Summary
여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.
Abstract
박테리아에서 알 수 없는 유전자의 기능 연구에 대 한 첫 번째 접근은이 유전자의 녹아웃을 만드는 것입니다. 여기, 우리는 강력 하 고 빠른 살 균 소 P1 일반화 된 변환 사용 하 여 다른 한 대장균 긴장에서 유전자 삭제 돌연변이 전송 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 돌연변이 선택 가능 (예: 항생제 카세트 삽입을 사용 하 여 유전자 중단에 따라) 해야 합니다. 이러한 항생제 카세트 기증자 긴장에서 동원 될 수 있습니다 관심 받는 사람 부담으로 신속 하 게 도입 하 고 쉽게 유전자 삭제 돌연변이 생성. 항생제 카세트 사이트별 recombinase 게놈에서 순서 ~ 100-기지-쌍-긴 흉터만 깨끗 한 녹아웃을 생산 하 여 카세트의 절단을 허용 하는 flippase 인식 사이트를 포함 하도록 디자인할 수 있습니다. 우리는 어셈블리 요소 autotransporter 속에 관련 된 인코딩 타 유전자를 노크 하 여 프로토콜을 설명 하 고는 속에이 노크 아웃의 효과 및 2 개의 trimeric autotransporter adhesins의 기능 테스트. P1 변환에 의해 유전자 삭제는 한계가, 비록 편리 하 고 속도 구현 하기가 유전자 삭제의 다른 방법에 매력적인 대안.
Introduction
유전자의 기능 연구에 대 한 일반적인 첫 번째 접근 노크 아웃 mutagenesis 수행 결과 표현 형을 관찰 하는 것입니다. 이것은 또한 반전 유전학을 불린다. 지난 70 년 동안 또는 이렇게, 그것의 경작 및의 순종 유전자 조작1의 용이성으로 인해 박테리아 대장균 분자 생물학의 주력 하고있다. 여러 가지 방법은 대장균, 등 표식 exchange mutagenesis2,3 , 더 최근에, λ 레드 또는 Rac 외 시스템4,5 를 사용 하 여 recombineering에에서 유전자 삭제를 생산 하기 위해 개발 되었습니다. , 6.
널리 사용 되는 시스템에서 개별 유전자의 코딩 시퀀스에서 염색체5,7excised 나중 수는 항생제 저항 카세트로 대체 됩니다. 코딩 시퀀스 대체 된다, 예를 들어 대 (칸) 저항 카세트, 양쪽에 flippase (FLP) 인식 대상 (FRT) 사이트에 의해 형벌 이다. FRT 사이트 recombinase 칸 카세트의 삭제로 이어지는 FRT 사이트 간의 사이트 재결합 중재 FLP에 의해 인식 됩니다. 이 방법에서는, 주어진된 유전자의 코딩 시퀀스의 전체 삭제 얻을 수 있습니다, 약 100의 기본적인 쌍 (bp) (그림 1)의 순서만 최소한의 흉터를 남겨두고.
전 10 년 넘게 소위 게이오 컬렉션 개발 되었다. 이것은 세균성 라이브러리 기반 표준 실험실 대장균 K12 변형, 거의 모든 비-필수 유전자 λ 빨간 재결합7,8에 의해 개별적으로 삭제 되었습니다. 이 컬렉션에서 클론 excisable 칸 저항 카세트 교체의 코딩 시퀀스 한 개 있다. 케이오 컬렉션9많은 응용 프로그램 대 한 유용한 도구가 될 입증 되었습니다. 하나는 같은 응용 프로그램 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이의 생산 이다. 일반적으로 살 균 소, P110,11,12,,1314등을 시험 하 여 주어진된 삭제 복제에서 칸 카세트를 동원 수 있습니다. 살 균 소 주식 같은 긴장에서 준비 사용할 수 있습니다 받는 사람의, E. 콜라이 긴장을 감염 하 어디 낮은 하지만 신뢰할 수 있는 주파수는 칸에서 카세트 포함 된 지역 포함 될 수 있습니다 받는 사람 게놈으로 동종 재결합에 의해 (그림 2)입니다. Transductants 칸 포함 된 매체에 성장에 대 한 선택할 수 있습니다. 이 따라 항생제 저항 카세트의 제거를 원하는 경우 트랜스 transductant 변형에 FLP recombinase 공급 수 있다. FLP 포함 된 플라스 미드, 암 피 실린 (Amp) 저항 마커를 운반, 경화 후 칸와 앰프-민감한 클론에 대 한 검사는 하 고 야생-타입 코딩 순서와 칸 카세트의 정확한 절단 식민지 PCR에 의해 확인 됩니다.
여기, 상세한 프로토콜 제공 됩니다, 각 녹아웃 대장균 스트레인 위에서 설명한 전략에 따라 생산 단계를 설명 하. 예를 들어, 타 마 유전자의 삭제는 보여 줍니다. 타 마 일부 전송 및 어셈블리 모듈 (TAM), 특정 autotransporter 단백질 및 pili15,,1617의 속에 포함 되는 외부 막 β 배럴 단백질을 인코딩합니다. 이 노크 아웃 긴장은 다음 2 개의 trimeric autotransporter adhesins (다시), 페스트 adhesin YadA와 대장균 면역 글로불린 (Ig)는 속에 다 마 삭제의 효과 검사 하는 데 사용 됩니다-TAA EibD 바인딩 18,19.
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Protocol
1. 긴장 및 플라스 미드
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세균성 긴장
- E. 콜라이 긴장 BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7,20, BL21(DE3) 및 BL21ΔABCF21을 사용 합니다. 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
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살 균 소
- P1비르 페이지를 사용 하 여 일반 변환에 대 한. 클로 프롬의 몇 방울과 액체 주식으로 페이지를 저장 (하십시오 단계 2.2 참조). 자세한 내용은 테이블의 자료를 참조 하십시오.
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플라스 미드
- 다음 플라스 미드를 사용 하 여이 프로토콜에: pCP2022,23, pIBA2 YadA pEibD1024. 제어 플라스 미드로 pASK-IBA2 및 pET22b ( 재료의 표참조)를 사용 합니다.
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성장 조건
- 전파는 lysogeny 국물 (파운드) 중간25 활기찬 동요 (180-200 rpm) 37 ° C 또는 BL21ΔABCF 및 pCP20를 포함 하는 긴장의 경우 30 ° C에 있는 박테리아.
- 43 ° c.에 치료 하는 플라스 미드를 수행
- 단단한 매체에 대 한 1 %agar (w/v)와 파운드를 보충.
- 최고 천 대 한 0.7 %agar 10mm CaCl2 와 압력솥 매체 LB 보충. Electroporation26후 회복 위한 SOC 매체를 사용 합니다.
- 항생제에 대 한 다음 농도 사용: 100 μ g/mL로 앰프와 칸에 대 한 25 μ g/mL
2. 준비 Lysate 살 균 소
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기증자 스트레인의 감염
- 10 m m CaCl2 와 함께 선택적으로 칸을 보충 하는 파운드 매체의 5 mL에 기증자 스트레인 JW4197 성장 (25 µ g/mL) 600에서 광학 밀도를 ~ 1.0 nm (OD600). 분 광 광도 계를 사용 하 여 세600 값을 측정 합니다.
- LB 매체에는 기존 p 1 살 균 소 주식의 희석 시리즈를 만들기: 희석은 10-3 10-7을 권장.
- 세균성 펜션과 15 mL 원심 분리기 관 또는 이와 동등한 주어진된 살 균 소 희석의 100 μ의 믹스 200 μ. 살 균 소 희석으로 많은 튜브를 준비 합니다. 동요 하지 않고 37 ° C에서 20 분 동안 튜브를 품 어.
- 녹은 가기 천 (~ 50 ° C) 10mm CaCl2 관에 보충의 ~ 3 mL를 추가 하 고 내용을 철저 하 게 혼합 vortexing에 의해 관 곧, 심지어 레이어를 만들기 위해 prewarmed 파운드 접시에 혼합물을 부 어.
- 37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어
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Lysate 준비
- 다음 날 살 균 소 패의 세미 confluent 성장과 플레이트를 선택 합니다. 약 절반의 표면적 접시 반 confluent 접시에 분명 하다 (그림 3).
- 접종 루프 또는 비슷한 도구를 사용 하 여 같은 접시에서 최고 천 층을 긁어과 원심 분리기 튜브에 최고 agar를 놓습니다. 증기 두건에서 파운드의 1-2 mL 및 클로 프롬 및 소용돌이 적극적으로 ~ 1 분 추가 클로 프롬에 대 한 튜브의 한 방울을 추가 합니다.
- 4000 g x 또는 더 작은 공의 천 및 세균성 세포에서 15 분 동안 튜브 원심
- 신선한 microcentrifuge 튜브, 피하 펠 릿에서 어떤 파편 든 지 운반에 상쾌한을 이동 합니다. 클로 프롬의 2 방울을 추가 하 고 4-10 ° c.에 lysate 저장 증기 두건에서 클로 프롬을 추가 합니다. 마십시오 하지 고정 페이지 lysate로이 전염 성 입자 수의 뜻깊은 감소 귀 착될 것 이다.
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Lysate titer를 결정
- BW25113 LB 문화 OD600 ~ 1.0에 도달할 때까지 37 ° C에서 10 mM CaCl2 보충에서 성장.
- 살 균 소 파운드 (예를 들어, 10-6– 10-9)에 lysate의 희석 시리즈 준비.
참고:은 희석을 클로 프롬을 전송 하지 않으려면 lysate의 위에서 피펫으로 샘플에 주의 해야 합니다. - 세균성 펜션과 15 mL 원심 분리기 관 또는 이와 동등한 주어진된 살 균 소 희석의 100 μ의 믹스 200 μ. 살 균 소 희석으로 많은 튜브를 준비 합니다. 동요 하지 않고 37 ° C에서 20 분 동안 튜브를 품 어.
- 녹은 가기 천 (~ 50 ° C) 10mm CaCl2 관에 보충의 ~ 3 mL를 추가 하 고 내용을 철저 하 게 혼합 vortexing에 의해 관 곧, 심지어 레이어를 만들기 위해 prewarmed 파운드 접시에 혼합물을 부 어.
- 37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어
- 다음 날 플 라크 (세균성 매트에 명확한 지역) 각 접시의 수를 계산 하 고 다음 수식을 사용 하 lysate의 titer를 계산:
예: 접시 희석 10-7, 10-8및 10-9에 있다 231, 27, 2 패, 각각. 각 희석의 100 μ, 감염에 대 한 사용 되었습니다 그리고는 titer 플 라크 형성으로 표현 했기 때문에 단위 (pfu) / mL, 도금 요소는 10. 이 숫자를 수식에 입력 됩니다.
따라서,는 titer 약 2 × 1010 전염 성 살 균 소 입자/mL 이다.
3. P1 변환
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받는 사람 세포 준비
- 받는 사람 변형 BL21ΔABCF 파운드 600에서 광학 밀도를 보충 성장 ~ 1.0 nm (OD600). OD600 값을 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다.
- 0.5의 감염 (MOI) 값의 다양성을 달성 하는 데 필요한 페이지 lysate의 볼륨을 계산 합니다. 나를 계산 하려면 문화권의 OD600 에 따라 박테리아의 수를 견적 한다. OD600 값이 1.0 ~ 109 cfu/mL에 해당 하는 가정 합니다. lysate의 알려진된 titer에 따라 필요한 볼륨을 계산 합니다.
예 (titer 단계 2.3.6 후 예제에서 계산에 따라):
- 10 m m 받는 사람 긴장 문화 CaCl2 를 추가 하 고 혼합. 변환에 대 한 문화의 1 mL를 가져가 라.
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변환 수행
- 받는 사람 문화 (를 포함 하 여 10 m m CaCl2 ) 단계 3.1.2에서에서 계산한 1 mL를 파지 lysate의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
참고: 플라스틱 믹스에 클로 프롬을 전송 하지 않으려면 lysate의 상단에서 샘플을 주의 해야 합니다. - 정적으로 37 ° c.에 20 분을 위한 혼합을 품 어
- 100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5 추가 하 여 감염을 중지 합니다.
- 박테리아 (5000 x g 2 분) centrifuge 고 상쾌한, 다음 100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5로 보충 하는 신선한 파운드의 1 mL에 그들을 resuspend.
- 세포 단계 무료 페이지 및 칼슘의 제거를 보장 하기 위해 3.2.4 에서처럼 두 번 더 씻는 다.
- 100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5로 보충 하는 신선한 파운드의 1 mL에 박테리아 resuspend (> 100 rpm)를 흔들어 1 h 30 ° C에서 박테리아를 품 어.
- 원심 (5000 x g 2 분)에 의해 박테리아를 수집 하 고 100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5와 파운드의 ~ 100 μ에 그들을 resuspend.
- 25 µ g/mL와 10 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5에서 칸으로 보충 하는 파운드 플레이트에 박테리아를 확산 하 고 식민지 (~ 24 h)이 나타날 때까지 30 ° C에서 박테리아를 성장.
- 받는 사람 문화 (를 포함 하 여 10 m m CaCl2 ) 단계 3.1.2에서에서 계산한 1 mL를 파지 lysate의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
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transductants를 선택 하면
- 식민지는 선택 접시에 성장 했다, 일단 단일 식민지를 위한 파운드 + 칸에 그들을 restreak 단일 식민지 나타납니다까지 30 ° C에서 성장 하 고.
4. 절 개 칸 카세트
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재조합 플라스 미드 전이
- 관 저항 BL21ΔABCF 긴장 electrocompetent를 확인 합니다.
- 신선한 파운드 (5 mL) 칸 보충에 단일 식민지에서 스트레인 성장 (25 µ g/mL) OD600 ~0.5-0.7까지 30 ° C에서.
- 여기에서에, 다음 단계 또는 얼음에 4 ° C에서 실시 합니다. Centrifuge 박테리아 (5000 x g 10 분) 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 이전 원심 분리 단계를 반복 하 여 두 번 차가운 증류수와 셀 펠 릿을 세척 하 고, 마지막으로, 얼음 10% 글리세롤의 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- 1mm electroporation 큐 벳 얼음에 식혀.
- 세포 현 탁 액을 플라스 미드 DNA (pCP20)의 1 세를 추가 하 고 부드럽게, 현 탁 액을 혼합 냉각된 electroporation 베트에 그것을 전송.
- 1.8는 electroporator 설정 kV 및 electroporate 셀.
- SOC 매체의 1 mL을 추가 하 고 1 h 30 ° c.에 대 한 그들을 성장 하 여 변형 된 세포를 구출
- 파운드에 셀의 100 µ L 플레이트 + 앰프 플레이트와 하룻밤 30 ° C에서 세포를 성장.
- 관 저항 BL21ΔABCF 긴장 electrocompetent를 확인 합니다.
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재결합의 유도
- 선택 단일 식민지 파운드 + 앰프에서 접시 하 고 접종 신선한 파운드 모든 항생제를 생략.
- FLP recombinase의 표현을 유도 하룻밤 비 허용 온도 (43 ° C)에서 세포 성장.
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Recombinants 선택
- 직렬 희석 하 고 만들고, 비 선택적 접시에 105-106 희석의 50 µ L 플레이트 하룻밤 30 ° c.에서 그것을 성장합니다
5입니다. 유전자 삭제 확인
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플라스 미드 손실 및 성공적인 재결합의 확인
- 격판덮개에서 행진 한 식민지 파운드 + 칸, 파운드 + 앰프, 그리고 파운드에 4.3.1 단계에서이 순서로 항생제 없이 접시 준비. 줄무늬에 투입, 식민지 표 사용 하 여 ( 보충 파일 1참조). 식민지 (~ 24 h)이 나타날 때까지 30 ° C에서 번호판을 성장.
- 비 선택적 접시에 성장 하지만 추가 확인에 대 한 선택적 미디어에 성장 하지 못했습니다 10-20 클론을 선택 합니다.
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식민지 PCR에 의해 추가 확인
- 식민지 PCR 뇌관 순서 코딩 타 마 측면으로 수행 ( 재료의 표참조).
- 마스터 PCR 혼합을 준비 합니다. 필요 믹스 ( 표 1의 예를 참조) 테스트 하는 식민지의 수에 따라 다릅니다. 얼음에 시 약을 혼합, 마지막에 중 합 효소를 추가 합니다.
- 철저 하 게, PCR 마스터 믹스를 섞어 다음 20 µ L를 PCR 스트립의 튜브로 분배. 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 상영 될 각 식민지의 작은 금액을 선택 하 고 튜브를 추가. 비교를 위해 원래 받는 사람 긴장을 포함 하도록 하십시오. 선택적으로, 기증자 스트레인 포함.
- PCR 반응 실행 (사용 하는 프로그램에 대 한 표 2 참조).
- 1 %agarose 젤 준비.
- 50ml 젤 agarose의 0.5 g을 측정 하 고 태 버퍼 (40 m m Tris, 20 mM 아세트산 그리고 1 mM EDTA, pH 8.0) 50 mL를 추가 합니다. 모든 agarose 해산 했다 때까지 렌지에 혼합물을 열.
- agarose 해산 했다, 일단 약 50 ° C에 대 한 해결책을 냉각 하 고 염료를 착 색 하는 DNA의 5 μ를 추가 합니다. 솔루션을 잘 혼합 하 고 주조 챔버에 젤 트레이에 부 어. 분자 크기 마커 뿐만 아니라 모든 샘플에 대 한 충분 한 웰 스는 잘 빗의 하나 이상의 행을 삽입 합니다. 30 분 설정 하 젤을 허용 합니다.
- PCR 실행 완료 되 면 각 샘플을 DNA 로드 염료 x 6의 4 µ L를 추가 합니다. 젤 전기 이동 법 챔버에 배치 하 고 우물 덮여 때까지 태 버퍼를 추가 합니다.
- 젤에 잘 각 PCR 반응에서 10-15 µ L를 적용 합니다. 또한 분자 크기 마커의 5 µ L를 추가 합니다. 그런 다음 75 V에서 30 분 동안 젤을 실행 합니다.
- 실행 완료 되 면 젤 블루 빛 영상 장치를 사용 하 여 이미지.
6. 기타 기술
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단백질 표정
참고: 테스트 단백질 (YadA와 EibD)의 표현 되었습니다23,24다른 곳에서 상세히 설명. 이것은 주요 단계에 대 한 간단한 요약입니다.- BL21ΔABCF Δ타 with 필요한 플라스 미드 (pIBA2-쫑 알, pEibD10 및 해당 제어 플라스 미드)를 변환 하 고 transformants 파운드 + 앰프에 대 한 선택.
- 단백질 표정에 대 한 변형 된 박테리아의 숙박 문화의 1 mL와 함께 파운드 매체 + 앰프의 100 mL를 접종 하 고 30 ° C에서이 시간에 중간 로그 단계까지 성장, (100 ng/mL)에서 어느 anhydrotetracycline와 단백질 생산을 유도 하거나 이소프로필 thiogalactoside (0.5 m m).
- 30 ° C에서 유도의 2 h 문화의 탁도 측정 하 고 OD600 에서 50 mL에 해당 하는 셀의 수를 수집 후 4000 x g에서 15 분 동안 문화 centrifuging 여 1.0 =. 펠 릿을 세척 1 x 10 mm HEPES, pH 7.4, 그리고 중-20 ° C 또는 프로세스 단계 6.2 에서처럼 추가 저장.
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외부 막 추출
참고: 외부 막 추출 레오 외 에 의해 세부 사항에 설명 된 대로 수행 됩니다. 27. 주요 단계 아래 요약 되어 있습니다.- 10 mm HEPES, pH 7.4, resuspend 1 mL에 셀 펠 릿 10 mM MgCl2 , MnCl2, lysozyme (0.1 mg/mL), 및 DNase의 핀치 나 보충.
- (예를 들어, 구슬 때리는 사용 하 여) 셀 lyse
- 세포 파편을 제거 하 고 신선한 튜브에는 상쾌한 이동 곧 셀 (15,600 x g2 분)을 원심.
- 16000 x g에서 30 분 동안 셀 후 원심, 10 mM HEPES, pH 7.4에에서 1% N lauroyl sarcosine의 400 μ에 펠 릿을 resuspend.
- 실 온에서 30 분 동안 교 반 후 셀을 품 어, 위와 같이 30 분 동안 원심.
- 세척은 반투명 1 x 10 mm HEPES, pH 7.4, 200 μ와 작은 10 mm HEPES 30 μ에 resuspend 그리고 SDS 페이지 샘플 버퍼 x 4의 10 μ를 추가.
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활동 분석 실험
참고: 설명28YadA와 EibD에 대 한 SDS 페이지 및 활동 분석 실험을 수행 합니다. 주요 단계는 아래에 요약 된다. -
SDS 페이지
- 단백질을 변성 시키기 방지 하려면 polyacrylamide 젤에 그들을 로드 하기 전에 5 분 동안 50 ° C에서 샘플을 열.
- SDS 페이지에서 분리 후 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 단백질을 전송 합니다.
- 송금 후 PBS에 2% 무 지방 우유 파우더 막을 차단 합니다.
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뭐라 나 콜라겐 멀리 서쪽 오 점
- 차단, 후 10 μ g/mL의 농도에 블로킹 버퍼에 소 콜라겐 유형 나 희석을 추가 하 고 1 시간에 대 한 막 품 어.
- 막 2 워시 x PBS + 0.05 %Tween20 (PBS-T).
- 블로킹 버퍼에 막에 1 차적인 항 체 (단일 클로 널 항 콜라겐 COL-1), 희석된 1:2,000를 추가 합니다.
- 잠복기 1 h 막, 후 6.3.2.2 단계에서 언급 한 대로 2 배를 세척 하 고 이차 항 체 [염소 반대로 마우스 IgG-양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 켤레], 희석된 1:10,000 블로킹 버퍼에 추가 합니다.
- 1 시간에 대 한 막 품 어 다음 그것을 씻어 PBS. 2 x 향상 된 chemiluminescent 기판 제조업체의 지침에 따라 막에 추가 하 고 CCD 카메라를 사용 하 여 밴드를 감지.
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EibD IgG 바인딩 분석 결과
- 차단, 이차 항 체 (염소 안티 토끼 HRP), 희석 1:2,000 블로킹 버퍼에 추가 합니다.
- 1 시간에 대 한 막 품 어 다음 그것을 씻어 PBS 가진 2 x. 6.3.2.5 단계에서 언급 한 대로 chemiluminescent 감지를 수행 합니다.
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Representative Results
세대는 타 마 노크 아웃 BL21ΔABCF의의:
위에서 설명한 전략은 이전 BL21(DE3), 외부 막 단백질 생산을 위한 최적화 이며 BL21ΔABCF21라는 단백질 생산에 사용 되는 표준 실험실 긴장의 파생 긴장을 생산 하기 위해 사용 되었습니다. 이 긴장 풍부한 외부 막 단백질을 코딩 하는 4 개의 유전자를 부족 하 고, 따라서, 야생-타입 스트레인 보다 더 heterologously 표현된 외부 막 단백질을 생산할 수 있다. 베 레모는 TAA 속에 참여 하는 여부를 테스트 하려면 타 마 진이이 백그라운드에서 삭제 되었습니다.
P1 lysate 게이오 컬렉션 스트레인 JW4179, 칸 저항 카세트에 의해 코딩 시퀀스 타 유전자 (이전 전화 yftM)가 대체 어디에서 준비 되었다. 다음, 변환 실험 BL21ΔABCF 받는 사람 긴장으로 수행 했다. 후 두 칸 카세트의 절단에 대 한 선정 됐다 몇 칸 저항력이 식민지 획득 했다. FLP recombinase 인코딩 플라스 미드 pCP20이이 클론에 도입 되었고, 이후, 43 ° c는 항생제 선택의 부재에서 성장 하 여 완 치. 클론의 수 (이 pCP20의 마커) 앰프와 칸, 감도 대 한 검사 했다 그리고 둘 다에 민감한 여러 클론 했다. 이러한 식민지 PCR에 의해 확인 했다 뇌관 타 시퀀스를 코딩 하 고 타 마 유전자 삭제 성공적으로 했다 발견 측면 (그림 4)를 사용 하 여.
TAA 속에 타 마의 역할:
타 마 일부 클래식 autotransporters16 과 역 autotransporter intimin15의 속에 포함 될 표시 되었습니다. 타 다시의 속에 대 한 중요 여부를 테스트 하려면 BL21ΔABCF Δ타 마 두 테스트 단백질, Yersinia adhesin YadA와 대장균 Ig-바인딩 단백질 EibD 인코딩 하는 플라스 미드로 변형 되었다. 이 단백질이 대장균 에서 잘 표현 하 고 이전 연구23,28TAA 속에 대 한 모델로 사용 되었습니다 알려져 있습니다.
단백질 생산을 유도, 후 식 문화의 외부 막 분수는 고립 되었고 SDS-PAGE로 분석. 샘플 하지는 단백질의 trimerization를 설명 하기 위해 삶은 했다. trimers는 단위체 45 kDa (YadA)의 크기와 51 kDa (EibD) 예상 하는 반면 100 kDa 이상의 크기에서 실행 합니다. 식에서 BL21ΔABCF 및 BL21ΔABCF 사이 큰 차이가 관찰 되었다 Δ타 마, 비록 뭐라 Δ타 긴장 (그림 5A)의 다소 낮은 수준에서 생산 될 것으로 보인다. 그러나, 반대는 EibD에 대 한 경우에 나타납니다.
타 마의 부족 정확한 폴딩 또는 단백질의 영향을 줄 수 있는지 여부를 검사, ligands에 바인딩할 그들의 능력 테스트를 했다. 쫑 알, 대 한이 콜라겐 멀리 서쪽 오 점 (그림 5B)에 의해 달성 되었다. 쫑 알, 둘 다 긴장에 바인딩된 콜라겐 비슷한 수준에서 단백질이 정확 하 게 접힌 및 기능 시연. 마찬가지로, 두 개의 긴장에서 EibD의 IgG 바인딩 활동 상관 식 수준 (그림 4C). 이러한 결과 타 마 의 삭제는 없습니다 TAA 속에 중요 한 영향 적어도이 두 모델 다시에 대 한 보여 줍니다.
그림 1: 노크-아웃 excisable 항생제 카세트와의 세대. 노크 아웃 유전자, 생산에 대 한 관심 (이 예제에서 유전자 B)의 유전자 FRT 사이트에 의해 형벌 관 저항 카세트로 대체 됩니다. FRT 칸 카세트, 차례 차례로, 짧은 의해 형벌 이다 (~ 50 bp) 시퀀스 유전자 b.의 상류와 하류 지역에 동종의 뻗어 B 유전자의 코딩 순서 FRT 칸 카세트 λ에 의해 교환 되어 빨간 재결합. 이 작업을 수행 하는 일단 FRT 사이트 간의 사이트 재결합을 중재 합니다 FLP recombinase 도입 하 여 자체 칸 카세트를 제거할 수 있습니다. 이 최소한의 떠나 칸 카세트 excises (~ 100 bp) 시퀀스 B 소재 시에 흉터. 자세한 내용은 참조 바 바 외. 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: P1 변환에 의해 유전자 삭제. 기증자 (베이지색) 운반 (블루) 염색체 (노란색) 관심사의 유전자를 교체한 칸 카세트 스트레인. 기증자 P1 살 균 소 감염 이다. 살 균 소 생산 progenies의 많은 기증자 스트레인에 곱합니다. 대부분은 야생-타입 (레드 게놈), 하지만 일부 그 기증자 긴장 보다는 살 균 소 염색체 DNA (블루 게놈)의 일부를 포함 하는 페이지를 시험. 이들의 비율 칸 카세트 (노란색 게놈) 포함할 것 이다. 결국, 감염 된 주인 세포 lyses 고 매체에는 페이지를 해제 합니다. 이 lysate를 준비 하는 데 사용 됩니다. 변환 실험에서 받는 사람 부담 (밝은 파란색)은 감염 lysate 기증자 긴장에서 준비. 경우 소수에서 받는 transducing 페이지 (그림 참조) 칸 카세트를 들고에 의해 감염 됩니다. 칸 카세트에 인접 한 지역 동종 재결합을 받 다, 칸 카세트 위해 선택할 수 있는 칸에 저항력이 클론 인 생 대립 유전자를 대체 받는 사람 염색체에 통합 됩니다. FLP recombinase 치료할 수 있는 플라스 미드에 추가 짧은 흉터 시퀀스 (노란색으로 여기에 표시), 칸 구분 표현 형을 복제 되돌립니다는 떠나 칸 카세트 excises. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: P1 감염 후 접시의 예. 개별 플 라크와 접시는 (A)이이 패널 표시 합니다. (B)이이 패널 세미 confluent 접시를 보여줍니다. (C)이이 패널-감염 된 플레이트, 어디 거의 모든 박테리아는 살 균 소에 의해 lysed 되었습니다 보여줍니다. 일부 저항 식민지 가기 한 계층에서 성장 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 삭제 코딩 시퀀스 타 마 . TamA::kan 삭제 대립 유전자 변형 BL21ΔABCF에 P1 변환에 의해 도입 되었다. 칸 카세트, 흉터 시퀀스의 절단 후 (~ 100 bp)는 모두가 타 현장에 남아 있다. 이 측면에 서는 삭제 사이트 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 확인 되었다. 그것의 부모 긴장, BL21(DE3), BL21ΔABCF에 PCR 제품 코딩 시퀀스 (예상된 크기는 1.7 kilobase 쌍) 타 마 의 길이 제공 합니다. BL21ΔABCF, 어디 칸 카세트 excised 되었습니다, 제품 예상된 흉터 시퀀스에 해당 (145 bp). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 다시 마 삭제 변형에 의해 표현의. (A)이이 패널 다시 뭐라 (EibD) 및 벡터 제어 (pIBA2 및 pET22)를 표현 하는 세포에서 준비 하는 외부 막의 SDS 페이지를 보여줍니다. 변종 BL21ΔABCF 하 마 (ΔtamA) 부족의 파생 스트레인. (B)이이 패널 보여줍니다 YadA 샘플의 콜라겐 멀리 서쪽 오 점. 뭐라 나 샘플 및 pIBA2 컨트롤 패널 A 에서 PVDF 막에 옮겨 졌다 고 인 큐베이 팅 콜라겐 유형으로 나. 그들은 그때 반대로 교원 질 항 체를 조사 고 ECL에 의해 감지. (C)이이 패널 EibD 샘플에 대 한 항 체 바인딩 분석 결과를 보여 줍니다. EibD 샘플 및 pET22 컨트롤 패널 A 에서 PVDF 막에 전송 하 고 HRP 활용 된 이차 항 체와 알을 품 되었고 ECL에 의해 감지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 | 1 x 믹스 | 7 x 믹스 |
| PCR-등급 물 | 17 Μ L | 119 Μ L |
| 중 합 효소 버퍼 x 10 | 2 Μ L | 14 Μ L |
| 10 m m deoxyribonucleotide 믹스 | 0.4 Μ L | 2.8 Μ L |
| 100 µ M 앞으로 뇌관 | 0.2 Μ L | 1.4 Μ L |
| 100 µ M 역 뇌관 | 0.2 Μ L | 1.4 Μ L |
| Taq DNA 중 합 효소 | 0.2 Μ L | 1.4 Μ L |
| 총 | 20 Μ L | 140 Μ L |
표 1: 식민지 PCR 믹스 마스터. 믹스 상영 될 식민지의 수에 따라 다릅니다. 또한, 제어 반응 (원래 받는 사람 부담)를 준비 합니다. 예를 들어, 5 개의 복제품을 심사, 6 반응 필요, 컨트롤을 포함 합니다. 그것은 준비 하는 모든 샘플에 대 한 충분 한 PCR 믹스가 되도록 (반복 작은 pipetting 오류 증폭 pipetting) 추가 반응 가치가 있다. 이 예제에서는 7 x 믹스 (5 식민지, 1 제어, 그리고 1 추가 반응)을 준비 합니다.
| 단계 | 온도 | 시간 | 노트 |
| 1입니다. | 94 ° C | 3 분 | |
| 2입니다. | 94 ° C | 30 s | |
| 3입니다. | 50 ° C | 30 s | |
| 4입니다. | 70 ° C | 2 분 | 1 분/kb 증폭 될를 모아합니다 |
| 2 24 시간 단계에 반환 | |||
| 5입니다. | 70 ° C | 5 분 | |
| 6입니다. | 12 ° C | 영원히 | 마지막 보류 |
표 2: 식민지 PCR 프로그램.
보조 파일 1: 식민지 격자의 예. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
P1 변환 대장균에 유전자 삭제를 생성 하기 위한 빠르고, 강력 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 여기 BL21 파생 된 받는 사람에 게 케이오 기증자 스트레인에서 타 마 삭제 돌연변이 시험에 의해 증명 됩니다. 변환 프로세스의 주요 단계는 lysate는 시험의 생산, 자체 변환, 칸 저항 카세트의 절단 및 PCR에 의해 녹아웃의 확인. 총에서 과정 약 1 주일 소요 하며 확인에 대 한 최종 PCR를 제외 하 고 사용할 수 없는 분자 생물학 방법. 따라서, P1 변환 빨간 재결합 팽창한 노력 및 시간 λ와 경쟁할 수 있는 하 고 전통적인 마커 exchange mutagenesis 보다 훨씬 빠릅니다.
제시 프로토콜 매우 강력한 이며 많은 단계 수정에 대 한 수 있습니다. 그러나 있다,, 몇 가지 중요 한 매개 변수. P1 감염, 그것은 매체에 칼슘 이온을 추가 해야 합니다. 칼슘은 박테리아를 살 균 소의 흡착에 대 한 필요 하 고 매체에 충분 한 칼슘을 추가 하려면 실패 감염의 효율성을 크게 줄일 것 이다. 일부 박테리아 변종 BL21ΔABCF 하는 경향이 같은 CaCl221의 집계. 이러한 경우, CaCl 없이2, 곧 감염 전에 서 스 펜 션에 추가할 수 있는 박테리아를 성장 수 있습니다. 그러나, 좀 더 전통적인 종자에 대 한 10 m m CaCl2 부터 성장 매체에 포함할 수 있습니다.
반대로, 그것은 매체에서 변환 후 무료 칼슘을 제거 하는 것이 중요입니다. 시트르산 칼슘 이온의 chelator 이며 이러한 호스트 셀 P1의 흡착에 필요한 때문에 매체에서 자유로운 칼슘을 제거 방지 더 감염. 칼슘 제거 되지 않는 경우는 페이지 감염 됩니다 추가 문화, 최고 변환 효율 감소 및 최악의 경우는 transductants를 포함 하 여 전체 문화를 lysing 셀.
또 다른 중요 한 단계는 박테리아 플라스 미드 pCP20를 들고 경작 이다. pCP20는 온도 37 ° C 또는 더 높은;에서 복제 하지 않는 조건에 따라 복제 플라스 미드 따라서, 세포에서 플라스 미드를 설정 하려면이 플라스 미드와 외피 해야 30 ° C에서 (또는 낮은), pCP20의 복제에 대 한 허용 온도. PCP20 치료에 대 한 높은 온도 (43 ° C)이 사용 됩니다. 약간 긴장;이 온도에서 잘 성장 하지 않는다 이러한 경우, 플라스 미드 치료는이 온도에 다소 효율이 있을 것입니다 비록 37 ° C 충분 해야 합니다.
때 박테리아 항 생 감도 대 한 테스트를 도금, 판 줄무늬의 순서는 중요. 포함 하는 항생제에 먼저 줄무늬를 클론에 대 한 호출 하는 프로토콜 접시 그리고 마지막으로 비 선택적인 매체에. 이 방법에서는, 탐정 수 선택적 미디어에 성장의 부족 때문에 항 생 감도 있을 것입니다 고 보다는 물자의 잠재적인 부족을 접시에 전송. 프로토콜, 파운드 + 칸에 아무 성장 판 확인 칸 저항 카세트;의 절단 아니 성장 LB + 앰프에 접시 재조합 플라스 미드 pCP20;의 손실을 확인 종자는 파운드 플레이트 (선택 접시에 같은 줄이 실험에서 성장 하지 않았다)에 긍정적인 recombinants 포함 됩니다.
대부분의 다른 단계는 상당한 풍 압에 대 한 허용. 프로토콜에서 제시 하 고, BL21ΔABCF는 교양 30 ° C에이 긴장 37 ° c.에서 잘 성장 하지 않습니다. 그러나, 성장 결함 없이 대장균 변종 (를 제외 하 고 때 pCP20으로 변형) 37 ° C에서 경작 될 수 있습니다.
박테리아 감염에 대 한 사용의 수는 어느 정도 다양 한 수 있습니다. OD600 및 가능한 수 사이의 관계는 대략 세600 값 0.1과 1.0 사이의 선형 어디 전 약 108 cfu/mL와 ~ 109 cfu/mL을 후자에 해당. 그러나,이 관계는 어느 정도 문제의 변형, 성장 매체 및 기타 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 각 실험실과 긴장, 특히 나 값 계산에 대 한 OD600 와 가능한 수 사이의 관계를 설립 되어야 합니다 것이 좋습니다. 감염 실험에 사용 되는 박테리아의 수는 특히 중요 한, 그리고 109 cfu/mL 셀 밀도 문화에 실행 가능한 세포의 비율 사이 적당 한 타협은 초기 고정 단계를 나타냅니다. 실행 가능한 박테리아의 낮은 수 변환에 사용 되는 경우 페이지 수는 단순히 적절 하 게 조정 해야 합니다. 자체는 나도 어느 정도 다양 한 수 있습니다. 프로토콜 요청 MOI 값이 0.5, 0.1과 0.5 사이 아무것도 좋은 효율을 생성 한다. 0.5의 모이에서 박테리아를 페이지의 비율은 1:2 (즉, 박테리아의 수에 비해 페이지의 절반 수)입니다. 프로토콜에 예제에서 문화권의 OD600 은 1.0, 그리고 문화의 1 mL 변환; 사용 됩니다 따라서, 필요한 페이지의 수는 5 x 108. MOI 값이 0.5 감염의 높은 수준을 제공 하지만 야생-타입 (전염 성) 페이지까지 transducing 페이지를 압도적으로 변환의 효율성을 줄일 것 이라고 이중 감염 된 박테리아의 수를 감소 시킨다. Transducing 살 균 소와 전염 성 살 균 소 두 배 감염 세포 세포의 용 해, 따라서이 transductant 생존자의 수영장에서 제거 이어질 것 이다. 따라서, 0.5 나 초과 하지 해야 합니다.
프로토콜은 또한 몇 가지 바로 가기에 대 한 수 있습니다. Lysates 접시에서 준비 하는 대신 일부 작가 옹호 액체 중간29살 균 소 lysates 준비. 야간 보육 단계가 필요 하지 않습니다으로이 시간을 저장할 수 있습니다. 마찬가지로, lysate 페이지 titrating 하지 필요할 수 있습니다. 위에서 설명 했 듯이는 나는 매우 중요 한, 그리고 합리적인 효율성은 단순히 표준 1010 pfu/mL의 titer lysate 가정에 의해 달성 될 수 있다.
기술의 용이성에도 불구 하 고 P1 변환 보편적으로 적용 되지 않습니다 하 고 여러 조건이 유용 하 게 그것에 대 한 충족 되어야 합니다. 첫째, 선택 가능한 노크 아웃 대립 유전자와 기증자 스트레인 사용할 수 없습니다. 이 일반적으로 항생제 내성 카세트는 관심사의 유전자를 대체 삭제를 사용 하 여 수행 됩니다. 항생제 카세트 기반 유전자 노크 아웃 대장균 K12에 거의 모든 비-필수 유전자를 취재의 준비-사용 라이브러리 제공 게이오 컬렉션은 이와 관련, 특히 유용 합니다. 이 컬렉션은 대부분 대장균 변종 (즉, 대장균 코어 게놈의 성분)에서 발견 하는 보존된 유전자를 두드리는 특히 유용 합니다. 병원 성 대장균 의 독성 요인에와 같은 보다 적게 일반적인 유전자에 대 한 긴장 또는 드문 신진 대사 경로 유전자, 돌연변이 드 노 보를 만들 수 할 수 있습니다. 이러한 경우에 P1 변환 않을 수 있습니다 잘 선택 하는 방법. 필수 유전자 뿐만 아니라 돌연변이는 P1 저항30이어질, P1 감염, galU, 등에 필요한 유전자 P1 변환에 의해 삭제에 대 한 불 쌍 한 대상입니다. 특히, 게이오 컬렉션을 사용 하 여 다른 참고는 약간 긴장 타겟된 유전자의 이중 하나만 칸 저항 카세트8에 의해 중단 되었다 수행. 이러한 경우, 관심사의 유전자는 필수; 수 있습니다. 수 사관 같은 유전자8에 대 한 업데이트 된 주석을 확인 것이 좋습니다. 그러나, 이러한 억제를 감안할 때, P1 변환 수 있습니다 대부분 유전자의 삭제를 실험실 E. 콜라이 긴장. 예를 들어 BW25113와 BL21(DE3) 사이의 차이 작은 이며 소수의 단백질 코딩 유전자31만 영향을.
둘째, 그것은 받는 사람 긴장 작업 변환에 대 한 동종 재결합의 수 있어야 합니다을 강조 하는 것이 중요입니다. RecA 수 recombinase 부족 스트레인 따라서 수정할 수 없습니다이 방법으로. 이 모든 표준 복제 긴장, 등 DH5α, HB101, TOP10, XL-1 블루를 제외합니다. RecA recombinations 동일 펼쳐진 8 짧은 사이 중재할 수 혈압; 그러나, 높은 유사성의 더 긴 지역 증가 재결합 확률 크게32,33. 또 다른 문제, 특히 임상 대장균 변종, 긴 O-항 원 체인 P1, lipopolysaccharide34의 핵심 올리고 당에 대 한 수용 체를 마스크 수 있습니다. 받는 사람 스트레인에 대 한 이러한 요구 사항 외에 변환에 사용 되는 P1 스트레인 비르 돌연변이; 이어야 한다 이 돌연변이 전체 용균성 감염35필요 합니다.
세 번째 변환 기증자 및 받는 사람 긴장 사이 측면에 서 지역에서 높은 유사성으로 기 절 하는 유전자 영역에 있어야 그는 p 1의 경으십시오. 긴장 사이 synteny의 부족은, 칸 카세트 시퀀스 코딩 대상 유전자의 교체 수 있습니다 잘 실패, 측면에 서 영역의 내용에 차이. 따라서, P1-중재 유전자 삭제에 착수 하기 전에 조사 측면에 서 시퀀스는 동종 되도록 기증자와 받는 사람 긴장의 시퀀스를 확인 해야 합니다. 물론,이 변종 시퀀스 가능만 하다. 알 수 없는 시퀀스와 긴장, 경우 P1 변환은 측면에 서 지구에서 유전자 변환 등의 다른 문제를 일으킬 또는 실패 수 있습니다. P1은 DNA; 약 90 kilobase 쌍 transduce 수 있습니다. 대상 유전자 (예를 들어, 작은 삭제 또는 삽입) 주변 지역에서 유전자 내용에 차이가 있다면 그것은 가능성이 이러한 기증자 시퀀스에 복귀할 것 이다. 이 있을 수 있습니다 받는 사람 긴장의 표현 형에 의도 하지 않은 결과. 따라서, 가능한, 기증자와 받는 사람 주위에 관심사의 유전자의 시퀀스 해야 항상 비교 될 P1 변환 전에.
결론적으로, P1 변환 초기 노크 아웃 돌연변이 생성 한 후 종자의 수는 특정 유전자 녹아웃을 전송 하는 빠른 방법입니다. 기술은 그것의 한계는, 비록 편리 하 고 속도 구현 하기가 유전자 삭제의 다른 방법에 매력적인 대안. P1만 대장균, 일반적으로 그것의 사용을 제한 하는이 종에 있는 감염. 그러나, p 1의 일부 변종 개발 되었습니다 광범위 한 호스트 및 가족 내에서 Enterobacteriaceae, 다른 종과 심지어 일부 다른 γ-proteobacterial 종, 감염 수 이기는 하지만 감소 효율36, 37. Myxococcus xanthus, δ-proteobacterium, 대장균 에서 복제 된 DNA의 변환도 보고38되었습니다. 미래 실험에서이 이체 일반 변환 하 여 항생제 카세트 기반 유전자 삭제에 사용 하는 받는 사람 긴장의 범위를 확대 하기 위해 비르 돌연변이 증강 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
케이오 컬렉션 긴장 국가 유관 프로젝트 (검, 일본)에서 가져온: 대장균. 그의 지속적인 지원에 감사 더크 맺고 (생물 과학 부, 오슬로 대학교) 하 고. 이 작품은 노르웨이 젊은 연구원 부여 249793 (잭 C. 레오)의 연구 위원회에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
References
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