראי סוג αHL.
    1. בצע אמצעי זהירות של MSDS בעת טיפול בחלבון αHL הרעלן.
    2. מערבבים את הסוג הפראי של monomeric S. האוראוס α-המוליזה (αHL) אבקה עם 18 MΩ ס"מ מים ב 1 מ"ג/mL. הפץ 10 עד 30 μL של המדגם לצינורות הצנטריפוגה בטוח בהקפאה, הקפא במהירות בחנקן נוזלי ולאחר מכן אחסן ב-80 ° c. לחילופין, השתמש מטוהרים מראש החוצה αHL31.
  3. התמוססות את השומנים 1, 2-Diphytanoyl-sn-גליזארו-3-פוספולינולינה (DPhyPC) ל 0.2 מ"ג/mL ב- n-decane ב 4 מ ל זכוכית בקבוקון עם כובע מצופה polyטטרפלואורומטר. אחסן את הפתרון בארבע מעלות צלזיוס לשימוש חוזר של עד חודש אחד.
  4. הכינו פתרונות חומצה phosphotungstic.
    1. לעקוב אחר MSDS אמצעי זהירות בעת טיפול אבקת חומצה phosphotungstic ולהכין 2 mM phosphotungstic חומצה מניות פתרון על ידי המסת 57.6 mg של H3pw12O40 לתוך 10 מ"ל של 1 מ ' הנאל ו 10 מ"מ2פו4 פתרון, המהווה את פתרון המניה.
    2. לקחת 5 מ ל של פתרון זה ולהתאים את ה-pH כדי 5.5 עם 3 M NaOH. להתאים את ה-pH של השני 5 מ ל של פתרון המניה 7.5 עם 3 M NaOH.
      הערה: ב-pH 5.5, 12-phosphotungstic חומצה (וועד ההורים, H3pw12O40) מפרקת בעיקר לתוך האניף מונריק [pw11O39]7-.

2. תא בדיקה הרכבה

  1. אסוף את תא הבדיקה לכל הוראות היצרן.
  2. משרים חוט Ag/AgCl אחד באקונומיקה (היפוכלוניט נתרן) עבור 10 דקות לאחר שהוא שולל את זה עם 600 חצץ נייר זכוכית. מקמו את האלקטרודה בתוך קרום הקוורץ הnanopore (QNM).
  3. מניחים את האלקטרודה הגלילית מוטבע בחוט כסף מחוץ QNM.
  4. לאחר הגדרת תא הבדיקה, הפעל את ספק הכוח ואת תוכנית רכישת הנתונים. ודא שהקריאה הנוכחית של DC היא 0 pA בהיעדר הפתרון בתא הניסוי.
  5. השתמש במזרק המחובר לתא הניסוי באמצעות קו נוזלי כדי להוסיף פתרון אלקטרוליט באגירה מעל הפנים של qnm ולהבטיח כי הזרם היונית שוטף את המגבר. אם לא, ה-QNM עלול להיות סתום. החל מתח pop (± 1 V) ו/או לחץ הגדול מ 300 מ"מ כספית כדי לנקות אותו. אם זה עובד, להפחית את מתח ולחץ.

