Summary
Hypopharyngeal klier acinus grootte is een robuuste maatregel van verpleegkundige honing honingbij voeding. Hier, bieden wij een gedetailleerd protocol voor ontleden, kleuring, imaging en verpleegkundige bee hypopharyngeal klier acini meten.
Abstract
De verpleegster hypopharyngeal klieren produceren de eiwitoplossing van de werknemer en de koninginnegelei die wordt gevoed aan de ontwikkeling van larven en koninginnen. Deze gepaarde klieren die zich in het hoofd van de bijen bevinden zijn uiterst gevoelig voor de hoeveelheid en kwaliteit van pollen en stuifmeel vervangt dat de verpleegkundige bee verbruikt. De klieren krijgen kleinere wanneer verpleegkundigen gebrekkig dieet worden gevoed en groot zijn wanneer ze volledige diëten worden gevoed. Omdat verpleegkundige hypopharyngeal klier grootte een robuuste indicator van verpleegkundige voeding is, is het essentieel dat die studeren honing honingbij voeding hoe weet te meten deze klieren. Hier, voorzien wij in gedetailleerde methoden ontleden, kleuring, imaging en verpleegkundige bee hypopharyngeal klieren te meten. Wij presenteren vergelijkingen van onbevlekt en gekleurd weefsel en gegevens die werden gebruikt voor het bestuderen van de impact van pollen op klier grootte. Deze methode is gebruikt om te testen hoe voeding invloed hypopharyngeal klier grootte maar verder gebruik voor het begrijpen van de rol van deze klieren in korf gezondheid heeft.
Introduction
Bijen zijn essentieel voor de landbouw omdat ze bestuiven een scala aan gewassen die worden verbruikt door mens en dier. Veel aandacht heeft besteed aan de daling van de bijenvolken honing als kolonie verliezen zweven rond 30-40% per jaar in de Verenigde Staten1 en 10 – 15% in Europa2,3. Meerdere factoren, met inbegrip van beperkte toegang tot hoge kwaliteit ruwvoer, waarschijnlijk akte samen om de negatieve invloed op de gezondheid van de bijen honing. Monocultuur, droogte, onhoudbaar bijenteelt praktijken en andere factoren verlagen de diversiteit en hoeveelheid natuurlijke pollens beschikbaar tot kolonies4,5. Omdat bijen bijna al hun dieet eiwitten en lipiden stuifmeel ontlenen, kunt individu en kolonie gezondheid ernstig beperken door minder toegang tot stuifmeel.
De hypopharyngeal klieren zijn secretoire structuren, gelegen in de bee's hoofd tussen de ogen en de hersenen6. Onder normale omstandigheden, de ontwikkelings- en functionele traject van de klieren spiegel die van de bijen ze bevinden zich in. Bij ongeveer 5 – 10 dagen oud presteert de honingbij verpleging gedrag in de korf. Op dit zelfde moment bereiken de hypopharyngeal klieren hun piek grootte en secretoire capaciteit, productie van de belangrijke eiwitoplossing van het brood eten of jelly gevoed aan de ontwikkeling van larven en andere volwassenen, zoals de koningin. De klieren op de grootte van deze piek lijken op een tros druiven waar elke druif een discrete kwab-structuur die bekend staat als de acinus is (meervoud: acini). Als de werknemer bee leeftijden en op verschillende taken in de component neemt, de hypopharyngeal klieren krimpen en nemen over de verschillende functies, zoals het breken van de suiker in de nectar7,8. De hypopharyngeal klieren zijn daarom gecorreleerd met het tijdperk van de bijen en hun leeftijd-geassocieerde taak.
Verpleegkundige hypopharyngeal klier grootte is gevoelig voor de kwaliteit en kwantiteit van de eiwitten in hun dieet9,10,11. Als verpleegkundige bijen goed gevoed zijn, zijn hun klieren groot. Overwegende dat de klieren klein zijn wanneer de honingbij is beroofd van stuifmeel, met name in de eerste week van volwassen ontwikkeling. Om te bepalen van de voedingstoestand van een verpleegkundige bee, onderzoekers meestal meten de hypopharyngeal klieren, hetzij door het rechtstreeks meten van de klier acinus grootte11,12,13,14 of eiwit15,16 -gehalte of door het meten van het eiwit gehalte11 vers gewicht17 van de gehele kop, waar zij zich bevinden. Elke methode heeft zijn eigen voors en tegens. Wij verkiezen de resolutie verkregen voor het meten van de klier acini, hoewel deze methode uitdagend op twee belangrijke manieren zijn kan. De eerste uitdaging is het correct identificeren en ontleden de klier. De tweede is het verkrijgen van een nauwkeurige maatstaf voor elke acinus. Onder een ontleden lichte Microscoop, kunnen de klieren verschijnen duidelijk of melkachtig wit en de grenzen van de acini moeilijk te definiëren. Met hulpmiddelen voor het beter definiëren van de rand van de acini, en om de kans voor het verkrijgen van nauwkeurige klier metingen te vergroten is gunstig voor iedereen studeren honing honingbij voeding.
Hier tonen we interesse onderzoekers hoe om te ontleden, vlekken, beeld, en hypopharyngeal klieren meten zodat nauwkeurige metingen van acinus grootte kunnen worden bereikt. De methode die we beschrijven biedt onderzoekers een eenvoudig, accuraat en repliceerbaar methode voor het bereiken van meerdere klier metingen in een relatief korte periode van tijd zodra de experimentator voldoende wordt beoefend. Een kon vertrouwen het meten van de klieren van bijna 10 personen in iets meer dan een uur. Wij bieden de details over de methode en de materialen die nodig zijn voor het verkrijgen van deze metingen. De belangrijkste aspecten van de hieronder beschreven methoden zijn de juiste dissectie en kleuring van de klieren. Hoewel we de vergrote beelden vastleggen en meten van de acini met commerciële software, kunnen de methoden die we presenteren gemakkelijk worden aangepast aan andere platformen18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontleden en vlekken van de klieren van de Hypopharyngeal van de verpleegster werknemers
- Maak een wax dissectie plaat door smelten cool instelling was in een kleine (60 x 15 mm) of grote (100 mm x 15 mm) glas petrischaal. De wax volledig afkoelen alvorens de plaat te gebruiken voor ontledingen.
- Voor elke bij te verwerken, bereiden 20 µL van een 1:20 Giemsa-werkoplossing (1:20 v/v van bereid Giemsa-kleuring in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb2HPO4, 1,8 mM KH2PO4)).
Let op: Giemsa-kleuring bevat methanol en is licht ontvlambaar. Het is giftig bij inslikken, inademing of als het gaat in contact with skin. Het moet worden verwijderd volgens de vereisten van de lokale instelling.
Opmerking: Zorg altijd een verse werkoplossing alleen voor de huidige batch van monsters omdat Giemsa-kleuring snel degradeert zodra het wordt verdund. Gooi de verdunde vlek als een neerslag ontwikkelt. - Pipetteer 20 µL Giemsa-kleuring in de putten van de Microscoop dia's en 50-100 µL saline op de dia grenzend aan de put.
- Loskoppelen van het hoofd van een bee, met behulp van de 10 mm micro-voorjaar schaar, en de hoofd voorzijde omhoog insluiten in de wax dissectie plaat met pincet en een wax-carving-pen. PIN het hoofd naar beneden in de wax plaat voor extra stabiliteit door het invoegen van pinnen in de ogen en een in de mond.
- Met behulp van een scherp scheermesje breekbare vast in een speld vise, maken een klein (~ 2-3 mm) incisie tussen de ogen en kaken aan weerskanten van de voorplaat. Voorzichtig lopen de micro schaar onder de voorplaat en snijd de antennal zenuw die tussen de antennes en de hersenen loopt.
- Met fijne pincet, grijpen de voorplaat door de mond, wegknipt het omhoog en het aan de plaat wax spelden met fijne punt pincet en een pin. Verwijder zo nodig de voorplaat volledig.
- Pipetteer 20 µL PBS op de snede open sectie van het hoofd.
Opmerking: De klieren kunnen zweven omhoog op dit punt of men moet zoeken voor hen. De klieren zien eruit als een tekenreeks van parels en zijn gelegen op de top van de hersenen als intact. - Super fijne punt pincet voorzichtig verwijderen een van de klieren van de hypopharyngeal (de klier kan breken, waarvoor het moet worden verwijderd in segmenten) gebruik, en onmiddellijk overbrengen in de klier de Giemsa-kleuring op de dia microscopie.
- Toestaan dat de klier te broeden in de Giemsa-oplossing gedurende 5 minuten, en gebruik vervolgens pincet te dragen van de klier aan de pool van zoutoplossing op dezelfde dia.. Indien nodig, de klier in kleinere stukjes gesneden met de micro schaar.
Opmerking: Dit helpt om de klieren liggen in een vlakker vlak, waardoor het makkelijker te verkrijgen van de klier acini en heldere beelden.
2. meten van de hypopharyngeal, de klier Acini
- Zet de Microscoop en open het programma van de meting. De lichtbron voor de Microscoop inschakelen als deze nog niet op. De Microscoop vergroting ingesteld op 10 X.
- Vinden van de klieren en gericht de vergrote afbeelding in het oculair, zonder de computer. Het zoompercentage op 60-80 X en richten het beeld in het oculair.
- Onder het tabblad 'verwerven' aanpassen en de klieren focus op het live beeld op de computer.
- Naam/monster Afbeeldingsbeschrijving typt in het vak ' afbeelding ' en klik op 'Verwerven Image' om een afbeelding van de klieren voor verdere metingen.
- De 'Analyse' tab. Selecteer de 'gebied tool' (gemarkeerd in aanvullende figuur 1A) selecteren en deselecteren van 'waarde' onder 'Display Labels', die ook 'eenheid deselecteren zal'. Stel alle andere instellingen op standaard (aanvullende figuur 1A).
Opmerking: De software kalibreert automatisch de gebied metingen volgens het niveau van vergroting zodat het gebied verkregen uit een lagere vergroting hetzelfde als die van een hogere vergroting is. - Elke acinus meten door voortdurend te klikken of continu ingedrukt de linkermuisknop ingedrukt terwijl het traceren van de omtrek van de acinus zo zorgvuldig mogelijk. Meten van ten minste 10 acini per honingbij.
Opmerking: Meer kan nodig zijn afhankelijk van het experiment (Zie de discussie). Meerdere afbeeldingen/secties van de klier vindt u voldoende duidelijk en goed georiënteerde acini voor meting, kan zij eisen. - Zodra alle van de acini van een enkel beeld zijn gemeten, selecteer 'Rapport maken'. Ervoor zorgen dat de opties zoals in aanvullende figuur 1B zijn geselecteerd en klik op 'exporteren'.
- Sla het rapport desgewenst. Als een bestand al is gemaakt voor de set van monsters en aanvullende metingen worden toegevoegd, zorgen ervoor dat het rapportbestand niet open zodat de nieuwe gegevens worden toegevoegd aan het bestaande bestand.
- Wanneer u klaar bent, de Microscoop camera en uitschakelen lichtbron. Veeg de vloeistof en de klieren uit de microscopie dia's schoon en veilig verwijderen van het gebruikte materiaal. Spoel de dia's met gedestilleerd water en veeg schoon met ethanol (70% v/v in water) voor hergebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hypopharyngeal klieren waren ontleed van verpleegkundige werknemers en gevisualiseerd met en zonder vlek bij 60-80 X vergroting (Figuur 1). In onbevlekt weefsel is het moeilijk om te vinden van de juiste contrast volledig concentreren en definiëren van de randen van de acini. In het gekleurd weefsel zijn de randen van de acini scherp vanwege het betere contrast tussen het gekleurd weefsel en de witte achtergrond.
Figuur 1: onbevlekt (A, B) of gebeitst (C, D) hypopharyngeal klieren van verpleegkundige-verouderde arbeiders. Merk op dat terwijl de klieren zichtbaar in beide gevallen zijn, de gekleurde klieren zijn meer welomschreven en daarom gemakkelijker te meten. Merk ook op dat de enigszins gekruld en spiraalsnoer morfologie van de resultaten van de hele klier in verschillende focal vlakken. De klier kan worden gesegmenteerd om dit te voorkomen. Schaal bars = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Honey bee werknemers werden verzameld op ≤18 h na opkomst en werden toegewezen aan twee verschillende voeding regimes: een dieet van voorjaar stuifmeel nature aanwezig zijn in Tucson, Arizona, VS gemengd met honing of gewoon honing met geen stuifmeel. Om de bijen beperken tot deze diëten terwijl in de korf, push-in: draad kooien werden gebruikt — zoals beschreven in eerdere studies13,14 — beperken de bijen bij een dichtheid van ongeveer een honingbij per vierkante centimeter. Elk dieet behandeling werd herhaald in drie kasten (N = 3). Bijen blootgesteld aan beide voedingswijze werden verzameld op 5 d en 8 d van leeftijd voor analyse van hun hypopharyngeal klieren. Met behulp van de dissectie, kleuring en meetmethoden bovenstaande, de klier acini van de hypopharyngeal van deze bijen werden gemeten en vergeleken (Figuur 2). In elk van de drie korven, werden drie bijen gemeten voor elke leeftijd x dieet behandeling combinatie. Tien acini werden gemeten voor elke bee. De acini metingen werden gemiddeld voor elk bee te verkrijgen van de grootte van een gemiddelde acinus per honingbij. Deze waarden werden dan gemiddeld voor een waarde voor de leeftijd x behandeling combinatie voor die component. ANOVA-analyse op de acinus metingen is gebleken dat dieet (F1,8= 2.65, p = 0,001), leeftijd (F1,8 = 10.03, p = 0,013), en de interactie tussen dieet x leeftijd (F1,8= 0.02, p = 0.020) belangrijke gevolgen gehad. We hebben vastgesteld dat de klieren hypopharyngeal na verloop van tijd in de bijen die werden gevoed stuifmeel groeide, zoals bepaald door de een Tukey HSD. Dit patroon is aangetoond eerder9,11,19. De grootte van de klier acini niet verschillen tussen de 5 d en de 8 dagen oude bijen, wanneer de bijen werden beroofd van stuifmeel.
Figuur 2: Hypopharyngeal klier maten van weldoorvoede verpleegkundigen en beroofd van stuifmeel. Werknemers werden gevoed een dieet van pollen en honing (grijze balken) of een dieet van honing alleen (witte balken) voor 5 of 8 d. Gedurende deze tijd, bijen waren binnenkant van de korf en gekooide over honing of de honing en stuifmeel. Hun hypopharyngeal klier acini werden gemeten zoals hierboven beschreven. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout voor de grootte van de gemiddelde acinus over de drie koloniën (N = 3) getest. Drie bijen werden gemeten vanaf elke kolonie voor elke behandeling leeftijd x dieet behandeling combinatie. Balken verbonden met een sterretje zijn beduidend verschillend van elkaar volgens een Tukey de HSD (α = 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Bijen kunnen ook worden gehouden in kooien los van de korf en gevoed gedefinieerde diëten. Honey bee werknemers werden verzameld bij ≤ 18 h na opkomst en werden toegewezen aan acrylglas kooien (100 bijen per korf) met één van vier dieet regimes: een dieet met geen stuifmeel of een dieet met een van de drie bee-verzameld pollens: "amandel" stuifmeel van een amandel boomgaard monocultuur, "woestijn" stuifmeel uit de Sonoran woestijn met een mix van woestijnplanten, of "SE" pollen uit kolonies ligt in het zuidoosten van de Verenigde Staten, zoals beschreven in Corby-Harris et al. 12. sacharose (50% g/v), water, en pollen (eventueel) werden ad libitumverstrekt. Vijf kooien werden gebouwd voor elk van de vier dieet behandelingen, resulterend in een totaal van 20 kooien. Bij 8 d van leeftijd, waren de klieren hypopharyngeal van tien bijen verzameld en gemeten. Tien acini werden gemeten voor ieder individu. De grootte van de gemiddelde acinus was berekend voor elke bee en deze waarden werden gebruikt om de grootte van een gemiddelde acinus voor elke kooi. We waargenomen dat hypopharyngeal klier grootte gevoelig voor zowel de aanwezigheid van stuifmeel in de voeding is (stuifmeel versus geen stuifmeel: t1 5.64, p = < 0.0001) en het type van stuifmeel geboden (amandel vs. woestijn vs. SE stuifmeel: F2.148 = 8.06, p = 0.0005; Figuur 3). Bijen gevoed woestijn of amandel stuifmeel had gelijk klier maten. Bijen gevoed SE stuifmeel had klieren die kleiner dan bijen waren gevoed amandel of woestijn stuifmeel.
Figuur 3: Hypopharyngeal klier maten van verpleegkundige-aged werknemers gevoed van drie verschillende soorten stuifmeel of beroofd van stuifmeel. Verpleegkundige bijen na opkomst in kooien zijn geplaatst en een dieet bestaande uit sacharose alleen (geen stuifmeel) of sucrose en één van de drie pollens (amandel, woestijn of SE stuifmeel) tot 8 d van leeftijd werden gevoed. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout voor de grootte van de gemiddelde acinus in bijen bemonsterd uit vijf kooien (N = 5). Tien bijen werden bemonsterd en gemeten in iedere kooi te verkrijgen van de grootte van een gemiddelde acinus van de kooi en voor de berekening van de variatie tussen kooien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand 1: Screen shots van meting software tijdens het meten van de klier acini (A) en het maken van het rapport (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hypopharyngeal klier grootte is gevoelig voor de hoeveelheid eiwit en pollen in het dieet en een kritische marker van voeding in jonge volwassen bijen. Hier tonen wij een voordelige en reproduceerbare manier om te ontleden en meten dit weefsel. Deze weefsels kunnen moeilijk te ontleden, maar met de praktijk steeds schoner dissecties met het relatief intact weefsel kunt krijgen. Het belangrijkste voordeel van de methode die hier gepresenteerd is dat het weefsel is gekleurd, waardoor de onderzoeker te visualiseren duidelijk de grenzen van elke acinus klier. Zonder een vlek zijn de grenzen van deze acini moeilijk te visualiseren en te richten onder de Microscoop die de onderzoeker de mogelijkheid vermindert om een nauwkeurige acinus meting. Ondanks het gemak van kleuring en het verkrijgen van een helder beeld voor de acini, moet verscheidene kritieke punten worden beschouwd met het oog op de nauwkeurige metingen; deze worden hieronder besproken.
Grote klieren vandaan weldoorvoede verpleegkundige bijen die ongeveer 7-10 dagen van leeftijd9,20 zijn. Het is altijd gemakkelijker, vooral bij het leren om te ontleden van deze weefsels, eerste praktijk ontrafeling van grote klieren alvorens op kleinere klieren als ze kunnen kleine, kwetsbare en moeilijk te ontleden. Verse weefsel levert ook de beste dissecties. Als een de honingbij voor een periode van tijd voordat de dissectie bevriezen moet, weet dat hoe langer dat een honingbij is bevroren, de meer kwetsbare het weefsel wordt. Hierdoor kunt u dissecties problematisch. De onderzoeker zal met de praktijk en scherpe pincet, uiteindelijk winnen van deze kwesties. We hebben niet gemerkt van een verschil in kleuring tussen bevroren en verse weefsel.
Verse vlek is noodzakelijk om het verkrijgen van de juiste kleuring van de klieren. Oudere vlek kan klomp, waardoor de vlek kan niet goed doordringen in de weefsels. Het is belangrijk dat verse vlek worden bereid in kleine batches, ongeveer elk uur. Dit zal ervoor zorgen dat goede contrast tussen het weefsel en de achtergrond onder de Microscoop, wat leidt tot scherpe beelden met randen van gedefinieerde acinus. Het is ook nuttig om te werken met een scala aan vlek verdunningen als de vlek is niet correct het weefsel doordringen. We vonden dat een 1:20 vers werken voorraad van vlek werkt het beste, maar andere verdunningen ook werken kan als een een donkerder of lichtere vlek wenst.
Wij gebruikte een camera die verbonden aan het ontleden Microscoop en commercieel beschikbare software om te meten en registreren van de gegevens van de acini. De camera en de software zijn enigszins duur en daarom mogelijk niet beschikbaar voor alle labs. Hoewel het nodig om een camera die is aangesloten op de ontleden Microscoop met het oog op het imago en de maatregel zijn de acini er verschillende lagere kosten-opties, met inbegrip van vrije software18, die kunnen worden gebruikt.
Hier, laten we de basic stappen voor kleuring en het meten van de hypopharyngeal klier acini, maar benadrukken dat het tot de onderzoeker om te beslissen hoeveel acini maatregel, of voor het meten van de acini op één of beide klieren en of voor het meten van meerdere gebieden van elke klier. Bijvoorbeeld, om op te sporen meer subtiele verschillen tussen experimentele behandelingen, nodig men heeft om meer dan 10 acini per klier en meer dan 10 bijen per behandeling te meten. We hebben niet gemerkt eventuele acini grootte verschillen op basis van hun locaties op de klier. We hebben ook niet gemerkt eventuele verschillen in grootte van acini die op de linker- of klieren bevinden zich. Als de onderzoeker eventuele verschillen van grootte vermoedt, moeten meerdere gebieden van de klier hypopharyngeal en misschien beide klieren worden gemeten.
Onderzoekers moeten zitten kundig voor met succes het verkrijgen van nauwkeurige metingen van hypopharyngeal klier grootte met behulp van het protocol beschreven hier voor ontleden en kleuring klier weefsel en het meten van acini. Met praktijk, kunnen deze metingen worden verkregen vrij snel, waardoor de onderzoeker voor het verwerken van meerdere monsters in één zitting. Wij verwachten dat meer onderzoekers gebruik van de methoden die hier worden geschetst maken zal als ze willen verder inzicht in de factoren die van invloed zijn hypopharyngeal klier grootte, en hoe deze klieren die betrekking hebben op de gezondheid van de kolonie en individueel gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door interne fondsen van de USDA-ARS (projectnummer: 2022-21000-017-00-D). De ARS/USDA is een gelijke kans werkgever en leverancier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
- Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
- Jacques, A., et al. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).
- Zee, R. vd, et al. Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).
- Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems. Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).
- Vaudo, A. D., Tooker, J. F., Grozinger, C. M., Patch, H. M. Bee nutrition and floral resource restoration. Current Opinion in Insect Science. 10, 133-141 (2015).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the Honey Bee. , Comstock Pub. Associates. (1984).
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. (1987).
- Johnson, B. R. Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).
- Pernal, S. F., Currie, R. W. Pollen quality of fresh and 1-year-old single pollen diets for worker honey bees (Apis mellifera L). Apidologie. 31 (3), 387-409 (2000).
- DeGrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Huang, E., Huang, M. H. The effect of diet on protein concentration, hypopharyngeal gland development and virus load in worker honey bees (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 56 (9), 1184-1191 (2010).
- Corby-Harris, V., Snyder, L., Meador, C., Ayotte, T. Honey bee (Apis mellifera) nurses do not consume pollens based on their nutritional quality. PLoS One. 13 (1), e0191050 (2018).
- Corby-Harris, V., et al. Transcriptional, translational, and physiological signatures of undernourished honey bees (Apis mellifera) suggest a role for hormonal factors in hypopharyngeal gland degradation. Journal of Insect Physiology. 85, 65-75 (2016).
- Corby-Harris, V., Jones, B. M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers. BMC Genomics. 15, 134 (2014).
- Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).
- Sagili, R. R., Pankiw, T. Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth. Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671 (2012).
- Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees. Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).
- Crailsheim, K. The protein balance of the honey bee worker. Apidologie. 21, 417-429 (1990).
