Summary
Tamaño de acino de glándula hipofaríngea es una medida robusta de enfermera nutrición de abejas de miel. Presentamos un protocolo detallado para disección, tinción, proyección de imagen y medición acinos de la glándula de enfermera abeja hipofaríngeo.
Abstract
Las enfermera las glándulas hipofaríngeas producen la fracción proteica del trabajador y la jalea real que se alimenta con el desarrollo de larvas y reinas. Estas glándulas apareadas que se encuentran en la cabeza de la abeja son muy sensibles a la cantidad y calidad de polen y polen sustituye que consume la abeja enfermera. Las glándulas consigue más pequeño cuando las enfermeras son alimentadas con dietas deficientes y son grandes cuando son alimentadas con dietas completas. Porque el tamaño de la glándula hipofaríngea enfermera es un indicador robusto de la enfermera de nutrición, es fundamental que quienes estudian miel abeja nutrición saben cómo medir estas glándulas. Aquí, ofrecemos métodos detallados para la disección, la coloración, la proyección de imagen y medición glándulas hipofaríngeas de enfermeras abeja. Presentamos las comparaciones de datos que se utilizaron para estudiar el impacto de polen en el tamaño de la glándula y tejido sin manchas y manchado. Este método se ha utilizado para probar cómo dieta afecta el tamaño de la glándula hipofaríngea pero tiene otro uso para la comprensión de la función de estas glándulas en la salud de la colmena.
Introduction
Miel de abejas es esenciales para la agricultura porque ellos polinizan una variedad de cultivos que son consumidos por los seres humanos y animales. Mucha atención se ha pagado a la declinación de las poblaciones de abejas como suspender las pérdidas de Colonia alrededor del 30-40% cada año en los Estados Unidos1 y 10 – 15% en Europa2,3. Múltiples factores, incluyendo el reducido acceso a la alta calidad de forraje, probable ley para afectar negativamente la salud de abejas de miel. Monocultivo, la sequía, las prácticas insostenibles de la apicultura y otros factores disminución de la diversidad y cantidad de polen natural disponible para las colonias4,5. Porque abejas derivan casi todos su dieta proteínas y lípidos de polen, acceso reducido al polen puede limitar severamente la salud individual y Colonia.
Las glándulas de la hipofaringe son estructuras secretoras situadas en cabeza de la abeja entre los ojos y el cerebro6. En circunstancias normales, la trayectoria del desarrollo y funcional de las glándulas de la abeja se encuentran en espejo. En aproximadamente 5 – 10 días de edad, la abeja realiza comportamientos de enfermería en la colmena. En este mismo tiempo, las glándulas hipofaríngeas alcanzan su máximo tamaño y capacidad secretora, produciendo la fracción de la proteína importante del alimento de cría o alimentada al desarrollo de las larvas y otros adultos, como la reina de la jalea. En este tamaño de pico las glándulas se asemejan a un racimo de uvas donde cada uva es una estructura discreta lóbulo conocida como los acinos (plural: acinos). Como la abeja del trabajador envejece y adquiere diferentes tareas en la colmena, las glándulas de la hipofaringe se encogerán y asumir diferentes funciones, como romper azúcares en el néctar7,8. Por lo tanto, las glándulas hipofaríngeas se correlacionan con la edad de la abeja y su tarea relacionado con la edad.
Tamaño de la glándula hipofaríngea enfermera es sensible a la cantidad y la calidad de la proteína en su dieta9,10,11. Cuando las abejas de la enfermera están bien alimentadas, sus glándulas son grandes. Mientras que las glándulas son pequeñas cuando la abeja carece de polen, especialmente en la primera semana del desarrollo adulto. Para determinar el estado nutricional de una abeja de la enfermera, los investigadores suelen medir las glándulas hipofaríngeas, ya sea por medición directa de la glándula acino tamaño11,12,13,14 o proteína15,16 de contenido fresco peso17 de toda la cabeza donde se encuentran o midiendo la proteína contenido11 . Cada método tiene sus propios pros y contras. Preferimos la resolución de la medición de los acinos de la glándula, aunque este método puede ser un desafío en dos formas principales. El primer desafío es identificar y disecar la glándula. La segunda es obtener una medida exacta de cada acino. Con un microscopio de disección ligero, las glándulas aparecen blanco claro o lechoso y las fronteras de los acinos pueden ser difíciles de definir. Tener herramientas para definir mejor el borde de los acinos y para aumentar la probabilidad de obtener mediciones precisas de la glándula es beneficioso para nadie estudiando nutrición de abejas de miel.
Aquí, mostramos investigadores interesados cómo diseccionar, mancha, imagen y medir glándulas hipofaríngeas por lo que pueden lograr mediciones precisas del tamaño de acinos. El método que describimos ofrece a los investigadores un método fácil, preciso y reproducible para la consecución de varias mediciones de la glándula en un período relativamente corto de tiempo una vez que el experimentador se practica lo suficiente. Uno podría medir con confianza las glándulas de casi 10 personas en poco más de una hora. Ofrecemos información sobre el método y los materiales necesarios para obtener estas medidas. Los aspectos más importantes de los métodos descritos a continuación son la adecuada disección y tinción de las glándulas. Aunque capturar las imágenes magnificadas y medimos los acinos con software comercial, los métodos que presentamos pueden ser fácilmente adaptados a otras plataformas18.
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Protocol
1. disección y tinción de las glándulas hipofaríngeas de trabajadores de la enfermera
- Hacer una placa de disección cera derritiendo cera ajuste cool en un pequeño (60 mm x 15 mm) o placa de Petri de vidrio grande (100 x 15 mm). Enfríe la cera antes de usar la placa para disecciones.
- Para que cada abeja a procesar, preparar 20 μl de una 1:20 solución Giemsa diluida (1:20 v/v del preparado mancha de Giemsa en solución salina tamponada con fosfato (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4)).
PRECAUCIÓN: La mancha de Giemsa contiene metanol y es inflamable. Es tóxico si está tragado, inhalado, o si entra en contacto con la piel. Se deben eliminarse según los requisitos de la institución local.
Nota: Haga siempre una solución fresca de trabajo sólo para el lote actual de muestras porque mancha de Giemsa se degrada rápidamente una vez que se diluye. Descartar el colorante diluido si se presenta un precipitado. - Tinción de Giemsa pipetee 20 μl a los pocillos de los portaobjetos de microscopio y 50 – 100 μl salino en la diapositiva junto al pozo.
- Separar la cabeza de una abeja, con las tijeras micro-primavera de 10 mm e incorporar la cabeza parte frontal para arriba en la placa de disección de cera utilizando fórceps y un lápiz de cera-talla. Perno de la cabeza hacia abajo en la placa de cera para estabilidad adicional insertando alfileres en los ojos y uno en la boca.
- Usando una cuchilla de frágil aguda en una prensa de tornillo pin, hacer un pequeño (~ 2-3 mm) incisión entre los ojos y mandíbulas a cada lado de la placa frontal. Ejecutar el micro tijeras debajo de la placa de cara y cortar el nervio antenal que discurre entre las antenas y el cerebro.
- Con unas pinzas finas, agarrar la placa por la boca lo levante y pasador a la placa de cera con pinzas de punta fina y un pin. Si es necesario, retire la placa frontal completo.
- Pipetee 20 μl PBS en el corte abierto sección de la cabeza.
Nota: Las glándulas pueden flotar para arriba en este punto o uno debe buscarlos. Las glándulas parecen un collar de perlas y se encuentran en la parte superior del cerebro si intacto. - Utilizar pinzas de punta súper fina para eliminar suavemente una de las glándulas hipofaríngeas (la glándula puede romper, que requieren para ser quitado en segmentos) y transferir inmediatamente la glándula a la tinción de Giemsa en el portaobjetos de microscopía.
- Permite la glándula para incubar en la solución de Giemsa durante 5 min y luego usar fórceps para transferir la glándula a la piscina de solución salina en la misma diapositiva. Si es necesario, cortar la glándula en trozos más pequeños con las tijeras micro.
Nota: Esto ayuda a que las glándulas se encuentran en un plano más plano, así haciéndolo más fácil obtener imágenes claras de los acinos de la glándula.
2. medición de la hipofaringe acinos de la glándula
- Abra en el microscopio y el programa de medición. Encienda la fuente de luz para el microscopio si no está ya en. Establece la ampliación del microscopio a 10 X.
- Encontrar las glándulas y enfocar la imagen magnificada en el ocular, sin la computadora. La ampliación a 60 – 80 X de aumentar y enfocar la imagen en el ocular.
- En la pestaña de 'adquisición', ajuste y las glándulas se centran en la imagen en directo en la computadora.
- Tipo de imagen Descripción nombre/muestra en el cuadro 'Nombre de la imagen' y haga clic en 'Adquirir imagen' para tomar una imagen de las glándulas para otras medidas.
- Seleccione la ficha 'Análisis' Seleccione la 'herramienta área' (resaltada en el suplementario Figura 1A) y deseleccionar 'valor' bajo 'Etiquetas de pantalla', que también será deseleccionar 'unidad'. Coloque todos los otros ajustes por defecto (suplementario Figura 1A).
Nota: El software calibra automáticamente las mediciones de área según el nivel de ampliación para que el área de un aumento inferior es igual a la de un aumento mayor. - Medir cada acino continuamente o continuamente manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón mientras se trazado el perímetro de acino tan cuidadosamente como sea posible. Medir por lo menos 10 acinos por abeja.
Nota: Más necesite dependiendo de la experiencia (ver discusión). Puede requerir múltiples imágenes/secciones de la glándula para encontrar suficiente acinos claros y correctamente orientados para la medición. - Una vez que se han medido todos los acinos de una única imagen, seleccione "Crear informe". Asegúrese de que opciones son seleccionadas como se muestra en la figura suplementaria 1B y haga clic en 'exportar'.
- Guarde el informe como se desee. Si ya se ha creado un archivo para el conjunto de muestras y mediciones adicionales se agregan, asegúrese de que el archivo de informe no está abierto para que los nuevos datos se agregan al archivo existente.
- Cuando haya terminado, apague la cámara de microscopio y fuente de luz. Limpie el líquido y las glándulas de los portaobjetos de microscopía y disponen con seguridad de cualquier material utilizado. Enjuague los portaobjetos con agua destilada y limpie con etanol (70% v/v en agua) para su reutilización.
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Representative Results
Glándulas hipofaríngeas fueron disectadas de los trabajadores de enfermería y visualizadas con y sin mancha en 60 – 80 X de ampliación (figura 1). En el tejido sin mancha, es difícil encontrar contraste apropiado enfocar y definir los bordes de los acinos. En el tejido manchado, las de los acinos están afiladas debido al mayor contraste entre el tejido manchado y el fondo blanco.
Figura 1: mancha (A, B) o manchados (C, D) las glándulas hipofaríngeas de enfermera edad trabajadores. Observe que mientras que las glándulas son visibles en ambos casos, las glándulas manchadas más bien definida y por lo tanto más fácil de medir. También nota que algo rizado en espiral la morfología de la glándula entera resulta en diferentes planos focales. La glándula puede ser seccionada para evitar que esto ocurra. Barras de escala = 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Miel abeja trabajadores fueron recogidos en ≤18 h después de la emergencia y fueron asignados a dos diferentes regímenes de dieta: una dieta de polen primavera naturalmente presente en Tucson, Arizona, EEUU mezclado con miel o solo miel con ningún polen. Para restringir las abejas a estas dietas mientras que en la colmena, se utilizaron jaulas de alambre empujar-en, como se ha descrito en estudios anteriores13,14 , el confinamiento de las abejas a una densidad de aproximadamente una abeja por centímetro cuadrado. Cada tratamiento dietético fue repetido en tres colmenas (N = 3). Las abejas expuestas a cualquier régimen alimenticio se recolectaron en d 5 y 8 días de edad para el análisis de sus glándulas hipofaríngeas. Mediante la disección, la coloración y se ha señalado anteriormente, los métodos de medición los acinos de glándulas hipofaríngeas de las abejas fueron medidos y compararon (figura 2). En cada una de las tres colmenas, las tres abejas fueron medidas para cada edad x combinación de tratamiento de dieta. Diez de los acinos se midieron para cada abeja. Las mediciones de acinos fueron promediadas para que cada abeja obtener un tamaño promedio del acino por abeja. Estos valores entonces se promediaron para obtener un valor para la edad x la combinación de tratamiento para esa colmena. Análisis ANOVA de las mediciones de acino demostraron esa dieta (F1,8= 2.65, p = 0,001), edad (F1,8 = 10.03, p = 0.013) y la interacción entre dieta x edad (F1,8= 0.02, p = 0.020) tuvo efectos significativos. Se observó que las glándulas hipofaríngeas crecieron con el tiempo en las abejas que fueron alimentados con polen, según lo determinado por el de Tukey HSD. Este patrón ha sido demostrado previamente9,11,19. El tamaño de los acinos de la glándula no difirió entre los d 5 y 8 días de edad abejas cuando las abejas fueron privadas de polen.
Figura 2: tamaños de glándula hipofaríngea de enfermeras bien alimentadas y los privan de polen. Los trabajadores fueron alimentados con una dieta de polen y miel (barras grises) o una dieta de miel sola (barras blancas) para 5 u 8 d. Durante este tiempo, las abejas fueron dentro de la colmena y enjaulado encima miel o miel y polen. Sus acinos de glándulas hipofaríngeas se midieron como se describió anteriormente. Barras de error representan el error estándar del tamaño de media acino a través de las tres colonias (N = 3) probado. Se midieron tres abejas de cada colonia para cada edad de tratamiento x combinación de tratamiento de dieta. Barras conectadas por un asterisco son significativamente diferente entre sí según un Tukey de HSD (α = 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Abejas pueden ser mantenidas en jaulas separadas de la colmena y alimentadas con dietas definidas. Miel abeja trabajadores recogieron a ≤ 18 h después de la emergencia y fueron asignados a las jaulas de vidrio acrílico (100 abejas por jaula) con uno de cuatro regímenes de dieta: una dieta que contenga no polen o una dieta que contiene uno de tres abejas recogen polen: polen de "almendra" de una almendra monocultura de huerta, "desierto" polen del desierto sonorense que contiene una mezcla de plantas del desierto o "SE" polen de colonias situado en el sureste de Estados Unidos, como se describe en Corby-Harris et al. 12. sacarosa (50% w/v), agua y polen (en su caso) fueron proporcionados ad libitum. Se construyeron cinco jaulas para cada uno de los cuatro tratamientos dietéticos, resultando en un total de 20 jaulas. En 8 días de edad, las glándulas hipofaríngeas de las diez abejas fueron recogidas y medidas. Diez acinos se midieron para cada individuo. El tamaño promedio del acino se calculó para cada abeja y estos valores se utilizaron para obtener un tamaño de acino promedio para cada jaula. Observamos que el tamaño de la glándula hipofaríngea es sensible a ambos la presencia de polen en la dieta (polen versus ningún polen: t1 = 5.64, p < 0.0001) y el tipo de polen que proporcionan (almendra vs desierto vs polen SE: F2.148 = 8.06, p = 0,0005; Figura 3). Las abejas alimentan desierto o polen almendra tenía tamaños equivalentes de la glándula. Las abejas alimentan con polen habían glándulas que eran más pequeñas que las abejas alimentados con polen de almendra o desierto.
Figura 3: tamaños de glándula hipofaríngea de trabajadores enfermera edad alimentados con tres diferentes tipos de polen o privadas de polen. Las abejas de la enfermera se colocaron en jaulas después de la emergencia y fueron alimentadas con una dieta de sacarosa sola (sin polen) o sacarosa y uno de tres pólenes (almendra, desierto o SE polen) hasta 8 días de edad. Barras de error representan el error estándar del tamaño de media acino en abejas muestreadas de cinco jaulas (N = 5). Diez abejas fueron muestreadas y medidas en cada jaula para obtener un tamaño de acino promedio para la jaula y para calcular la variación entre jaulas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: pantalla de fotos de software de medición medición de los acinos de la glándula (A) y crear el informe (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Tamaño de la glándula hipofaríngea es sensible a la cantidad de proteínas y polen en la dieta y es un marcador importante de alimentación en abejas adultas jóvenes. Aquí, demostramos una forma económica y reproducible para analizar y medir este tejido. Estos tejidos pueden ser difíciles de disecar, pero con la práctica, se pueden obtener cada vez más limpiador disecciones con el tejido relativamente intacta. La principal ventaja del método presentado aquí es que el tejido se tiñe, que permite al investigador a visualizar claramente las fronteras de cada acino de glándula. Sin una mancha, las fronteras de estos acinos son difíciles de visualizar y enfocar en el microscopio que disminuye la capacidad del investigador para obtener una medición exacta del acino. A pesar de la facilidad de tinción y la obtención de una imagen clara de los acinos, deben considerarse varios puntos críticos para obtener mediciones precisas; Estos se discuten a continuación.
Grandes glándulas vienen de las abejas de la enfermera bien alimentados que son aproximadamente 7-10 días de edad9,20. Siempre es más fácil, especialmente cuando aprender a diseccionar estos tejidos, a la primera práctica disección grandes glándulas antes de pasar a las glándulas más pequeñas como pueden ser pequeñas, frágiles y difíciles de disecar. Tejido fresco produce también las disecciones mejor. Si uno debe congelar la abeja durante un período de tiempo antes de la disección, saber que cuanto más frágil, más que una abeja se congela el tejido se vuelve. Esto puede hacer disecciones problemático. Con práctica y pinzas afiladas, el investigador será finalmente superar estos problemas. No hemos notado una diferencia en la coloración entre el tejido congelado y fresco.
Fresco es necesario para obtener la coloración adecuada de las glándulas. Pueden grupo mayores manchas, dejando la mancha incapaz de impregnar adecuadamente los tejidos. Es importante que mancha fresca preparado en pequeñas cantidades, aproximadamente cada hora. Esto asegurará el adecuado contraste entre el tejido y el fondo bajo el microscopio, que conduce a fuertes imágenes con bordes definidos acino. También es útil trabajar con una gama de diluciones de la mancha si la mancha no permean el tejido correctamente. Encontramos que una 1:20 acción de trabajo fresca mancha funciona mejor, pero otras diluciones también puede funcionar si uno desea un tinte más oscuro o más claro.
Se utilizó una cámara acoplada al microscopio de disección y software disponible en el mercado para medir y registrar los datos de los acinos. La cámara y el software son un poco costosas y por lo tanto pueden no estar disponibles para todos los laboratorios. Aunque es necesario tener una cámara acoplada al microscopio de disección con el fin de obtener la imagen y medir los acinos hay varias opciones de costo más bajas, incluyendo software libre18, que puede ser utilizado.
A continuación, os mostramos el básico pasos de tinción y medición de los acinos de la glándula hipofaríngea, sino subrayar que él hasta el investigador decide cómo muchos acinos a medida, si al medir acinos en una o ambas glándulas y si medir áreas múltiples de cada glándula. Por ejemplo, con el fin de detectar diferencias más sutiles entre los tratamientos experimentales, uno puede necesitar medir más de 10 acinos por glándula y más de 10 abejas por tratamiento. No hemos notado diferencias de tamaño de acinos basan en sus ubicaciones en la glándula. También no hemos notado diferencias en los tamaños de los acinos que se encuentran en las glándulas de izquierda o derecha. Si el investigador sospecha que las diferencias de tamaño, múltiples áreas de la glándula hipofaríngea y quizás ambas glándulas se deben medir.
Los investigadores deben ser capaces de obtener con éxito las medidas exactas del tamaño de la glándula hipofaríngea utilizando el protocolo descrito aquí de disección y tejido de la glándula de la coloración y medición acinos. Con la práctica, estas medidas pueden obtenerse muy rápidamente, permitiendo que el investigador procesar las muestras múltiples de una sola vez. Se espera que más investigadores emplean los métodos descritos aquí para entender más los factores que influyen el tamaño de la glándula hipofaríngea, y cómo estas glándulas se refieren a la salud de la Colonia y comportamiento individual.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos internos de la USDA-ARS (número del proyecto: 2022-21000-017-00-D). ARS/USDA es un proveedor y empleador de igual oportunidad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
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