Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

إنتاج الجينات الحذف في الإشريكيّة القولونية بتوصيل P1 مع أشرطة الكاسيت المهربة مقاومة المضادات الحيوية

doi: 10.3791/58267 Published: September 1, 2018

Summary

وهنا يقدم بروتوكول لاستخدام الموجودة مسبقاً بنيات الحذف كاسيت مقاومة المضادات الحيوية كأساس لتحقيق طفرات الحذف في سلالات كولاي الأخرى. يمكن تعبئة هذه الطفرات الحذف وإدراجها في محور المقابلة من سلالة المستلم باستخدام توصيل عاثية P1.

Abstract

نهج أول دراسة مهمة الجينات غير معروف في البكتيريا خلق المغلوب هذا الجين. هنا، يمكننا وصف بروتوكول قوية وسريعة لنقل طفرات الجينات الحذف من سلالة الإشريكيّة القولونية واحد إلى آخر باستخدام توصيل المعمم مع عاثية P1. يتطلب هذا الأسلوب أن الطفرة تكون انتقائية (مثلاً، استناداً إلى اضطرابات الجينات باستخدام غرز كاسيت المضادات الحيوية). مثل هذه الأشرطة المضادات الحيوية يمكن تعبئتها من سلالة مانحة وأدخلت سلالة المستفيدة من تهم بسرعة وتوليد متحولة حذف جينات بسهولة. يمكن تصميم كاسيت المضادات الحيوية تشمل فلبس التعرف على المواقع التي تسمح بختان الإناث الكاسيت ريكومبيناسي الخاصة بالموقع لإنتاج المغلوب نظيفة مع تسلسل ندبة ~ 100-قاعدة-زوج-منذ فترة طويلة في الجينوم. إظهار البروتوكول بانقطاع الجين تاما الترميز عاملاً الجمعية المعنية في نشوء حيوي أوتوترانسبورتير، واختبار تأثير هذا المغلوب على نشوء حيوي ووظيفة هما أوتوترانسبورتير تريميريك أدهيسينس. على الرغم من حذف الجينات بتوصيل P1 قصوره، بسهولة وسرعة تنفيذه جعلها بديلاً جذاباً لأساليب أخرى لحذف الجينات.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نهج أول مشترك لدراسة وظيفة الجين هو أداء الطفرات المغلوب ومراعاة النمط الظاهري الناتج عن ذلك. وهذا يسمى أيضا علم الوراثة العكسي. بكتيريا كولاي كانت العمود الفقري للبيولوجيا الجزيئية للسنوات السبعين الأخيرة، أو حتى، بسبب السهولة في استزراع وبه الانقياد للتلاعب بالجينات1. وقد وضعت عدة أساليب لإنتاج الجينات الحذف في كولاي، بما في ذلك علامة تبادل الطفرات2،3 ، وفي الآونة الأخيرة، ريكومبينيرينج باستخدام λ الأحمر أو ET راك نظم4،5 , 6.

في نظام مستخدمة على نطاق واسع، وتحل محلها متواليات ترميز الجينات الفردية كاسيت مقاومة للمضادات الحيوية التي يمكن فيما بعد أن اقتطعت من5،كروموسوم7. يتم استبدال تسلسل الترميز، على سبيل المثال بكاسيت مقاومة كاناميسين (أساسه)، الذي يحيط به فلبس (حزب العمل الفيجي) الاعتراف بالمواقع المستهدفة (معاهدة سجل الأفلام) على كلا جانبي. يتم التعرف على مواقع FRT قبل recombinase حزب العمل الفيجي، الذي يتوسط جزئ خاصة بالموقع بين المواقع FRT مما يؤدي إلى حذف الكاسيت كان. وبهذه الطريقة، يمكن تحقيق حذف كامل لتسلسل الجين المعطى للترميز، تاركين وراءهم تسلسل ندبة الحد أدنى فقط من حوالي 100 قاعدة أزواج (bp) (الشكل 1).

فقط على مدى عقد من الزمان، وقد وضعت ما يسمى مجموعة كيو. هذه هي مكتبة بكتيرية استناداً إلى أحد مختبرات قياسية السلالة K12 كولاي ، حيث تم حذفها تقريبا جميع الجينات غير الضرورية على حدة بواسطة λ جزئ الأحمر7،8. وقد استنساخ ضمن هذه المجموعة كل تسلسل ترميز واحد استبداله كاسيت مقاومة كان المهربة. جمع كيو ثبت أن تكون أداة مفيدة للعديد من التطبيقات9. واحد مثل هذا الطلب هو إنتاج طفرات الحذف في سلالات كولاي الأخرى. يمكن تعبئة الكاسيت كان من استنساخ حذف معين قبل عموما ترانسدوسينج باكتيريوفاجيس، مثل P110،،من1112،،من1314. ثم يمكن استخدام أسهم بالعاثية أعدت من سلالة من هذا القبيل لتصيب مستلم سلالة كولاي من الفائدة، حيث تردد منخفض ولكن موثوق بها كان المنطقة المحتوية على كاسيت يمكن إدراجها في جينوم المتلقي من جزئ مثلى (الشكل 2). يمكن تحديد ترانسدوكتانتس للنمو عن طريق الوسائط التي تحتوي على أساسه. وفي أعقاب ذلك، إذا كان المطلوب هو إزالة كاسيت المقاومة للمضادات الحيوية، يمكن توفيره recombinase حزب العمل الفيجي إلى سلالة ترانسدوكتانت في ترانس. بعد علاج بلازميد المحتوية على حزب العمل الفيجي، الذي يحمل علامة مقاومة الأمبيسلّين (أمبير)، يتم فحص الحيوانات المستنسخة أساسه ومراعية لامبير ل، والختان الصحيح لتسلسل البرية من نوع الترميز وكاسيت كان يتم التحقق من قبل مستعمرة [بكر].

