Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

可抽税抗生素耐药盒 P1 转导制备大肠杆菌中的基因缺失

Published: September 1, 2018 doi: 10.3791/58267
Automatic Translation
1, 1, 1
1Evolution and Genetics, Department of Biosciences, University of Oslo

Summary

在这里, 我们提出了使用预先存在的抗生素耐药性-盒式删除结构作为一个基础, 使删除突变体在其他大肠杆菌菌株。这种删除突变可以调动和插入到相应的受体菌株的位置使用 P1 噬菌体转导。

Abstract

第一种研究未知基因在细菌中的作用的方法是创建一个基因的敲除。在这里, 我们描述了一个健壮和快速的协议, 将基因缺失突变从一个大肠杆菌的菌株转移到另一个, 利用广义转导与噬菌体 P1。这种方法要求突变是可选择的 (例如,基于基因中断使用抗生素盒插入)。这种抗生素盒可以从捐献者的应变中调动出来, 并引入一个感兴趣的受体菌株, 迅速而容易地产生基因删除突变体。该抗生素盒可以设计为包括 flippase 识别网站, 允许通过特定地点的 recombinase 切除卡带, 以产生一个干净的敲出, 只有一个〜100基对长的疤痕序列在基因组。我们通过敲除 autotransporter 合成中涉及的一个装配因子的多摩基因来证明该协议, 并测试这一击出对两三联 autotransporter adhesins 合成和功能的影响。虽然 P1 转导基因的缺失有其局限性, 但其实施的简便性和速度使其成为其他基因缺失的一种有吸引力的替代方法。

Introduction

研究基因功能的一个共同的第一种方法是执行敲出诱变和观察结果表型。这也被称为反向遗传学。细菌大肠杆菌一直是分子生物学的主力, 在过去的70年左右, 由于它的培养和它的顺从的遗传操作1。在大肠杆菌中产生基因缺失的方法有好几种, 包括标记交换诱变2、3和最近的重组工程使用λ红色或 Rac ET 系统4,5,6。

在广泛使用的系统中, 单个基因的编码序列被一种抗生素耐药性盒取代, 以后可以从5、7号染色体中切除。编码序列被替换, 例如由卡那霉素 (菅直人) 抵抗卡带, 由 flippase (FLP) 识别目标 (首次登记) 站点在两边旁边。首次登记税的地点是由 recombinase FLP 认可的, 该处介导在首次登记税地点之间, 导致删除菅直人卡带的地点特定的重组。这样, 可以实现对给定基因编码序列的完全删除, 只留下大约100基对 (bp) 的最小疤痕序列 (图 1)。

就在十年前, 所谓的京王收藏被开发出来了。这是一个基于标准实验室大肠杆菌K12 菌株的细菌库, 几乎所有非必需基因都被λ红色重组7,8单独删除。此集合中的克隆每个都有一个编码序列, 替换为可抽税的坎电阻盒。在许多应用中, 京王系列已被证明是一个有用的工具9。其中一个应用是在其他大肠杆菌菌株中产生删除突变体。从一个给定的删除克隆的菅直人可以动员一般传感噬菌体, 如 P110,11,12,13,14。从这种菌株中制备的噬菌体可以用来感染受体大肠杆菌, 在低但可靠的频率下, 可以通过同源重组将菅直人盒包含的区域纳入受体基因组。(图 2)。Transductants 可以选择在含菅直人的培养基上生长。在此之后, 如果需要去除抗生素耐药性盒, FLP recombinase 可以提供给 transductant 菌株的反式。对含有氨苄西林 (amp) 抗性标记物的 FLP 质粒进行了筛选, 对其进行了筛查, 并对野型编码序列和菅直人盒的正确切除进行了菌落 PCR 验证。

在这里, 提出了一个详细的协议, 描述了根据上述战略生产出的大肠杆菌菌株的每一个步骤。作为一个例子, 一个删除的摩的基因是证明。多摩编码的外层膜β-桶蛋白是运输和组装模块 (TAM) 的一部分, 涉及某些 autotransporter 蛋白的合成和毛菌15,16,17。然后用这个敲出的菌株来考察多摩的删除对两个三联 autotransporter adhesins (TAAs)、合成耶尔森氏杆菌和大肠杆菌免疫球蛋白 (Ig) 结合黏附 TAA的影响。18,19。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 菌株和质粒

  1. 菌株
    1. 使用大肠杆菌菌株 BW251135, JW4179 (BW25113摩:: 菅直人)7, BL21 (DE3)20, BL21ΔABCF21。有关详细信息, 请参阅材料表。
  2. 噬菌体
    1. 使用噬菌体 P1vir的一般转导。将噬菌体储存在少量氯仿滴下的液体储存中 (见步骤 2.2)。有关详细信息, 请参阅材料表。
  3. 质 粒
    1. 在本协议中使用以下质粒: pCP2022、pIBA2-YadA23和 pEibD1024。作为控制质粒, 使用 pASK-IBA2 和 pET22b (见材料表)。
  4. 生长条件
    1. 在含有 pCP20 的 BL21ΔABCF 和菌株的情况下, 以剧烈震动 (180–200 rpm) 在37摄氏度或30摄氏度的溶源性肉汤 (磅) 培养基25中传播细菌。
    2. 进行质粒固化43摄氏度。
    3. 对于固体培养基, 补充 LB 与1% 琼脂 (w/v)。
    4. 对于顶琼脂, 补充 LB 与0.7% 琼脂和10毫米 CaCl2和高压釜的培养基。使用 SOC 介质进行电穿孔26后的恢复。
    5. 使用以下抗生素浓度: 100 微克/毫升为安培和25微克/毫升为菅直人。

2. 制备噬菌体裂解液

  1. 供体菌株感染
    1. 生长捐赠者应变 JW4197 在5毫升 LB 介质补充与10毫米 CaCl2和可选与菅直人 (25 µg/毫升) 到光学密度在600毫微米 (OD600) ~ 1.0。使用分光光度计测量 OD600值。
    2. 在 LB 介质中做一个现有 P1 噬菌体库存的稀释系列: 推荐的稀释介于 10-3到 10-7之间。
    3. 混合 200 ul 的细菌悬浮和 100 ul 的特定噬菌体稀释在15毫升离心管或同等。准备尽可能多的管作为噬菌体稀释。在37摄氏度处孵育20分钟, 不摇晃。
    4. 添加〜3毫升的熔融顶琼脂 (~ 50 °c) 补充10毫米 CaCl2的管, 混合的内容, 通过涡流的管很快, 并倒入 prewarmed LB 板上的混合物, 使均匀层。
    5. 在37摄氏度一夜之间孵化盘子。
  2. 裂解制剂
    1. 第二天选择一个有半汇合生长的噬菌体斑块的盘子。在半汇合板上, 大约一半的板块表面是清晰的 (图 3)。
    2. 使用接种回路或类似的工具从这样的盘子刮上琼脂层, 并将顶琼脂放在离心管中。添加一毫升的 LB 和一滴氯仿和漩涡的管大力1分钟. 在通风罩中加入氯仿。
    3. 离心管15分钟, 在 4000 x克或更快的颗粒的琼脂和细菌细胞。
    4. 将上清移至新鲜的离心管, 避免从颗粒中携带任何碎片。加入2滴氯仿, 在4–10°c 储存裂解液。在通风罩中加入氯仿。不要冻结噬菌体裂解物, 因为这将导致显著减少感染微粒的数量。
  3. 测定裂解液滴度
    1. 生长 BW25113 在 LB 补充与10毫米 CaCl2在37°c, 直到文化达到 OD600的 ~ 1.0。
    2. 准备一个稀释系列的噬菌体裂解液在 LB (例如, 10-6–10-9)。
      注意: 小心吸管从裂解液顶部取样, 避免将氯仿转移到稀释。
    3. 混合 200 ul 的细菌悬浮和 100 ul 的特定噬菌体稀释在15毫升离心管或同等。准备尽可能多的管作为噬菌体稀释。在37摄氏度处孵育20分钟, 不摇晃。
    4. 添加〜3毫升的熔融顶琼脂 (~ 50 °c) 补充10毫米 CaCl2的管, 混合的内容, 通过涡流的管很快, 并倒入 prewarmed LB 板上的混合物, 使均匀层。
    5. 在37摄氏度一夜之间孵化盘子。
    6. 第二天计算每个板块的斑块数量 (细菌垫中的清除区域), 并使用以下公式计算裂解液的滴度:
      Equation 1
      例子: 在板材与稀释 10-7, 10-8和 10-9, 分别有 231, 27 和2个匾。当 100 ul 每稀释被使用了为传染, 并且, 因为效价被表达作为斑块形成的单位 (pfu)/mL, 电镀因素是10。这些数字输入到公式中:
      Equation 2
      因此, 滴度是大约 2 x 1010传染性噬菌体粒子/毫升。

3. P1 转导

  1. 准备收件人单元格
    1. 增加接受者应变 BL21ΔABCF 在 LB 补充到光学密度在600毫微米 (OD600) 1.0。使用分光光度计测量 OD600值。
    2. 计算所需的噬菌体裂解液的体积, 以达到0.5 的感染多样性 (语言) 值。计算语言, 估计细菌数量的基础上600的文化。假设 OD600值1.0 对应于 ~ 109 cfu/毫升。根据已知的裂解液滴度计算所需的体积。
      示例 (基于在步骤2.3.6 后的示例中计算的效度):
      Equation 3
    3. 添加 CaCl2到接受菌株的文化, 以10毫米和混合。采取1毫升的文化进行转导。
  2. 执行转导
    1. 添加适当数量的噬菌体裂解到1毫升的接受者文化 (包括 CaCl2在10毫米), 计算在步骤3.1.2 和轻轻混合。
      注意: 小心把样品从裂解液的顶部移除, 避免将氯仿转移到混合物中。
    2. 静态孵化混合20分钟, 在37摄氏度。
    3. 通过添加柠檬酸钠, pH 值 5.5, 到100毫米停止感染。
    4. 离心的细菌 (5000 x g 2 分钟) 和清除上清, 然后并用重悬他们在1毫升的新鲜磅补充100毫米柠檬酸钠, pH 5.5。
    5. 在步骤3.2.4 中清洗细胞两次, 以确保去除游离噬菌体和钙。
    6. 并用重悬1毫升新鲜磅的细菌补充100毫米柠檬酸钠, pH 5.5。用震动 (> 100 rpm) 在30摄氏度孵化细菌1小时。
    7. 收集细菌的离心 (5000 x g 2 分钟) 和并用重悬他们在 100 ul 的 LB 与100毫米柠檬酸钠, pH 5.5。
    8. 在 LB 板上传播细菌, 辅以25µg/毫升和10毫米柠檬酸钠, pH 5.5, 并将细菌生长在30摄氏度, 直到菌落出现 (~ 24 h)。
  3. 选择 transductants
    1. 一旦殖民地生长在选择板块上, restreak 他们在 LB + 菅直人为单一的殖民地和增长30摄氏度, 直到单一的殖民地出现。

4. 切除菅直人卡带

  1. 重组质粒的转化
    1. 使抗 BL21ΔABCF 应变 electrocompetent。
      1. 生长菌株从一个单一的蚁群在新鲜磅 (5 毫升) 补充与菅直人 (25 µg/毫升) 在30°c, 直到 OD600是 ~ 0.5–0.7。
      2. 从这里, 执行以下步骤在4°c 或在冰上。将细菌 (5000 x g 10 分钟) 离心, 取出上清液。
      3. 重复先前的离心步骤, 并在100µL 的冰冷10% 甘油中并用重悬细胞颗粒, 用冰冷的蒸馏水冲洗两次细胞颗粒。
    2. 冷却1毫米电穿孔小试管在冰上。
    3. 在细胞悬浮液中加入 1 pg 质粒 DNA (pCP20), 轻轻混合悬浮液, 将其转移到冷电穿孔试管。
    4. 将 electroporator 设置为1.8 伏, 并 electroporate 单元格。
    5. 通过添加1毫升的 SOC 培养基, 并在30摄氏度的1小时内生长, 来抢救转化后的细胞。
    6. 板100µL 的细胞在 LB + 安培板和增长的细胞在30°c 过夜。
  2. 重组的诱导
    1. 从 lb + 安培板中挑选单一的菌落, 接种新鲜的 lb, 省略所有的抗生素。
    2. 在不允许的温度下 (43 摄氏度) 一夜之间生长细胞, 以诱导 FLP recombinase 的表达。
  3. 选择重组
    1. 使系列稀释和板材50µL 105-106稀释在非选择性板材和增长它隔夜在30°c。

5. 基因删除的验证

  1. 质粒丧失与成功重组的验证
    1. 在这一顺序中, 4.3.1 在 lb、lb、磅和无抗生素的 lb 板上进行的平板上的单菌落。要帮助裸奔, 请使用殖民地网格 (参见辅助文件 1)。将盘子生长在30摄氏度, 直到菌落出现 (~ 24 小时)。
    2. 选择在非选择性板上生长的10–20克隆, 但在选择性介质上无法生长以进行进一步的验证。
  2. 用菌落 PCR 法进行附加验证
    1. 执行一个群体 PCR 与引物侧翼的多重摩编码序列 (见材料表)。
    2. 准备一个主 PCR 组合。所需的混合量取决于要测试的菌落数 (参见表 1中的示例)。将试剂混合在冰上, 最后加入聚合酶。
    3. 将 pcr 大师组合彻底混合, 然后将20µL 放入 pcr 条的管中。选择一个小数量的每个殖民地使用不育的吸管提示, 并添加到管。请记住包含原始的收件人应变以进行比较。另外, 还包括捐助者的应变。
    4. 运行 PCR 反应 (见表 2所用的程序)。
    5. 准备1% 琼脂糖凝胶。
      1. 50毫升凝胶, 测量0.5 克琼脂糖和添加50毫升的泰缓冲器 (40 毫米三, 20 毫米醋酸, 1 毫米 EDTA, pH 值 8.0)。在微波炉中加热混合物, 直到所有琼脂糖都溶解。
      2. 一旦琼脂糖溶解, 冷却溶液约50摄氏度, 然后添加 5 ul 的 DNA 染色染料。把溶液搅拌好, 倒入浇注室的凝胶盘中。插入一个或多个行的好梳子, 以便有足够的水井为所有样品, 以及分子尺寸标记。允许凝胶设置为30分钟。
    6. 一旦 PCR 运行完成, 添加4µL 的 6x DNA 负载染料的每个样本。将凝胶放在电泳室中, 在井盖前加泰缓冲器。
    7. 应用10–15µL 从每个 PCR 反应到一个良好的凝胶。还添加5µL 的分子尺寸标记。然后, 在 75 v 上运行30分钟的凝胶。
    8. 一旦运行完成, 图像的凝胶使用蓝光成像仪。

6. 其他技术

  1. 蛋白表达
    注: 测试蛋白 (亚 EibD) 的表达在其他地方23,24被详细描述。这是对主要步骤的简要总结。
    1. 将所需的质粒 (pIBA2-YadA 和 pEibD10 及相应的控制质粒) 转换成 BL21ΔABCF Δ多摩 w, 并选择在 LB + Amp 上转化。
    2. 对于蛋白表达, 接种100毫升的 LB 中 + 安培与1毫升的一夜文化转化细菌和增长这些30°c, 直到中期记录阶段, 在这段时间, 诱导蛋白质生产与任何乳糖 (在 100 ng/毫升) 或异丙基-β-d (0.5 毫米)。
    3. 在 2 h 以后归纳在30°c, 测量文化的浊度和收集对应于50毫升的细胞在 OD600 = 1.0 通过离心文化为15分钟在 4000 x g。用10毫米 HEPES, pH 7.4, 然后将球团 1x, 然后将其存储在-20 摄氏度或进一步处理, 如步骤6.2。
  2. 外膜萃取
    注: 外膜萃取是由 Leo等详细描述的。27. 下面概述了主要步骤。
    1. 并用重悬细胞颗粒在1毫升10毫米 HEPES, pH 7.4, 补充10毫米氯化镁2和 MnCl2, 溶菌酶 (0.1 毫克/毫升), 和一捏 DNase i。
    2. 溶解细胞 (例如, 使用一个珠子搅拌器)。
    3. 将细胞尽快离心 (15600 x g2 分钟) 去除细胞碎片, 将上清移至新鲜管。
    4. 离心细胞为30分钟在 1.6万 x g, 在之后, 并用重悬颗粒在 400 ul 1% n-月桂肌氨酸在10毫米 HEPES, pH 7.4。
    5. 在室温下, 用搅拌30分钟孵育细胞, 然后将其离心30分钟以上。
    6. 清洗半透明颗粒1x 与 200 ul 10 毫米 HEPES, pH 7.4, 然后并用重悬它在 30 ul 的10毫米 HEPES 和添加 10 ul 4x SDS 页样本缓冲区。
  3. 活动化验
    注: 执行 SDS 页和活动化验为亚多和 EibD 如28所述。主要步骤概述如下。
  4. SDS 页
    1. 将样品加热50摄氏度5分钟, 然后再将其装入聚丙烯酰胺凝胶上, 以避免蛋白质变性。
    2. 在 SDS 页分离后, 将蛋白质转移到聚偏聚氟 (PVDF) 膜上。
    3. 转移后, 在 PBS 中用2% 脱脂奶粉堵住膜。
  5. 远西胶原蛋白印迹
    1. 阻断后, 加入牛胶原 i 型稀释在阻塞缓冲液中浓度为10微克/毫升, 并孵育膜1小时。
    2. 用 pbs + 0.05% Tween20 (pbs t) 冲洗膜2x。
    3. 将原抗体 (单克隆抗胶原 COL-1) 添加到膜中, 稀释 1:2, 000 在阻塞缓冲液中。
    4. 孵化后1小时的膜, 洗 2x, 如步骤6.3.2.2 中所述, 然后添加二次抗体 [山羊抗鼠 IgG-辣根过氧化物酶 (HRP) 共轭], 稀释1:10,000 在阻塞缓冲。
    5. 将膜孵化1小时, 然后用 PBS 清洗2x。根据制造商的指示, 在膜上添加增强的化学发光基板, 并使用 CCD 摄像机检测波段。
  6. EibD IgG 结合试验
    1. 阻断后, 添加二次抗体 (山羊抗兔 HRP), 稀释 1:2, 000 在阻塞缓冲。
    2. 将膜孵化1小时, 然后用 PBS 冲洗2x。执行步骤6.3.2.5 中提到的化学发光检测。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

多摩BL21ΔABCF 的产生:

上面概述的战略以前曾被用来生产 BL21 (DE3) 的衍生物菌株, 这是用于蛋白质生产的标准实验室菌株, 它被优化用于外膜蛋白生产, 并被称为 BL21ΔABCF21。这种菌株缺乏四基因编码的丰富的外膜蛋白, 因此, 能够产生更多的 heterologously 表达外膜蛋白比野生型菌株。为了测试 TAM 是否参与了 TAA 合成, 在这个背景下删除了摩的基因。

P1 裂解液是由京王收集应变 JW4179, 其中摩阻基因 (以前称为yftM) 编码序列被一个坎电阻盒取代。然后以 BL21ΔABCF 为受体菌株进行转导实验。获得了几个抗坎的殖民地, 在这之后, 两个被选为切除的菅直人卡带。该质粒 pCP20, 编码的 FLP recombinase, 被引入到这些克隆, 随后, 在没有抗生素选择的情况下, 生长在43摄氏度的情况下治愈。为了对两个放大器 (这是 pCP20 的标记) 和菅直人的敏感性, 筛选了一些克隆, 并获得了对两者都敏感的几个克隆。这些无性系经菌落 PCR 技术验证, 使用的是对摩数编码序列的引物, 发现该基因已成功删除 (图 4)。

摩 TAA 合成的角色:

在一些经典 autotransporters16和逆 autotransporter intimin15的合成中, 摩比已被证明参与其中。为了检验多摩对 TAAs 的合成是否重要, BL21ΔABCF Δ多摩是由两种检测蛋白、耶尔森氏杆菌和大肠杆菌结合蛋白 EibD 的质粒编码转化而成。已知这些蛋白在大肠杆菌中表达良好, 并被用作 TAA 合成的模型, 在早期研究23,28。

在诱导蛋白质生产后, 通过 SDS 页对表达培养的外膜组分进行分离和分析。这些样品没有煮沸来证明三聚的蛋白质。三聚体的尺寸在 100 kDa 以上, 而单体的尺寸为 45 kDa (亚) 和 51 kDa (EibD)。BL21ΔABCF 和 BL21ΔABCF δ摩中的表达水平没有显著差异, 但在δ摩(图 5A) 中, 亚比似乎在较低的水平上产生。然而, EibD 的情况似乎恰恰相反。

为了研究是否有摩的缺乏可能影响正确的折叠或运输的蛋白质, 他们的能力绑定到配体被测试。对于亚大, 这是由一个胶原蛋白的远西方印迹 (图 5B) 完成。在这两种菌株中, 胶原蛋白在相似的水平上, 表明蛋白质是正确的折叠和功能。同样, EibD 在两种菌株中的 IgG 结合活动与表达水平相关 (图 4C)。这些结果表明, 对 TAA 合成的删除没有显著的影响, 至少对这两种模型 TAAs 不起作用。

Figure 1
图 1: 可抽税抗生素盒产生的撞击声.为了产生基因敲出, 一个感兴趣的基因 (在这个例子中的基因 B) 被一个菅直人的抵抗磁带取代了首次登记税网站。而首次登记税-菅直人卡带则是由短 (约 50 bp) 与基因 B 的上游和下游区域同源的序列延伸而成。用λ红重组的方法, 将基因 B 的编码序列交换为首次登记。一旦完成这一任务, 就可以通过引入 FLP recombinase 来删除菅直人卡带, 这将调解首次登记税站点之间的站点特定重组。这切除了菅直人卡带, 留下了一个最小的 (100 bp) 疤痕序列在 B 轨迹。详细信息, 见巴比等。7.请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 2
图 2: P1 转导的基因缺失.捐献者的应变 (米色) 携带了一个菅直人磁带, 取代了基因的兴趣 (黄色) 的染色体 (蓝色)。捐献者感染了 P1 噬菌体。噬菌体在供体菌株中成倍增加, 产生了大量的后代。大多数是野生型 (红色基因组), 但一小部分是传感噬菌体, 已经纳入了一部分的捐赠者菌株染色体, 而不是噬菌体 DNA (蓝色基因组)。其中的一部分将包含菅直人磁带 (黄色基因组)。最终, 受感染的宿主细胞裂解并将噬菌体释放到培养基中。这些用于制备裂解液。在转导实验中, 受体应变 (浅蓝色) 感染了由捐献者应变制备的裂解液。在少数情况下, 接受者感染了传感噬菌体携带的菅直人磁带 (这里显示)。如果与菅直人相邻的区域进行同源重组, 则将菅直人盒并入接受者染色体中, 取代内源性等位基因, 从而导致可选择的抗菅克隆。在可固化质粒上添加 FLP recombinase 可以切除菅直人的卡带, 只留下一个短的疤痕序列 (这里以黄色显示), 这将克隆恢复到菅直人敏感的表型。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: P1 感染后板块的例子.(a) 此面板显示一个带有单独斑块的盘子。(B) 本小组显示一个半汇合板。(C) 这个小组显示了一个过度感染的板块, 几乎所有的细菌都被噬菌体裂解。一些抗性的菌落已经从上面的琼脂层中生长出来。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 删除了几摩的编码序列。BL21ΔABCF: 通过 P1 转导, 将菅直人的删除等位基因引入到菌株中。在切除的菅直人卡带后, 疤痕序列 (100 bp) 是所有留在摩的轨迹。这是通过 PCR 验证, 使用在删除站点侧翼的引物。在 BL21ΔABCF 及其母菌株 BL21 (DE3) 中, PCR 给出了多摩编码序列的长度 (预期大小为 1.7 kilobase 对)。在 BL21ΔABCF, 其中的菅直人卡带已被切除, 该产品对应于预期的疤痕序列 (145 bp)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: TAAs 的表达. (A) 本小组显示了由表达 TAAs 的细胞 (亚多亚或 EibD) 和矢量控制 (pIBA2 和 pET22) 制备的外层膜的 SDS 页。菌株为 BL21ΔABCF, 其衍生物菌株缺乏摩 (ΔtamA)。(B) 这个小组显示了一个胶原蛋白远西方的印迹样本。从面板A上的亚 pIBA2 的样品和控制, 转移到 PVDF 膜和孵化的胶原 i 型。然后, 他们用抗胶原抗体进行探测, 并通过 ECL 检测。(C) 本小组显示了 EibD 样品的抗体结合试验。EibD 样品和 pET22 控制从小组a被转移了到 PVDF 膜并且由 HRP 共轭二次抗体孵化, 然后由 ECL 检测。请单击此处查看此图的较大版本.

试剂 1x 混合 7x 混合
PCR 级水 17µL 119µL
10 x 聚合酶缓冲器 2µL 14µL
10毫米 deoxyribonucleotide 混合 0.4 µL 2.8 µL
100µM 前底漆 0.2 µL 1.4 µL
100µM 反向底漆 0.2 µL 1.4 µL
Taq DNA 聚合酶 0.2 µL 1.4 µL
总 20µL 140µL

表 1: 菌落 PCR 主组合.混合的数量取决于要筛选的菌落数量。另外, 准备一个控制反应 (原始的接受者劳损)。例如, 如果筛选五克隆, 需要六反应, 包括控制。这是值得准备一个额外的反应, 以确保有足够的 PCR 组合所有样品 (重复吹打放大小吹打错误)。在这个例子中, 准备一个7x 混合 (5 个殖民地, 1 控制和1额外的反应)。

步 温度 时间 笔记
1。 94°c 3分钟
2。 94°c 三十年代
3。 50°c 三十年代
4。 70°c 2分钟 放大1分钟/kb, 四舍五入
返回步骤 2 24 次
5。 70°c 5分钟
6。 12°c 永远 最终举行

表 2: 菌落 PCR 方案。

补充文件 1: 殖民地网格的一个例子.请单击此处下载此文件.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

P1 转导是一种快速、稳健、可靠的方法, 可在大肠杆菌中产生基因缺失。这在这里展示了传感一个摩中的删除突变从一个王庆会捐献者的应变 BL21-derived 接受。转导过程的主要阶段是传感裂解液的产生、转导本身、菅直人抗性盒的切除以及 PCR 的验证。总的来说, 这个过程需要大约1周的时间, 不需要使用分子生物学方法, 除了最终的 PCR 进行验证。因此, P1 转导可以在花费的努力和时间与λ红重组竞争, 比传统的标记交换诱变快得多。

所提出的协议非常健壮, 允许对许多步骤进行修改。但是, 有一些关键参数。对于 P1 感染, 有必要将钙离子添加到培养基中。钙是需要的, 以吸附噬菌体的细菌, 并没有添加足够的钙到培养基将大大降低感染的效率。一些细菌菌株如 BL21ΔABCF 在 CaCl221的存在下趋于聚集。在这种情况下, 细菌可以在没有 CaCl2的情况下生长, 在感染前不久就可以添加到悬浮液中。然而, 对于更常规的菌株, 10 毫米 CaCl2可以从一开始就包含在生长培养基中。

反之, 在转导后从培养基中去除游离钙是很重要的。柠檬酸盐是钙离子的离子螯合剂, 因为这些是 P1 对宿主细胞的吸附所必需的, 从培养基中去除游离钙可以防止进一步感染。如果钙不被去除, 噬菌体将感染更多的细胞在整个文化, 最好降低传导效率和最坏的株溶藻整个文化, 包括 transductants。

另一个关键步骤是培养携带质粒 pCP20 的细菌。pCP20 是一种有条件复制质粒, 在37摄氏度或更高的温度下不复制;因此, 要在细胞中建立质粒, 孵化必须以30摄氏度 (或更低) 的温度为 pCP20 的复制。对于固化 pCP20, 使用高温 (43 °c)。有些菌株在这种温度下生长不好;在这种情况下, 37 °c 应该是足够的, 虽然质粒固化将在这个温度下有点低效率。

当电镀细菌检测抗生素敏感度时, 平板裸奔的顺序是很重要的。该协议要求克隆首先在含抗生素的板块上进行条纹, 最后在非选择性培养基上进行。通过这种方式, 调查人员可以确定, 在选择性培养基上的任何缺乏增长都是由于抗生素敏感性, 而不是可能缺乏的材料转移到盘子上。根据该协议, LB + 坎板上的任何增长都不能验证菅直人电阻盒的切除;在 LB + 安培板上没有生长, 验证重组质粒 pCP20 的损失;在 LB 板上生长的菌株 (在选择板上没有生长在相同的裸奔实验中) 将含有积极的重组。

其他大多数步骤都允许有相当大的回旋余地。在所提出的协议中, BL21ΔABCF 的培养在30摄氏度, 因为这种菌株在37摄氏度的生长不太好。但是, 无生长缺陷的大肠杆菌菌株可培养为37摄氏度 (除与 pCP20 转化时除外)。

感染细菌的数量在某种程度上可以改变。od600和一个可行的计数之间的关系是大致线性之间的 od600值0.1 和 1.0, 前者对应于大约 10 8 cfu /毫升和后者到 ~ 109 cfu/毫升。然而, 这种关系可能在某种程度上取决于问题的应变、增长媒介和其他因素。建议在每个实验室和应变之间建立 OD600和可行计数之间的关系, 特别是计算教学语言的价值。在感染实验中使用的细菌数量并不特别重要, 109 cfu/毫升代表了早期的固定阶段, 这是细胞密度与培养中存活细胞比例之间的合理折衷。如果使用较低数量的活菌用于转导, 噬菌体的数量就需要相应地加以调整。教学语言本身也可以在一定程度上有所变化。该议定书要求0.5 的教学语言值, 尽管0.1 和0.5 之间的任何内容都应该产生良好的效率。在0.5 的教学语言中, 噬菌体与细菌的比值是 1:2 (即噬菌体的数量与细菌数量的一半)。在该议定书的例子中, 文化的 OD600是 1.0, 而1毫升的文化用于转导;因此, 所需的噬菌体数量是 5 x 108。0.5 的教学语言值具有较高的感染水平, 但减少了双重感染的细菌数量, 这将降低转导的效率, 因为野生型 (传染性) 噬菌体远远超过传感噬菌体。双感染传感噬菌体和传染性噬菌体将导致细胞裂解, 从而消除这 transductant 从幸存者池。因此, 不应超过0.5 的教学语言。

该协议还允许一些快捷方式。一些作者主张在液体培养基29中制备噬菌体裂解物, 而不是从盘子中制备裂解物。这可以节省时间作为一夜孵化步骤是不需要的。同样, 滴定噬菌体裂解可能没有必要。如上所述, 教学语言不是非常重要的, 可以通过简单假设一个标准裂解液的 1010 pfu/毫升的滴度来达到合理的效率。

尽管这种技术很容易, P1 转导并不是普遍适用的, 必须满足几个条件才能发挥作用。首先, 必须有一个可选择的敲出等位基因的捐献者应变。这通常是通过使用抗生素耐药性盒取代了感兴趣的基因的删除来完成的。在这方面, 京王的收藏特别有用, 因为它提供了一个现成的使用抗生素盒式的基因敲除在大肠杆菌K12 的几乎所有非必需基因的研究。这种收集对于排除大多数大肠杆菌菌株 (即大肠杆菌核心基因组的成分) 中发现的保守基因特别有用。对于不常见的基因, 如致病性大肠杆菌菌株的致病因子或罕见的代谢通路基因, 可能需要从头创建突变。在这种情况下, P1 转导很可能不是选择的方法。除基本基因外, P1 感染所需的基因, 如galU, 导致 P1 抵抗30的突变, 是 P1 转导删除的低目标。另一种说明, 当使用庆应王收集, 特别是, 是少数菌株携带的目标基因重复, 其中只有一个副本被中断的菅直人的电阻盒8。在这种情况下, 感兴趣的基因可能是必要的;建议调查员检查更新的注解, 为这些基因8。然而, 鉴于这些限制, P1 转导允许删除在实验室大肠杆菌菌株的大多数基因。例如, BW25113 和 BL21 (DE3) 之间的差异很小, 只影响了少数蛋白质编码基因31。

第二, 重要的是要强调, 接受者的应变必须有能力的同源重组的转导工作。因此, 缺乏 recombinase RecA 的应变可以不被这种方法修改。这排除了所有标准克隆菌株, 如 DH5α、HB101、TOP10 和 XL-1 蓝。RecA 可以调解起来预料之间的相同伸展短于 8 bp;然而, 一个较长的相似区域会增加32,33的重组几率。另一个问题, 特别是与临床大肠杆菌菌株, 是长 O 抗原链可能掩盖的受体 P1, 这是在核心寡糖的脂多糖34。除了对受体菌株的这些要求外, 用于转导的 P1 菌株应为vir突变体;这种突变是需要的全面裂解感染35。

P1 转导的第三个告诫是, 被淘汰的基因应该驻留在捐献者和受体菌株之间的侧翼区域高度相似的区域。如果菌株之间缺乏同线性, 则由于侧翼区域的内容不同, 将目标基因编码序列与菅直人磁带替换可能会失败。因此, 在开始 P1-mediated 基因删除之前, 研究者应该检查捐献者和受体菌株的序列, 以确保侧翼序列是同源的。当然, 这是唯一可能的, 如果菌株已经排序。对于一个未知序列的菌株, P1 转导可能会失败或导致其他问题, 如在侧翼区域的基因转换。P1 能传感器大约 90 kilobase 对脱氧核糖核酸;如果目标基因周围区域的基因含量有差异 (例如, 小的缺失或插入), 很可能会恢复到捐献者的序列。这可能会对受体的表型产生意想不到的影响。因此, 在可能的情况下, 在 P1 转导之前, 应始终将捐赠者和受体的序列与感兴趣的基因进行比较。

总之, P1 转导是一种快速的方式转移特定的基因敲出到一些菌株一旦初始的突变产生。尽管该技术有其局限性, 但其实现的易用性和速度使得它成为其他基因删除方法的一个诱人替代。P1 只感染大肠杆菌, 通常会限制它对这个物种的使用。然而, P1 的一些变种已经开发出来, 它们的寄主范围更广, 并且可以感染家庭杆菌中的其他物种, 甚至其他一些γ proteobacterial 物种, 尽管效率降低了36, 37. 甚至从大肠杆菌向Myxococcus xanthus(δ proteobacterium) 转导的克隆 DNA 也被报道了38。在未来的实验中, 这些变种可以增加与vir变异, 以扩大的受体菌株的范围内使用抗生素盒基基因删除的一般转导。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

京王收集菌株来自国家 BioResource 项目 ( 日本 ) :大肠杆菌。我们感谢德克左翼 (奥斯陆大学生物科学系) 继续提供支持。这项工作由挪威青年研究员补助金 249793 (对杰克. 里奥) 的研究理事会资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGG
ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATT
CTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
  3. Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
  4. Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
  5. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  6. Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
  7. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  8. Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
  9. Baba, T., Huan, H. -C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, Clifton, NJ. 183-194 (2008).
  10. Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
  11. Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
  12. Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
  13. Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
  14. Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
  15. Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
  16. Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
  17. Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
  18. Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
  19. Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
  20. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  21. Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
  22. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
  23. Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
  24. Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), London, UK. 1021-1030 (1993).
  25. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
  26. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  27. Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 157-167 (2015).
  28. Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
  29. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., et al. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 1, Unit 1.17 (2007).
  30. Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
  31. Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
  32. Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
  33. Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
  34. Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
  35. Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
  36. Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
  37. Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
  38. O'Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).

Tags

遗传学 问题 139 抗生素耐药性盒 删除诱变 FLP recombinase P1 转导 易位和组装模块 三联 autotransporter 黏附
可抽税抗生素耐药<em></em>盒 P1 转导制备大肠杆菌中的基因缺失
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J.… More

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter