Summary
Her presenterer vi en protokoll for bruk av eksisterende antibiotikumet motstand-kassett sletting konstruksjoner som grunnlag for å gjøre sletting mutanter i andre E. coli stammer. Slike sletting mutasjoner kan være mobilisert og satt inn i tilsvarende locus mottaker belastning bruker P1 bacteriophage signaltransduksjon.
Abstract
En første tilnærming til studere funksjonen til en ukjent genet i bakterier er å skape en knock-out av dette genet. Her beskriver vi en robust og rask protokoll for overføring av genet sletting mutasjoner fra en Escherichia coli stamme til en annen ved hjelp av generalisert signaltransduksjon bacteriophage P1. Denne metoden krever at mutasjon være valgbar (f.eks basert på gene forstyrrelser med antibiotika kassett innsettinger). Slike antibiotika kassetter kan mobiliseres fra en donor belastning og introdusert til en mottaker belastning av interesse for raskt og generere enkelt en genet sletting mutant. Antibiotika kassetten kan utformes med flippase gjenkjennelse nettsteder som lar eksisjon av kassetten av en områdespesifikk recombinase å produsere en ren knock-out med bare en ~ 100-base-par-lange arr sekvens i genomet. Vi demonstrere protokollen av fortrenging tamA genet koding en montering faktor i autotransporter biogenesis og teste effekten av denne knock-out på biogenesis og funksjon av to trimeric autotransporter adhesins. Om genet sletting av P1 signaltransduksjon har begrensninger, gjør den enkle og hastigheten på implementeringen det et attraktivt alternativ til andre metoder for genet sletting.
Introduction
En felles første tilnærming til å studere et gen funksjon er å utføre knock-out mutagenese og observere resulterende fenotypen. Dette kalles også omvendt genetikk. Bakterien E. coli er arbeidshesten fra molekylærbiologien for de siste 70 årene eller så, enkel sin dyrking og dens amenability genetisk manipulasjon-1. Flere metoder har blitt utviklet for å produsere genet slettingene i E. coli, inkludert markør exchange mutagenese2,3 og, mer nylig, recombineering bruker λ rød eller Rac ET systemer4,5 , 6.
I en mye brukt system, er koding sekvenser av enkelte gener erstattet av en antibiotikaresistens kassett som kan senere kreditert fra kromosom5,7. Koding sekvensene er erstattet, for eksempel med en kanamycin (Kan) motstand kassett, som er flankert av flippase (FLP) anerkjennelse (FRT) målområder på hver side. Webområdene FRT gjenkjennes av recombinase FLP, som formidler områdespesifikke rekombinasjon mellom FRT områder fører til sletting av Kan kassetten. På denne måten kan en fullstendig sletting av et gitt gen koding oppnås, og etterlot seg bare en minimal arr sekvens av omtrent 100 base parene (bp) (figur 1).
Bare over et tiår siden, ble såkalte Keio samlingen utviklet. Dette er en bakteriell bibliotek som er basert på en standard laboratorium E. coli K12 belastning, der nesten alle ikke-essensielle gener individuelt ble slettet av λ rød rekombinasjon7,8. Kloner i denne samlingen hvert har en koding sekvens erstattet med en excisable Kan motstand kassett. Keio samlingen har vist seg for å være et nyttig verktøy for mange programmer9. Et slikt program er produksjon av sletting mutanter i andre E. coli stammer. Kan kassetten fra en gitt sletting klone kan mobiliseres av generelt transducing bacteriophages, som P1,10,,11,,12,,13,,14. En phage lager forberedt fra slik en belastning kan deretter brukes til å infisere en mottaker E. coli stamme av interesse, hvor på en lav, men pålitelig frekvens Kan kassett inneholder regionen kan innlemmes i mottakerens genomet av homologe rekombinasjon (Figur 2). Transductants kan velges for vekst på Kan inneholder mediet. Etter dette, eventuelt fjerning av antibiotikaresistens kassetten er kan FLP recombinase leveres til transductant belastning i trans. Etter FLP inneholder plasmider, som bærer en ampicillin (Amp) motstand markør, Kan og Amp-sensitive kloner er vist for, og den riktige eksisjon av vill-type koding sekvensen og Kan kassetten bekreftes av kolonien PCR.
Her vises en detaljert protokoll, beskriver hvert trinn i å produsere en knock-out E. coli belastning basert på strategi skissert ovenfor. Som et eksempel, er sletting av tamA genet demonstrert. tamA koder en ytre membran β fat protein som er en del av Transport og montering modul (TAM) som er involvert i biogenesis av visse autotransporter proteiner og pili15,16,17. Denne knock-out belastningen ble brukt til å undersøke effekten av tamA sletting på biogenesis av to trimeric autotransporter adhesins (TAAs) og Yersinia adhesin YadA E. coli immunglobulin (Ig)-bindende TAA EibD 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stammer og plasmider
-
Bakteriell stammer
- Bruke E. coli stammer BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20og BL21ΔABCF21. Se Tabellen for materiale for mer informasjon.
-
Bacteriophages
- Bruk phage P1vir for den generelle signaltransduksjon. Lagre phage som en flytende lager med noen dråper kloroform (se trinn 2.2). For mer informasjon, kan du se Tabellen for materiale.
-
Plasmider
- Bruk følgende plasmider i denne protokollen: pCP2022, pIBA2-YadA23og pEibD1024. Kontroll plasmider, bruke pASK-IBA2 og pET22b (se Tabell for materiale).
-
Vekst forhold
- Overføre bakterier i en lysogeny kjøttkraft (LB) middels25 med kraftig risting (180-200 rpm) på 37 ° C eller 30 ° C BL21ΔABCF og stammer som inneholder pCP20.
- Utføre plasmider herding på 43 ° C.
- For en solid medium, supplere LB med 1% agar (w/v).
- For topp agar, supplere LB med 0,7% agar og 10 mM CaCl2 og autoklav medium. Bruk SOC medium for gjenoppretting etter electroporation26.
- Bruk følgende konsentrasjonen for antibiotika: 100 μg/mL for Amp og 25 μg/mL for Kan.
2. klargjør en Phage Lysate
-
Infeksjon av donor belastningen
- Vokse donor belastningen JW4197 i 5 mL av LB medium supplert med 10 mM CaCl2 og eventuelt Kan (25 µg/mL) en optisk tetthet på 600 nm (OD600) av ~ 1.0. Måle OD600 verdien bruker et spektrofotometer.
- Inngå fortynning en eksisterende P1 phage lager i LB medium: anbefalt fortynninger er mellom 10-3 til 10-7.
- Mix 200 μL av bakteriell hjuloppheng, 100 μL av en gitt phage fortynning i en 15 mL sentrifuge rør eller tilsvarende. Forberede så mange rør som phage fortynninger. Inkuber rør for 20 min på 37 ° C uten å riste.
- Legge ~ 3 mL smeltet topp agar (~ 50 ° C) med 10 mM CaCl2 til rør, bland innholdet godt av vortexing rør kort og hell blandinger på prewarmed LB plater å gjøre enda flere lag.
- Inkuber platene overnatting på 37 ° C.
-
Lysate forberedelse
- Dagen velge en plate med en semi confluent vekst av phage plakk. På en semi confluent plate, omtrent halve arealet av platen er klar (Figur 3).
- Skrape topp agar laget fra slik en plate med en inokuleringen sløyfe eller et lignende verktøy og plasser den øverste agar i en sentrifuge rør. Legge til 1-2 mL LB og en dråpe kloroform og vortex tube kraftig i ~ 1 min. Legg til kloroform i avtrekksvifte.
- Sentrifuge røret i 15 min på 4000 x g eller raskere å pellets agar og bakterielle celler.
- Flytte nedbryting til en frisk microcentrifuge tube, unngå bærer over alle partikler fra pellet. Legge til 2 dråper kloroform og lagre lysate på 4-10 ° C. Legge til kloroform i avtrekksvifte. Frys phage lysate som dette vil resultere i en betydelig reduksjon av antall smittsomme partikler.
-
Bestemme lysate titer
- Vokse BW25113 i LB supplert med 10 mM CaCl2 på 37 ° C til kultur når en OD600 ~ 1,0.
- Forberede en fortynning rekke phage lysate i LB (f.eks, 10-6– 10-9).
Merk: Pass til Pipetter prøven fra toppen av den lysate å unngå å overføre kloroform til fortynninger. - Mix 200 μL av bakteriell hjuloppheng, 100 μL av en gitt phage fortynning i en 15 mL sentrifuge rør eller tilsvarende. Forberede så mange rør som phage fortynninger. Inkuber rør for 20 min på 37 ° C uten å riste.
- Legg ~ 3 mL smeltet topp agar (~ 50 ° C) med 10 mM CaCl2 til rør, bland innholdet godt av vortexing rør kort tid, og Hell blandingen på prewarmed LB plater å gjøre enda flere lag.
- Inkuber platene overnatting på 37 ° C.
- Dagen etter antall plaketter (klart regioner i bakteriell matten) for hver plate og beregne titer av lysate ved hjelp av følgende formel:
Eksempel: På plater med fortynninger 10-7og 10-810-9, det er 231 27 og 2 plaketter, henholdsvis. 100 μL av hver fortynning ble brukt for infeksjon, og fordi titer uttrykkes plakk-forming enheter (pfu) / mL, plating faktoren er 10. Disse tallene angis i formelen:
Dermed er titer ca 2 x 1010 smittsomme phage partikler/mL.
3. P1 signaltransduksjon
-
Forbereder mottaker cellene
- Vokse mottaker belastningen BL21ΔABCF i LB supplert en optisk tetthet på 600 nm (OD600) av ~ 1.0. Bruk et spektrofotometer som måler OD600 verdien.
- Beregne volumet av phage lysate nødvendig for å oppnå et mangfold av infeksjon (MOI) verdi på 0,5. For å beregne MOI, anslå hvor mange bakterier basert på OD600 av kulturen. Anta at en OD600 verdi 1,0 tilsvarer ~ 109 cfu/mL. Beregne volumet kreves basert på den kjente titer av den lysate.