3. השומנים הביאוייר היווצרות

  1. מלאו את הפתרון בתא הניסוי כך שרמת הפתרון נמצאת היטב מעל פני QNM. ואז להנמיך את רמת הפתרון דרך מזרק אל מתחת לפנים, כך הנוכחי פוחתת לאפס.
  2. טובלים במבחנה של 10 μL לתוך הבקבוקון השומנים. לדחוף על הקצה האחורי של קצה הפיפטה ולהקיש אותו בצד של המבחנה כדי להסיר את כל השומנים גלוי.
  3. גע בעצת הפיפטה אל ממשק מי האוויר של הפתרון בתא הניסוי כאשר רמת הפתרון מעל הפנים של QNM והמתן שתיים עד חמש דקות לשומנים להתפשט בצורה אחידה.
  4. באיטיות להקטין את רמת הפתרון מתחת לפני QNM עד הזרם הנוכחי, ולאחר מכן לאט להעלות את רמת הפתרון מעבר לפני QNM כדי ליצור קרום bilayer השומנים.
    1. לאחר שהופעת הופעת הטופס (כלומר, כאשר הזרם עובר לאפס), נסה לפתוח אותו מספר פעמים על-ידי הגדלת הלחץ ולוודא ש-qnm אינו סתום. כדי לשנות את קרום bilayer ליפיד, להקטין את רמת הפתרון מתחת לפני QNM ולהעלות לאט להרים אותו.
  5. אם קרום bilayer ליפיד לא ליצור את הפעם הראשונה, להנמיך את הפתרון מתחת לפנים ולהעלות אותו שוב. אם הוא לא מגיע לאחר 3 מבחנים, להוסיף לשומנים יותר כפי שמתואר ב 3.2 ו 3.3.
  6. לאחר יצירת קרום, הגדר את ההיסט הנוכחי כאפס כאשר הפוטנציאל המוחל הוא אפס.

4. αאל היווצרות נקבובית

  1. הוסף 2.5 ng של מטהר מראש αHL מדגם החלבון (או 250 ng של monomeric αHL) לתא הניסוי (נפח ≈ 200 μl) כדי לאפשר את היווצרות הערוץ.
  2. להגביר את הלחץ על bilayer עם מזרק גז הדוק (איור 1) לאחר bilayer נוצר, כדי להרחיב את קרום מ qnm, ולהקל nanopore הוספה. העלה את הלחץ האחורי המוחל בדרך כלל בין 40 ל 200 mmHg, תלוי בכל QNM.
    הערה: תוכנת ה-בס יש תכונה הכנסה אוטומטית החלה הטיה גבוהה יותר (בדרך כלל 200 כדי 400 mV) כדי לגרום להיווצרות הנקבוביות ולאחר מכן באופן אוטומטי מפחית את המתח הרצוי להטיית המדידה פעם אחת טפסים ערוץ.
  3. לאחר nanopore טפסים, להקטין את הלחץ האחורי על 1 ⁄ 2 של לחץ הכניסה. אם מספר ערוצים נצפו, הסר אותם על-ידי הפחתת הלחץ באופן משמעותי.

5. אשכול מתכתי חלוקה בNanopore

  1. כדי להתחשב בחוסר איזון באלקטרודות, הגדר את מתח ההיסט של DC כך שכאשר הפוטנציאל המוחל מוגדר כאפס, אין זרם מדוד.
  2. לפני הוספת מדגם ה-פום, בצע ניסוי בקרה כדי לוודא שאין מזהמים (למשל, מעקב אחר הפופון מניסוי קודם) במאגר. באופן ספציפי, לרכוש מעקב הנוכחי יונית תחת פוטנציאל מוחל של + 120 mV ל-120 mV בהיעדר כל העפון כדי לוודא כי לא קיימים מחסומים הנוכחי ספונטנית.
    הערה: בשל המבנה האסימטרי של ערוץ αHL (איור 1), הmagnitute של הזרם היונית יהיה שונה עבור פוטנציאלים מיושמים חיוביים ושליליים. היחס של הזרם נמדד מעל מתח זה הוחל מעיד על כיוון αHL nanopore בקרום.
  3. הוסף את מדגם ה-פום על-ידי ריקון המאגר עם פתרון אשכול מתכתי בריכוז של 1 עד 5 מ"מ. לחילופין, טען את המדגם לתוך הקפילר לפני הרכבת התא כדי ללמוד את החלוקה למחיצות של הפופון לקצה השני של ערוץ αHL.
  4. הקלט את הזרם היוני באמצעות תוכנת היצרן כדי לזהות בלודות נוכחיים שנגרמו כתוצאה מחלוקה של הפופון הפרטני לתוך הnanopore. העריכו את התכונות הפיזיות והכימיות של המולקולה מעומק המצור הנוכחי יונית, תדר האירוע והפצת זמן המגורים של החסימות.

