Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

Published: September 1, 2018 doi: 10.3791/58267
Automatic Translation
1, 1, 1
1Evolution and Genetics, Department of Biosciences, University of Oslo

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

Abstract

בגישה הראשונה ללמוד את תפקוד ג'ין לא ידוע של חיידקים היא ליצור את מדהימה של הגן הזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול חזקה ומהירה להעברת מחיקה מוטציות מהמאמץ Escherichia coli אחד למשנהו באמצעות bacteriophage P1 שימוש התמרה חושית מוכללת. שיטה זו דורשת כי המוטציה להיות ניתן לבחירה (למשל, בהתבסס על הפרעות גנטי באמצעות קלטת לאנטיביוטיקה הוספות). קלטות לאנטיביוטיקה כזה יכול להיות גייסה מכל זן התורם מוחדרים זן הנמען עניין במהירות, בקלות ליצור מוטציה מחיקה ג'ין. ניתן לעצב בקלטת לאנטיביוטיקה כדי לכלול flippase זיהוי אתרים המאפשרים הכריתה של הקלטת על ידי recombinase בייעודי לאתר כדי לייצר את מדהימה נקי עם רק צלקת ~ 100-בסיס-זוג-ארוך רצף הגנום. אנו מדגימים את הפרוטוקול על ידי לדפוק את הגן של טאמה קידוד גורם הרכבה מעורב autotransporter להן, לבחון את השפעת הזה מעלף על להן והתפקוד של שני trimeric autotransporter adhesins. למרות המחיקה הגן על ידי התמרה חושית P1 יש מגבלות משלו, קלות ומהירות של יישומה להגיע חלופה אטרקטיבית בשיטות אחרות של ג'ין מחיקה

Introduction

גישה ראשונה משותפת ללמוד את הפונקציה של הגן הוא ביצוע מעלף מוטגנזה מכוונת ולבחון את פנוטיפ וכתוצאה מכך. זה נקרא גם גנטיקה הפוכה. חיידק e. coli כבר סוס עבודה של ביולוגיה מולקולרית במשך 70 השנים האחרונות, או אז, בגלל הקלות של culturing שלה, שלה amenability מניפולציה גנטית1. פותחו מספר שיטות כדי לייצר ג'ין מחיקות ב e. coli, כולל סמן exchange מוטגנזה מכוונת2,3 , לאחרונה, recombineering באמצעות λ אדום או Rac ET מערכות4,5 , 6.

במערכת בשימוש נרחב, קידוד רצף של גנים יחידניים מוחלפים קלטת עמידות לאנטיביוטיקה זה אפשר להוציא אחר כך5,של כרומוזום7. רצפי קידוד מוחלפים, למשל קלטת ההתנגדות kanamycin (קאן), אשר מוקף flippase (FLP) זיהוי אתרי היעד (והשפלתם) משני הצדדים. האתרים והשפלתם מזוהים על-ידי recombinase FLP, אשר שמתווכת בייעודי לאתר רקומבינציה בין האתרים והשפלתם שמוביל המחיקה של קלטת קאן. בדרך זו, פעולת מחיקה מלאה של רצף קידוד של גן מסוים יכולה להיות מושגת, משאיר מאחור רק צלקת מינימלית רצף של בסיסי כ-100 זוגות (bp) (איור 1).

רק לפני כעשור, פותחה האוסף קאיו כביכול. זוהי ספרייה חיידקי בהתבסס על מעבדה סטנדרטיים זן K12 e. coli , שבו כמעט כל הגנים שאינם חיוניים נמחקו בנפרד על ידי λ רקומבינציה אדום7,8. בתוך אוסף זה כל שלשיבוטים רצף קידוד אחד הוחלפו קלטת התנגדות ניתן לניתוח קאן. האוסף קאיו הוכיחה להיות כלי שימושי עבור יישומים רבים9. יישום אחד כזה הוא הייצור של מחיקה מוטציות בזנים אחרים e. coli . יכול להיות גייסה בקלטת קאן שיבוט נתון מחיקה מאת בדרך כלל transducing bacteriophages, כגון P110,11,12,13,14. מניה phage שהוכנו בכזה מתח יכול לשמש לאחר מכן להדביק את הנמען e. coli זן של עניין, איפה בתדר נמוך אבל אמין קן אזור המכילים קלטת ניתן לשלב לתוך הגנום הנמען מאת רקומבינציה הומולוגית (איור 2). Transductants ניתן לבחור את הצמיחה על המדיום המכיל קאן. בעקבות זאת, אם הסרת הקלטת עמידות לאנטיביוטיקה היא הרצויה, recombinase FLP יכולות להיות מסופקות המתח transductant טרנס. לאחר ריפוי של פלסמיד המכיל FLP, אשר נושאת סמן ההתנגדות אמפיצילין (אמפר), שיבוטים קאן לבין מגבר רגיש מוקרנים במשך ולאחר הכריתה הנכון של הרצף פראי-סוג קידוד ובקלטת קאן אומתו המושבה PCR.

. הנה, פרוטוקול מפורט מוצג, המתארת את כל השלבים בהפקת זן e. coli בהתבסס על האסטרטגיה שפורטו לעיל את מדהימה. כדוגמה, הוא הפגין מחיקה של הגן בתמ א . תמ א מקודד חלבון β-חבית של הממברנה החיצונית היא חלק של הובלה, הרכבה מודול (TAM), אשר עוסקת להן autotransporter חלבונים מסוימים, pili15,16,17. זן זה מעלף שימש אז כדי לבחון את ההשפעה של המחיקה תמ א על להן של trimeric autotransporter שתי adhesins (תעש), adhesin Yersinia את ידה של אימונוגלובולין e. coli (Ig)-מחייב TAA EibD 18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זנים, פלסמידים

  1. זני חיידקים
    1. השתמש e. coli זנים BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20, BL21ΔABCF21. ראה טבלה של חומרים למידע נוסף.
  2. Bacteriophages
    1. להשתמש את phage P1vir התמרה חושית כללי. לאחסן את phage כמו מניה נוזלי עם כמה טיפות של כלורופורם (ראה שלב 2.2). לקבלת מידע נוסף, ראה טבלה של חומרים.
  3. פלסמידים
    1. להשתמש את פלסמידים הבאים בפרוטוקול זה: pCP2022, pIBA2-בלה23, ו pEibD1024. כמו שליטה פלסמידים, להשתמש pASK-IBA2 pET22b (ראה טבלה של חומרים).
  4. תנאי הגידול
    1. הפצת חיידקים lysogeny מרק (LB) בינוני25 ברעידות נמרצת (180-200 סל ד) 37 ° C או 30 מעלות צלזיוס במקרה של BL21ΔABCF, זנים המכילים pCP20.
    2. לבצע פלסמיד ריפוי-43 מעלות צלזיוס.
    3. עבור מדיום מוצק, תוספת ליברות עם 1% אגר (w/v).
    4. עבור אגר העליון, תוספת ליברות עם-0.7% אגר ו- 10 מ"מ CaCl2 ו אוטוקלב המדיום. שימוש SOC בינוני ההתאוששות לאחר אלקטרופורציה26.
    5. השתמש הריכוזים הבאים על אנטיביוטיקה: μg/mL 100 אמפר ו 25 μg/mL עבור קאן.

2. הכנת Phage של Lysate

  1. זיהום של המתח התורם
    1. לגדול המתח התורם JW4197 ב 5 מ ל LB בינוני בתוספת 10 מ מ CaCl2 , באופן אופציונלי עם קאן (25 µg/mL) צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של ~ 1.0. למדוד את הערך600 OD באמצעות ספקטרופוטומטרים.
    2. להפוך סדרת דילול מניות phage הקיים P1 המדיום LB: מומלץ דילולים הן בין 10-3 כדי 10-7.
    3. ΜL מיקס 200 של המתלה חיידקי, 100 μL לדילול phage נתון צינור צנטריפוגה 15 מ"ל או שווה ערך. להכין צינורות רבים כמו phage דילולים. דגירה הצינורות כעשרים דקות ב 37 ° C ללא רועד.
    4. הוסף ~ 3 מ"ל של אגר מותכת העליון (~ 50 ° C) בתוספת 10 מ"מ CaCl2 עד הצינורות, לערבב התוכן ביסודיות על ידי vortexing הצינורות זמן קצר, שופכים את תערובות על גבי לוחות LB prewarmed כדי להפוך אפילו שכבות.
    5. דגירה הלוחות בן לילה ב 37 º C.
  2. הכנה lysate
    1. למחרת היום לבחור צלחת עם גידול confluent למחצה של phage הפלאק. על צלחת confluent למחצה, בערך חצי את פני השטח של הצלחת ברור (איור 3).
    2. לגרד את השכבה העליונה אגר מצלחת כזה באמצעות ללולאה חיסון או כלי דומה ולמקם את אגר העליון שפופרת צנטרפוגה. מוסיפים 1-2 מ ל LB טיפה של כלורופורם וב מערבולת הצינור נמרצות עבור מינימלית ~ 1 הוסף הכלורופורם בשכונה fume.
    3. Centrifuge את הצינור למשך 15 דקות ב 4000 x g או מהר יותר הצניפה אגר של תאים חיידקיים.
    4. להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge טריים, הימנעות נושא מעל כל פסולת בגדר. להוסיף 2 טיפות של כלורופורם ולאחסן את lysate ב 4 – 10 ° C. הוסף כלורופורם בשכונה fume. אין להקפיא את phage lysate כמו זה יגרום לירידה משמעותית של מספר חלקיקים זיהומיות.
  3. קביעת כייל את lysate
    1. לגדול BW25113 ב ק ג בתוספת 10 מ מ CaCl2 ב 37 ° C עד התרבות מגיע עם יתר600 של ~ 1.0.
    2. להכין סדרת דילול phage lysate ב ליברות (למשל, 10-6–10-9).
      הערה: להיות זהירים כדי pipet הדגימה מהחלק העליון של lysate כדי למנוע העברת כלורופורם דילולים.
    3. ΜL מיקס 200 של המתלה חיידקי, 100 μL לדילול phage נתון צינור צנטריפוגה 15 מ"ל או שווה ערך. להכין צינורות רבים כמו phage דילולים. דגירה הצינורות כעשרים דקות ב 37 ° C ללא רועד.
    4. הוסף ~ 3 מ"ל של אגר מותכת העליון (~ 50 ° C) בתוספת 10 מ"מ CaCl2 עד הצינורות, לערבב התוכן ביסודיות על ידי vortexing הצינורות זמן קצר, שופכים את התערובת על גבי לוחות LB prewarmed כדי להפוך אפילו שכבות.
    5. דגירה הלוחות בן לילה ב 37 º C.
    6. למחרת לספור את הפלאק (ברור אזורים המזרן חיידקי) עבור כל אחד מהלוחות ולחשב את כייל של lysate באמצעות הנוסחה הבאה:
      Equation 1
      דוגמה: על צלחות עם דילולים 10-7, 10-8ו 10-9, 231, 27, ויש 2 לוחות, בהתאמה. כפי μL 100 של כל דילול שימשו את הזיהום, ומכיוון כייל מבוטאת ויוצרים רובד יחידות (pfu) / mL, הגורם ציפוי הוא 10. מספרים אלו מוזנות לנוסחה:
      Equation 2
      לכן, כייל הוא כ 2 x 1010 phage זיהומיות חלקיקים/mL.