Eksempel (basert på titer beregnet i eksempel etter trinn 2.3.6):
- Legg CaCl2 til mottakeren stamme kulturen til 10 mM og bland. Ta 1 mL av kulturen for signaltransduksjon.
-
Utføre signaltransduksjon
- Legg den aktuelle mengden phage lysate til 1 mL av mottakeren kultur (inkludert CaCl2 på 10 mM) som beregnet trinn 3.1.2 og bland forsiktig.
Merk: Pass Pipetter prøven fra toppen av den lysate å unngå å overføre kloroform til mix. - Statisk Inkuber en miks for 20 min på 37 ° C.
- Stopp infeksjon ved å legge natriumsitrat, pH 5.5 til 100 mM.
- Sentrifuge bakterier (5000 x g i 2 minutter) og fjerne nedbryting, deretter resuspend dem i 1 mL av fersk LB supplert med 100 mM natriumsitrat, pH 5.5.
- Vask cellene to ganger mer som i trinn 3.2.4 å sikre fjerning av gratis phages og kalsium.
- Resuspend bakterier i 1 mL av fersk LB supplert med 100 mM natriumsitrat, pH 5.5. Inkuber bakterier på 30 ° C i 1 time med skjelvende (> 100 rpm).
- Samle bakterier med sentrifugering (5000 x g i 2 minutter) og resuspend dem i ~ 100 μL LB med 100 mM natriumsitrat, pH 5.5.
- Spre bakterier på en LB plate supplert med Kan 25 µg/mL og 10 mM natriumsitrat, pH 5.5 og vokse bakterier på 30 ° C til koloniene vises (~ 24 h).
- Legg den aktuelle mengden phage lysate til 1 mL av mottakeren kultur (inkludert CaCl2 på 10 mM) som beregnet trinn 3.1.2 og bland forsiktig.
-
Valg av transductants
- Når kolonier har vokst på utvalg plate, restreak dem på LB + Kan for enkelt kolonier og vokse på 30 ° C til enkelt kolonier vises.
4. excising Kan kassetten
-
Transformasjonen med rekombinasjon plasmider
- Kontroller Kan-resistente BL21ΔABCF stammen electrocompetent.
- Vokse belastningen fra en enkelt koloni i frisk LB (5 mL) med Kan (25 µg/mL) på 30 ° C til OD600 er ~0.5-0,7.
- Herfra kan du utføre følgende trinn 4 ° C eller is. Sentrifuge bakterier (5000 x g i 10 min) og fjerne nedbryting.
- Vask celle pellets med iskald destillert vann to ganger ved å gjenta forrige sentrifugering trinn, og til slutt resuspend celle pellet i 100 µL iskald 10% glyserol.
- Avkjøl 1 mm electroporation cuvettes på is.
- Legge til 1 pg av plasmider DNA (pCP20) i celle suspensjon, bland suspensjon forsiktig og overføre den til avkjølt electroporation søppel.
- Satt til electroporator til 1,8 kV og electroporate celler.
- Redde transformert celler ved å legge 1 mL av SOC medium og voksende dem 1t på 30 ° C.
- Plate 100 µL cellene i LB + Amp plater og vokse cellene på 30 ° C over natten.
- Kontroller Kan-resistente BL21ΔABCF stammen electrocompetent.
-
Induksjon av rekombinasjon
- Velg enkelt kolonier fra LB + Amp plate og vaksinere frisk LB utelater alle antibiotika.
- Vokse cellene på uten tillatelse temperaturen (43 ° C) over natten å induserer uttrykk for FLP recombinase.
-
Velge recombinants
- Lage føljetong fortynninger og plate 50 µL av en 105-106 fortynning på ikke-selektive plater og vokse over natten på 30 ° C.
5. verifisering av Gene sletting
-
Bekreftelse av plasmider tap og vellykket rekombinasjon
- Strek enkelt kolonier fra platene forberedt trinn 4.3.1 LB + Kan, LB + Amp og LB plater uten antibiotika, i denne rekkefølgen. Til hjelp i det striper, bruke en koloni rutenett (se utfyllende fil 1). Vokse platene på 30 ° C til koloniene vises (~ 24 h).
- Velg 10-20 kloner som har vokst på ikke-selektive plate, men ikke klarte å vokse på selektiv mediet for ytterligere bekreftelse.
-
Ytterligere bekreftelse fra kolonien PCR
- Utføre en koloni PCR primere flankert tamA koding sekvens (se Tabell for materiale).
- Forberede en master PCR blanding. Mengden av blanding nødvendig, avhenger av antall kolonier skal testes (se eksemplet i tabell 1). Bland reagensene på is, Legg polymerase sist.
- Bland PCR master blandingen godt, deretter dispensere 20 µL inn i rør til en PCR stripe. Plukke litt hver kolonien å bli vist med et sterilt pipette tips og legge den til et rør. Husk å inkludere den opprinnelige mottakerne belastningen for sammenligning. Du kan eventuelt også inkludere donor belastningen.
- Kjøre en PCR reaksjon (se tabell 2 for programmet brukes).
- Forberede en 1% agarose gel.
- For en 50 mL gel, måle 0,5 g agarose og legge til 50 mL av TAE buffer (40 mM Tris og 20 mM eddiksyre 1 mM EDTA, pH 8.0). Varm blandingen i en mikrobølgeovn til alle agarose har oppløst.
- Når agarose har oppløst, kule løsningen på ca 50 ° C, og deretter legge 5 μL DNA flekker fargestoff. Bland løsningen godt og hell den i en gel skuff i en avstøpning kammer. Sette inn en eller flere rader med godt kammer slik at det er tilstrekkelig brønner for alle prøver, i tillegg til molekylær størrelse markører. Tillate gel angi for 30 min.
- Når PCR kjøringen er fullført, kan du legge 4 µL av 6 x DNA laste fargestoff til hvert utvalg. Plasser gel i geleelektroforese kammeret og legge TAE buffer til brønnene er dekket.
- Bruk 10-15 µL fra hver PCR reaksjon på en brønn i gel. Også legge til 5 µL av merketråd molekylær størrelse. Deretter Kjør gel i 30 min på 75 V.
- Når kjøringen er fullført, bilde gel med et blått lys imager.
6. andre teknikker
-
Protein uttrykk
Merk: Uttrykk for test proteiner (YadA og EibD) har blitt beskrevet i detalj andre steder23,24. Dette er et kort sammendrag av de viktigste trinnene.- Transformere BL21ΔABCF ΔtamA with nødvendig plasmider (pIBA2-YadA og pEibD10 og tilhørende kontroll plasmider) og velge transformants på LB + Amp.
- For protein uttrykk, vaksinere 100 mL LB medium + Amp med 1 mL av en overnatting kultur transformert bakterier og vokse disse på 30 ° C til midten av Logg fase, da, indusere protein produksjon med enten anhydrotetracycline (på 100 ng/mL) eller isopropyl thiogalactoside (på 0,5 mM).
- Etter 2 timer med induksjon ved 30 ° C, måle turbiditet av kulturer og samle en rekke cellene tilsvarer 50 mL på OD600 = 1.0 av sentrifugering kulturer i 15 min 4000 x g. Vask pellet 1 x med 10 mM HEPES, pH 7.4, og deretter enten lagre den på 20 ° C eller forarbeide det videre som i trinn 6.2.
-
Ytre membran utvinning
Merk: Ytre membran utvinning utføres som beskrevet i detalj av Leo et al. 27. de viktigste trinnene er oppsummert nedenfor.- Resuspend celle pellet i 1 mL av 10 mM HEPES, pH 7.4, supplert med 10 mM MgCl2 , MnCl2, lysozyme (0,1 mg/mL) og et snev av DNase jeg.
- Lyse cellene (f.eksbruke en perle visp).
- Sentrifuge cellene kort tid (2 min 15,600 x g) for å fjerne celle rusk og flytte nedbryting slik frisk.
- Sentrifuge celler for 30 min 16.000 x g, hvoretter, resuspend pellet i 400 μL 1% N-lauroyl sarcosine i 10 mM HEPES, pH 7.4.
- Inkuber cellene med agitasjon for 30 min ved romtemperatur, hvoretter, sentrifuge dem i 30 min som ovenfor.
- Vask gjennomsiktig pellets 1 x med 200 μL av 10 mM HEPES, pH 7.4, resuspend det i 30 μL 10 mM HEPES og tilsett 10 μL av 4 x SDS side eksempel buffer.
-
Aktivitet analyser
Merk: Utføre SDS side og aktivitet analyser for YadA og EibD som beskrevet28. De viktigste trinnene er oppsummert nedenfor. -
SDS-SIDE
- Varme prøvene ved 50 ° C i 5 minutter før du legger dem til en polyakrylamid gel, å unngå denaturing proteiner.
- Etter separasjon i SDS-side, kan du overføre proteiner til en polyvinylidene difluoride (PVDF) membran.
- Blokkere membranen med 2% skummet melk pulver i PBS etter overføringen.
-
YadA-kollagen langt-western blot
- Etter blokkering, legge til storfe kollagen type jeg utvannet blokkerer buffer i en konsentrasjon av 10 μg/mL og ruge membranen 1t.
- Vask membranen 2 x med PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T).
- Legge til primære antistoff (monoklonale anti-kollagen COL-1) membranen, utvannet 1:2,000 blokkerer buffer.
- Etter rugende membranen 1t, vask 2 x som nevnt i trinn 6.3.2.2 og deretter legge til sekundære antistoff [geit anti-musen IgG-pepperrot peroxidase (HRP) konjugert], utvannet 1:10,000 blokkerer buffer.
- Inkuber membranen 1t, så vaske det 2 x med PBS-T. Legge til en forbedret chemiluminescent substrat membranen i henhold til produsentens instruksjoner og oppdage bandet bruker et CCD kamera.
-
EibD-IgG bindende analysen
- Etter blokkering, kan du legge til en sekundær antistoff (geit anti-kanin HRP), utvannet 1:2,000 blokkerer buffer.
- Inkuber membranen 1t, så vaske det 2 x med PBS. Utføre chemiluminescent gjenkjenning som nevnt i trinn 6.3.2.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av en tamA Knock-out av BL21ΔABCF:
Strategi skissert ovenfor har tidligere blitt brukt til å produsere en avledede stamme av BL21(DE3), en standard laboratorium belastning brukt for protein produksjon, som er optimalisert for ytre membran protein produksjon og kalt BL21ΔABCF21. Denne belastningen mangler fire gener koding for rikelig ytre membran proteiner, og derfor er i stand til å produsere mer heterologously uttrykt ytre membran proteiner enn vill-type belastningen. For å teste om TAM er involvert i TAA biogenesis, ble tamA genet slettet i denne bakgrunn.
En P1 lysate var forberedt fra Keio samling stammen JW4179, hvor tamA genet (tidligere kalt yftM) coding sekvensen er erstattet av en Kan motstand kassett. Deretter ble en signaltransduksjon eksperiment utført med BL21ΔABCF som mottaker belastningen. Flere Kan-resistente kolonier ble oppnådd, etter som to ble valgt for eksisjon av Kan kassetten. Plasmider pCP20, koding FLP-recombinase ble introdusert i disse kloner, og deretter kurert av vokser 43 ° C i fravær av en antibiotikumet utvalg. En rekke kloner ble vist for følsomhet for både Amp (som er en markør for pCP20) og Kan, og flere kloner følsomme for begge ble oppnådd. Disse Klonene ble bekreftet av kolonien PCR bruker primere flankert tamA koding sekvens og fant at tamA genet hadde blitt slettet (Figur 4).
Tamas rolle i TAA Biogenesis:
TamA har vist seg å være involvert i biogenesis på en klassisk autotransporters16 og omvendt autotransporter intimin15. For å teste om TamA er viktig for biogenesis av TAAs, ble BL21ΔABCF ΔtamA forvandlet med Plasmidene koding to test proteiner, Yersinia adhesin YadA og E. coli Ig-bindende protein EibD. Disse proteinene er kjent for å uttrykke i E. coli og har vært brukt som modeller for TAA biogenesis i tidligere studier23,28.
Etter induserende protein produksjon, ble ytre membran fraksjoner av uttrykket kulturer isolert og analyseres av SDS-side. Prøvene ble ikke kokt for å demonstrere trimerization av proteiner. Trimers kjøre på størrelser over 100 kDa, mens monomerer forventet størrelser av 45 kDa (YadA) og 51 kDa (EibD). Ingen store forskjeller ble observert mellom uttrykk nivåer i BL21ΔABCF og BL21ΔABCF ΔtamA, selv om YadA synes å bli produsert på noe lavere nivåer i ΔtamA belastningen (figur 5A). Men synes motsatt å være tilfelle for EibD.
For å undersøke om mangel på TamA kan påvirke riktig folding eller transport av proteiner, ble deres evne til å binde til ligander testet. For YadA, ble dette gjort av en kollagen langt-western blot (figur 5B). YadA, bundet både belastninger, kollagen på et tilsvarende nivå, demonstrere at protein er riktig foldet og funksjonelle. Tilsvarende IgG-bindende aktivitetene til EibD i de to stammene korrelert med hvilket uttrykk (figur 4C). Disse resultatene viser at sletting av tamA ikke har en betydelig effekt på TAA biogenesis, i hvert fall ikke for disse to modell TAAs.
Figur 1: generasjon av fortrenging med excisable antibiotika kassetter. For å produsere den gen knock-outs, er en genet av interesse (Gene B i dette eksemplet) erstattet av en Kan motstand kassett flankert av FRT nettsteder. FRT-Kan kassetten, i sin tur er flankert av kort (~ 50 bp) strekninger av sekvens homologe til oppstrøms og nedstrøms regionene Gene B. Koding sekvensen av Gene B mellom to FRT-Kan kassetten ved λ røde rekombinasjon. Når dette er skjedd, kan Kan kassetten selv fjernes ved å innføre FLP recombinase, som vil formidle en områdespesifikk rekombinasjon mellom FRT områder. Dette avgifter Kan kassetten, forlate en minimal (~ 100 bp) arr rekkefølgen B locus. For detaljer, se Baba et al. 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Gene sletting av P1 signaltransduksjon. Giveren belastning (beige) bærer en Kan kassett som har erstattet genet av interesse (gul) på kromosomet (blå). Giveren er infisert med P1 bacteriophage. Phage multipliserer i donor belastningen, produserer en rekke progenies. De fleste er vill-type (rød genomet), men en brøkdel er transducing phages som har tatt en del av donor belastning kromosom i stedet for phage DNA (blå genomet). En andel av disse inneholder Kan kassetten (gul genomet). Til slutt, infiserte vert cellen lyses og utgivelser phages til medium. Disse brukes til å forberede en lysate. I signaltransduksjon forsøket, er mottaker belastningen (lys blå) infisert med den lysate forberedt fra donor belastningen. I en minoritet tilfeller, er mottakeren infisert av et transducing phage bærer Kan kassetten (vist her). Hvis områdene ved Kan kassetten gjennomgå homologe rekombinasjon, er Kan kassetten innlemmet i mottakerens kromosomet erstatter det endogene allelet, noe som resulterer i Kan-resistente kloner som kan velges for. Tillegg av FLP recombinase på en helbredelig plasmider avgifter Kan kassetten, forlater bare en kort arr rekkefølge (vist her i gult), som tilbakestilles klone til Kan-sensitive fenotypen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksempler på plater etter en P1 infeksjon. (A) dette panelet viser en plate med personlige plakk. (B) dette panelet viser en semi confluent plate. (C) dette panelet viser en over infiserte plate, der nesten alle bakterier har blitt lysed av phage. Noen motstandsdyktig kolonier har vokst ut av topp agar laget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Sletting av tamA koding sekvens. TamA::kan sletting allelet ble introdusert i belastning BL21ΔABCF av P1 signaltransduksjon. Etter excision av Kan kassetten, en arr sekvens (~ 100 bp) er alt som gjenstår på tamA locus. Dette ble bekreftet av PCR, bruke grunning flankert webområdet sletting. I BL21ΔABCF og dens overordnede belastning, BL21(DE3), gir PCR et produkt hvor tamA koding sekvens (den forventede størrelsen er 1,7 kilobase par). I BL21ΔABCF, der Kan kassetten har vært forbrukeravgift, produktet tilsvarer forventede arr sekvensen (145 bp). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Uttrykk for TAAs av en tamA sletting stamme. (A) dette panelet viser SDS-siden av ytre membraner forberedt fra celler uttrykke TAAs (YadA eller EibD) og vektor kontroller (pIBA2 og pET22). Stammene er BL21ΔABCF og dens avledede belastning mangler TamA (ΔtamA). (B) dette panelet viser en kollagen langt-western blot YadA prøvene. YadA prøver og pIBA2 kontroller fra panelet A ble overført til en PVDF membran og inkubert med kollagen type jeg. De var da analysert med et anti-kollagen antistoff og oppdaget av ECL. (C) dette panelet viser et antistoff bindende analysen for EibD prøver. EibD prøver og pET22 kontroller fra panelet A ble overført til en PVDF membran og inkubert med en sekundær HRP-konjugerte antistoffer og deretter oppdaget av ECL. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | 1 x mix | 7 x mix |
| PCR-grade vann | 17 ΜL | 119 ΜL |
| 10 x polymerase buffer | 2 ΜL | 14 ΜL |
| 10 mM deoxyribonucleotide mix | 0,4 ΜL | 2,8 ΜL |
| 100 µM frem primer | 0,2 ΜL | 1.4 ΜL |
| 100 µM bakover grunning | 0,2 ΜL | 1.4 ΜL |
| Taq DNA utvalg | 0,2 ΜL | 1.4 ΜL |
| Totalt | 20 ΜL | 140 ΜL |
Tabell 1: kolonien PCR master mix. Mengden av blanding, avhenger av antall koloniene til å bli vist. I tillegg klargjør en kontroll reaksjon (opprinnelige mottakeren belastning). For eksempel hvis screening fem kloner, er seks reaksjoner nødvendig, inkludert kontrollen. Det er verdt forbereder en ekstra reaksjon for å sikre at det er nok PCR blanding for alle utvalg (gjentatt pipettering forsterker små pipettering feil). I dette eksemplet kan du forberede en 7 x blanding (5 kolonier, 1 kontroll og 1 ekstra reaksjon).
| Trinn | Temperatur | Tid | Notater |
| 1. | 94 ° C | 3 min | |
| 2. | 94 ° C | 30 s | |
| 3. | 50 ° C | 30 s | |
| 4. | 70 ° C | 2 min | 1 min/kb å være forsterkes, runde opp |
| Gå tilbake til trinn 2 24 ganger | |||
| 5. | 70 ° C | 5 min | |
| 6. | 12 ° C | for alltid | siste hold |
Tabell 2: Kolonien PCR programmet.
Supplerende fil 1: et eksempel på rutenett colony. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
P1 signaltransduksjon er en rask, robust og pålitelig metode for å generere genet slettinger i E. coli. Dette er demonstrert her av transducing en tamA sletting mutant fra en Keio donor belastning til en BL21-avledet mottaker. Store stadier i signaltransduksjon prosess er produksjon av den transducing lysate, signaltransduksjon selv, eksisjon av Kan motstand kassetten og verifisering av knock-out av PCR. Totalt prosessen tar ca 1 uke og krever ingen molekylærbiologi metoder brukes, bortsett fra den siste PCR for verifikasjon. Dermed P1 signaltransduksjon kan konkurrere i utvidet innsats og tid med λ rød rekombinasjon og er mye raskere enn tradisjonelle markør exchange mutagenese.
Presentert protokollen er svært robust, og tillater modifikasjoner av mange av foranstaltningene. Det er imidlertid noen kritiske parametere. For P1 infeksjoner er det nødvendig å legge kalsiumioner til mediet. Kalsium er nødvendig for opptak av phage til bakterier, og unnlatelse av å legge til nok kalsium til medium vil redusere effektiviteten av infeksjonen. Noen bakteriell stammer som BL21ΔABCF tendens til å samle i nærvær av CaCl221. I slike tilfeller kan bakterier dyrkes uten CaCl2, som kan legges til suspensjon kort tid før infeksjonen. Men for mer konvensjonelle stammer, kan 10 mM CaCl2 inkluderes i vekst medium fra begynnelsen.
Derimot er det viktig å fjerne gratis kalsium fra mediet etter signaltransduksjon. Citrat er en chelator av kalsiumioner, og fordi dette er nødvendig for opptak av P1 vert celler, fjerne gratis kalsium fra mediet hindrer videre infeksjoner. Hvis kalsium ikke er fjernet, vil phages infisere ytterligere celler i hele kulturen, i beste fall redusere effektiviteten av signaltransduksjon og i verste fall lysing hele kulturen, inkludert transductants.
Et annet viktig skritt er dyrking bakterier bærer plasmider pCP20. pCP20 er en betinget etterligner plasmider som ikke replikerer ved temperaturer på 37 ° C eller høyere; dermed for å etablere plasmider i cellene, incubations med denne plasmider må være utført på 30 ° C (eller lavere), en temperatur ettergivende for replikering av pCP20. For herding pCP20, brukes høy temperatur (43 ° C). Noen bakteriestammer vokser ikke godt ved denne temperaturen; i slike tilfeller bør 37 ° C nok, selv om plasmider herding vil være litt mindre effektiv ved denne temperaturen.
Når plating bakterier å teste for antibiotikumet følsomheten, er rekkefølgen på plate striper viktig. Protokollen Etterlyser kloner å være stripete først på antibiotika inneholder plater og til slutt på ikke-selektive medium. På denne måten etterforskeren kan være sikker på at mangel på vekst på selektiv media skyldes antibiotikumet følsomheten og i stedet for potensielle mangel av materiale overført på platene. Følge protokollen, ingen vekst på LB + Kan plate validerer eksisjon av Kan motstand kassetten; ingen vekst på LB + Amp plate validerer tap av rekombinasjon plasmider pCP20; stammer vokser på LB plate (som ikke vokser i samme streker eksperiment på utvalg plater) inneholder de positive recombinants.
De fleste av de andre trinnene gir betydelig spillerom. I protokollen som presenteres, er BL21ΔABCF kultivert på 30 ° C, som denne belastningen ikke vokser godt på 37 ° C. Imidlertid kan E. coli stammer uten vekst defekter bli kultivert på 37 ° C (unntatt når forvandlet pCP20).
Hvor mange bakterier brukes for infeksjoner kan varieres til noen grad. Forholdet mellom OD600 og en levedyktig teller er omtrent lineær mellom en OD600 verdi på 0,1 og 1.0, der den tidligere tilsvarer ca 108 cfu/mL og sistnevnte til ~ 109 cfu/mL. Dette forholdet kan imidlertid variere til en viss grad avhengig av belastningen i spørsmålet, vekstmediet og andre faktorer. Det anbefales at forholdet mellom OD600 og levedyktig greven skal opprettes for hvert laboratorium og belastninger, spesielt for å beregne MOI verdier. Hvor mange bakterier smitte forsøk er ikke spesielt kritisk og 109 cfu/mL representerer tidlig stasjonære fasen, som er et rettferdig kompromiss celle tetthet og andelen av levedyktige cellers i kulturen. Hvis et lavere antall levedyktig bakterier brukes til signaltransduksjon, må antall phages bare justeres tilsvarende. MOI selv kan også varieres til en viss grad. Protokollen krever en MOI verdi på 0,5, selv om alt mellom 0,1 og 0,5 skal resultere i en god effektivitet. På en MOI på 0,5 er phages for bakterier 1:2 (dvs., halvparten av antall phages i forhold til antall bakterier). I eksemplet i protokollen OD600 kultur er 1.0, og 1 mL av kulturen brukes for signaltransduksjon; Dermed er antall phages som kreves 5 x 10-8. En MOI verdi på 0,5 gir høy infeksjon, men reduserer antall bakterier som er dobbelt infisert, som ville redusere effektiviteten av signaltransduksjon vill-type (smittsom) phages langt tallmessig de transducing phages. En dobbel infeksjon med en transducing phage og en smittsomme phage ville føre til celle lysis, dermed eliminere denne transductant fra pool av overlevende. Derfor bør en MOI på 0,5 ikke overskrides.
Protokollen kan også noen snarveier. I stedet for å forberede lysates fra platene, noen forfattere advokat forberede phage lysates i flytende medium29. Dette kan spare tid som en overnatting inkubasjon trinnet ikke er nødvendig. Tilsvarende kan titrating phage lysate ikke være nødvendig. Som nevnt ovenfor, MOI er ikke veldig kritisk og rimelig effektivitet oppnås ved å bare anta en titer 1010 pfu/ml for en standard lysate.
Til tross for enkelt teknikken, P1 signaltransduksjon er ikke allment tilgjengelig, og flere betingelser må være oppfylt å være nyttig. Først må en donor stamme med en valgbar knock-out allelet være tilgjengelig. Dette gjøres vanligvis ved hjelp av en sletting der en antibiotikaresistens kassett har erstattet genet av interesse. Keio samlingen er spesielt nyttig i denne forbindelse, som det gir en klar-å-bruke biblioteket antibiotika kassett-baserte genet knock-outs som dekker nesten alle ikke-essensielle gener i E. coli K12. Denne samlingen er spesielt nyttig for fortrenging bevarte gener i de fleste E. coli stammer (dvs., bestanddeler av E. coli kjernen genomet). For mindre vanlige gener, som virulens faktorer av patogene E. coli stammer eller sjeldne stoffskiftebane gener, mutasjonen må opprettes de novo. I slike tilfeller kan P1 signaltransduksjon vel ikke være metoden for valg. Viktig gener er gener som kreves for P1 infeksjon, for eksempel galU, mutasjoner som fører til P1 motstand30, dårlig mål for sletting av P1 signaltransduksjon. En annen merknad om samlingen Keio, spesielt er at noen stammer bærer en duplisering av målrettet genet, der bare én kopi forstyrret av Kan motstand kassett8. I slike tilfeller kan genet av interesse være avgjørende; etterforskerne anbefales å sjekke oppdaterte merknader for slike gener8. Men tillater gitt disse begrensningene, P1 signaltransduksjon sletting av de fleste gener i laboratorium E. coli stammer. For eksempel forskjellene mellom BW25113 og BL21(DE3) er små og påvirker bare en håndfull av protein-koding gener31.
Dernest er det viktig å understreke at mottakeren belastning må støtte en homologe rekombinasjon for signaltransduksjon å arbeide. En stamme mangler recombinase RecA kan derfor endres ikke av denne metoden. Dette ekskluderer alle standard kloning stammer, som DH5α, HB101, TOP10 og XL-1 blå. RecA kan megle recombinations mellom identiske strekninger idet kort idet 8 bp; men en lengre regionen høy likheten vil øke sannsynligheten for rekombinasjon betydelig32,33. Et annet problem, spesielt med klinisk E. coli påkjenningen, er at lange O-antigen kjeder kan maskere reseptoren for P1, som ligger i kjernen oligosaccharide av lipopolysakkarid34. I tillegg til disse kravene for mottakeren belastningen bør P1 påkjenningen brukes for signaltransduksjon være en vir mutant; Denne mutasjonen kreves for full lytisk infeksjon35.
En tredje påminnelse av P1 signaltransduksjon er at genet å bli slått ut bør ligge i et område med høy likheten i regionene flankemanøveren mellom giver og mottaker stammer. Hvis det er en mangel på synteny mellom stammene, kan utskifting av målet genet koding sekvens med Kan kassetten også mislykkes, på grunn av forskjeller i innholdet i regionene flankemanøveren. Derfor før embarking på P1-mediert genet sletting, bør etterforskere sjekke sekvenser av giver og mottaker toner at flankemanøveren sekvensene er homologe. Selvfølgelig, er dette bare mulig hvis stammene har blitt sekvensert. Ved stammer med en ukjent sekvens, P1 signaltransduksjon enten mislykkes eller forårsake andre problemer, for eksempel et gen konvertering i flankemanøveren regioner. P1 kan transduce ca 90 kilobase par av DNA; Hvis det er forskjeller i genet innholdet i regionene rundt målet genet (f.eksliten slettinger og innsettinger), er det sannsynlig at dette vil gå til donor sekvensen. Dette kan ha utilsiktede konsekvenser på fenotypen av mottakeren belastningen. Derfor bør sekvenser av giver og mottaker rundt genet av interesse alltid sammenlignes før P1 signaltransduksjon der det er mulig.
Avslutningsvis er P1 signaltransduksjon en rask måte å overføre en bestemt gen banke ut til flere stammer når første knock-out mutasjon har blitt generert. Om teknikken har begrensninger, gjør den enkle og hastigheten på implementeringen det et attraktivt alternativ til andre metoder for genet sletting. P1 infiserer bare E. colisom vanligvis begrenser bruken til denne arten. Men noen varianter av P1 er utviklet som et bredere vert utvalg og kan infisere andre arter i familien Enterobacteriaceae, og noen andre γ-proteobacterial arter, men redusert effektivitet36, 37. selv signaltransduksjon klonet DNA fra E. coli til en cellemembran, en ses-proteobacterium, har vært rapportert38. I senere eksperimenter, kunne disse variantene bli forsterket med vir mutasjon å utvide omfanget av mottakeren stammer brukt antibiotika kassett-baserte genet sletting av generelle signaltransduksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Keio samling stammer ble innhentet fra National BioResource Project (NIG, Japan): E. coli. Vi takker Dirk Linke (avdeling av biovitenskap, UiO) for sin fortsatte støtte. Dette arbeidet ble finansiert av forskningsråd Norge ung forsker grant 249793 (til Jack C. Leo).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
References
- Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
- Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
- Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
- Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
- Baba, T., Huan, H. -C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, Clifton, NJ. 183-194 (2008).
- Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
- Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
- Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
- Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
- Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
- Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
- Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
- Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
- Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
- Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
- Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
- Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), London, UK. 1021-1030 (1993).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 157-167 (2015).
- Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
- Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., et al. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 1, Unit 1.17 (2007).
- Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
- Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
- Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
- Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
- Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
- Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
- Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
- Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
- O'Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).