6. יון ערוץ הקלטות וניתוח נתונים

  1. לרכוש את מדידות סדרת הזמן הנוכחי יונית באמצעות עכבה גבוהה, רעש נמוך מגבר ומערכת רכישת נתונים. בצע את המדידות במתח מיושם של-120 mV (יחסית לערוץ העמים ) עבור כל pH.
  2. החלת מסנן בסל מעבר נמוך 100 kHz 8-מוט לאות, אשר הינו דיגיטלי לאחר מכן ב 500 kHz (כלומר, 2 ms/נקודה). לחלץ אירועים מסידרת הזמן ולנתח אירועים באמצעות אלגוריתם מיומן בחבילת תוכנה פסיפס 32,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במהלך שני העשורים האחרונים, הממברנה מאוגד חלבון nanometer בקנה מידה הוכחו כחיישנים מולקולה יחיד רב-תכליתי. מדידות מבוססות Nanopore הן ברורות יחסית לביצוע.  שני תאים מלאים אלקטרוליט מופרדים על ידי nanopore מוטבע קרום השומנים בידוד חשמלית. מגבר מהדק-טלאי או ספק כוח חיצוני מספק פוטנציאל סטטי לאורך הnanopore באמצעות אלקטרודות Ag/agcl שקועים במאגרים האלקטרוליט. השדה החשמלי מסיע חלקיקים טעונים בודדים לתוך הנקבובית, אשר מייצרת הפחתות ארעי בזרם יונית התלויים בגודל, צורה, והמטען של החלקיקים. תוכנית מחשב שולטת מתח וצגים שהוחלו, בזמן אמת, הבלוק הנוכחי יונית הנגרמת על ידי מולקולות לחלוקה הפיך לתוך הנקבובית. הזרם הוא הוגדל והמרה למתח עם רעש נמוך, העכבה גבוהה האפקט שדה הטרנזיסטור דיגיטלי באמצעות כרטיס רכישת נתונים.

כאן, אנו מספקים הליך כללי לגילוי פוליוקסאומטטים עם nanopore ביולוגי. כפי שנראה באיור 2, לפני התוספת של מפעיל הערוץ הפתוח יש ממוצע זרם הערוץ פתוחה של ~ 100 pA בפוטנציאל מיושם של-120 mV. התוספת של הפופון מייצרת מחסומים ארעיים ומקטינה את הזרם היוניים בכ-80%. כצפוי, מכיוון שחלקיקים אלה טעונים שלילית, החסימות אינן מנצפו כאשר הקוטביות של הפוטנציאל המוחל מתהפך. שים לב כי אם הפונים לא היה אינטראקציה עם הקיר נקבובית, הם היו לפזר דרך הנקבובית של כ 100 ns, אשר קצר מדי כדי להיות מזוהה עם מגבר ההדק המקובלת טלאי. כך, רוב הזמן חלקיק נתון מבלה בנקבובית היא תוצאה ישירה של האינטראקציה בין החלקיק לנקבובית. משך האירוע של המצור הנוכחי יונית מוגדר כזמן המגורים, טאו (τ).

כדי להמחיש את השירות של שיטה זו, אנו דנים בשימוש αHL nanopore לפקח על פירוק של 12 phosphotungstic חומצה (הורים, H3pw12O40) ב-ph 5.5 ו-ph 7.5. ריקבון זה יכול להיות נצפתה עם 31P nmr מדידות, אבל הריכוז הדרוש הוא 2 מ"מ בעוד nanopore מדידות צריך פחות מ 30 μm, בגלל הרגישות מדידה nanopore. ב-pH 5.5, [PW11O39]7- הוא המין השולט30.

ניתוח הנתונים מבוצע על-ידי חישוב היסטוגרמה של יחס עומק המצור היחסי (כלומר,<אני>/<io>, כאשר <אני> הוא הזרם הממוצע עם הפום בנקבובית ו<אניo > הוא זרם הערוץ הפתוח הממוצע). היסטוגרמה של יחסי עומק המצור הנוכחי ממוצע ב-120 mV ו-pH 5.5 מציג שיא קטין ב <אני>/<io> ≈ 0.06 ואת הפסגה הגדולה ב < אני >/<io> ≈ 0.16 (איור 3 , ירוק). אנו מניחים פסגות אלה מתאימים [P 2W5o23]6- ו [pw11o39]7-, בהתאמה, מבוסס על 31P nmr. מיכל בן 31 P NMR מחקרים מראים כי הגדלת ה-pH משנה את הריכוז היחסי של שני מינים אלה, וזה מוכן על ידי שינוי באזור של שתי הפסגות המוצג באיור 3.

כאשר הפתרון פום הוא טיטרציה ל-pH 7.5 ex באתרו, הריכוז הכולל של פום פוחתת בשל השפלה חלקית של שני המינים העיקריים למלחים אורגניים (כלומר, פוספט חינם, HxPO4-3 + x ו-tungstate, WO42 -יוני). ההיסטוגרמה של יחס עומק המצור היחסי מראה גם שתי פסגות הראשי ( איור 3, כתום), אבל עם 20-קיפול פחות אירועים (אשר מציע את הריכוז הכולל של פום ב-ph 7.5 הוא כ 20 קיפול פחות מזה ב-ph 5.5, אם ה יעילות הלכידה של nanopore עבור ה-"פופון" זהה בשני ערכי ה-pH). מעניין לציין כי ב-pH 7.5 ומעלה, מינים פום שנצפו כאן לא זוהו בספקטרום 31P nmr בשל הריכוז הנמוך שלהם שנגרמו על ידי הדיסוציאציה שלהם לתוך פוספט ויונים tungstate.

זמן המגורים של כל אירוע בנקבובית מוגדר על ידי המשך של בודדים יוניים הנוכחי בלואדס. חלוקת זמני המגורים מספקת תובנה למינים שונים המצויים בהווה. זה הוצג מוקדם יותר כי עבור החסימות שנגרמו על ידי פולימרים בגודל שונה של פולי (אתילן גליקול), התפלגות זמן מגורים עבור כל גודל של פולימר זה מתואר היטב על ידי מעריכי אחד. התוצאה מרמזת על האינטראקציה של הפולימר הזה היא תגובה כימית פשוטה הפיך12,13,20.

איור 4 ממחיש כי הפצות זמן מגורים עבור שתי הפסגות היו הבדיל היטב ב-pH 5.5 ו 7.5. . שתי תכונות ברורות ראשית, תחת כל התנאים, נדרשים מספר רב של החזקה כדי להתאים לכל אחת מההפצות, מה שמרמז שיש וריאציות של הפופון בתוך כל מין. שנית, זמני המגורים של הפופון בנקבובית קצרים הרבה יותר ב-pH 7.5 לעומת אלה ב-pH 5.5, אשר מציע היחלשות של האינטראקציה בין הנקבובית והפופון. זה כבר הוכח בעבר כי שינוי ב-pH משנה את המספר היחסי של חיובים קבועים בתוך או בסמוך ל αHL ערוץ לומן. שינויים אלה במישרין לשנות את האינטראקציות עם מחיצות הפונים בתוך הנקבובית ולכן לשנות את המגורים שלהם פעמים34,35.

Figure 1
איור 1: דיאגרמת סכמטית של הכיוונון הניסיוני. שיטה לאפיון מבוסס nanopore של מולקולות polyoxometalate בודדות. Nanopore חלבון כי מרכיב עצמי בקרום 4 ננומטר שומנים בעובי השומנים הוא רחץ על ידי מימית פתרונות אלקטרוליט בנימי זכוכית ומאגר גדול יותר. לחץ מוחל על נימי זכוכית עם מזרק גז הדוק כדי לסייע nanopore התאגדות. V פוטנציאלי מוחל על פני הקרום עם זוג תואם של אלקטרודות Ag/agcl וכוננים זרם יונית (למשל, Na+ ו-Cl-) דרך הנקבובית. הזרם מומר מתח עם מגבר עכבה גבוהה, סרוקים עם אנלוגי לממיר דיגיטלי (ADC) ומאוחסן במחשב. תוכנת מחשב שולטת בפוטנציאל המוחל באמצעות דיגיטלי לממיר אנלוגי (DAC) וצגים, בזמן אמת, הבלוק הנוכחי החולף שנגרמו על ידי מולקולות יחיד המחיצה לתוך הנקבובית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: Nanopore מבוססי זיהוי של מטאלו-חלקיקים בודדים. איור של שרידים יוניים של סדרות הזמן המתרחשות לפני ואחרי התוספת של פתרון פום למנגנון nanopore. החלוקה של האניוני היחיד לתוך הנקבובית גורם הפחתות הנוכחי ארעי בזרם הפתוח מתכוון הנקבוביות, <אניo>.  (מימין) אירוע אופייני, הממחישות את הזרם הממוצע של המצור (<אני>) ואת זמן המגורים (τ) של החלקיק בנקבובית. הפוטנציאל שהוחל היה-120 mV, והפתרונות הכילו 1 M הנאל, 10 מ"מ מילימטר2הפו4 ב-pH 5.5. תא העמים גם הכיל 30 μM של phosphotungstic חומצה 12. יחס עומק המצור הנוכחי (<אני>/<io>) וזמני המגורים (τ) מספקים מידע לגבי הנתונים של פום מינים הנמצאים בפתרון. תחת התנאים שבהם השתמשנו כאן, ערוץ αHL אינו מופיע בשער (קרוב לספונטניות) כאשר הפונים אינם נוכחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: היסטגרמות של יחס עומק המצור הנוכחי ב-pH 5.5 ו 7.5. היסטוריגרמות של היחס הנוכחי יונית המושרה של המצור ב-pH 5.5 (ירוק) ו 7.5 (כתום) עם פוטנציאל מוחל V =-120 mV. שתי הפסגות להציג בכל ערך pH להתאים מינים פום הידוע מראש בפתרון בתנאים אלה. יחסי עומק המצור הנוכחיים של 0 ו -1 מתאימים לנקבובית חסומה ופתוחה לחלוטין, בהתאמה. היסטגרמות נוצרו ברוחב bin של 0.001 ומנורמל לספירות/s על-ידי חלוקה לפי זמן רכישת הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מגורים בזמן הפצת והתאמה עם מספר החזקה. התפלגות זמני המגורים עבור הבלוק הנוכחי פום המושרה הנגרמת על ידי המינים שני העיקריים (פסגות 1 ו 2 באיור 4) נצפתה ב-pH 5.5 ו 7.5 בעלילה למחצה יומן. לשני המינים, זמני המגורים קצרים במידה ניכרת בערך ה-pH הגבוה, המרמז על האינטראקציה בין הנקבובית לבין הפופון. הקווים המוצקים מתאימים למודל של תערובת אקספוננציאלית לנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עקב הטעינה האנייונית שלהם, כנראה שפופון מקשר בין העברת מונים אורגניים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטית. לכן, חשוב לזהות את תנאי הפתרון המתאימים ואת סביבות האלקטרוליט הנכונות (בעיקר הקטשות בפתרון) כדי להימנע ממערך מורכב עם הפופון. דרושה טיפול מיוחד בבחירת המאגר. לדוגמה, קצב הלכידה של הפופון עם טריס (הידרוקסימתיל) ופתרונות באגירה בחומצה לימון נמוך באופן משמעותי מזה בפתרון באגירה מפוספז, סביר להניח כי אחד משני המאגרים הראשונים יוצר קומפלקס עם הפום שאינו אינטראקציה מאוד עם הnanopore. יתר על כן, אלקטרוליט הנאל היה בשימוש בכוונה במקום KCl (כמו גם מתכות אלקליות אחרות) כדי למנוע את המשקעים של [PW11O39]7- על K+.

קריטי למדידה המדויקת של הפצות זמן המגורים היא היכולת למדוד את הזרם ברוחב פס גבוה מספיק. למשל, עם שעות מגורים מבוזרים באופן אקספוננציאלי יש הרבה יותר מחסומים עם הרבה זמן מגורים ארוכים, ושערוך מדויק של הפצות זמן המגורים מושגת טוב יותר על ידי איסוף מידע רב (כלומר, השגת אותו גבוה כמו רוחב פס הקיבול החשמלי של המערכת מאפשר). כדי להשיג מצב זה בספקטרוסקופיית nanopore, יש למזער את הקיבוליות של המערכת (הממברנה והקיבוליות התועה). קיבוליות תועה מופחתת על-ידי הקטנת אורך כל כבלי החיבור ושימוש בקשרים חשמליים באיכות גבוהה. קיבוליות הקרום הוא ממוזער על ידי הפחתת שטח פני השטח של הביאייר, הגדלת העובי של חומרי התמיכה (כלומר, קוורץ, polyטטראואתילן, וכו '), והפחתת השטח של חומרי תמיכה חשופים לאלקטרוליט. בפועל, קיבוליות תועה של כלי הנגינה (≈ 2 pF) תגביל את הרעש לקרומים ≈ 1 מיקרון עד 5 מיקרון בקוטר. הדבר מהווה את הגבלת השיטה. לדוגמה, זיהוי של מולקולות קטנות מאוד טעונה מאוד יכול להיות מאתגר בשל זמני המגורים הקצרים יחסית שלהם.

המנגנון שדרכו לחץ מאפשר שליטה על הכנסת הערוץ אינו מובן לחלוטין. מיקרונימים קוורץ יש קוטר קטן מאוד שבו נוצרת הקרום. הפעלת לחץ יגרום הקרום לבליטה (ובכך להגדיל את פני שטח הקרום) ואולי רזה הקרום. שני ההשפעות יגדיל את הקצב שבו הערוצים יהיה ליצור את הקרום. כאשר ערוץ בודד מטפסים באופן ספונטני, הפחת את הלחץ כדי למנוע החדרת ערוצים נוספים. ההסרה של αלא הוכנס משלב המים בתפזורת אינו נדרש אם ריכוז αhl הוא נמוך מספיק.

המבנים והחיובים של polyoxometalates הם לומדים כיום באמצעות טכניקות כימיה אנליטית מסורתית, כולל NMR, אולטרה סגול-גלוי, אינפרא אדום ו ראמאן ספקטרוסקופית, ספקטרומטר מסה, ו-X-ray עקיפה. אנו מצפים כי מדידות nanopore ישלימו את האפיון של תכונות פיזיות אלה ואחרות של הפונים, כמו גם את חקר היווצרות המינים שלהם בריכוז נמוך, אשר יסייעו להבין טוב יותר את הדרך הסינתטית של הפוליוקסטליטים יווצרות. זה הוכח גם בעבר כי הנקבובית αHL יכול אפילו להבחין בין 2 איזוers של הטופס השני של התלת ממדי Na8hpw9O3430.

לסיכום, הצגנו כי nanopore חלבון מאוגד הממברנה ניתן להשתמש כדי לזהות ולאפיין אשכולות תחמוצת טונגסטן מתכתי (heteropolytungstates) בפתרון באמצעות מדידה פשוטה ברזולוציה גבוהה חשמל. רגישות שניתנה על ידי הגישה הרומן הזה מאפשר מעקב אחר הבדלים עדינים מבנה פום העולות בערכי ה-pH שונים בריכוזים כי הם נמוכים משמעותית (> 70-קיפול) מאשר נדרש עבור שיטות מסורתיות כגון NMR ספקטרוסקופיה. בשל יכולת זיהוי המולקולה היחידה של nanopores, המגבלה בפועל של גילוי בשיטה יכולה להיות נמוכה הרבה יותר על-ידי מדידת הזרם לתקופות ארוכות יותר (קצב הלכידה מאזניים בפרופורציה לריכוז פום).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה על התמיכה הפיננסית מארגון הביולוגיה המולקולרית האירופאית למענק פוסט-דוקטורט (לJ.E.) ומענק מ-NIH ננגרי (עד J.J.K.). אנו מעריכים את עזרתם של פרופסורים ג'ינגיואה ג ' ו וסרגיי Kalachikov (אוניברסיטת קולומביה) למתן הαHL, ועל השראה דיונים עם פרופ ' יוסף ריינר (אוניברסיטת וירג העמים).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nanopatch DC System Electronic Biosciences, Inc., EBS
Millipore LC-PAK Millipore vacuum filter
1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850356P
Decane, ReagentPlus, ≥99%, Sigma-Aldrich D901
αHL List Biological Laboratories, Campbell, CA
Ag wire Alfa Aesar
2 mm Ag/AgCl disk electrode In Vivo Metric E202
High-impedance amplifier system Electronic Biosciences, San Diego, CA
quartz capillaries
custom polycarbonate test cell
Data Processing and Analysis MOSAIC https://pages.nist.gov/mosaic/
Phosphotungstic acid hydrate Sigma-Aldrich 455970
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
  2. Bezrukov, S., Kasianowicz, J. Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel. Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).
  3. Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations. Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).
  4. Please, T. R., Ayub, M. Solid-State Nanopore. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , Elsevier Inc. 121-140 (2013).
  5. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature Nanotechnology. 2 (4), 209-215 (2007).
  6. Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).
  7. Akeson, M., et al. Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules. Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).
  8. Singer, A., Meller, A. Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes. Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).
  9. Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an α-hemolysin nanopore. Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).
  10. Halverson, K. M., et al. Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).
  11. Oukhaled, G., et al. Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording. Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).
  12. Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).
  13. Robertson, J. W. F., et al. Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).
  14. Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -K., Rühe, J., Behrends, J. C. Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray. ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).
  15. Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters. Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).
  16. Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore. Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).
  17. Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry. Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).
  18. Campos, E., et al. Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the α-hemolysin nanopore. Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).
  19. Campos, E., et al. The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the α-hemolysin nanopore. Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).
  20. Baaken, G., et al. High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore. ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).
  21. Berzelius, J. J. Beitrag zur näheren Kenntniss des Molybdäns. Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).
  22. Long, D. -L., Burkholder, E., Cronin, L. Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices. Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).
  23. Muller, A., et al. Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies. Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).
  24. Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting. Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).
  25. Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications. Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).
  26. Busche, C., et al. Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters. Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).
  27. Pope, M., Müller, A. Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, Springer Science & Business Media. Dordrecht. (2012).
  28. Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F. Polyoxometalates in medicine. Chemical Reviews. 98 (1), 327-358 (1998).
  29. Gao, N., et al. Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer's disease. Nature Communications. 5, 3422 (2014).
  30. Pope, M. T. Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1983).
  31. Braha, O., et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chemistry & Biology. 4 (7), 497-505 (1997).
  32. Forstater, J. H., et al. MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data. Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).
  33. Balijepalli, A., et al. Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements. ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).
  34. Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel. Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).
  35. Piguet, F., et al. Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore. Nature Communication. 9 (966), (2018).

Tags

כימיה גיליון 148 Nanopore α-המוליל ביליפיד אנליזה של מולקולה אחת פוליוקסטלטים איזופולימרים
אפיון פיסי ברזולוציה גבוהה של חלקיקים מתכתיים בודדים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ettedgui, J., Forstater, J.,… More

Ettedgui, J., Forstater, J., Robertson, J. W., Kasianowicz, J. J. High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (148), e58257, doi:10.3791/58257 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter