Summary
Hipofaringe glândula acinus tamanho é uma medida robusta de nutrição de abelhas de mel de enfermeira. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para dissecar, coloração, imagem e medição ácinos de glândula enfermeira abelha hipofaringe.
Abstract
As enfermeira hipofaringe glândulas produzem a fração proteica do trabalhador e geleia real que é alimentada para desenvolver as larvas e as rainhas. Estas glândulas pareadas localizadas na cabeça da abelha são altamente sensíveis à quantidade e qualidade de pólen e pólen substitutos que a enfermeira abelha consome. As glândulas ficam menores quando as enfermeiras são alimentadas com dietas deficientes e são grandes, quando eles são alimentados com dietas completas. Porque a enfermeira hipofaringe glândula tamanho é um indicador robusto da enfermeira nutrição, é essencial que os que estudam a nutrição de abelhas de mel sabem como medir essas glândulas. Aqui, nós fornecemos métodos detalhados para dissecando, coloração, imagem latente e glândulas de hipofaringe enfermeira abelha de medição. Apresentamos as comparações de dados que foram usados para estudar o impacto do pólen no tamanho da glândula e tecido imaculado e manchado. Este método tem sido usado para testar como dieta afeta o tamanho de glândula de hipofaringe, mas tem mais uso para compreender o papel dessas glândulas na saúde de colmeia.
Introduction
As abelhas são essenciais para a agricultura porque eles polinizam uma variedade de culturas que são consumidos por seres humanos e animais. Muita atenção para o declínio das populações de abelhas de mel como focalizar de perdas de colônia em torno de 30-40% anualmente no Estados Unidos1 e 10-15% na Europa,2,3. Múltiplos fatores, incluindo o acesso reduzido a alta qualidade de forragem, provável ato juntos para afetar negativamente a saúde das abelhas de mel. Monocultura, seca, práticas insustentáveis de apicultura e outros fatores diminuem a diversidade e a quantidade de pólens naturais disponíveis para colônias4,5. Porque as abelhas derivam quase todas as suas proteínas dietéticas e lipídios de pólen, acesso reduzido ao pólen pode limitar severamente a saúde individual e colônia.
As glândulas de hipofaringe são estruturas secretoras, localizadas na cabeça da abelha, entre os olhos e o cérebro6. Em circunstâncias normais, a trajetória do desenvolvimento e funcional das glândulas espelho que da abelha estão localizados no. Com aproximadamente 5-10 dias de idade, a abelha realiza comportamentos de enfermagem na colmeia. Neste mesmo momento, as glândulas de hipofaringe atingir seu pico e capacidade secretora, produzindo a fração de proteína principal do alimento ninhado ou geleia alimentado para o desenvolvimento de larvas e outros adultos, como a rainha. Neste tamanho de pico as glândulas se assemelhar a um cacho de uvas, onde cada uva é uma estrutura discreta lobo conhecida como o acinus (plural: acinar). Como a abelha operária, idades e assume diferentes tarefas na colmeia, as glândulas de hipofaringe encolhem e assumem diferentes funções, como quebrar açúcares no néctar7,8. As glândulas de hipofaringe, portanto, estão correlacionadas com a idade da abelha e sua tarefa associada a idade.
Tamanho de glândula enfermeira hipofaringe é sensível à quantidade e qualidade de proteína em sua dieta9,10,11. Quando a enfermeira abelhas são bem nutridas, suas glândulas são grandes. Considerando que, as glândulas são pequenas quando a abelha é privada de pólen, particularmente na primeira semana do desenvolvimento adulto. Para determinar o estado nutricional de uma abelha de enfermeira, pesquisadores normalmente medem as glândulas de hipofaringe, ou medindo diretamente a glândula acinus tamanho11,12,13,14 ou proteína15,16 de conteúdo ou medindo-se a proteína11 de conteúdo ou peso fresco17 de cabeça inteira onde eles estão localizados. Cada método tem suas próprias vantagens e desvantagens. Nós preferimos a resolução Obtida de medição ácinos da glândula, embora esse método pode ser um desafio de duas maneiras principais. O primeiro desafio é identificar e dissecar a glândula corretamente. O segundo é a obtenção de uma medida exata de cada acinus. Sob um microscópio de luz dissecação, as glândulas aparecem transparente ou leitoso branco e as fronteiras dos ácinos podem ser difícil de definir. Ter ferramentas para definir melhor a borda da acinar e aumentar a probabilidade de obter medições precisas da glândula é benéfica a ninguém estudar nutrição de abelha de mel.
Aqui, nós mostramos pesquisadores interessados como dissecar, mancha, imagem e medir a hipofaringe glândulas para que as medidas exatas de tamanho acinus podem ser alcançadas. O método que descrevemos oferece pesquisadores um método fácil, preciso e replicável para alcançar várias medições de glândula em um período relativamente curto de tempo, uma vez que o experimentador é suficientemente praticado. Um com confiança poderia medir as glândulas de quase 10 pessoas em mais de uma hora. Oferecemos detalhes sobre o método e materiais necessários para obter estas medidas. Os aspectos mais importantes dos métodos indicados abaixo são a dissecação adequada e coloração das glândulas. Apesar de capturar as imagens ampliadas e medir os ácinos com software comercial, os métodos que apresentamos podem ser facilmente adaptados para outras plataformas,18.
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Protocol
1. dissecando e manchando as glândulas de hipofaringe de trabalhadores de enfermeira
- Fazer uma placa de dissecação de cera derretendo cera de definição legal em uma pequena (60 mm x 15 mm) ou um copo grande (100 x 15 mm) placa de Petri. Esfrie a cera completamente antes de usar a placa para as dissecções.
- Para cada abelha para serem processados, prepare-se 20 µ l de uma 01:20 Giemsa solução de trabalho (01:20 v/v de preparado o corante de Giemsa em tampão fosfato salino (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4)).
Cuidado: Giemsa mancha contém metanol e é inflamável. É tóxico se ingerido, inalado, ou se ele entra em contato com a pele. -Deve ser descartada de acordo com os requisitos da instituição local.
Nota: Sempre faça uma solução fresca de trabalho apenas para o lote atual de amostras porque mancha Giemsa degrada rapidamente uma vez que está diluído. Descarte a mancha diluída se desenvolve de um precipitado. - Pipetar 20 µ l Giemsa uma mancha nos poços de corrediças do microscópio e salina de 50 a 100 µ l a lâmina adjacente ao poço.
- Retire a cabeça de uma abelha, usando a tesoura de micro-Primavera de 10mm e incorporar o lado da frente da cabeça a placa de dissecação de cera usando fórceps e uma caneta de escultura de cera. Segure a cabeça na placa de cera para estabilidade adicional, inserindo os pinos nos olhos e um na boca.
- Usando uma lâmina de barbear afiada quebrável fixa no torno de bancada pino, fazer uma pequena (~ 2-3 mm) incisão entre os olhos e mandíbulas de cada lado da placa de cara. Delicadamente, executar a tesoura micro sob a placa de cara e cortou o nervo da antena que se estende entre a antena e o cérebro.
- Usando a pinça fina, pegar a placa de cara pela boca, flip-la e fixá-lo à placa de cera, com pinça de ponta fina e um pin. Se necessário, remova a placa de cara completamente.
- Pipetar 20 µ l PBS para o corte abre a seção da cabeça.
Nota: As glândulas podem flutuar acima neste ponto ou um deve procurá-los. As glândulas se parece com um colar de pérolas e estão localizadas na parte superior do cérebro se intacto. - Use pinça ponto super fino para remover suavemente uma das glândulas de hipofaringe (glândula pode quebrar, obrigá-la a ser removidas em segmentos) e transferir imediatamente a glândula para a mancha de Giemsa do slide de microscopia.
- Permitir que a glândula a incubar na solução de Giemsa por 5 min e então usar fórceps para transferir a glândula para o pool de soro no mesmo slide. Se necessário, corte a glândula em pequenos pedaços com uma tesoura de micro.
Nota: Isso ajuda a tornar as glândulas mentir em um avião mais plano, tornando assim mais fácil de obter imagens claras dos ácinos da glândula.
2. medir a hipofaringe glândula acinar
- Ligue o microscópio e abrir o programa de medição. Ligue a fonte de luz para o microscópio, se ainda não estiver na. Defina a ampliação do microscópio para 10 X.
- Encontrar as glândulas e focar a imagem ampliada na ocular, sem o computador. Aumentar a ampliação de 60 – 80 X e focar a imagem na ocular.
- Na guia 'adquirir', ajustar e focar as glândulas a imagem ao vivo no computador.
- Digite a descrição do nome/amostra de imagem na caixa 'Nome de imagem' e clique em 'Adquirir imagem' para criar a imagem de glândulas para medições ainda mais.
- Selecione a guia 'Análise' a 'área ferramenta Selecionar' (destacada na Figura suplementar 1A) e desmarque 'valor' sob 'Exibir rótulos', que também irá desmarcar 'unidade'. Como todas as outras configurações padrão (Supplemental figura 1A).
Nota: O software calibra automaticamente as medições de área, de acordo com o nível de ampliação para que a área Obtida de uma baixa ampliação é o mesmo que obtidos de uma maior ampliação. - Medir cada acinus continuamente clicando ou continuamente mantendo pressionado o botão esquerdo do mouse enquanto o perímetro acinus de rastreamento tão cuidadosamente quanto possível. Medir pelo menos 10 acinar por abelha.
Nota: Mais podem ser necessárias dependendo do experimento (veja a discussão). Pode exigir várias imagens/seções da glândula encontrar suficiente acinar clara e corretamente orientado para medição. - Uma vez que todos os ácinos de uma única imagem foram medidos, selecione 'Criar relatório'. Certifique-se que as opções são selecionadas, como mostrado na Figura suplementar 1B e clique em 'Exportar'.
- Salve o relatório como desejado. Se um arquivo já foi criado para o conjunto de amostras e medições adicionais estão sendo adicionadas, certifique-se de que o arquivo de relatório não está aberto para que os novos dados são adicionados ao arquivo existente.
- Quando terminar, desligue a câmera do microscópio e a fonte de luz. Limpar o líquido e glândulas fora as lâminas de microscopia e eliminar de forma segura de qualquer material usado. Lave os slides com água destilada e limpe com álcool etílico (70% v/v em água) para reusar.
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Representative Results
Glândulas de hipofaringe foram dissecadas da enfermeira trabalhadores e visualizadas com e sem mancha na ampliação de 60 – 80 X (Figura 1). No tecido imaculado, é difícil encontrar o contraste adequado totalmente foco e definir as bordas dos ácinos. No tecido manchado, as bordas dos ácinos são nítidas devido o melhor contraste entre o tecido manchado e o fundo branco.
Figura 1: Unstained (A, B) ou manchado (C, D) hipofaringe glândulas de enfermeira-idade trabalhadores. Observe que, enquanto as glândulas são visíveis em ambos os casos, as glândulas manchadas são mais bem definidas e, portanto, mais fácil de medir. Também nota que um pouco enrolado e bobinados morfologia da glândula inteira resulta em diferentes planos focais. A glândula pode ser seccionada para evitar que isso ocorra. Escala de barras = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Mel abelha trabalhadores foram coletados em ≤18 h após a emergência e foram atribuídos a dois diferentes regimes alimentares: uma dieta de pólen da Primavera naturalmente em Tucson, Arizona, EUA misturada com mel ou só mel com nenhum pólen. A fim de restringir as abelhas para estas dietas enquanto no hive, utilizaram-se gaiolas de arame empurrar-nos — conforme descrito em anteriores estudos13,14 — confinar as abelhas em uma densidade de aproximadamente uma abelha por centímetro quadrado. Cada tratamento dietético repetiu-se em três seções (N = 3). As abelhas expostas a qualquer regime dietético foram coletadas na 5D e 8D de idade para a análise de suas glândulas de hipofaringe. Usando a dissecação, coloração e medindo os métodos indicados acima, os hipofaringe ácinos de glândula destas abelhas foram medidos e comparados (Figura 2). Em cada uma das três colmeias, três abelhas foram medidas para cada idade x combinação de tratamento dieta. Dez Acinos foram medidos para cada abelha. As medições de ácinos foram em média para cada abelha obter um tamanho médio acinus por abelha. Estes valores foram então em média para obter um valor para a idade x combinação de tratamento para a colmeia. ANOVA análise nas medidas acinus mostrou que a dieta (F1,8= 2,65, p = 0,001), idade (F1,8 = 10,03, p = 0,013) e a interação entre dieta x idade (F1,8= 0.02, p = 0.020) tinha efeitos significativos. Observamos que as glândulas de hipofaringe cresceram ao longo do tempo as abelhas que foram alimentados com pólen, conforme determinado por um Tukey HSD. Este padrão tem sido demonstrado anteriormente de11,9,19. O tamanho de ácinos da glândula não diferiu entre a 5D e abelhas de 8 dias de idade, quando as abelhas foram privadas de pólen.
Figura 2: tamanhos de glândula hipofaringe de enfermeiros bem alimentados e aqueles privaram de pólen. Os trabalhadores foram alimentados com uma dieta de pólen e mel (barras cinza) ou uma dieta de mel sozinho (barras brancas) para 5 ou 8 d. Durante este tempo, as abelhas estavam dentro da colmeia e enjaulados em mel ou mel e pólen. Os ácinos de glândula de hipofaringe foram medidos conforme descrito acima. Barras de erro representam o erro padrão para o tamanho médio acinus em três colônias (N = 3) testado. Três abelhas foram medidas em cada colônia para cada idade de tratamento x combinação de tratamento dieta. Barras ligadas por um asterisco são é significativamente diferente do outro, de acordo com um Tukey HSD (α = 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As abelhas também podem ser mantidas em gaiolas separadas da colmeia e alimentadas com dietas definidas. Mel abelha trabalhadores foram coletados no ≤ 18 h após a emergência e foram designados para gaiolas de vidro acrílico (100 abelhas por gaiola) com um dos quatro regimes alimentares: uma dieta não contendo nenhum pólen ou uma dieta contendo um dos três abelha coleta pólen: pólen "amêndoa" de amêndoa monocultura de pomar, pólen "deserto" do deserto Sonoran contendo uma mistura de plantas do deserto ou pólen "SE" das colônias, localizado no sudeste dos Estados Unidos, conforme descrito no Corby-Harris et al . 12. sacarose (50% p/v), água e pólen (eventualmente) foram fornecidos ad libitum. Cinco gaiolas foram construídas para cada um dos quatro tratamentos dietéticos, resultando em um total de 20 gaiolas. D 8 de idade, as glândulas de hipofaringe de dez abelhas foram coletadas e medidas. Dez Acinos foram medidos para cada indivíduo. O tamanho médio acinus foi calculado para cada abelha e esses valores foram utilizados para obter um tamanho médio acinus para cada gaiola. Observamos que o tamanho de glândula de hipofaringe é sensível à presença de pólen na dieta (pólen contra nenhum pólen: t1 = 5,64, p < 0,0001) e o tipo de pólen fornecido (amêndoa vs deserto vs pólen SE: F2.148 = 8,06, p = 0,0005; A Figura 3). Abelhas alimentou deserto ou pólen amêndoa tinha tamanhos glândula equivalente. As abelhas alimentados pólen SE tinham glândulas que eram menores que as abelhas alimentados pólen amêndoa ou deserto.
Figura 3: tamanhos de glândula hipofaringe de enfermeira-idade trabalhadores alimentados com três tipos diferentes de pólen ou privados de pólen. Enfermeira de abelhas foram colocadas em gaiolas após a emergência e foram alimentadas com uma dieta composta de sacarose sozinho (sem pólen) ou sacarose e um dos três pólenes (amêndoa, deserto ou SE pólen) até 8 d de idade. Barras de erro representam o erro padrão para o tamanho médio acinus em abelhas amostrados de cinco gaiolas (N = 5). Dez abelhas foram amostradas e medidas em cada gaiola para obter um tamanho médio acinus para a gaiola e para calcular a variação entre as gaiolas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementares 1 arquivo: tiros de software de medição de tela enquanto os ácinos da glândula (A) de medição e criando o relatório (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Tamanho de glândula de hipofaringe é sensível à quantidade de proteína e pólen na dieta e um marcador crítico de nutrição em abelhas adultas jovens. Aqui, vamos demonstrar uma maneira barata e reprodutível para dissecar e medir este tecido. Estes tecidos podem ser difíceis de dissecar, mas com a prática, um pode obter cada vez mais limpas dissecações com o tecido relativamente intacta. A principal vantagem do método apresentado aqui é que o tecido é manchado, o que permite que o pesquisador Visualizar claramente as fronteiras de cada acinus glândula. Sem uma mancha, nas fronteiras destes ácinos são difíceis de Visualizar e concentrar-se ao microscópio que diminui a capacidade do investigador para obter uma medição exata acinus. Apesar da facilidade de coloração e obter uma imagem nítida para o acinar, vários pontos críticos devem ser considerados para obter medições precisas; Estes são discutidos abaixo.
Grandes glândulas provêm de abelhas de enfermeira bem alimentados que são aproximadamente 7-10 dias de idade9,20. É sempre mais fácil, especialmente quando aprender a dissecar esses tecidos, a primeira prática dissecando grandes glândulas antes de mudar-se para as glândulas menores, como eles podem ser pequeno, frágil e difícil de dissecar. Tecido fresco também produz as melhores dissecações. Se um deve congelar a abelha, por um período de tempo antes da dissecação, sei que quanto mais frágil, mais que uma abelha é congelada o tecido torna-se. Isso pode tornar as dissecções problemático. Com prática e Pinças afiadas, o pesquisador irá eventualmente superar estas questões. Não notamos uma diferença na coloração entre tecidos congelados e frescos.
Mancha fresca é necessária para obter a coloração adequada das glândulas. Mancha mais velha pode aglutinar, deixando a mancha não é possível corretamente permeiam os tecidos. É importante que mancha fresca preparada em pequenos lotes, aproximadamente a cada hora. Isto irá garantir o contraste adequado entre o tecido e o fundo sob o microscópio, o que leva a imagens nítidas com bordas acinus definidos. Também é útil trabalhar com uma série de diluições de mancha, se a mancha não permear o tecido corretamente. Descobrimos que um 01:20 fresco trabalho estoque da mancha funciona melhor, mas outras diluições também pode funcionar se um deseja uma mancha mais escura ou mais clara.
Usamos uma câmera acoplada ao microscópio dissecação e software disponíveis comercialmente para medir e gravar os dados de ácinos. A câmera e o software são um pouco caros e, portanto, podem não estar disponíveis para todos os laboratórios. Embora seja necessário ter uma câmera acoplada ao microscópio dissecação para obter a imagem e medir a acinar, existem várias opções de custo mais baixas, incluindo software livre18, que pode ser usado.
Aqui, nós mostramos o basic etapas para coloração e medindo os ácinos de glândula de hipofaringe, mas salientar que isso até o pesquisador decidir quantos acinar a medida, se medir ácinos em uma ou ambas as glândulas e se deve medir várias áreas de cada glândula. Por exemplo, a fim de detectar mais sutis diferenças entre os tratamentos experimentais, um talvez precise medir mais de 10 acinar por glândula e mais de 10 abelhas por tratamento. Não notamos as diferenças de tamanho de ácinos com base em suas localizações na glândula. Também não notamos as diferenças nos tamanhos dos ácinos que estão localizados nas glândulas esquerdas ou direita. Se o investigador suspeitar de quaisquer diferenças de tamanho, talvez ambas as glândulas e várias áreas da hipofaringe glândula devem ser medidas.
Pesquisadores devem ser capazes de obter com êxito as medidas exatas do tamanho de glândula de hipofaringe usando o protocolo descrito aqui para dissecar e manchando o tecido da glândula e medição acinar. Com a prática, estas medições podem ser obtidas rapidamente, permitindo que o pesquisador processar amostras múltiplas de uma só vez. Esperamos que mais pesquisadores vão empregar os métodos descritos aqui como eles procuram a entender melhor os fatores que influenciam o tamanho de glândula de hipofaringe, e como essas glândulas se relacionam à colônia saúde e comportamento individual.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por fundos internos a partir do USDA-ARS (número do projeto: 2022-21000-017-00-D). O USDA/ARS é um empregador que oferece oportunidades iguais e provedor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
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