3. התמרה חושית P1

  1. הכנת התאים הנמען
    1. לגדול המתח הנמען BL21ΔABCF ב ק ג בתוספת צפיפות אופטית-600 nm (OD600) של ~ 1.0. להשתמש ספקטרופוטומטרים כדי למדוד את הערך600 OD.
    2. חישוב נפח phage lysate צורך להשיג את ריבוי של זיהום (MOI) ערך של 0.5. כדי לחשב את MOI, להעריך את מספר החיידקים בהתבסס על ה OD600 של התרבות. נניח כי ערך600 OD של 1.0 מקביל ~ 109 cfu/mL.... לחשב את אמצעי האחסון הדרושים בהתאם את כייל הידוע של lysate.
      דוגמה (מבוסס על כייל החישוב בדוגמה לאחר שלב 2.3.6):
      Equation 3
    3. מוסיפים CaCl2 לתרבות זן הנמען עד 10 מ"מ ומערבבים. קח 1 מ"ל של התרבות עבור התמרה חושית.
  2. ביצוע התמרה חושית
    1. להוסיף נפח מתאים של phage lysate 1 מ"ל של תרבות הנמען (כולל CaCl2 -10 מ מ) כפי שמחושבת בשלב 3.1.2 ומערבבים בעדינות.
      הערה: יש להיזהר pipette המדגם מהחלק העליון של lysate כדי למנוע העברה של כלורופורם לתערובת.
    2. דגירה באופן סטטי את התערובת למשך 20 דקות ב 37 º C.
    3. לעצור את הזיהום על-ידי הוספת סודיום ציטרט, pH 5.5, 100 מ מ.
    4. Centrifuge החיידק (5,000 x g למשך 2 דקות), הסר את תגובת שיקוע, לאחר מכן resuspend אותם ב- 1 מ ל LB טרי בתוספת 100 מ מ סודיום ציטרט, pH 5.5.
    5. לשטוף את התאים עוד פעמיים, כמו שלב 3.2.4 כדי להבטיח הסרת phages חינם וסידן.
    6. Resuspend החיידק ב 1 מ"ל של LB טרי בתוספת 100 מ מ סודיום ציטרט, pH 5.5. דגירה החיידק ב 30 ° C עבור h 1 ברעידות (> 100 סל"ד).
    7. לאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה (5,000 x g למשך 2 דקות), resuspend אותם בμl ~ 100 של ליברות עם 100 מ מ סודיום ציטרט, pH 5.5.
    8. התפשטות החיידקים בצלחת LB בתוספת קאן ב 25 µg/mL ו 10 מ מ סודיום ציטרט, pH 5.5, ולגדול החיידק ב 30 ° C עד מושבות יופיעו (~ 24 שעות).
  3. בחירה של transductants
    1. ברגע מושבות גדלו על הצלחת הבחירה, restreak אותם על ק ג + קן על מושבות יחיד ו לגדול ב 30 מעלות צלזיוס עד יחיד מושבות מופיעים.

4. excising את הקלטת קאן

  1. הטרנספורמציה עם רקומבינציה פלסמיד
    1. להפוך את electrocompetent זן עמיד קאן BL21ΔABCF.
      1. תגדל את זן מושבה בודדת ב- LB טריים (5 מ"ל) בתוספת קאן (25 µg/mL) ב 30 ° C עד ה OD600 ~0.5 – 0.7.
      2. מכאן ואילך, לבצע את הפעולות הבאות ב 4 ° C או על קרח. Centrifuge החיידק (5,000 x g 10 דקות) ולהסיר את תגובת שיקוע.
      3. לשטוף את צניפה תא עם קרח מים מזוקקים פעמיים על-ידי חזרה על השלב הקודם צנטריפוגה ו, לבסוף, resuspend תא גלולה ב 100 µL של גליצרול 10% קר כקרח.
    2. לקרר 1 מ"מ אלקטרופורציה וואקום על קרח.
    3. להוסיף עמוד 1 של פלסמיד דנ א (pCP20) התליה תא, לערבב בעדינות את המתלים, וכן להעביר אותו cuvette אלקטרופורציה מקורר.
    4. הגדר את electroporator 1.8 kV, electroporate התאים.
    5. הצלה טרנספורמציה תאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום SOC וגדל אותם עבור 1 h ב- 30 ° C.
    6. צלחת 100 µL של התאים ב- LB + מגבר צלחות ולגדול התאים ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. אינדוקציה של רקומבינציה
    1. מושבות פיק יחיד מ LB + Amp לוח, לחסן LB טריים תוך השמטת כל אנטיביוטיקה.
    2. לגדל את התאים בטמפרטורה שאינו מתירניות (43 ° C) לילה לזירוז הביטוי של FLP recombinase.
  3. בחירת ציטוקינים-חלבונים רקומביננטיים
    1. להפוך דילולים טורי, צלחת µL 50 לדילול6 5-10 10 על צלחות לא בררניים, לגדל את זה בן לילה ב- 30 ° C.

5. אימות של המחיקה ג'ין

  1. אימות של אובדן פלסמיד, רקומבינציה מוצלח
    1. מושבות יחיד רצף של הצלחות מוכן בשלב 4.3.1 על ליברות + קאן, ליברות + מגבר ו LB צלחות ללא אנטיביוטיקה, בצו זה. כדי לסייע ומבטא, השתמש ברשת המושבה (ראה 1 קובץ משלים). לגדל את הצלחות ב 30 ° C עד מושבות יופיעו (~ 24 שעות).
    2. לבחור שיבוטים 10 – 20 גדל על הצלחת לא בררניים אך נכשל לגדול באמצעי התקשורת סלקטיבית לצורך אימות נוסף.
  2. אימות נוסף מאת המושבה PCR
    1. לבצע מושבה PCR עם תחל איגוף תמ א קידוד רצף (ראה טבלה של חומרים).
    2. להכין תערובת PCR מאסטר. מידת שילוב הדרוש תלוי מספר מושבות להיבדק (עיין בדוגמה טבלה 1). לערבב את ריאגנטים על קרח, מוסיפים את פולימראז אחרונה.
    3. לערבב את תערובת הבסיס של PCR ביסודיות, אז לוותר על 20 µL לתוך הצינורות של רצועת ה-PCR. לאסוף כמות קטנה של כל מושבה שיוקרנו באמצעות טיפ פיפטה סטרילי והוסף אותו לרכבת התחתית. זכור לכלול המתח הנמענים המקוריים עבור השוואה. באופן אופציונלי, כוללים גם המתח התורם.
    4. להפעיל את תגובת ה-PCR (ראו טבלה 2 התוכנית המשמשת).
    5. הכנת ג'ל agarose 1%.
      1. עבור 50 מ ל ג'ל, למדוד 0.5 גר' agarose ולהוסיף 50 מ של מאגר טה (40 מ מ טריס, חומצה אצטית 20 מ מ ו- 1 מ מ EDTA, pH 8.0). מחממים את התערובת בתנור מיקרוגל עד agarose כל יש התפרקה.
      2. ברגע agarose פיזר, מגניב הפתרון עד כ 50 ° C, ולאחר מכן להוסיף 5 μL של ה-DNA מכתים לצבוע. מערבבים היטב את הפתרון ויוצקים אותו לתוך מגש ג'ל בתוך תא הליהוק. הוסף שורה אחת או יותר של מסרקים היטב כדי שלא יהיו בארות מספיק עבור כל דגימות, כמו גם סמני גודל מולקולרי. לאפשר את הג'ל להגדיר למשך 30 דקות.
    6. לאחר סיום המרוץ PCR, להוסיף 4 µL של 6 x DNA הטעינה לצבוע כל דגימה. מקם את הג'ל בבית הבליעה אלקטרופורזה ולהוסיף טה מאגר עד הבארות מכוסים.
    7. החל µL 10-15 מ כל התגובה PCR לבאר, הג'ל. גם להוסיף 5 µL של סמן גודל מולקולרי. לאחר מכן הפעל את הג'ל במשך 30 דקות ב-75 V.
    8. לאחר סיום המרוץ, תמונה הג'ל באמצעות imager אור כחול.

6. טכניקות אחרות

  1. ביטוי חלבון
    הערה: הביטוי של בדיקת חלבונים (בלה ו- EibD) היו מתוארות בפרוטרוט במקום אחר23,24. זהו סיכום קצר של השלבים העיקריים.
    1. להפוך BL21ΔABCF Δתמ א wהמדומה של פלסמידים הכרחי (pIBA2-בלה, pEibD10, פלסמידים התואם את הבקרה) ו בחר עבור transformants ליברות + כח.
    2. עבור הביטוי חלבון, לחסן 100 מ ל LB בינוני + מגבר עם 1 מ"ל של תרבות לילה של חיידקים טרנספורמציה, גדלים אלה ב 30 ° C עד שלב אמצע יומן, ובו בזמן, לגרום לייצור חלבון או anhydrotetracycline (תמורת 100 ננוגרם למ"ל) או איזופרופיל thiogalactoside (ב- 0.5 מ מ).
    3. לאחר 2 h האינדוקציה ב 30 מעלות צלזיוס, למדוד את עכירות של התרבויות ולאסוף של מספר תאים המתאימים 50 מ ל- OD600 = 1.0 מאת צריך שתוציאו את התרבויות למשך 15 דקות ב x 4,000 גרם. לשטוף את גלולה 1 x עם 10 מ מ HEPES, pH 7.4 ולאחר מכן גם לאחסן אותו ב-20 ° C או תהליך זה יותר כמו שלב 6.2.
  2. הממברנה החיצונית החילוץ
    הערה: הממברנה החיצונית החילוץ מתבצע כפי שתואר בפירוט על ידי ליאו. et al. 27. השלבים העיקריים מסוכמים להלן.
    1. Resuspend בגדר תא ב- 1 מ ל 10 מ מ HEPES, pH 7.4, בתוספת 10 מ מ MgCl2 , MnCl2, ליזוזים (0.1 mg/mL) ו קמצוץ של DNase אני.
    2. Lyse התאים (למשל, באמצעות מכה חרוז).
    3. Centrifuge התאים זמן קצר (2 דקות ב 15,600 x g) כדי להסיר שאריות תאים ולעבור את תגובת שיקוע צינור טריים.
    4. Centrifuge התאים למשך 30 דקות ב- 16,000 x g, לאחר מכן, resuspend בגדר ב 400 μL של 1% sarcosine N-lauroyl ב- 10 מ מ HEPES, pH 7.4.
    5. דגירה התאים עם עצבנות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן, centrifuge אותם למשך 30 דקות כמפורט לעיל.
    6. תשטוף שקוף גלולה 1 x עם 200 μL 10 מ מ HEPES, pH 7.4, ואז resuspend אותו בμl 30 10 מ מ HEPES, להוסיף 10 μL של 4 x מרחביות-דף לדוגמה מאגר.
  3. פעילות מבחני
    הערה: לבצע מבחני מרחביות-דף ופעילות בלה, EibD כפי שמתואר28. השלבים העיקריים מסוכמים להלן.
  4. עמוד למען חברה דמוקרטית
    1. מחממים את הדגימות ב 50 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות לפני והעמיסו אותם ג'ל לזיהוי, כדי להימנע denaturing את החלבונים.
    2. לאחר ההפרדה בדף-מרחביות, להעביר את החלבונים קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene.
    3. לאחר המעבר, לחסום את הקרום עם 2% אבקת חלב רפרפתי ב- PBS.
  5. בלה-קולגן רחוק-מערב חשופה
    1. לאחר חסימת, להוסיף קולגן סוג שאני מדולל במאגר חסימה ריכוז μg/מ"ל, דגירה קרום לשעה.
    2. לשטוף את קרום 2 x עם PBS + 0.05% Tween20 (PBS-T).
    3. הוסף את נוגדן ראשוני (monoclonal אנטי-קולגן COL-1) למוח, 1:2,000 מדולל במאגר חסימה.
    4. לאחר המקננת הקרום עבור 1 h, לשטוף 2 x כפי שהוזכר בשלב 6.3.2.2 ולאחר מכן להוסיף את הנוגדן משנית [עז העכבר אנטי איג-חזרת peroxidase (HRP) המספר המשלים], 1:10,000 מדולל במאגר חסימה.
    5. דגירה הקרום עבור 1 h, ולאחר מכן לשטוף אותה 2 x עם PBS-טי להוסיף המצע chemiluminescent משופרת של הקרום על פי הוראות היצרן, לזהות את הלהקה בעזרת מצלמה CCD.
  6. אג EibD איגוד וזמינותו
    1. לאחר חסימת, להוסיף נוגדנים משניים (עז נגד ארנב HRP), מדולל 1:2,000 במאגר חסימה.
    2. דגירה הקרום עבור 1 h, ולאחר מכן לשטוף אותה 2 x עם PBS. לבצע זיהוי chemiluminescent כפי שהוזכר בשלב 6.3.2.5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מהדור תמ א הנוק-אאוט של BL21ΔABCF:

האסטרטגיה שפורטו לעיל בעבר שימש כדי לייצר זן נגזרות של BL21(DE3), זן מעבדה סטנדרטי המשמש לייצור חלבון, אשר אופטימיזציה עבור ייצור החלבון הממברנה החיצונית, שנקרא BL21ΔABCF21. זן זה חסר ארבעה גנים קידוד חלבונים בשפע הממברנה החיצונית, כתוצאה מכך, הוא מסוגל לייצר חלבונים הממברנה החיצונית ביטוי יותר heterologously מאשר המתח פראי-סוג. כדי לבדוק אם TAM מעורב TAA להן, הגן של טאמה נמחק ברקע הזה.

P1 lysate הוכן בגלל הלחץ אוסף קאיו JW4179, איפה הגן בתמ א (בעבר נקרא yftM) קידוד רצף מוחלף על ידי קלטת ההתנגדות קאן. לאחר מכן, ניסוי התמרה חושית בוצעה עם BL21ΔABCF כמו המתח. הנמען. מספר מושבות עמידים קאן התקבלו, אחרי אשר שניים נבחרו הכריתה של קלטת קאן. PCP20 פלסמיד, קידוד recombinase FLP, הציגו לתוך שיבוטים אלה, לאחר מכן, נרפא על ידי הגדלה ב 43 ° C, בהעדר למבחר לאנטיביוטיקה. מספר שיבוטים הוקרנו על רגישות המגבר (אשר מהווה סמן של pCP20) והן קאן, רגיש לשני מספר שיבוטים התקבלו. שיבוטים אלה אומתו על ידי המושבה PCR באמצעות תחל איגוף תמ א קידוד רצף ומצא כי הגן תמ א בהצלחה נמחקה (איור 4).

התפקיד של תמ א TAA להן:

תמ א הוכח להיות מעורב להן של כמה autotransporters קלאסית16 וה-intimin הפוך autotransporter15. כדי לבדוק אם תמ א חשוב להן של תעש, Δ BL21ΔABCFתמ א הפך עם פלסמידים קידוד חלבונים מבחן שני, את adhesin Yersinia בלה ו- e. coli Ig מחייב חלבון EibD. חלבונים אלה ידועים express גם ב e. coli ו שימשו כמודלים TAA להן מחקרים קודמת23,28.

לאחר גרימת ייצור החלבון, שברים הממברנה החיצונית של התרבויות ביטוי היו מבודדים, נותחו על ידי עמודים מרחביות. הדגימות היו מבושלים לא להפגין trimerization של החלבונים. Trimers להפעיל בגדלים מעל 100 kDa, ואילו מונומרים לצפות בגדלים 45 kDa (בלה) ו- kDa 51 (EibD). אין הבדלים משמעותיים נצפו בין רמות הביטוי של BL21ΔABCF BL21ΔABCF Δתמ א, למרות בלה נראה להיות מיוצר ברמות נמוכות במקצת בנימהשל טאמה Δ (איור 5A). עם זאת, ההיפך נראה אם זה EibD.

כדי לבחון אם חוסר של תמ א עלולה להשפיע את הנכון מתקפלות או הובלה של החלבונים, נבחנה יכולתם כדי לאגד ליגנדים. על ידה, זה בוצעה על ידי אבן חשופה רחוק-מערבי של קולגן (איור 5B). בלה, שני זנים, מסבת קולגן ברמה דומה, הוכחת כי החלבון הוא כראוי מקופל ופונקציונליים. בדומה לכך, פעילויות IgG-איגוד של EibD שני זנים בקורלציה עם רמת ביטוי (איור 4C). תוצאות אלו מדגימים כי המחיקה של תמ א אין השפעה משמעותית על TAA להן, לפחות לא עבור אלה תעש דגם שני.

Figure 1
איור 1: דור של טוק-outs עם קלטות אנטיביוטי ניתן לניתוח. להפקת ג'ין טוק-ודוק, גן עניין (B. ג'ין בדוגמה זו) מוחלף על ידי קלטת ההתנגדות קאן ולצדו והשפלתם אתרים. בקלטת והשפלתם-קאן, בתורו, מוקף קצר (~ 50 bp) משתרע רצף הומולוגי לאזורים ויוצאת לכמה גנים רצף קידוד של הגן B היא להחליף את הקלטת והשפלתם-קאן מאת λ רקומבינציה אדום. ברגע מטרה זו מושגת, ניתן להסיר את הקלטת קאן עצמה על ידי החדרת את recombinase FLP, אשר לתווך של רקומבינציה בייעודי לאתר בין האתרים והשפלתם. זה excises את הקלטת קאן, עוזב מינימלית (~ 100 bp) צלקת רצף לוקוס B. לקבלת פרטים מלאים, ראה בבא. et al. 7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ג'ין מחיקה על-ידי התמרה חושית P1. התורם זן נושאת (בז) קלטת קאן זה החליף את הגן עניין (צהוב) בכרומוזום (כחול). התורם נגוע P1 bacteriophage. Phage הכפלת בנימה התורם, לייצר מספר גדול של progenies. ביותר הם פראי-סוג (הגנום אדום), אך חלק קטן הם transducing phages אשר שילבו חלק תורם למתח כרומוזום במקום phage הדנ א (הגנום כחול). שיעור של אלה יכיל את הקלטת קאן (הגנום צהוב). בסופו של דבר, התא הנגוע מארח הנה קטעי. העיתונים ומשחרר את phages לתוך האמצעי. אלה משמשים כדי להכין את lysate. התמרה חושית לניסוי, המתח. הנמען (תכלת) נגוע lysate שהוכנו המתח התורם. במיעוט מהמקרים, הנמען הוא נגוע phage transducing נושאת את הקלטת קאן (המוצג כאן). אם האזורים הסמוכים בקלטת קאן לעבור רקומבינציה הומולוגית, בקלטת קאן הוא שולב את כרומוזום הנמען. אלל אנדוגני, וכתוצאה מכך שיבוטים קאן עמידים שניתן לבחור עבור החלפת. התוספת של FLP recombinase על פלסמיד לריפוי excises את הקלטת קאן, עוזב רק צלקת קצרה רצף (המוצג כאן בצהוב), אשר חוזרת השיבוט כדי פנוטיפ קאן-רגיש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: דוגמאות צלחות לאחר זיהום P1. (א) לוח זה מראה לצלחת עם לוחות בודדים. (B) לוח זה מציג צלחת confluent למחצה. (ג) לוח זה מציג צלחת יתר נגוע, שבו כמעט כל החיידקים יש כבר lysed על ידי phage. כמה מושבות עמיד גדלו מחוץ לשכבה העליונה אגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: מחיקת תמ א קידוד רצף. אלל מחיקה tamA::kan הוכנס המתח BL21ΔABCF על ידי התמרה חושית P1. לאחר הכריתה של קלטת קאן, רצף צלקת (~ 100 bp) הוא כל שנותר על מיקומה של טאמה . זה אומתה על ידי ה-PCR, באמצעות תחל איגוף האתר מחיקה. BL21ΔABCF, זן האב שלו, BL21(DE3), ה-PCR נותן מוצר האורך של תמ א קידוד רצף (הגודל הצפוי הוא 1.7 kilobase זוגות). BL21ΔABCF, איפה יש כבר חתכתם את הקלטת קאן, המוצר מתאים רצף הצלקת הצפוי (145 bp). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ביטוי של תעש על ידי זן מחיקה בתמ א . (א) לוח זה מראה מרחביות-הדף של ממברנות החיצוני מוכן מתאי לבטא תעש (בלה או EibD) ופקדים וקטור (pIBA2 ו- pET22). הזנים הם BL21ΔABCF שלה זן נגזרות חסר בתמ א (ΔtamA). (B) לוח זה מראה אבן חשופה רחוק-מערב קולגן בלה דגימות. בלה ודוגמאות של פאנל A פקדים pIBA2 הועברו קרום PVDF, מודגרות עם סוג הקולגן. הם היו לאחר מכן נחקר עם נוגדן אנטי-קולגן, זוהה על ידי ECL. (ג) לוח זה מראה של וזמינותו מחייבת נוגדנים עבור דגימות EibD. דוגמאות EibD ופקדים pET22 פאנל A היו הועבר קרום PVDF מודגרות עם נוגדן משני מצומדת HRP, אז זוהה על ידי ECL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מגיב 1 x מיקס 7 x מיקס
כיתה ה-PCR מים 17 ΜL 119 ΜL
10 x פולימראז מאגר 2 ΜL 14 ΜL
מיקס deoxyribonucleotide 10 מ מ 0.4 ΜL 2.8 ΜL
פריימר לפנים 100 מיקרומטר 0.2 ΜL 1.4 ΜL
פריימר הפוכה 100 מיקרומטר 0.2 ΜL 1.4 ΜL
Taq DNA פולימראז 0.2 ΜL 1.4 ΜL
סה 20 ΜL 140 ΜL

טבלה 1: המושבה PCR מאסטר מיקס. מכמות תערובת תלויה במספר מושבות שיוקרנו. בנוסף, להכין תגובה שליטה (זן הנמען המקורי). למשל, אם הקרנה שיבוטים חמש, שש תגובות נדרשים, כולל את הפקד. זה שווה הכנה לתגובה נוספת כדי לוודא שאין מספיק לערבב PCR עבור כל הדגימות (חזר pipetting מגביר את שגיאות pipetting קטנות). בדוגמה זו, להכין תערובת 7 x (5 מושבות, שליטה 1 ו 1 תגובה נוספת).

שלב טמפרטורה זמן הערות
1. 94 ° C 3 דקות
2. 94 ° C 30 s
3. 50 ° C 30 s
4. 70 ° C 2 דקות 1 דקות/kb, הגברה לכנס
לחזור שלב 2 24 פעמים
5. 70 ° C 5 דקות
6. 12 ° C לנצח להחזיק הסופי

טבלה 2: המושבה PCR התוכנית.

1 הקבצים המשלימים: דוגמה של המושבה רשת. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התמרה חושית P1 הוא שיטה מהירה, חזקה ואמינה ליצירת ג'ין מחיקות ב e. coli. זה מומחש פה transducing מוטציה מחיקה תמ א של זן התורם קאיו לנמען נגזר BL21. השלבים העיקריים בתהליך התמרה חושית הן את הייצור של transducing lysate, את התמרה חושית עצמה, הכריתה של קלטת ההתנגדות קאן, ואימות של עקום החוצה על ידי ה-PCR. בסך הכל, התהליך לוקח בערך שבוע 1 ודורש אין שיטות בביולוגיה מולקולרית כדי לשמש, מלבד ה-PCR הסופי עבור האימות. לפיכך, התמרה חושית P1 יכול להתחרות המתכלים במאמץ ובזמן עם λ רקומבינציה אדום, הוא מהיר יותר מסורתי סמן exchange מוטגנזה מכוונת.

פרוטוקול הציג היא חזקה מאוד ומאפשר שינויים רבים מהשלבים. עם זאת, ישנם מספר פרמטרים קריטיים. זיהומים P1, זה הכרחי להוסיף יונים של סידן המדיום. סידן יש צורך של ספיחה של phage של חיידקים, כשל כדי להוסיף סידן מספקת המדיום תפחית באופן משמעותי את היעילות של הזיהום. בקטריאלי כמה זנים כמו BL21ΔABCF נוטים לצבור בנוכחות2CaCl21. במקרים כאלה, ניתן לגדל את החיידקים ללא CaCl2, אשר ניתן להוסיף את המתלים זמן קצר לפני הזיהום. עם זאת, עבור קונבנציונליים יותר זנים, 10 מ מ CaCl2 ניתן לכלול במצע הגידול מההתחלה.

לעומת זאת, חשוב להסיר את הסידן חינם של המדיום לאחר התמרה חושית. ציטראט הוא chelator של יוני סידן, ומונע כי אלה יש צורך ספיחה של P1 לתאים המארח, הסרת את הסידן חינם של המדיום נוסף זיהומים. אם לא יוסר הסידן, phages יזהם נוספת לתאים בכל התרבות, לכל היותר להפחית את היעילות של התמרה חושית, במקרה הגרוע lysing את כל התרבות, כולל את transductants.

עוד צעד קריטי הוא culturing חיידקים נושאת את pCP20 פלסמיד. pCP20 הוא פלסמיד מותנית שכפול זה לא לשכפל בטמפרטורה של 37 ° C ומעלה; לכן, כדי ליצור את פלסמיד בתאים, incubations עם פלסמיד הזה חייב להיות שבוצעו ב 30 ° C (או נמוכים יותר), טמפרטורה מתירניות עבור השכפול של pCP20. לריפוי pCP20, משמש חום גבוה (43 ° C). זנים מסוימים לא גדלים טוב בטמפרטורה זו; במקרים כאלה, מהטנק 37 ° C, למרות פלסמיד לריפוי יהיה פחות יעיל בטמפרטורה זו.

כאשר ציפוי חיידקים לבדוק רגישות לאנטיביוטיקה, הסדר של צלחת ומבטא הוא חשוב. הפרוטוקול מצריך שיבוטים להיות רץ בעירום קודם על המכיל אנטיביוטיקה צלחות, ולבסוף באמצעי לא בררניים. בדרך זו, החוקר יכול להיות בטוח כי כל חוסר צמיחה באמצעי התקשורת סלקטיבי יהיה בשל רגישות לאנטיביוטיקה, יותר מאשר על חוסר חומר פוטנציאליים מועברים על הלוחות. בעקבות הפרוטוקול, אין התפתחות על ק ג + קן צלחת מאמת הכריתה של קלטת ההתנגדות קאן; אין צמיחה על ק ג + מגבר צלחת מאמת את אובדן רקומבינציה פלסמיד pCP20; זנים הגדלים על הצלחת ליברות (אשר לא צמח בניסוי streaking אותו על לוחות בחירה) יכיל את ציטוקינים-חלבונים רקומביננטיים חיובי.

רוב הצעדים אחרים מאפשרים מרחב תמרון ניכר. בפרוטוקול כפי שהוצג, BL21ΔABCF הוא תרבותי ב 30 מעלות צלזיוס, כמו זה זן לא גדל טוב ב 37 º C. עם זאת, ייתכן תרבותי זני החיידק ללא פגמים הצמיחה ב 37 מעלות צלזיוס (למעט כאשר הפך עם pCP20).

מספר החיידקים המשמשים עבור זיהומים יכולים להיות מגוונים במידה מסוימת. הקשר בין OD600 ספירה מעשית הוא בערך ליניארי בין ערך600 OD של 0.1 1.0, איפה שהראשון מתאים כ 108 cfu/mL, והשני אל ~ 109 cfu/mL.... עם זאת, קשר גומלין זה עשוי להשתנות במידה מסוימת בהתאם המתח המדוברת, מדיום הגידול וגורמים אחרים. מומלץ כי יש להקים את היחסים בין OD600 הרוזן קיימא לכל מעבדה או להתאמץ, במיוחד עבור חישוב ערכים MOI. מספר החיידקים המשמשים בניסויים זיהום זה לא קריטי במיוחד, 109 cfu/mL מייצג שלב נייח מוקדם, אשר היא פשרה סבירה בין צפיפות התאים את הפרופורציה של התאים קיימא בתרבות. אם מספר נמוך יותר של חיידקים קיימא משמשים עבור התמרה חושית, המספר של phages פשוט צריך להיות מותאם בהתאם. גם יכולים להיות מגוונים למשרד הפנים עצמו במידה מסוימת. הפרוטוקול קוראת ערך MOI של 0.5, למרות משהו בין 0.1-0.5 יביא יעילות טובה. בבית עבדכם של 0.5 היחס של phages חיידקים הוא 1:2 (כלומר, חצי מספר phages לעומת מספר חיידקים). בדוגמה בפרוטוקול, ה OD600 של התרבות הוא 1.0, 1 מ"ל של התרבות משמש התמרה חושית; לכן, מספר phages הנדרש הוא 5 x 108. ערך MOI של 0.5 מעניקה רמה גבוהה של זיהום אך מפחית את מספר החיידקים שהודבקו כפליים, אשר יפחית את היעילות של התמרה חושית כפי phages (מדבקות) פראי-סוג רחוק עולים במספרם על phages transducing. זיהום כפול עם phage transducing של, של phage זיהומיות יוביל תא פירוק, וכך למנוע הזה transductant מהמאגר של ניצולים. לכן, MOI של 0.5 צריך לא להיות חריגה.

הפרוטוקול מאפשר גם כמה קיצורי דרך. במקום מכינים lysates של צלחות, יש מחברים עו ד הכנת phage lysates נוזלי בינוני29. זה יכול לחסוך זמן כפי שלב הדגירה לילה לא נחוצה. באופן דומה, titrating את phage lysate ייתכן שלא יהיה צורך. כפי שצוין לעיל, למשרד הפנים הוא לא מאוד קריטי, יעילות סבירה יכולה להיות מושגת על ידי פשוט בהנחה של כייל של 1010 pfu/mL עבור תקן lysate.

למרות הקלות של הטכניקה, התמרה חושית P1 אינה ישימה אוניברסלית, חייבים להתקיים מספר תנאים כדי שזה יהיה שימושי. ראשית, המתח תורם עם אלל הנוק-אאוט לבחירה חייבת להיות זמינה. זו מושגת בדרך כלל על-ידי שימוש מחיקה איפה קלטת עמידות לאנטיביוטיקה החליף את הגן עניין. האוסף קאיו שימושי במיוחד בהקשר זה, כפי שהוא מציע ספרייה מוכן לשימוש של ג'ין מבוססי קלטת לאנטיביוטיקה טוק-outs מכסה כמעט את כל הגנים שאינם חיוניים ב e. coli K12. אוסף זה שימושי במיוחד ששילמת את הגנים שנשמרת נמצאו רוב זני החיידק (קרי, המרכיבים של הגנום core e. coli ). עבור גנים פחות נפוצים, כגון הגורמים התקפה אלימה של פתוגניים החיידק זנים או הגנים נדירה מסלול מטבולי, המוטציה ייתכן שיהיה צורך ליצור דה נובו. במקרים כאלה, P1 התמרה חושית לא ייתכן שיטת הבחירה. בנוסף גנים חיוניים, גנים הדרושים עבור זיהום P1, המשמעותי, מוטציות אשר להוביל P1 ההתנגדות30, הם מטרות המסכן עבור מחיקה על-ידי התמרה חושית P1. הערה נוספת בעת שימוש האוסף קאיו, באופן ספציפי, הוא כי כמה זנים לבצע שכפול של הגן יישוב, שבו רק עותק אחד הופרעו על ידי קן ההתנגדות קלטת8. במקרים כאלה, הגן עניין עשוי להיות חיוני; החוקרים מומלץ לבדוק ביאורים מעודכנים עבור גנים כאלה8. עם זאת, בהתחשב הרסנים האלו, התמרה חושית P1 מאפשרת את המחיקה של גנים רוב זני החיידק מעבדה. לדוגמה, ההבדלים בין BW25113 לבין BL21(DE3) קטנים ומשפיעים רק קומץ של חלבונים הגנים31.

שנית, חשוב להדגיש כי המתח. הנמען חייב להיות מסוגל רקומבינציה הומולוגית עבור התמרה חושית לעבודה. זן חסר את recombinase שרקה יכול, לפיכך, לא ניתן לשנות בשיטה זו. לא כולל את כל זני שיבוט רגיל, כגון DH5α, HB101, TOP10 כחול XL-1. רקה יכולים לתווך recombinations בין קצר ככל 8 זהים מותח bp; עם זאת, אזור זמן של דמיון גבוה יהיה להגדיל את ההסתברות של רקומבינציה באופן משמעותי32,33. בעיה נוספת, במיוחד עם קליניים e. coli זנים, הוא זמן O אנטיגן שרשראות עשוי להסוות את הקולטן עבור P1, אשר טמון של פחמימה # מיון הליבה הפחמימות ליפופוליסכריד34. בנוסף לדרישות אלו לזן של הנמען, המתח P1 שימוש עבור התמרה חושית צריך להיות מוטציה vir ; מוטציה זו נדרשת עבור זיהום lytic מלא35.

אזהרה שלישית של התמרה חושית נמצא כי הגן לנוק אאוט צריך שוכנים באזור עם דמיון גבוהה באזורי איגוף בין התורמים לבין זנים נמען P1. אם יש חוסר synteny בין הזנים, ההחלפה של הגן היעד קידוד רצף בקלטת קאן עשויה היטב להיכשל, בגלל ההבדלים בתוכן של האזורים איגוף. לכן, לפני היציאה בתיווך P1 גן מחיקה, החוקרים לבדוק הרצפים של זנים התורם ואת נמען כדי לוודא רצפי איגוף הומולוגיים. כמובן, הדבר אפשרי רק אם יש כבר וסודרו הזנים. במקרה של זנים עם רצף לא ידוע, התמרה חושית P1 עלול להיכשל או לגרום לבעיות אחרות, כגון המרה גנים באזורים איגוף. P1 יכול מגלי כ 90 kilobase זוגות של DNA; אם קיימים הבדלים בתוכן גנים באזורים סביב הגן המטרה (למשל, מחיקות קטן או הוספות), סביר להניח כי אלה להגדרתו רצף התורם. אולי יש לזה השלכות בלתי מכוונות על פנוטיפ של המתח. הנמען. לכן, במידת האפשר, הרצפים של התורם, נמען ברחבי הגן עניין תמיד יש להשוות לפני התמרה חושית P1.

לסיכום, התמרה חושית P1 הוא דרך מהירה של העברת גנים ספציפיים את מדהימה של מספר זנים, ברגע המוטציה מעלף הראשונית נוצרה. על פי השיטה יש מגבלות משלו, קלות ומהירות של יישומה להגיע חלופה אטרקטיבית בשיטות אחרות של ג'ין מחיקה P1 משפיע רק על e. coli, אשר בדרך כלל מגביל את השימוש בו מין זה. עם זאת, מספר וריאציות של P1 פותחו כי יש טווח רחב יותר של המחשב המארח, יכול להדביק מינים אחרים בתוך המשפחה Enterobacteriaceae, ואפילו כמה מינים וγ-proteobacterial אחרים, גם אם במחיר מופחת יעילות36, 37. אפילו התמרה חושית של דנ א המשוכפל של e. coli Myxococcus xanthus, אלפא-proteobacterium, כבר דווח על38. בניסויים בעתיד, גרסאות אלה יכול להיות מרובדת עם המוטציה vir כדי להרחיב את מגוון זנים הנמען בשימוש ג'ין מבוססי קלטת לאנטיביוטיקה מחיקה על-ידי כללי התמרה חושית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

קאיו אוסף זנים התקבלו מפרוייקט BioResource הלאומית (כוש, יפן): e. coli. אנו מודים החיבור דירק (המחלקה של החיים, אוניברסיטת אוסלו) על תמיכתו המתמשכת. עבודה זו מומן על ידי המועצה למחקר של חוקר צעיר נורבגיה גרנט 249793 (כדי ג'ק ג לאו).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGG
ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATT
CTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
  3. Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
  4. Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
  5. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  6. Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
  7. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  8. Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
  9. Baba, T., Huan, H. -C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, Clifton, NJ. 183-194 (2008).
  10. Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
  11. Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
  12. Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
  13. Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
  14. Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
  15. Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
  16. Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
  17. Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
  18. Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
  19. Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
  20. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  21. Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
  22. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
  23. Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
  24. Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), London, UK. 1021-1030 (1993).
  25. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
  26. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  27. Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 157-167 (2015).
  28. Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
  29. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., et al. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 1, Unit 1.17 (2007).
  30. Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
  31. Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
  32. Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
  33. Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
  34. Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
  35. Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
  36. Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
  37. Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
  38. O'Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).

Tags

גנטיקה גיליון 139 קלטת עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה מוטגנזה מכוונת FLP recombinase P1 התמרה חושית רוברטסונית ומודול הרכבה trimeric autotransporter adhesin
הפקת ג'ין מחיקות ב- <em>Escherichia coli</em> מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J.… More

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter