Summary
下咽腺性腺泡大小是护理蜂蜜蜂营养的有力措施。在这里, 我们提供了一个详细的协议解剖, 染色, 成像和测量护士蜂下咽腺腺泡细胞。
Abstract
护士下咽腺体产生的蛋白质分数的工人和蜂王浆, 是喂养发展幼虫和皇后。这些位于蜂头的配对腺体对护士蜂所消耗的花粉和花粉替代品的数量和质量非常敏感。当护士喂养不足的饮食时, 腺体变得更小, 当他们喂养完完全的饮食时就会变大。由于护士下咽腺大小是护士营养的有力指标, 研究蜂蜜蜂营养的人知道如何测量这些腺体至关重要。在这里, 我们提供详细的方法, 解剖, 染色, 成像, 并测量护士蜂下咽腺。我们现在比较无瑕和染色组织和数据, 用于研究花粉对腺体大小的影响。该方法已被用来测试饮食如何影响下咽腺大小, 但进一步使用, 以了解这些腺体在蜂巢健康的作用。
Introduction
蜂蜜蜜蜂对农业是必不可少的, 因为它们授粉了人类和动物所消耗的各种农作物。蜜蜂种群数量的下降引起了人们的广泛关注, 因为殖民地的损失每年在美国的30-40% 左右徘徊在1和欧洲的 10–15%2,3。多种因素, 包括减少获得高质量的饲料, 可能会一起行动, 对蜂蜜蜜蜂的健康产生负面影响。单一、干旱、不可持续的养蜂做法以及其他因素减少了4、5殖民地的天然花粉的多样性和数量。由于蜂蜜蜜蜂几乎从花粉中获得所有的膳食蛋白质和脂质, 因此减少花粉的摄入会严重限制个体和群体的健康。
下咽腺是位于蜜蜂头部之间的分泌结构, 介于眼睛和大脑之间6。在正常情况下, 腺体的发育和功能轨迹反映出它们所在的蜂。在大约5–10天的时候, 蜜蜂在蜂巢中执行护理行为。同时, 下咽腺体达到其峰值大小和分泌能力, 产生的主要蛋白质分数的育雏食品或果冻喂养发展幼虫和其他成人, 如皇后。在这个峰值的大小腺体类似一串葡萄, 其中每一个葡萄是一个离散的叶结构称为性腺泡 (复数: 腺泡细胞)。当工作者蜂年龄和承担不同的任务在蜂巢, 下咽腺收缩并且采取不同的作用, 象分解糖在花蜜7,8。因此, 下咽腺与蜜蜂的年龄及其与年龄相关的任务相关。
护士下咽腺大小是敏感的数量和质量的蛋白质在他们的饮食9,10,11。当护士蜜蜂营养良好, 他们的腺体很大。然而, 当蜜蜂被剥夺花粉时, 腺体很小, 特别是在成人发育的第一周。为了确定护士蜂的营养状况, 研究人员通常测量下咽腺体, 无论是直接测量腺体性腺泡大小11,12,13,14或蛋白质含量15,16或通过测量蛋白质含量11或新鲜重量17的整个头部, 他们的位置。每个方法都有其优缺点。我们更喜欢从测量腺体腺泡细胞获得的分辨率, 尽管这种方法有两种主要的挑战。第一个挑战是正确识别和解剖腺体。第二个是对每个性腺泡的精确测量。在解剖光显微镜下, 腺体看起来清晰或乳白色, 腺泡细胞的边界很难定义。有工具, 以更好地定义腺泡细胞的边缘, 并增加获得准确的腺体测量的可能性, 有利于任何研究蜂蜜蜜蜂营养。
在这里, 我们向感兴趣的研究人员展示如何解剖, 染色, 图像和测量咽腺, 以便准确测量性腺泡大小可以达到。我们描述的方法为研究人员提供了一种简单、准确和可复制的方法, 在实验者充分练习后, 在相对较短的时间内实现多腺体测量。在短短一个多小时内, 人们可以自信地测量近10人的腺体。我们提供了获得这些测量所需的方法和材料的详细信息。下面概述的方法最重要的方面是正确的解剖和染色腺体。虽然我们捕获的放大图像和测量腺泡细胞与商业软件, 我们目前的方法可以很容易地适应其他平台18。
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Protocol
1. 从护士工作者身上解剖和染色下咽腺
- 通过熔化冷却设置蜡成一个小 (60 毫米 x 15 毫米) 或大 (100 毫米 x 15 毫米) 玻璃培养皿制成蜡夹层板。在使用钢板进行解剖前, 完全冷却蜡。
- 要处理的每只蜜蜂, 准备20µL 1:20 工作姬姆萨溶液 (1:20 伏/五的磷酸盐缓冲盐水 (PBS: 137 毫米氯化钠, 2.7 毫米氯化钾, 10 毫米 Na2HPO4, 1.8 毫米, 2 PO4).
注意: 姬姆萨染色含有甲醇, 易燃。它是有毒的, 如果吞下, 吸入, 或如果它接触到皮肤。应根据当地机构的要求处理。
注: 始终为当前批次的样品做一个新的工作解决方案, 因为姬姆萨染色一旦稀释, 很快就会降解。如果沉淀物发育, 就丢弃稀释的污渍。 - 吸管20µL 姬姆萨在显微镜滑梯的水井中着色, 50–100µL 盐水贴在井旁的滑梯上。
- 用10毫米的微弹簧剪刀将头从蜜蜂中分离出来, 用镊子和蜡雕笔将头前侧嵌入蜡夹层板中。将头部钉在蜡板中, 通过在眼睛和嘴中插入针脚来增加稳定性。
- 使用锋利的易碎剃刀刀片固定在一个别针钳, 做一个小 (~ 2–3毫米) 切口之间的眼睛和下颚两侧的脸板。轻轻地在面板下运行微剪刀, 并切断在触角和大脑之间运行的触角神经。
- 使用精钳, 抓住嘴上的面板, 翻转它, 并把它钉在蜡板与细点钳和别针。如有需要, 完全取下面板。
- 吸管20µL PBS 上的切口开放部分的头部。
注: 此时腺体可能浮起来, 或者必须搜索它们。腺体看起来像一串珍珠, 并位于大脑的顶端, 如果完好无损。 - 使用超细点钳轻轻移除其中的下咽腺体 (腺体可能会折断, 要求它被删除的片段), 并立即转移腺体到姬姆萨染色显微镜幻灯片。
- 允许腺体在姬姆萨溶液中孵化5分钟, 然后用镊子将腺体转移到同一张幻灯片上的盐水池中。如果需要, 用微剪刀把腺体切成小块。
注意: 这有助于使腺体位于平坦的平面上, 从而更容易获得腺体腺泡细胞的清晰图像。
2. 测量下咽腺腺泡细胞
- 打开显微镜, 开启测量程序。打开显微镜的光源, 如果它尚未打开。将显微镜放大倍数设置为10X。
- 找到腺体, 聚焦放大的图像在目镜, 没有计算机。增大放大倍数以 60–80X, 并将图像聚焦在目镜中。
- 在 "获取" 标签下, 调整并聚焦计算机上的实时图像上的腺体。
- 在 "图像名称" 框中键入图像名称/样本描述, 然后单击 "获取图像" 以获取腺体的图像以进行进一步测量。
- 选择 "分析" 选项卡. 选择 "区域工具" (在补充图 1A中突出显示), 并取消选中 "显示标签" 下的 "值", 这也将取消选中 "单位"。将所有其他设置设置为默认值 (补充图 1A)。
注意: 软件根据放大倍数自动校准区域测量, 以便从较低的放大倍数获得的面积与从更高的放大倍数获得的区域相同。 - 通过连续单击或连续按住鼠标左键来测量每个性腺泡, 同时尽可能仔细地跟踪性腺泡周长。每只蜜蜂测量至少10腺泡细胞。
注: 可能需要更多的根据实验 (见讨论)。它可能需要多个图像/部分的腺体, 以找到足够清晰, 正确的定向腺泡细胞测量。 - 一旦测量了单个图像中的所有腺泡细胞, 请选择 "创建报告"。确保选择的选项如补充图 1B所示, 然后单击 "导出"。
- 按需要保存报表。如果已为示例集创建了文件, 并且正在添加其他度量值, 请确保报表文件未打开, 以便将新数据添加到现有文件中。
- 完成后, 关闭显微镜摄像机和光源。擦拭显微镜下的液体和腺体, 并安全地处理任何使用过的材料。用蒸馏水冲洗滑梯, 用乙醇 (70% 伏/v) 擦拭干净以供重复使用。
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Representative Results
从护士工作者身上解剖咽喉腺, 并在60–80X 放大 (图 1) 上可视化并无染色。在无瑕组织中, 很难找到合适的对比度来充分聚焦和定义腺泡细胞的边缘。在染色的组织中, 腺泡细胞的边缘是尖锐的, 因为染色组织和白色背景的对比度有所改善。
图 1: 无瑕 (A, B) 或染色 (C, D) 下咽腺体从护士年龄的工人.注意, 虽然腺体是可见的两种情况下, 染色腺体是更明确, 因此更容易测量。还要注意的是, 整个腺体有点卷曲和卷曲的形态导致不同的焦平面。腺体可以切片, 以防止这种情况发生。刻度条 = 500 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
蜂蜜蜂工作者在≤18 h 被收集了在诞生以后并且被分配了到两种不同的膳食制度: 春天花粉的膳食自然地存在于图森, 亚利桑那州, 美国混合蜂蜜或仅蜂蜜与没有花粉。为了限制蜜蜂对这些饮食, 而在蜂巢, 推入式网箱被使用-如前研究13,14 -限制蜜蜂每平方厘米约一蜂密度。每种膳食治疗重复三个蜂巢 (N = 3)。接触到两种食物的蜜蜂都是在5维和8岁的时候收集的, 用来分析他们的下咽腺。利用以上概述的解剖、染色和测量方法, 对这些蜜蜂的下咽腺腺泡细胞进行了测量和比较 (图 2)。在每三个蜂巢中, 三只蜜蜂被测量每个年龄 x 饮食治疗组合。每只蜜蜂测量了十腺泡细胞。每只蜜蜂平均性腺泡大小的腺泡细胞测量平均值。然后将这些值平均为该蜂巢的 x 龄治疗组合获取值。性腺泡测量的方差分析表明, 饮食 (f18= 2.65, p = 0.001), 年龄 (f18 = 10.03, p = 0.013) 和饮食 x 年龄之间的相互作用 (f18=0.02, p = 0.020) 有显著的影响。我们观察到, 随着时间的推移, 下咽腺在蜜蜂中生长, 这些花粉是由 Tukey 的 HSD 所决定的。这个模式已经被证明以前9,11,19。当蜜蜂被剥夺花粉时, 腺体腺泡细胞的大小在5维和8天的老蜜蜂之间没有什么不同。
图 2: 下咽腺大小的喂养良好的护士和那些被剥夺花粉.工人们吃了花粉和蜂蜜 (灰色的酒吧) 或单独的蜂蜜 (白酒吧) 的饮食, 5 或 8 d。在这段时间里, 蜜蜂在蜂巢内, 被关在蜂蜜、蜂蜜和花粉中。他们的下咽腺腺泡细胞的测量如上文所述。误差线表示三个菌落 (N = 3) 测试的平均性腺泡大小的标准误差。三只蜜蜂是从每个殖民地测量每个治疗年龄 x 饮食治疗组合。根据 Tukey 的 HSD (α = 0.05), 由星号连接的条形明显不同。请单击此处查看此图的较大版本.
蜜蜂也可以维持在笼子里, 与蜂巢和喂食确定的饮食分开。蜂蜜蜂工作者被收集了在≤18小时在诞生以后并且被分配了到丙烯酸玻璃笼子 (每笼子100只蜜蜂) 与四个膳食制度: 不含花粉的膳食或包含三蜂收集的花粉的膳食: 杏仁 "杏仁" 花粉果园单一, "沙漠" 花粉从索诺兰沙漠含有混合的沙漠植物, 或 "SE" 花粉从殖民地位于美国东南部, 如科比-哈里斯等。12. 蔗糖 (50% 瓦特/五), 水和花粉 (酌情) 提供了ad 随意。五个笼子是为每四饮食治疗, 导致总共20笼。在8岁时, 收集和测量十只蜜蜂的下咽腺。每个人测量十腺泡细胞。计算每只蜜蜂的平均性腺泡大小, 并利用这些值获得每个笼的平均性腺泡大小。我们观察到, 下咽腺大小对花粉在饮食中的存在是敏感的 (花粉与无花粉: t1 = 5.64, p < 0.0001) 和提供的花粉类型 (杏仁与沙漠与硒花粉:F2148 = 8.06, p = 0.0005;图 3)。蜜蜂喂养的沙漠或杏仁花粉有同等的腺体大小。蜜蜂喂养硒花粉的腺体比蜜蜂喂养的杏仁或沙漠花粉小。
图 3: 护老工人的下咽腺大小喂养三种不同类型的花粉或被剥夺花粉.护士蜜蜂在出现后被放置在笼子里, 并喂养一个由蔗糖单独 (没有花粉) 或蔗糖和三花粉 (杏仁, 沙漠, 或硒花粉) 的饮食, 直到8岁。误差线表示从五笼中取样的蜜蜂平均性腺泡大小的标准误差 (N = 5)。在每个笼子里取样和测量了十只蜜蜂, 以获得笼子的平均性腺泡大小, 并计算笼子之间的变化。请单击此处查看此图的较大版本.
补充文件 1: 测量软件的屏幕截图, 同时测量腺体腺泡细胞 (A) 和创建报告 (B).请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
下咽腺大小对饮食中的蛋白质和花粉量敏感, 是幼蜂营养的重要标志。在这里, 我们展示了一种廉价和重现的方法来解剖和测量这个组织。这些组织可能很难解剖, 但随着实践, 你可以得到越来越干净的解剖与组织相对完好。这里提出的方法的主要优点是, 组织染色, 使研究者能够清楚地可视化每个腺体性腺泡的边界。如果没有污点, 这些腺泡细胞的边界很难想象和聚焦在显微镜下, 从而降低了研究者获得精确性腺泡测量的能力。尽管容易染色和获得清晰的图像腺泡细胞, 应考虑几个关键点, 以获得准确的测量;下文将讨论这些问题。
大腺体来自喂养良好的护士蜜蜂, 大约7–10天的9,20。它总是更容易, 特别是当学习解剖这些组织, 首先练习解剖大腺体之前, 移动到较小的腺体, 因为它们可以是小的, 脆弱的, 很难解剖。新鲜的组织也能产生最好的解剖。如果一个人必须在解剖前冻结蜜蜂一段时间, 要知道蜜蜂被冰冻得越久, 组织就越脆弱。这可以使解剖有问题。随着实践和尖锐的钳, 研究员将最终克服这些问题。我们没有注意到冷冻和新鲜组织之间的染色差异。
为了获得正确的腺体染色, 需要新鲜的污渍。旧的污渍会结块, 留下的污渍不能正确渗透组织。重要的是, 新鲜的污渍准备小批量, 大约每小时。这将确保在显微镜下的组织和背景的适当对比, 从而导致尖锐的图像与定义的性腺泡边缘。如果污渍不能正确渗透到组织中, 也有助于处理一系列的染色稀释。我们发现, 1:20 新鲜的工作库存的染色效果最好, 但其他稀释也可以工作, 如果一个人想要一个更暗或更轻的污点。
我们使用了一个相机连接到解剖显微镜和商用软件来测量和记录腺泡细胞数据。照相机和软件有些昂贵, 因此可能无法用于所有实验室。虽然有必要有一个相机连接到解剖显微镜, 以获得图像和测量腺泡细胞有几个较低的成本选项, 包括免费软件18, 可以使用。
在这里, 我们展示了染色和测量下咽腺腺泡细胞的基本步骤, 但强调它由研究者决定有多少腺泡细胞测量, 是否测量腺泡细胞在一个或两个腺体, 以及是否测量每个腺体的多个区域。例如, 为了在实验治疗中发现更微妙的差异, 你可能需要测量每腺体超过10腺泡细胞, 每治疗10多只蜜蜂。我们没有注意到任何腺泡细胞大小差异的基础上, 他们的位置在腺体。我们也没有注意到在左或右腺体的腺泡细胞大小有任何差别。如果研究人员怀疑任何大小差异, 下咽腺的多个区域, 也许两个腺体都应该测量。
研究人员应该能够通过这里描述的用于解剖和染色腺体组织和测量腺泡细胞的协议, 成功地获得对下咽腺大小的精确测量。通过实践, 这些测量可以得到相当快, 允许研究员处理多个样本在一个坐。我们期待更多的研究人员将使用这里概述的方法, 因为他们试图进一步了解影响下咽腺大小的因素, 以及这些腺体如何与群体健康和个体行为有关。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国农业部的内部资金的支持 (项目编号: 2022-21000-017-00 D)。美国农业部是一个平等机会的雇主和供应商。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
- Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
- Jacques, A., et al. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).
- Zee, R. vd, et al. Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).
- Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems. Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).
- Vaudo, A. D., Tooker, J. F., Grozinger, C. M., Patch, H. M. Bee nutrition and floral resource restoration. Current Opinion in Insect Science. 10, 133-141 (2015).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the Honey Bee. , Comstock Pub. Associates. (1984).
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. (1987).
- Johnson, B. R. Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).
- Pernal, S. F., Currie, R. W. Pollen quality of fresh and 1-year-old single pollen diets for worker honey bees (Apis mellifera L). Apidologie. 31 (3), 387-409 (2000).
- DeGrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Huang, E., Huang, M. H. The effect of diet on protein concentration, hypopharyngeal gland development and virus load in worker honey bees (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 56 (9), 1184-1191 (2010).
- Corby-Harris, V., Snyder, L., Meador, C., Ayotte, T. Honey bee (Apis mellifera) nurses do not consume pollens based on their nutritional quality. PLoS One. 13 (1), e0191050 (2018).
- Corby-Harris, V., et al. Transcriptional, translational, and physiological signatures of undernourished honey bees (Apis mellifera) suggest a role for hormonal factors in hypopharyngeal gland degradation. Journal of Insect Physiology. 85, 65-75 (2016).
- Corby-Harris, V., Jones, B. M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers. BMC Genomics. 15, 134 (2014).
- Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).
- Sagili, R. R., Pankiw, T. Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth. Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671 (2012).
- Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees. Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).
- Crailsheim, K. The protein balance of the honey bee worker. Apidologie. 21, 417-429 (1990).