هنا، يقدم بروتوكول مفصلاً، تصف كل خطوة من الخطوات في إنتاج المغلوب سلالة كولاي استناداً إلى الاستراتيجية المبينة أعلاه. على سبيل مثال، يظهر حذف من الجينات تاما . بترميز تاما بروتين بيتا لبرميل غشاء خارجي الذي هو جزء من النقل والجمعية الوحدة النمطية (TAM)، الذي تشترك في نشوء حيوي لبعض البروتينات أوتوترانسبورتير وبيلي15،،من1617. ثم استخدم هذه السلالة المغلوب لدراسة تأثير الحذف تاما على نشوء حيوي هما أوتوترانسبورتير تريميريك أدهيسينس (TAAs) وأدهيسين واليرسينيا يادا كولاي الغلوبولين المناعي (Ig)-ملزمة "ﻷعمالهم عيبد" 18،19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-سلالات والبلازميدات

  1. السلالات البكتيرية
    1. استخدام سلالات BW25113 كولاي 5، JW4179 (BW25113 tamA::kan)7، BL21(DE3)20و BL21ΔABCF21. انظر الجدول للمواد للحصول على مزيد من المعلومات.
  2. باكتيريوفاجيس
    1. استخدام بالعاثية P1فير لتوصيل عامة. تخزين في بالعاثية أسهم سائلة مع بضع قطرات من كلوروفورم (راجع الخطوة 2، 2). للحصول على مزيد من المعلومات، راجع الجدول للمواد.
  3. البلازميدات
    1. استخدام البلازميدات التالية في هذا البروتوكول: pCP2022ويادا pIBA223pEibD1024. والبلازميدات التحكم، استخدم باسك-IBA2 و pET22b (انظر الجدول للمواد).
  4. ظروف النمو
    1. تنتشر البكتيريا في ليسوجيني مرق (رطل) متوسطة25 مع قوي يهز (180-200 لفة في الدقيقة) في 37 درجة مئوية أو 30 درجة مئوية في حالة BL21ΔABCF والسلالات التي تحتوي على pCP20.
    2. أداء بلازميد علاج في 43 درجة مئوية.
    3. لوسيلة متينة، وتكملة رطل مع أجار 1% (w/v).
    4. لاجار العلوي، الملحق رطل مع 0.7% أجار و 10 مم كاكل2 والاوتوكلاف المتوسطة. تستخدم شركة نفط الجنوب متوسطة للانتعاش بعد انهانسر26.
    5. استخدام التركيزات التالية للمضادات الحيوية: 100 ميكروغرام/مل لامبير و 25 ميكروغرام/مل لشخص

2-إعداد بالعاثية ليستي

  1. الإصابة بسلالة المانحين
    1. تنمو سلالة المانحة JW4197 في 5 مل متوسطة رطل تستكمل مع 10 مم كاكل2 وكان اختيارياً (25 ميكروغرام/مل) كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD600) ~ 1.0. قياس القيمة600 OD باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    2. جعل سلسلة تمييع المخزون بالعاثية P1 الموجودة في الأجل المتوسط ليبره: أوصى بتخفيف ما بين 10-3 إلى 10-7.
    3. ميكس 200 ميكروليتر من تعليق البكتيرية و 100 ميكروليتر من إضعاف بالعاثية معين في أنبوب الطرد المركزي 15 مل أو ما يعادلها. إعداد العديد من الأنابيب كتخفيف بالعاثية. احتضان هذه الأنابيب لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية دون المصافحة.
    4. إضافة ~ 3 مل أجار أعلى المنصهر (~ 50 درجة مئوية) وتستكمل مع 10 ملم كاكل2 للأنابيب وخلط المحتويات جيدا قبل فورتيكسينج الأنابيب قريبا، وصب الخلائط على لوحات رطل بريوارميد جعل الطبقات حتى.
    5. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. إعداد ليستي
    1. وفي اليوم التالي اختر لوحة مع نمو لويحات بالعاثية شبه المتلاقية. على لوحة شبه المتلاقية، حوالي نصف مساحة اللوحة من الواضح (الشكل 3).
    2. كشط الطبقة الأعلى أجار من صفيحة باستخدام حلقة تطعيم أو أداة مماثلة واجار أعلى في أنبوب الطرد مركزي. أضف 1 – 2 مل رطل وقطره من كلوروفورم ودوامه الأنبوب بشدة ل ~ 1 دقيقة إضافة كلوروفورم في غطاء دخان.
    3. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 15 دقيقة في 4000 x ز أو أسرع بيليه أجار والخلايا البكتيرية.
    4. نقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة، تجنب تحمل أكثر من أي حطام من بيليه. 2 إضافة قطرات كلوروفورم وتخزين في 4-10 درجة مئوية. إضافة كلوروفورم في غطاء دخان. لا تجمد بالعاثية ليستي كهذا سيؤدي إلى انخفاض كبير في عدد الجسيمات المعدية.
  3. تحديد عيار ليستي
    1. ينمو BW25113 في رطل وتستكمل مع 10 ملم كاكل2 في 37 درجة مئوية حتى تصل إلى الثقافة التطوير التنظيمي600 ~ 1.0.
    2. إعداد سلسلة تمييع بالعاثية في رطل (مثلاً، 10-6–10-9).
      ملاحظة: كن حذراً إلى بيبيت العينة من الجزء العلوي من ليساتي لتجنب نقل كلوروفورم لتخفيف.
    3. ميكس 200 ميكروليتر من تعليق البكتيرية و 100 ميكروليتر من إضعاف بالعاثية معين في أنبوب الطرد المركزي 15 مل أو ما يعادلها. إعداد العديد من الأنابيب كتخفيف بالعاثية. احتضان هذه الأنابيب لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية دون المصافحة.
    4. إضافة ~ 3 مل أجار أعلى المنصهر (~ 50 درجة مئوية) وتستكمل مع 10 ملم كاكل2 للأنابيب وخلط المحتويات جيدا قبل فورتيكسينج الأنابيب قريبا، وصب الخليط على لوحات رطل بريوارميد جعل الطبقات حتى.
    5. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    6. وفي اليوم التالي إحصاء عدد اللوحات (مناطق واضحة في حصيرة البكتيرية) لكل لوحة وحساب عيار من ليستي باستخدام الصيغة التالية:
      Equation 1
      على سبيل المثال: في لوحات مع تخفيف 10-7و 10-8و 10-9، هناك 231، 27، ولويحات 2، على التوالي. كما تم استخدام 100 ميكروليتر من كل تمييع للعدوى، وأن يتم التعبير عنها عيار كتشكيل اللوحة وحدات (بفو)/مل، عامل الطلاء هو 10. يتم إدخال هذه الأرقام في الصيغة:
      Equation 2
      وهكذا، عيار حوالي 2 × 1010 بالعاثية المعدية الجسيمات/مل.

3-توصيل P1

  1. إعداد الخلايا المتلقية
    1. تنمو سلالة المتلقي BL21ΔABCF في رطل استكملها بكثافة بصرية في 600 نانومتر (OD600) ~ 1.0. استخدام جهاز المطياف الضوئي قياس قيمة600 OD.
    2. حساب حجم بالعاثية ليستي اللازمة لتحقيق تعدد العدوى (وزارة الداخلية) في القيمة 0.5. لحساب وزارة الداخلية، تقدير عدد البكتيريا استناداً إلى OD600 للثقافة. افترض أن قيمة600 OD 1.0 يناظر ~ 109 زيمبابوي/مل. حساب حجم المطلوبة استناداً إلى عيار معروف.
      على سبيل المثال (استناداً إلى عيار حسابها في المثال بعد الخطوة 2.3.6):
      Equation 3
    3. إضافة كاكل2 إلى الثقافة المتلقية سلالة إلى 10 ملم، ومزيج. أخذ 1 مل الثقافة لتوصيل.
  2. توصيل المنفذ
    1. إضافة حجم المناسبة بالعاثية ليساتي إلى 1 مل ثقافة المتلقية (بما في ذلك كاكل2 في 10 ملم) المحسوبة في الخطوة 3.1.2 وتخلط بلطف.
      ملاحظة: احرص على "الماصة؛" العينة من الجزء العلوي من لتجنب نقل كلوروفورم إلى المزيج.
    2. بشكل ثابت في احتضان هذا المزيج لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. إيقاف العدوى عن طريق إضافة سترات الصوديوم، الأس الهيدروجيني 5.5، إلى 100 مم.
    4. الطرد المركزي البكتيريا (5,000 س ز 2 دقيقة) وإزالة المادة طافية، ثم ريسوسبيند عليها في 1 مل رطل جديدة تستكمل مع سترات الصوديوم 100 مم، الرقم الهيدروجيني 5.5.
    5. تغسل الخلايا أكثر مرتين كما في الخطوة 3.2.4 لضمان إزالة فاجيس الحرة والكالسيوم.
    6. ريسوسبيند البكتيريا في 1 مل رطل جديدة تستكمل مع سترات الصوديوم 100 مم، الرقم الهيدروجيني 5.5. احتضان هذه البكتيريا في 30 درجة مئوية ح 1 مع الهز (> 100 لفة في الدقيقة).
    7. تجمع البكتيريا بالطرد المركزي (5,000 س ز 2 دقيقة) وريسوسبيند لهم في ~ 100 ميكروليتر من رطل مع سترات الصوديوم 100 مم، الرقم الهيدروجيني 5.5.
    8. انتشار البكتيريا على صفيحة رطل وتستكمل مع كان في 25 ميكروغرام/مل وسترات الصوديوم 10 مم، الرقم الهيدروجيني 5.5، وتنمو البكتيريا في 30 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات (~ 24 h).
  3. تحديد ترانسدوكتانتس
    1. مرة واحدة قد نمت المستعمرات على لوحة التحديد، ريستريك لهم على أساسه + رطل للمستعمرات واحدة وينمو بمعدل 30 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات واحدة.

4-نسق الكاسيت كان

  1. التحول مع جزئ بلازميد
    1. جعل اليكتروكومبيتينت سلالة مقاومة لكان BL21ΔABCF.
      1. تنمو السلالة من مستعمرة واحدة في الطازجة رطل (5 مل) وتستكمل مع كان (25 ميكروغرام/مل) في 30 درجة مئوية حتى يصبح OD600 ~0.5 – 0.7.
      2. من هنا، القيام بالخطوات التالية عند 4 درجة مئوية أو على الجليد. الطرد المركزي البكتيريا (5,000 س ز لمدة 10 دقائق) وإزالة المادة طافية.
      3. أغسل بيليه الخلية مع الماء المقطر المثلج مرتين بتكرار الخطوة السابقة الطرد المركزي، وأخيراً، ريسوسبيند بيليه الخلية في 100 ميليلتر من المثلج والغليسيرول 10%.
    2. أن تهدئة 1 مم انهانسر الترعة على الجليد.
    3. إضافة pg 1 من بلازميد الحمض النووي (pCP20) إلى تعليق خلية ومزيج التعليق بلطف وأنه نقل إلى ومبومو انهانسر تبريد.
    4. تعيين اليكتروبوراتور إلى 1.8 كيلو فولت واليكتروبوراتي الخلايا.
    5. إنقاذ الخلايا المحولة بإضافة 1 مل من شركة نفط الجنوب المتوسطة وتزايد عليها ح 1 في 30 درجة مئوية.
    6. لوحة 100 ميليلتر الخلايا LB + أمبير لوحات وتنمو الخلايا عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. تحريض جزئ
    1. لوحة المستعمرات اختيار واحد من رطل + أمبير وتطعيم رطل جديدة مع حذف كل المضادات الحيوية.
    2. تنمو الخلايا في درجة الحرارة غير المتساهلة (43 درجة مئوية) بين عشية وضحاها للحث على التعبير عن حزب العمل الفيجي ريكومبيناسي.
  3. تحديد ريكومبينانتس
    1. جعل تخفيف المسلسل ولوحة 50 ميليلتر من5-10 106 إضعاف على ألواح غير انتقائية وأنها تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.

5-تحقق حذف الجينات

  1. التحقق من فقدان بلازميد وممارسو الناجحة
    1. الانتصارات المستعمرات واحدة من لوحات إعدادها في الخطوة 4.3.1 على أساسه + رطل + أمبير، رطل، ولوحات رطل دون المضادات الحيوية، بهذا الترتيب. للمساعدة في streaking، استخدم شبكة مستعمرة (انظر 1 ملف تكميلي). تنمو لوحات عند 30 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات (~ 24 h).
    2. اختيار 10 – 20 الحيوانات المستنسخة التي نمت على اللوحة غير انتقائية ولكن فشلت في النمو في وسائل الإعلام الانتقائي لمزيد من التحقق.
  2. إضافية للتحقق من مستعمرة [بكر]
    1. أداء مستعمرة [بكر] مع الإشعال المرافقة تاما الترميز تسلسل (انظر الجدول للمواد).
    2. إعداد مزيج PCR رئيسي. مقدار المزيج المطلوبة يعتمد على العدد المستعمرات لفحصها (انظر المثال في الجدول 1). مزيج الكواشف على الجليد، إضافة بوليميريز آخر.
    3. مزيج مزيج الرئيسي بكر جيدا، ثم الاستغناء عن 20 ميليلتر في أنابيب قطاع بكر. اختيار كمية صغيرة من كل مستعمرة فحص استخدام تلميح ماصة معقمة وإضافته إلى أنبوب. تذكر أن تدرج سلالة المستلم الأصلي للمقارنة. بشكل اختياري، وتشمل أيضا سلالة المانحين.
    4. تشغيل رد فعل بكر (انظر الجدول 2 للبرنامج المستخدم).
    5. تعد من 1% [اغروس] هلام.
      1. قياس 0.5 غرام من [اغروس] هلام 50 مل، وإضافة 50 مل من المخزن المؤقت تاي (40 مم تريس وحمض الخليك 20 مم 1 مم يدتا، pH 8.0). حرارة الخليط في فرن ميكروويف حتى قد حلت جميع [اغروس].
      2. مرة واحدة قد حلت [اغروس]، بارد الحل إلى ما يقرب من 50 درجة مئوية، ثم قم بإضافة 5 ميكروليتر من تلطيخ صبغ الحمض النووي. مزيج الحل جيد وأنه صب في علبة جل في غرفة صب. إدراج صف واحد أو أكثر من الامشاط جيدا حيث لا توجد آبار كافية لجميع العينات، فضلا عن علامات الحجم الجزيئي. السماح للهلام لمدة 30 دقيقة.
    6. بمجرد اكتمال تشغيل PCR، إضافة 4 ميليلتر من 6 × صبغ تحميل الحمض النووي لكل عينة. ضع الجل في قاعة التفريد وإضافة تاي المخزن المؤقت حتى يتم تغطية الآبار.
    7. تطبيق 10 – 15 ميليلتر من كل بكر كرد فعل لبئر في الهلام. أيضا إضافة 5 ميليلتر علامة الحجم الجزيئي. ثم قم بتشغيل جل لمدة 30 دقيقة في 75 الخامس.
    8. بمجرد اكتمال التشغيل صورة جل تستخدم تصوير الضوء الأزرق.

6-غير ذلك من التقنيات

  1. تعبير البروتين
    ملاحظة: قد تم التعبير عن اختبار البروتينات (يادا وعيبد)23،24ووصف بالتفصيل في مكان آخر. هذا ملخص موجز للخطوات الرئيسية.
    1. تحويل BL21ΔABCF Δث تاماايث والبلازميدات اللازمة (يادا pIBA2 و pEibD10 ووالبلازميدات التحكم المقابلة) وحدد ترانسفورمانتس رطل + أمبير.
    2. للتعبير البروتين، تطعيم 100 مل المتوسطة رطل + أمبير مع 1 مل ثقافة بين عشية وضحاها تحول البكتيريا وتنمو هذه في 30 درجة مئوية حتى سجل منتصف المرحلة، في الوقت الذي، والحث على إنتاج البروتين مع أما أنهيدروتيتراسيكليني (في 100 نانوغرام/مليلتر) أو الأيزوبروبيل ثيوجالاكتوسيدي (في 0.5 مم).
    3. بعد قياس التعكر الثقافات ح 2 الاستقراء عند 30 درجة مئوية، وجمع عدد من الخلايا المقابلة إلى 50 مل OD600 = 1.0 من سينتريفوجينج الثقافات لمدة 15 دقيقة في س 4,000 ز. أغسل بيليه x 1 مع 10 ملم حبيس، ودرجة الحموضة 7.4، ومن ثم أما تخزينها في-20 درجة مئوية أو العملية كذلك كما هو الحال في الخطوة 6، 2.
  2. استخراج الغشاء الخارجي
    ملاحظة: يتم استخراج الغشاء الخارجي كما هو موضح بالتفصيل قبل ليو et al. 27-فيما يلي موجز للخطوات الرئيسية.
    1. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل 10 مم حبيس، درجة الحموضة 7.4، تستكمل مع ملم 10 MgCl2 والحركة2، lysozyme (0.1 مغ/مل)، وقليل من الدناز أنا.
    2. الخلايا (مثلاً، استخدام الخافق حبة).
    3. الطرد المركزي الخلايا قريبا (2 دقيقة في س 15,600 ز) إزالة الحطام خلية وتحريك المادة طافية على أنبوب جديد.
    4. الطرد المركزي الخلايا لمدة 30 دقيقة في س 16,000 ز، بعد ذلك، ريسوسبيند بيليه في ميكروليتر 400 من 1% N-لوريل ساركوسيني في 10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.4.
    5. احتضان الخلايا مع الإثارة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، بعد ذلك، الطرد المركزي لهم لمدة 30 دقيقة كما ذكر أعلاه.
    6. أغسل بيليه x 1 مع 200 ميكروليتر من 10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.4، شفافة وثم ريسوسبيند أنه في 30 ميكروليتر من 10 ملم حبيس وإضافة 10 ميكروليتر من 4 × الحزب الديمقراطي الصربي صفحة نموذج المخزن المؤقت.
  3. فحوصات النشاط
    ملاحظة: إجراء فحوصات الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والنشاط يادا وعيبد ك وصف28. ويرد أدناه الخطوات الأساسية.
  4. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة
    1. الحرارة العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل تحميلها على جل بولياكريلاميدي، لتجنب يشوه البروتينات.
    2. بعد الانفصال في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، نقل البروتينات إلى غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن.
    3. بعد النقل، كتلة الغشاء مع مسحوق حليب منزوع الدسم 2% في برنامج تلفزيوني.
  5. وصمة عار في أقصى غرب يادا-الكولاجين
    1. وبعد تجميد، إضافة نوع الكولاجين البقري المخفف أنا في المخزن المؤقت لحظر لتركيز من 10 ميكروغرام/مل واحتضان الغشاء ح 1.
    2. يغسل الغشاء 2 x مع برنامج تلفزيوني + 0.05% Tween20 (برنامج تلفزيوني-T).
    3. إضافة جسم الأولية (COL الكولاجين المضادة [مونوكلونل]-1) للغشاء، والمخفف 1:2,000 في المخزن المؤقت لحظر.
    4. بعد حضانة الغشاء ح 1، يغسل 2 x كما هو مذكور في الخطوة 6.3.2.2 ثم قم بإضافة جسم الثانوي [الماعز الماوس المضادة IgG-الفجل البيروكسيديز (HRP) المتقارن]، المضيفين المخفف في المخزن المؤقت لحظر.
    5. احتضان الغشاء ح 1، ثم غسله x 2 مع برنامج تلفزيوني-ت. إضافة تعزيز الركيزة تشيميلومينيسسينت للغشاء طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة، والكشف عن الفرقة باستخدام كاميرا CCD.
  6. مفتش عيبد مقايسة الربط
    1. وبعد تجميد، إضافة تضعف جسم ثانوي (الماعز المضادة أرنب HRP)، 1:2,000 في المخزن المؤقت لحظر.
    2. احتضان الغشاء ح 1، ثم غسله x 2 مع برنامج تلفزيوني. تنفيذ الكشف عن تشيميلومينيسسينت كما هو مذكور في الخطوة 6.3.2.5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

جيل من تاما المغلوب من BL21ΔABCF:

وقد استخدمت سابقا الاستراتيجية المبينة أعلاه لإنتاج سلالة مشتقة من BL21(DE3)، سلالة مختبر قياسية المستخدمة لإنتاج البروتين، وهو الأمثل لإنتاج البروتين الغشاء الخارجي ودعا BL21ΔABCF21. ويفتقر إلى أربعة جينات الترميز للبروتينات الغشاء الخارجي وفيرة هذه السلالة، وبالتالي فهي قادرة على إنتاج البروتينات الغشاء الخارجي المعرب عنها أكثر هيتيرولوجوسلي من سلالة البرية من نوع. لاختبار ما إذا كانت تشارك تام في نشوء حيوي ﻷعمالهم، تم حذف الجين تاما في هذه الخلفية.

P1 ليستي أعد من سلالة جمع كيو JW4179، حيث يتم استبدال الجينات تاما (تسمى سابقا يفتم) الترميز تسلسل كاسيت مقاومة كان. ثم أجريت تجربة توصيل مع BL21ΔABCF كسلالة المتلقية. وتم الحصول على العديد من المستعمرات كان المقاوم، بعد اثنين اختيرت لختان كاسيت كان. PCP20 بلازميد، ترميز recombinase حزب العمل الفيجي، قد أدخلت هذه الحيوانات المستنسخة، والشفاء في وقت لاحق، بتزايد في 43 درجة مئوية وفي غياب اختيار المضادات الحيوية. تم فحص عدد من الحيوانات المستنسخة لحساسية لامبير (وعلامة على pCP20) وكان، وتم الحصول على استنساخ عدة حساسة على حد سواء. تم التحقق من هذه الحيوانات المستنسخة بمستعمرة [بكر] استخدام كبسولة تفجير المرافقة تاما الترميز تسلسل ووجد أن الجينات تاما قد حذفت بنجاح (الشكل 4).

الدور تاما في نشوء حيوي ﻷعمالهم:

قد ثبت أن تشارك في نشوء حيوي بعض أوتوترانسبورتيرس الكلاسيكي16 وال إينتيمين أوتوترانسبورتير معكوس15تاما. لاختبار ما إذا كان تاما أمر مهم لنشوء حيوي TAAs، تحولت BL21ΔABCF Δتاما مع البلازميدات ترميز البروتينات اختبار اثنين، أدهيسين واليرسينيا يادا وبروتين كولاي Ig-ملزمة عيبد. هذه البروتينات معروفة للتعبير عن جيدا في كولاي واستخدمت كنماذج لنشوء ﻷعمالهم حيوي في دراسات سابقة23،28.

بعد حفز إنتاج البروتين، كانت معزولة الكسور الغشاء الخارجي للثقافات التعبير وتحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. كانت المغلي العينات لا تثبت تريميريزيشن البروتينات. أرتب تشغيل في أحجام فوق 100 كاتشين، بينما يتوقع مونومرات أحجام كاتشين 45 (يادا) و 51 كاتشين (عيبد). ولوحظت أية اختلافات رئيسية بين مستويات التعبير في BL21ΔABCF و BL21ΔABCF Δتاما، على الرغم من أن يبدو يادا أن تنتج مستويات أدنى إلى حد ما في سلالة Δتاما (الشكل 5A). ومع ذلك، يبدو العكس الحال بالنسبة إييبد.

لفحص ما إذا كانت قد تؤثر عدم تاما للطي الصحيح أو النقل من البروتينات، تم اختبار قدرتها على ربط يغاندس. يادا، تم إنجاز هذا بوصمة عار أقصى غرب الكولاجين (الشكل 5 (ب)). يادا، في كلا سلالات، ملزمة الكولاجين مستوى مماثل، مما يدل على أن البروتين بشكل صحيح مطوية والوظيفية. وبالمثل، مفتش-ربط أنشطة عيبد في سلالات اثنين يرتبط بمستوى التعبير (الشكل 4). وتبين هذه النتائج أن حذف تاما ليس لديه تأثير كبير على نشوء حيوي ﻷعمالهم، على الأقل ليس لهذه TAAs نموذج اثنين.

Figure 1
رقم 1: جيل من طرق-الرافضة مع أشرطة الكاسيت المضادات الحيوية المهربة. لإنتاج الجينات تدق الرافضة، يتم استبدال جينات للفائدة (الجين B في هذا المثال) كاسيت مقاومة كان محاط بمواقع FRT. كاسيت أساسه معاهدة سجل الأفلام، بدوره، يحيط به قصيرة (~ 50 شركة بريتيش بتروليوم) تمتد من تسلسل مثلى لمناطق المنبع والمصب باء الجينات يتم تبادل الترميز تسلسل الجين ب للكاسيت أساسه معاهدة سجل الأفلام التي λ جزئ أحمر. حالما يتم ذلك، يمكن إزالة كاسيت كان نفسها بإدخال recombinase حزب العمل الفيجي، الذي سوف التوسط التثب خاصة بالموقع بين المواقع FRT. هذا اكسسيسيس في الكاسيت كان، ترك الحد الأدنى (~ 100 bp) ندبة في موضع ب تسلسل. لمزيد من التفاصيل، انظر بابا et al. 7- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: حذف الجينات بتوصيل P1. سلالة الجهة المانحة (بيج) يحمل كاسيت كان التي حلت محل الجين للفائدة (أصفر) على الصبغي (أزرق). هو إصابة الجهة المانحة مع عاثية P1. بالعاثية ضرب في إجهاد المانحين، إنتاج عدد كبير من نسلها. هي الأكثر البرية من نوع (الجينوم الحمراء)، ولكن جزء صغير يتم ترانسدوسينج فاجيس التي أدخلت جزء من المانحين سلالة كروموسوم بدلاً من بالعاثية الحمض النووي (الجينوم الأزرق). سوف تحتوي على نسبة من هذه الكاسيت كان (أصفر الجينوم). في نهاية المطاف، الخلية المضيفة المصابة ليسيس والنشرات فاجيس في المتوسط. وتستخدم هذه لإعداد. في تجربة توصيل، مصاب سلالة المتلقية (أزرق فاتح) مع أعدت من سلالة المانحين. في أقلية حالات، هو إصابة المستلم بالعاثية ترانسدوسينج تحمل كاسيت كان (الموضح هنا). إذا كانت المناطق المتاخمة للكاسيت كان يخضع ممارسو مثلى، كاسيت كان أدمجت في كروموسوم المتلقية استبدال اليل الذاتية، أسفر عن استنساخ المقاوم لكان يمكن تحديدها ل. إضافة recombinase حزب العمل الفيجي على بلازميد الشفاء منه اكسسيسيس الكاسيت كان، تترك فقط ندبة قصيرة تسلسل (يظهر هنا باللون الأصفر)، الذي يعود الاستنساخ للنمط الظاهري المراعية لكان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: أمثلة على لوحات بعد إصابة P1. (أ) هذا الفريق يظهر لوحة مع لويحات الفردية. (ب) هذا الفريق يظهر صفيحة شبه المتلاقية. (ج) يظهر هذا الفريق صفيحة الإفراط مصابة، حيث قد تم تفكيك تقريبا جميع البكتيريا واسطة بالعاثية. بعض المستعمرات مقاومة نمت خارج الطبقة العليا أجار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: حذف تاما الترميز تسلسل. اليل الحذف tamA::kan قدم إلى سلالة BL21ΔABCF بتوصيل P1. بعد الختان كان الكاسيت، تسلسل ندبة (~ 100 bp) كل ما تبقى في موضع تاما . تم التحقق من ذلك ببكر، استخدام كبسولة تفجير المرافقة في موقع الحذف. في BL21ΔABCF وفي سلالة الأم، BL21(DE3)، يعطي ال [بكر] منتج طول تاما الترميز تسلسل (الحجم المتوقع 1.7 كيلوبس أزواج). في BL21ΔABCF، حيث كانت قد اقتطعت الكاسيت كان، المنتج يتوافق مع تسلسل ندبة المتوقعة (145 شركة بريتيش بتروليوم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: التعبير عن TAAs من سلالة حذف تاما . (أ) هذا الفريق يظهر الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة الأغشية الخارجي إعداد من الخلايا الإعراب عن TAAs (يادا أو عيبد) وعناصر مكافحة ناقلات (pIBA2 و pET22). السلالات من BL21ΔABCF وبه السلالة مشتقة تفتقر تاما (ΔtamA). (ب) هذا الفريق يظهر اسطوانة أقصى غرب الكولاجين يادا العينات. يادا عينات وضوابط pIBA2 من الفريق ألف نقلوا إلى غشاء PVDF والمحتضنة مع نوع الكولاجين أنا. ثم كانوا سبر مع جسم الكولاجين المضادة والكشف عنها بواسطة القامة. (ج) هذا الفريق يظهر مقايسة ربط جسم لعينات عيبد. عينات عيبد وضوابط pET22 من الفريق ألف نقلت لغشاء PVDF والمحتضنة مع جسم ثانوي HRP مترافق وثم الكشف عنها بواسطة القامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كاشف 1 x ميكس 7 x ميكس
المياه PCR-الصف ميليلتر 17 119 ميليلتر
10 × بوليميريز المخزن المؤقت 2 ميليلتر 14 ميليلتر
مزيج ديوكسيريبونوكليوتيدي 10 ملم ميليلتر 0.4 ميليلتر 2.8
التمهيدي إلى الأمام 100 ميكرومتر ميليلتر 0.2 ميليلتر 1.4
100 ميكرومتر عكس التمهيدي ميليلتر 0.2 ميليلتر 1.4
بوليميراز "الدنا بوليميراز" ميليلتر 0.2 ميليلتر 1.4
المجموع 20 ميليلتر ميليلتر 140

الجدول 1: مستعمرة بكر سيد ميكس- مقدار مزيج يعتمد على العدد المستعمرات فحص. وبالإضافة إلى ذلك، تعد مراقبة رد فعل (سلالة المستلم الأصلي). على سبيل المثال، إذا كان الفحص استنساخ خمسة، يلزم ستة ردود الفعل، بما في ذلك عنصر التحكم. من الجدير إعداد فعل إضافي للتأكد من أن هناك ما يكفي مزيج PCR لجميع العينات (تكرار بيبيتينج تضخيم أخطاء بيبيتينج الصغيرة). في هذا المثال، إعداد مزيج 7 x (5 مستعمرات والتحكم 1، ورد فعل إضافي 1).

الخطوة درجة الحرارة الوقت وتلاحظ
1. 94 درجة مئوية 3 دقيقة
2. 94 درجة مئوية 30 s
3. 50 درجة مئوية 30 s
4. 70 درجة مئوية 2 دقيقة 1 دقيقة/كيلو بايت تضخيم، حتى الجولة
أرجع إلى الخطوة 2 24 مرات
5. 70 درجة مئوية 5 دقيقة
6. 12 درجة مئوية للأبد عقد نهائي

الجدول 2: مستعمرة [بكر] برنامج.

التكميلية ملف 1: مثال على شبكة مستعمرة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

توصيل P1 طريقة سريعة وقوية وموثوق بها لتوليد الجينات الحذف في كولاي. وهذا يتجلى هنا ترانسدوسينج متحولة حذف تاما من سلالة مانحة كيو إلى مستلم المستمدة من BL21. المراحل الرئيسية في عملية توصيل يتم إنتاج ترانسدوسينج ليستي، توصيل نفسها، وختان كاسيت المقاومة أساسه، والتحقق من المغلوب ببكر. في المجموع، العملية تستغرق حوالي أسبوع واحد ويتطلب لا طرق البيولوجيا الجزيئية التي ستستخدم، وبصرف النظر عن PCR النهائي للتحقق. وهكذا، توصيل P1 يمكن أن تتنافس في أنفقت الجهد والوقت مع λ جزئ أحمر وهو أسرع بكثير من الطفرات تبادل العلامة التقليدية.

البروتوكول قدم قوية جداً ويسمح لإدخال تعديلات على العديد من الخطوات. ومع ذلك، هناك عدد قليل من المعالم الهامة. للالتهابات P1، من الضروري إضافة أيونات الكالسيوم إلى المتوسط. الكالسيوم ضروري امتزاز بالعاثية بالبكتيريا، وسيقلص عدم إضافة الكالسيوم كافية إلى المتوسط كفاءة العدوى. بعض البكتريا سلالات مثل BL21ΔABCF تميل إلى تجميع حضور كاكل221. وفي مثل هذه الحالات، يمكن زراعة البكتيريا دون كاكل2، التي يمكن أن تضاف إلى تعليق قبل وقت قصير من العدوى. ومع ذلك، لسلالات أكثر تقليدية، يمكن تضمين 10 مم كاكل2 في المتوسطة النمو من البداية.

على العكس من ذلك، من المهم لإزالة الكالسيوم الحر من المتوسط بعد توصيل. سترات chelator أيونات الكالسيوم، ونظرا لأن هذه مطلوبة من أجل امتزاز P1 إلى الخلايا المضيفة، إزالة الكالسيوم الحر من الوسط يمنع زيادة الالتهابات. إذا لم تتم إزالة الكالسيوم، سوف تصيب فاجيس المزيد من الخلايا في جميع أنحاء الثقافة، وفي أحسن الأحوال التقليل من كفاءة توصيل وليسينج ثقافة كاملة، بما في ذلك ترانسدوكتانتس وفي أسوأ الأحوال.

يتم استزراع خطوة حاسمة أخرى تحمل pCP20 بلازميد البكتيريا. pCP20 هو بلازميد مشروط تكرار عدم النسخ المتماثل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية أو أعلى؛ وهكذا، إنشاء بلازميد في الخلايا، إينكوبيشنز مع هذا بلازميد يجب أن يكون تنفيذه في 30 درجة مئوية (أو أقل)، درجة حرارة متساهلة للنسخ متماثل pCP20. ويستخدم لعلاج pCP20، درجة حرارة عالية (43 درجة مئوية). بعض سلالات لا تنمو جيدا في درجة الحرارة هذه؛ في مثل هذه الحالات، ينبغي أن يكفي 37 درجة مئوية، على الرغم من أن علاج بلازميد ستكون إلى حد ما أقل كفاءة في درجة الحرارة هذه.

عند الطلاء البكتيريا لاختبار حساسية المضادات الحيوية، المهم ترتيب لوحة streaking. البروتوكول ويدعو الحيوانات المستنسخة أن السنة اللهب أثناء أولاً على المضادات الحيوية التي تحتوي على لوحات وأخيراً في المتوسط غير انتقائية. وبهذه الطريقة، يمكن أن يكون المحقق التأكد من أن أي نقص في النمو في وسائل الإعلام الانتقائي بسبب حساسية المضادات الحيوية، وبدلاً من عدم محتملة للمواد المنقولة على اللوحات. بعد على البروتوكول، أي نمو على رطل + كان لوح بالتحقق من صحة ختان كاسيت المقاومة كان؛ أي نمو على رطل + أمبير بالتحقق من صحة لوحة فقدان pCP20 بلازميد جزئ؛ وسيتضمن الضغوط المتزايدة على لوحة رطل (التي لم تنمو في نفس التجربة streaking على لوحات مختارة) ريكومبينانتس إيجابية.

معظم الخطوات الأخرى التي تسمح لفسحة كبيرة. في البروتوكول كما عرضت، BL21ΔABCF هو مثقف في 30 درجة مئوية، هذه السلالة لا تنمو جيدا في 37 درجة مئوية. ومع ذلك، قد مثقف سلالات كولاي دون عيوب النمو عند 37 درجة مئوية (باستثناء عندما تتحول مع pCP20).

العدد من البكتيريا التي تستخدم للالتهابات يمكن أن تختلف إلى حد ما. العلاقة بين التطوير التنظيمي600 وعدد قابلة للحياة خطية تقريبا بين قيمة600 OD 0.1 و 1.0، حيث يقابل السابقة إلى ما يقارب 108 زيمبابوي/مل وهذا الأخير إلى ~ 109 زيمبابوي/مل. ومع ذلك، قد تختلف هذه العلاقة إلى حد ما اعتماداً على السلالة المعنية والمتوسطة النمو، وعوامل أخرى. من المستحسن أن تنشأ العلاقة بين التطوير التنظيمي600 والعد قابلة للتطبيق لكل مختبر والسلالة، خاصة بالنسبة لحساب قيم موي. العدد من البكتيريا المستخدمة في التجارب العدوى ليست حاسمة بشكل خاص، وزيمبابوي9 10/مل يمثل المرحلة الأولى ثابتة، وحل وسط معقول بين كثافة الخلايا والنسبة من خلايا قابلة للحياة في الثقافة. إذا كان يتم استخدام عدد أقل من البكتيريا قادرة على البقاء لتوصيل، يحتاج عدد فاجيس ببساطة إلى تعديلها تبعاً لذلك. يمكن أيضا أن تختلف وزارة الداخلية نفسها إلى حد ما. ويدعو البروتوكول قيمة موي 0.5، على الرغم من أن أي شيء بين 0.1 و 0.5 ينبغي أن يؤدي كفاءة جيدة. في وزارة الداخلية 0.5، نسبة فاجيس للبكتيريا هي 1:2 (أي، نصف عدد فاجيس مقارنة بالعدد من البكتيريا). في المثال الوارد في البروتوكول، OD600 للثقافة هو 1.0، ويستخدم لتوصيل؛ 1 مل الثقافة وهكذا، عدد فاجيس المطلوب هو 5 × 108. قيمة موي 0.5 يعطي درجة عالية من الإصابة ولكن يقلل من عدد البكتيريا التي يصاب مضاعف، مما سيقلل من كفاءة توصيل ما يفوق فاجيس (المعدية) البرية من نوع فاجيس ترانسدوسينج. إصابة مزدوجة مع بالعاثية ترانسدوسينج وبالعاثيه معدية سيؤدي إلى خلية تفسخ، وبالتالي القضاء على هذا ترانسدوكتانت من التجمع للباقين على قيد الحياة. ولذلك، يجب عدم تجاوزها وزارة الداخلية 0.5.

كما يسمح البروتوكول لبعض الاختصارات. بدلاً من إعداد ليساتيس من لوحات، الدعوة بعض المؤلفين إعداد ليساتيس بالعاثية في المتوسط السائل29. هذا يمكن أن يوفر الوقت كما ليس هناك حاجة إلى خطوة احتضان بين عشية وضحاها. وبالمثل فإن المعايرة بالعاثية ليستي قد لا يكون ضروريا. وكما لوحظ أعلاه، وزارة الداخلية ليست حرجة للغاية، وكفاءة معقولة يمكن أن يتحقق بمجرد افتراض عيار 1010 بفو/مل لمعيار ليساتي.

وعلى الرغم من سهولة الأسلوب، توصيل P1 ليست قابلة للتطبيق عالمياً، ويجب استيفاء عدة شروط لكي تكون مفيدة. أولاً، يجب أن تكون سلالة المانحين مع اليل المغلوب اختيار متاح. ويتم ذلك عادة باستخدام حذف حيث حلت محل كاسيت مقاومة للمضادات الحيوية الجينات للفائدة. جمع كيو مفيدة بشكل خاص في هذا الصدد، كما أنها توفر مكتبة جاهزة للاستخدام من الجينات المضادات الحيوية على أساس كاسيت تدق الرافضة تغطي تقريبا جميع الجينات غير الضروري في K12 كولاي . هذه المجموعة مفيدة بشكل خاص لانقطاع المصانة الجينات الموجودة في معظم سلالات الإشريكيّة القولونية (أي، مكونات الجينوم الأساسية كولاي ). للجينات أقل شيوعاً، مثل عوامل الفوعة من الممرضة كولاي سلالات أو الجينات المسار الأيضي النادرة، أن الطفرة قد تحتاج إلى إنشاء حيثياته. وفي مثل هذه الحالات، قد لا تكون توصيل P1 الأسلوب المفضل. بالإضافة إلى جينات أساسية، الجينات المطلوبة للعدوى P1، مثل جالو، الطفرات التي تؤدي إلى مقاومة P130، أهداف الفقيرة لحذف بتوصيل P1. ملاحظة أخرى عند استخدام مجموعة كيو، على وجه التحديد، أن سلالات قليلة تحمل ازدواجية الجينات المستهدفة، حيث تعطلت نسخة واحدة فقط من كاسيت المقاومة كان8. في مثل هذه الحالات، قد تكون الجينات للفائدة الأساسية؛ للتحقق من تحديث شروح لمثل هذه الجينات8يوصي بالمحققين. ومع ذلك، ونظرا لهذه القيود، توصيل P1 يسمح حذف معظم الجينات في مختبر كولاي سلالات. على سبيل المثال، الاختلافات بين BW25113 و BL21(DE3) صغيرة وتؤثر على عدد قليل من الجينات ترميز بروتين31.

وثانيا، من المهم التأكيد على أن سلالة المستلم يجب أن تكون قادرة على التثب مثلى لتوصيل للعمل. سلالة تفتقر recombinase RecA يمكن، لذلك، لا يمكن تعديل بهذا الأسلوب. ويستثنى من ذلك جميع سلالات الاستنساخ القياسية، مثل DH5α، HB101، TOP10، وأزرق XL-1. يمكن التوسط RecA ريكومبيناتيونس بين الامتدادات متطابقة قصيرة قدر 8 بي بي؛ إلا أن منطقة أطول من التشابه عالية سوف يزيد من احتمال جزئ كبير32،33. هناك مشكلة أخرى، لا سيما مع السريرية كولاي سلالات، وهو أن فترة طويلة مستضد O سلاسل قد تخفي المستقبلات ل P1، التي تكمن في oligosaccharide الأساسية ليبوبوليساكتشاريدي34. وبالإضافة إلى هذه المتطلبات لسلالة المتلقية، ينبغي أن تكون سلالة P1 المستخدمة لتوصيل متحولة فير ؛ مطلوب هذه الطفرة ل إصابة الكاملة الحال35.

ثالثا التحذير من P1 توصيل أن الجينات أن خرج ينبغي أن يقيم في منطقة مع تشابه عالية في المناطق إطارية بين البلدان المانحة والمتلقية من سلالات. إذا كان هناك نقص في سينتيني بين السلالات، قد أيضا تفشل استبدال الجينات المستهدفة الترميز مع كاسيت كان تسلسل، نظراً للاختلافات في المحتوى للمناطق التي ترافقه. ولذلك، قبل الشروع في حذف P1 بوساطة الجينات، يجب التحقق المحققين في تسلسل السلالات الجهات المانحة والمتلقية التأكد من تسلسل ترافقه مثلى. وبطبيعة الحال، هذا ممكناً فقط إذا كان قد تم تعيين تسلسل السلالات. في حالة السلالات مع تسلسل غير معروف، توصيل P1 قد تفشل أو يسبب مشاكل أخرى، مثل تحويل جينات في المناطق التي ترافقه. يمكن ترانسدوسي P1 حوالي 90 من أزواج كيلوبس من الحمض النووي؛ إذا كانت هناك اختلافات في محتوى الجينات في المناطق المحيطة الجينات المستهدفة (مثلالحذف الصغيرة أو الملاحق)، فمن المحتمل أن هذه سوف تعود إلى تسلسل الجهات المانحة. وقد يكون لهذا عواقب غير مقصودة على النمط الظاهري لسلالة المتلقية. ولذلك، حيثما كان ذلك ممكناً، ينبغي دائماً مقارنة تسلسل المانح والمتلقي حول الجينات للفائدة قبل توصيل P1.

وفي الختام، توصيل P1 وسيلة سريعة نقل المغلوب جين معين إلى عدد من السلالات بمجرد أن الطفرة المغلوب الأولى قد تم إنشاؤها. على الرغم من أن هذه التقنية لها حدودها، بسهولة وسرعة تنفيذه جعلها بديلاً جذاباً لأساليب أخرى لحذف الجينات. إلا يصيب P1 كولاي، التي تقيد استخدامها عادة لهذه الأنواع. ومع ذلك، بعض المتغيرات من P1 قد وضعت التي لديها مجموعة مضيف الأوسع نطاقا، ويمكن أن تصيب الأنواع الأخرى داخل الأسرة انتيروباكتيرياسي، وحتى بعض الأنواع الأخرى من γ-بروتيوباكتيريال، أن كان ذلك في انخفاض كفاءة36، 37. حتى توصيل دنا مستنسخ من كولاي إلى إكسانثوس ميكسوكوككوس، بروتيوباكتيريوم-δ، تم الإبلاغ عن38. يمكن أن تزاد هذه المتغيرات في التجارب المقبلة، مع الطفرة فير توسيع نطاق المستلم السلالات المستخدمة في حذف الجينات المضادات الحيوية على أساس كاسيت بتوصيل عامة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم الحصول على سلالات مجموعة كيو من المشروع بيوريسورسي الوطني (رجال، اليابان): كولاي. ونحن نشكر "ديرك لينكه" (قسم العلوم البيولوجية، جامعة أوسلو) على دعمه المستمر. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث منحة النرويج الشباب الباحث 249793 (لجاك ليو جيم).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGG
ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATT
CTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171, (9), 4617-4622 (1989).
  3. Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179, (20), 6228-6237 (1997).
  4. Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
  5. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (12), 6640-6645 (2000).
  6. Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26, (5), 325-331 (2001).
  7. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  8. Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
  9. Baba, T., Huan, H. -C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, Clifton, NJ. 183-194 (2008).
  10. Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191, (17), 5549-5552 (2009).
  11. Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9, (4), 379-386 (2007).
  12. Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76, (5), 1035-1042 (2007).
  13. Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199, (16), (2017).
  14. Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14, (6), 237-246 (2008).
  15. Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8, (6), 1690-1705 (2016).
  16. Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, (5), 506-510 (2012).
  17. Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1, (7), 16064 (2016).
  18. Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46, (8-9), 1860-1866 (2009).
  19. Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305, (2), 252-258 (2015).
  20. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189, (1), 113-130 (1986).
  21. Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
  22. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, (1), 9-14 (1995).
  23. Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189, (24), 9011-9019 (2007).
  24. Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19, (7), London, UK. 1021-1030 (1993).
  25. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62, (3), 293-300 (1951).
  26. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, (4), 557-580 (1983).
  27. Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. Clifton, NJ. 157-167 (2015).
  28. Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194, (4), 827-838 (2012).
  29. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., et al. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M., et al. Chapter 1, Unit 1.17 (2007).
  30. Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38, (1), 189-191 (1969).
  31. Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394, (4), 644-652 (2009).
  32. Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291, (22), 11572-11580 (2016).
  33. Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, (14), 4768-4772 (1985).
  34. Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75, (4), 1661-1666 (2006).
  35. Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14, (1), 85-109 (1965).
  36. Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38, (4), 754-757 (1979).
  37. Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118, (3), 810-814 (1974).
  38. O'Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155, (1), 317-329 (1983).
إنتاج الجينات الحذف في <em>الإشريكيّة القولونية</em> بتوصيل P1 مع أشرطة الكاسيت المهربة مقاومة المضادات الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).More

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter