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Genetics

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

doi: 10.3791/58267 Published: September 1, 2018

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

Abstract

Uma primeira abordagem para estudar a função de um gene desconhecido em bactérias é criar um knock-out deste gene. Aqui, descrevemos um protocolo robusto e rápido para transferência de mutações do gene exclusão de uma estirpe de Escherichia coli para outro usando transdução generalizada com o bacteriófago P1. Este método requer que a mutação seja selecionável (por exemplo, baseado em interrupções de gene usando inserções de gaveta antibiótico). Tais fitas antibióticas podem ser mobilizadas a partir de uma estirpe de doador e introduziram uma destinatário estirpe de interesse para rapidamente e facilmente geram um mutante de apagamento do gene. A gaveta antibiótica pode ser projetada para incluir sites de reconhecimento de flipase que permitem que a excisão da fita por um site-specific recombinase para produzir um nocaute limpo com apenas uma sequência de ~ 100-base-par-longa cicatriz no genoma. Demonstramos o protocolo ao nocautear o gene de tamA codifica um fator de montagem envolvido na biogênese de autotransporter e testar o efeito desse nocaute sobre a biogênese e a função de dois autotransporter trimeric adesinas. Embora a supressão do gene por transdução P1 tem suas limitações, a facilidade e rapidez de sua implementação seja uma alternativa atraente para outros métodos de apagamento do gene.

Introduction

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Uma primeira abordagem comum para estudar a função de um gene é executar o mutagenesis de mata-mata e observar o fenótipo resultante. Isto também é denominado genética reversa. A bactéria e. coli tem sido o carro-chefe da biologia molecular nos últimos 70 anos, ou então, devido à facilidade do seu cultivo e sua acessibilidade para manipulação genética1. Vários métodos foram desenvolvidos para produzir exclusões de gene em e. coli, incluindo troca de marcador a mutagênese2,3 e, mais recentemente, recombineering usando o λ vermelho ou Rac ET sistemas4,5 , 6.

Em um sistema amplamente utilizado, codificação de sequências de genes individuais são substituídas por uma gaveta de resistência aos antibióticos que pode mais tarde ser extirpada do cromossoma5,7. As sequências de codificação são substituídas, por exemplo, uma gaveta de resistência de canamicina (Kan), que é ladeada por sites de destino (FRT) de reconhecimento de flipase (FLP) em ambos os lados. Os sites da FRT são reconhecidos pela recombinase FLP, que medeia a site-specific recombinação entre os sites FRT, levando à supressão da fita Kan. Desta forma, uma exclusão total de sequência de código de um determinado gene pode ser conseguida, deixando para trás apenas uma sequência de cicatriz mínima de aproximadamente 100 pares de bases (bp) (Figura 1).

Pouco mais de uma década atrás, foi desenvolvida a coleção chamada de Keio. Esta é uma biblioteca bacteriana com base em um padrão de laboratório cepa de Escherichia coli K12, onde quase todos os genes não essenciais foram individualmente excluídos por λ recombinação vermelho7,8. Os clones dentro de cada coleção tem uma sequência de código substituída com uma gaveta de resistência Kan sujeitas. A coleção de Keio provou para ser uma ferramenta útil para muitas aplicações9. Uma tal aplicação é a produção de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . A gaveta de Kan de um clone de exclusão determinada pode ser mobilizada por geralmente transducing bacteriófagos, tais como P110,11,12,13,14. Um estoque de fago preparado a partir de uma tensão tão grande pode ser usado para infectar um destinatário Escherichia coli cepa de interesse, onde em uma frequência baixa, mas de confiança o Kan região contendo gaveta pode ser incorporada o genoma destinatário por recombinação homóloga (Figura 2). Transductants podem ser selecionados para o crescimento em meio de Kan-contendo. Em seguida, se a remoção da fita resistência aos antibióticos é desejada, a recombinase FLP pode ser fornecido para a estirpe transductant em trans. Após a cura o plasmídeo contendo FLP, que transporta um marcador de resistência a ampicilina (Amp), clones de Kan e Amp-sensíveis são selecionados para, e a correta excisão de sequência de codificação a selvagem-tipo e a gaveta de Kan são verificadas por PCR de colônia.

Aqui, é apresentado um protocolo detalhado, descrevendo cada uma das etapas na produção de uma estirpe de Escherichia coli , baseado na estratégia delineada acima de mata-mata. Como exemplo, uma deleção do gene da tamA é demonstrada. tamA codifica uma proteína de β-barril de membrana exterior que é uma parte do transporte e módulo de montagem (TAM), que está envolvida na biogênese de certas proteínas autotransporter e pili15,16,17. Esta estirpe de mata-mata foi usado para examinar o efeito da exclusão tamA sobre a biogênese de dois autotransporter trimeric adesinas (TAAs), a Yersinia adesina YadA e a Escherichia coli imunoglobulinas (Ig)-vinculação TAA EibD 18,19.

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Protocol

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1. cepas e plasmídeos

  1. Estirpes bacterianas
    1. Use a e. coli as estirpes BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20e BL21ΔABCF21. Consulte Tabela de materiais para mais informações.
  2. Bacteriófagos
    1. Use o fago P1vir para a transdução geral. Armazenar a Praga como um estoque líquido com algumas gotas de clorofórmio (consulte a etapa 2.2). Para obter mais informações, consulte Tabela de materiais.
  3. Plasmídeos
    1. Use os seguintes plasmídeos neste protocolo: pCP2022, pIBA2-YadA23e pEibD1024. Como plasmídeos de controle, use pASK-IBA2 e pET22b (ver Tabela de materiais).
  4. Condições de crescimento
    1. Propaga as bactérias em um lisogenia caldo (LB) médio25 com agitação vigorosa (180 – 200 rpm) a 37 ° C ou 30 ° C, no caso de tensões que contém pCP20 e BL21ΔABCF.
    2. Executar o plasmídeo curando a 43 ° C.
    3. Para um meio sólido, suplemento LB com ágar de 1% (p/v).
    4. Para ágar superior, suplemento LB com 0,7% agar e 10 mM CaCl2 e autoclave a médio. Use meio de SOC para a recuperação após electroporation26.
    5. Use as seguintes concentrações de antibióticos: 100 μg/mL para o Amp e 25 μg/mL para Kan.

2. preparar um Phage lisado

  1. Infecção da estirpe dos doadores
    1. Crescer a tensão do doador JW4197 em 5 mL de LB suplementado com 10 mM CaCl2 e opcionalmente com Kan (25 µ g/mL) para uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Medir o valor de600 OD usando um espectrofotômetro.
    2. Fazer uma série de diluição de um stock de fago P1 existente no meio de LB: recomendado diluições são entre 10-3 a 10-7.
    3. Mix de 200 μL da suspensão bacteriana e 100 μL de uma diluição do fago determinado em um tubo de centrífuga de 15 mL ou equivalente. Prepare os tubos como muitos como diluições do fago. Incube os tubos por 20 min a 37 ° C, sem agitação.
    4. Adicionar ~ 3 mL de ágar superior fundido (~ 50 ° C) suplementado com 10 mM CaCl2 para os tubos, homogeneizar o conteúdo vortexing dos tubos em breve e despeje as misturas em placas LB escaldadas para fazer camadas mesmo.
    5. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.
  2. Lisado preparação
    1. No dia seguinte escolha uma placa com um crescimento semi confluente de placas do fago. Em um prato semi confluente, aproximadamente metade da área de superfície da placa é evidente (Figura 3).
    2. Raspar a camada superior de ágar de tal uma placa usando um loop de inoculação ou uma ferramenta semelhante e coloque o ágar superior num tubo de centrífuga. Adicionar 1 a 2 mL de LB e uma gota de clorofórmio e vortex o tubo vigorosamente para ~ 1 min Add o clorofórmio em uma coifa.
    3. Centrifugar o tubo durante 15 minutos a 4.000 x g ou mais rápido para o agar e células bacterianas de Pelotas.
    4. Mova o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora fresco, evitando carregando ao longo de todos os restos da pelota. Adicione 2 gotas de clorofórmio e armazenar o lisado 4 e 10 ° c. Adicione clorofórmio em uma coifa. Não congele o fago lisado como isso irá resultar em uma redução significativa do número de partículas infecciosas.
  3. Determinação do título de lisado
    1. Cresce BW25113 em LB suplementado com 10 mM CaCl2 a 37 ° C até a cultura atinge uma OD600 ~ 1.0.
    2. Prepare uma série de diluição do fago lisado em LB (por exemplo, 10-6– 10-9).
      Nota: Tenha cuidado para pipetar amostra do topo do lisado para evitar a transferência de clorofórmio para as diluições.
    3. Mix de 200 μL da suspensão bacteriana e 100 μL de uma diluição do fago determinado em um tubo de centrífuga de 15 mL ou equivalente. Prepare os tubos como muitos como diluições do fago. Incube os tubos por 20 min a 37 ° C, sem agitação.
    4. Adicionar ~ 3 mL de ágar superior fundido (~ 50 ° C) suplementado com 10 mM CaCl2 para os tubos, homogeneizar o conteúdo vortexing dos tubos em breve e despeje a mistura em placas LB escaldadas para fazer camadas mesmo.
    5. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.
    6. No dia seguinte contar o número de placas (regiões claras na esteira da bacteriana) por cada placa e calcular o título do lisado, usando a seguinte fórmula:
      Equation 1
      Exemplo: Em placas com as diluições 10-7, 10-8e 10-9, existem 231, 27 e 2 placas, respectivamente. Como 100 μL de cada diluição foi utilizado para a infecção, e porque o título é expresso como formadoras de placa unidades (pfu) / mL, o fator do chapeamento é 10. Estes números são inseridos na fórmula:
      Equation 2
      Assim, o título é aproximadamente 2 x 1010 do fago infecciosas partículas/mL.

3. P1 transdução

  1. Preparando as células destinatários
    1. Crescer o destinatário estirpe BL21ΔABCF em LB suplementado com uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Use um espectrofotômetro para medir o valor de600 OD.
    2. Calcule o volume do fago lisado necessário para a realização de uma multiplicidade de valor de infecção (MOI) de 0,5. Para calcular o MOI, estime o número de bactérias baseada o OD600 da cultura. Suponha que um valor de600 OD de 1.0 corresponde ~ 109 UFC/mL. Calcule o volume necessário com base do título conhecido do lisado.
      Exemplo (com base do título calculado no exemplo após etapa 2.3.6):
      Equation 3
    3. Adicione o CaCl2 para a cultura de estirpe destinatário a 10 mM e misture. Tome 1 mL da cultura para a transdução.
  2. Realizando a transdução
    1. Adicionar o volume apropriado do fago lisado a 1 mL de cultura destinatário (incluindo CaCl2 a 10 mM), conforme calculado no passo 3.1.2 e misture delicadamente.
      Nota: Tenha cuidado para pipetar amostra do topo do lisado para evitar transferir clorofórmio à mistura.
    2. Estaticamente, incubar a mistura por 20 min a 37 ° C.
    3. Pare a infecção pela adição de citrato de sódio, pH 5,5 a 100 mM.
    4. Centrifugar as bactérias (5.000 x g por 2 min) e remover o sobrenadante e, em seguida, resuspenda-los em 1 mL de fresco LB suplementado com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5.
    5. Lave as células mais duas vezes como na etapa 3.2.4 para garantir a remoção do fago livre e cálcio.
    6. Ressuspender as bactérias em 1 mL de fresco LB suplementado com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5. Incube a bactéria a 30 ° C, durante 1 h com agitação (> 100 rpm).
    7. Recolher as bactérias por centrifugação (5.000 x g por 2 min) e Resuspenda-los em ~ 100 μL de LB com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5.
    8. Espalhar as bactérias em uma placa LB suplementado com Kan a 25 µ g/mL e citrato de sódio de 10 mM, pH 5,5 e crescer a bactéria a 30 ° C até colônias aparecem (~ 24 h).
  3. Selecionando as transductants
    1. Uma vez que as colónias têm crescido na placa de seleção, restreak-los na LB + Kan para colônias única e crescer a 30 ° C até colônias única aparecem.

4. extirpando a gaveta de Kan

  1. A transformação com plasmídeo de recombinação
    1. Fazer o electrocompetent de estirpe BL21ΔABCF Kan-resistente.
      1. Crescer a tensão de uma única colônia em fresco LB (5 mL), suplementado com Kan (25 µ g/mL) a 30 ° C até que o OD600 ~0.5-0,7.
      2. A partir daqui, execute as etapas a seguir a 4 ° C ou em gelo. Centrifugar as bactérias (5.000 x g durante 10 minutos) e remover o sobrenadante.
      3. Lave o centrifugado com água destilada gelada duas vezes, repetindo o passo anterior de centrifugação e, finalmente, resuspenda o pellet de células em 100 µ l de gelado 10% de glicerol.
    2. Arrefecer cubetas de eletroporação de 1 mm no gelo.
    3. Adicionar 1 pg de plasmídeo (pCP20) para a suspensão de eritrócitos, misture-os delicadamente a suspensão e transferi-lo para uma cubeta de eletroporação de refrigeração.
    4. Definir o electroporator para 1,8 kV e electroporate as células.
    5. Resgate de células transformadas, adicionando 1 mL de meio SOC e fazê-los crescer por 1h a 30 ° C.
    6. Placa de 100 µ l de células na LB + Amp placas e crescer as células a 30 ° C durante a noite.
  2. Indução da recombinação
    1. Palheta simples colônias do LB + Amp placa e inocular fresco LB, omitindo todos os antibióticos.
    2. Crescem as células à temperatura não-permissivo (43 ° C) durante a noite para induzir a expressão de recombinase FLP.
  3. Seleção de recombinantes
    1. Fazer diluições em série e 50 µ l de uma diluição de6 105-10 em placas não-seletivo da placa e cultivá-lo durante a noite a 30 ° C.

5. verificação da exclusão Gene

  1. Verificação da perda do plasmídeo e recombinação de sucesso
    1. Colônia de raia única dos pratos preparados na etapa 4.3.1 na LB Kan, LB + Amp e placas LB sem antibióticos, nesta ordem. Para ajudar as estrias, usar uma grade de Colônia (ver arquivo complementar 1). Crescem as placas a 30 ° C até colônias aparecem (~ 24 h).
    2. Pegue 10 – 20 clones que têm crescido na placa não-seletivo, mas não conseguiram crescer na mídia seletiva para posterior verificação.
  2. Verificação suplementar por PCR de colônia
    1. Realizar uma colônia PCR com primers flanqueando o tamA sequência de código (consulte a Tabela de materiais).
    2. Prepare uma mistura PCR a mestre. A quantidade de mistura necessária depende do número de colónias a ser testado (Veja o exemplo na tabela 1). Misture os reagentes no gelo, adicionar o polymerase última.
    3. Homogeneizar a mistura de mestre de PCR e, em seguida, diluir 20 µ l em tubos de uma tira PCR. Pegue uma pequena quantidade de cada colônia para ser exibido usando uma ponta de pipeta estéril e adicioná-lo para um tubo. Lembre-se de incluir a estirpe de destinatário original para comparação. Opcionalmente, também inclua a estirpe do doador.
    4. Executar uma reação de PCR (ver tabela 2 para o programa utilizado).
    5. Prepare um gel de agarose a 1%.
      1. Para um gel 50 mL, medir 0,5 g de agarose e adicionar 50 mL de tampão TAE (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM e 1 mM EDTA, pH 8.0). Aqueça a mistura em um forno de microondas até dissolver toda da agarose.
      2. Uma vez que a agarose dissolveu, arrefecer a solução para cerca de 50 ° C e adicione 5 μL de DNA coloração tintura. Misture a solução bem e despeje em uma bandeja de gel em uma câmara de fundição. Insira uma ou mais linhas de pentes bem assim há poços suficientes para todas as amostras, bem como marcadores de tamanho molecular. Permitir que o gel definir por 30 min.
    6. Uma vez concluída a execução PCR, adicione 4 µ l de 6 x tintura do carregamento de DNA de cada amostra. Colocar o gel na câmara de eletroforese e adicionar tampão TAE até os poços estão cobertos.
    7. Aplica 10 a 15 µ l de cada reação de PCR para um poço no gel. Também Adicione 5 µ l de um marcador de tamanho molecular. Em seguida, execute o gel por 30 min a 75 V.
    8. Uma vez concluída a execução, o gel usando um gerador de imagens de luz azul da imagem.

6. outras técnicas

  1. Expressão da proteína
    Nota: A expressão de proteínas de teste (YadA e EibD) tem sido descrito em detalhe em outro lugar,23,24. Este é um breve resumo das principais etapas.
    1. Transformar BL21ΔABCF ΔtamA with os necessários plasmídeos (YadA-pIBA2 e pEibD10 e os correspondente plasmídeos de controle) e selecione para transformants na LB + Amp.
    2. Para a expressão da proteína, inocular 100 mL de meio LB + Amp 1ml da cultura de bactérias transformadas durante a noite e crescer estas a 30 ° C até a fase log de mid, momento em que, induzir a produção de proteína com qualquer anhydrotetracycline (a 100 ng/mL) ou thiogalactoside isopropílico (a 0,5 mM).
    3. Depois de 2h de indução a 30 ° C, medir a turbidez das culturas e coletar um número de células, correspondente a 50 mL no OD600 = 1.0 por centrifugação as culturas por 15 min a 4.000 x g. Lave o pellet 1x com 10 mM HEPES, pH 7,4 e em seguida ou armazená-lo a-20 ° C ou processo etapa 6.2 ainda mais.
  2. Extração de membrana externa
    Nota: Extração de membrana externa é realizada conforme descrito em detalhe por Leo et al . 27. as principais etapas estão resumidas a seguir.
    1. Ressuspender o pellet de células em 1 mL de 10 mM HEPES, pH 7,4, suplementado com 10 mM MgCl2 e MnCl2, lisozima (0,1 mg/mL) e uma pitada de DNase eu.
    2. Lise as células (por exemplo, usando um batedor do grânulo).
    3. Centrifugar as células em breve (2 min a 15.600 x g) para remover os detritos celulares e mover o sobrenadante para um tubo de fresco.
    4. Centrifugar as células por 30 min a 16.000 x g, após o qual, resuspenda o pellet em 400 μL de 1% N-lauroyl sarcosina em 10 mM HEPES, pH 7,4.
    5. Incube as celulas com agitação por 30 min à temperatura ambiente, após o qual, centrifugue-los durante 30 min como acima.
    6. Lave o translúcido da pelota 1x com 200 μL de 10 mM HEPES, pH 7,4, resuspenda-lo em 30 μL de 10 mM HEPES e adiciona 10 μL de tampão de amostra SDS-PAGE de 4x.
  3. Ensaios de atividade
    Nota: Realizar ensaios de SDS-PAGE e atividade para YadA e EibD como descrito28. As principais etapas estão resumidas a seguir.
  4. SDS-PAGE
    1. Aquece as amostras a 50 ° C por 5 min antes de carregá-los em um gel de poliacrilamida, para evitar a desnaturação das proteínas.
    2. Após a separação em SDS-PAGE, transferi as proteínas para uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno.
    3. Após a transferência, bloquear a membrana com pó de leite desnatado 2% em PBS.
  5. Borrão do extremo-oeste YadA-colágeno
    1. Após o bloqueio, adicionar tipo de colágeno bovino que diluído em tampão de bloqueio a uma concentração de 10 μg/mL e incubar a membrana por 1h.
    2. Lavar a membrana 2 x com PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T).
    3. Adicione o anticorpo primário (anticorpo monoclonal anticolágeno COL-1) para a membrana, 1:2,000 diluído em tampão de bloqueio.
    4. Após a incubação da membrana por 1h, lave 2x como mencionado na etapa 6.3.2.2 e em seguida, adicione o anticorpo secundário [conjugado de peroxidase (HRP) de rábano-IgG de anticabra rato], 1:10,000 diluído em tampão de bloqueio.
    5. Incubar a membrana para 1 h e, em seguida, lave-o 2 vezes com PBS-T. Adicionar um substrato quimioluminescente reforçado para a membrana de acordo com as instruções do fabricante e detectar a banda usando uma câmera CCD.
  6. EibD-IgG ensaio
    1. Após o bloqueio, adicione um anticorpo secundário (de cabra anticoelho HRP), diluído 1:2,000 em tampão de bloqueio.
    2. Incubar a membrana para 1 h e, em seguida, lave-o 2 x com PBS. Execute a detecção quimioluminescente como mencionado na etapa 6.3.2.5.

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Representative Results

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Geração de um tamA Knock-out de BL21ΔABCF:

A estratégia acima descrita anteriormente foi usada para produzir uma tensão derivada de BL21(DE3), uma estirpe de laboratório padrão usada para a produção de proteína, que é otimizada para a produção de proteínas de membrana exterior e chamada BL21ΔABCF21. Esta tensão não possui quatro genes que codificam para proteínas de membrana externa abundante e, consequentemente, é capaz de produzir proteínas de membrana exterior expressa mais heterologously do que a estirpe selvagem-tipo. Para testar se a TAM está envolvido na biogênese TAA, o gene tamA foi excluído deste fundo.

Um P1 lisado foi preparada a partir da estirpe de coleção de Keio JW4179, onde o gene de tamA (anteriormente chamado yftM) sequência de código é substituído por uma fita de resistência de Kan. Em seguida, um experimento de transdução foi realizado com BL21ΔABCF como a destinatário estirpe. Obtiveram-se várias colónias Kan-resistente, depois que dois foram escolhidos para a excisão da fita Kan. O plasmídeo pCP20, codificação a recombinase FLP, foi introduzido estes clones e, posteriormente, curado crescendo a 43 ° C, na ausência de uma seleção de antibiótica. Um número de clones foram selecionado para sensibilidade ao Amp (que é um marcador de pCP20) e Kan, e obtiveram-se vários clones sensíveis para ambos. Estes clones foram verificados pela colônia PCR utilizando primers flanqueando o tamA sequência de código e achei que o gene tamA tinha sido excluído com êxito (Figura 4).

Papel do TamA na biogênese TAA:

TamA foi mostrado para ser envolvido na biogênese de alguns clássicos autotransporters16 e o autotransporter inversa Intimina15. Para testar se o TamA é importante para a biogênese de TAAs, BL21ΔABCF ΔtamA foi transformada com plasmídeos codificação dois proteínas de teste, a Yersinia adesina YadA e a Escherichia coli Ig-proteína EibD. Estas proteínas são conhecidas por expressar bem em e. coli e têm sido usados como modelos para biogênese TAA em anteriores estudos23,28.

Após a indução de produção de proteína, as frações de membrana exterior das culturas de expressão foram isoladas e analisadas por SDS-PAGE. As amostras não foram fervidas para demonstrar Trimerização das proteínas. Os trímeros executar em tamanhos acima de 100 kDa, Considerando que os monômeros tem esperado que tamanhos de 45 kDa (YadA) e 51 kDa (EibD). Não principais foram observadas diferenças entre os níveis de expressão em BL21ΔABCF e BL21ΔABCF ΔtamA, embora YadA parece ser produzido em níveis um pouco inferiores a tensão detamA Δ (Figura 5A). No entanto, o oposto parece ser o caso de EibD.

Para examinar se a falta de TamA possa influenciar o correto dobramento ou transporte das proteínas, sua capacidade de se ligar a ligantes foi testada. Para YadA, isso foi realizado por um borrão do extremo-oeste de colágeno (Figura 5B). YadA, em ambas as cepas, vinculado colágeno em um nível semelhante, demonstrando que a proteína é correctamente dobrada e funcional. Da mesma forma, atividades de IgG-vinculação de EibD nas duas variedades correlacionaram com o nível de expressão (Figura 4). Estes resultados demonstram que a supressão do tamA não tem um efeito significativo na biogênese TAA, pelo menos não para estes dois modelo TAAs.

Figure 1
Figura 1: geração de nocautes com sujeitos cassettes antibióticos. Produzindo o gene knock-outs, um gene de interesse (Gene B neste exemplo) é substituído por uma fita de resistência Kan ladeada por sites FRT. A fita de FRT-Kan, por sua vez, é ladeada por curto-circuito (~ 50 bp) estende-se da sequência homóloga às regiões a montante e a jusante do Gene B. A sequência de código do Gene B é trocada pela fita FRT-Kan por λ recombinação vermelha. Uma vez que isso é feito, a gaveta de Kan em si pode ser removida introduzindo a recombinase FLP, que vai mediar uma site-specific recombinação entre os sites FRT. Isto excises a fita Kan, deixando um mínimo (~ 100 bp) sequência no locus B da cicatriz. Para detalhes completos, consulte Baba et al 7. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: exclusão de Gene por transdução P1. O doador estirpe (bege) carrega um estojo de Kan que substituiu o gene de interesse (amarelo) no cromossomo (azul). O doador está infectado com o bacteriófago P1. O fago multiplica-se em tensão o doador, produzindo um grande número de progênies. São mais selvagem-tipo (genoma vermelho), mas uma fração são transducing fago que incorporou uma porção do doador estirpe cromossomo ao invés do fago do DNA (genoma azul). Uma proporção destes irá conter a gaveta de Kan (genoma amarelo). Eventualmente, a célula hospedeira infectada Lise e libera os fago entram no meio. Estes são usados para preparar um lisado. No experimento de transdução, a estirpe de destinatário (luz azul) está infectada com o lisado preparadas a partir da estirpe de doador. Numa minoria dos casos, o destinatário é infectado por um fago transducing carregando a gaveta de Kan (mostrada aqui). Se as regiões adjacentes ao estojo Kan submeter-se a recombinação homóloga, a gaveta de Kan é incorporada ao destinatário cromossomo substituindo o alelo endógeno, resultando em clones Kan-resistentes que podem ser selecionados para. A adição de recombinase FLP em um plasmídeo curável excises a fita Kan, deixando apenas uma cicatriz curta sequência (mostrada aqui em amarelo), que reverte o clone para o fenótipo de Kan-sensíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: exemplos de placas após uma infecção P1. (A), este painel mostra uma placa com placas individuais. (B), este painel mostra uma placa semi confluente. (C) este painel mostra uma placa over infectada, onde quase todas as bactérias têm sido lysed por fago. Algumas colônias resistentes têm crescido fora da camada superior de ágar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Exclusão do tamA sequência de código. o alelo de exclusão tamA::kan foi introduzido para a estirpe BL21ΔABCF por transdução de P1. Após a excisão da fita Kan, uma sequência de cicatriz (~ 100 bp) é tudo que resta para o locus de tamA . Isto foi verificado por PCR, utilizando primers flanqueando o site de exclusão. Em BL21ΔABCF e sua estirpe, BL21(DE3), o PCR dá um produto o comprimento da tamA sequência (o tamanho esperado é de 1,7 mil pares) de código. Em BL21ΔABCF, onde tem sido retirada a fita de Kan, o produto corresponde à sequência de cicatriz esperada (145 bp). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Expressão de TAAs por uma estirpe de exclusão tamA . (A), este painel mostra o SDS-PAGE de membranas externas, preparadas a partir de células expressando TAAs (YadA ou EibD) e controles vetoriais (pIBA2 e pET22). As cepas são BL21ΔABCF e seu derivado estirpe faltando TamA (ΔtamA). (B), este painel mostra uma mancha de extremo-oeste de colágeno de YadA amostras. As amostras de YadA e pIBA2 controles de painel A foram transferidos para uma membrana PVDF e incubadas com colágeno tipo eu. Eles então foram analisados com um anticorpo anticolágeno e detectados pelo ECL. (C), este painel mostra um ensaio de ligação do anticorpo para amostras de EibD. As amostras de EibD e pET22 controles de painel A foram transferidos para uma membrana PVDF e incubadas com um anticorpo secundário conjugado HRP e então detectados pelo ECL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Reagente 1 mistura de x mistura de x 7
Água da PCR-classe Μ L 17 Μ L 119
10x buffer de polimerase 2 Μ l Μ L 14
mistura de 10mm dNTP 0,4 Μ l Μ l 2.8
Cartilha para a frente de 100 µM 0,2 Μ l 1.4 Μ l
Primeira demão reversa 100 µM 0,2 Μ l 1.4 Μ l
Taq DNA polimerase 0,2 Μ l 1.4 Μ l
Total 20 Μ l Μ L 140

Tabela 1: colônia PCR master mix. A quantidade de mistura depende do número de colônias para ser exibido. Além disso, prepare uma reação de controle (estirpe destinatário original). Por exemplo, se cinco clones de triagem, seis reações são necessários, incluindo o controle. Vale a pena preparar uma reação extra certificar-se de que há suficiente mistura PCR para todas as amostras (repetidas pipetagem amplifica pequenos erros de pipetagem). Neste exemplo, prepare uma mistura de 7 x (5 colônias, 1 controle e 1 reação extra).

Passo Temperatura Tempo Notas
1. 94 ° C 3 min
2. 94 ° C 30 s
3. 50 ° C 30 s
4. 70 ° C 2 min 1min/kb para ser amplificado, arredondar
Retorno para a etapa 2 24 vezes
5. 70 ° C 5 min
6. 12 ° C Para sempre preensão final

Tabela 2: Colônia PCR programa.

Complementar arquivo 1: um exemplo de grade colônia. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

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Transdução de P1 é um método rápido, robusto e confiável para a geração de exclusões de gene em e. coli. Isso é demonstrado aqui pelo transducing um mutante de exclusão de tamA de uma estirpe de doador de Keio para um destinatário BL21-derivado. As grandes etapas do processo de transdução são a produção do transducing lisada, a transdução em si, a excisão da fita Kan resistência e a verificação do knock-out pelo PCR. No total, o processo leva cerca de 1 semana e requer sem métodos de biologia molecular para ser usado, para além do final do PCR para a verificação. Assim, P1 transdução pode competir no esforço gastos e tempo com λ recombinação vermelha e é muito mais rápida que o mutagenesis de troca marcador tradicional.

O protocolo apresentado é muito robusto e permite modificações de muitas das etapas. Há, no entanto, alguns parâmetros críticos. Para infecções de P1, é necessário adicionar íons cálcio para o meio. Cálcio é necessário para a adsorção do fago para as bactérias, e falha para adicionar cálcio suficiente para o Médio irá reduzir significativamente a eficiência da infecção. Algumas bactérias cepas como BL21ΔABCF tendem a agregar na presença de CaCl221. Em tais casos, as bactérias podem ser crescidas sem CaCl2, que pode ser adicionado à suspensão pouco antes da infecção. No entanto, para as estirpes mais convencionais, 10 mM CaCl2 pode ser incluído no meio de crescimento desde o início.

Por outro lado, é importante remover o cálcio livre do meio após a transdução. Citrato é um quelante de íons cálcio, e porque estes são necessários para a adsorção de P1 para células hospedeiras, remover o cálcio livre do meio impede que novas infecções. Se o cálcio não é removido, os fago irão infectar novas células em toda a cultura, na melhor das hipóteses reduzindo a eficiência da transdução e na pior das hipóteses lise toda a cultura, incluindo os transductants.

Outro passo crítico é cultivo bactéria carregando o plasmídeo pCP20. pCP20 é um plasmídeo condicionalmente replicam que não Replica a temperaturas de 37 ° C ou superior; assim, para estabelecer o plasmídeo nas células, incubação com este plasmídeo deve ser realizada a 30 ° C (ou inferior), uma temperatura permissível para a replicação de pCP20. Para curar pCP20, de alta temperatura (43 ° C) é usada. Algumas cepas não crescem bem a esta temperatura; em tais casos, 37 ° C deve ser suficiente, embora o plasmídeo cura será um pouco menos eficiente a esta temperatura.

Quando o chapeamento de bactérias para teste de sensibilidade aos antibióticos, a ordem de placa estrias é importante. O protocolo exige clones ser listado primeiro na contendo antibiótico placas e finalmente em meio não-seletivo. Desta forma, o investigador pode ter certo que qualquer falta de crescimento na mídia seletiva será devido à sensibilidade aos antibióticos e, em vez da uma potencial falta de material transferido nas placas. Seguindo o protocolo, não há crescimento no LB + Kan placa valida a excisão da fita Kan resistência; Não há crescimento no LB + Amp placa valida a perda da pCP20 de plasmídeo de recombinação; tensões crescentes na placa LB (que não cresceu no mesmo experimento estrias nas placas seleção) conterá os positivos recombinantes.

A maioria das outras etapas permitir margem de manobra considerável. No protocolo tal como apresentado, BL21ΔABCF culto a 30 ° C, como esta tensão não cresce bem em 37 ° C. No entanto, cepas de e. coli , sem defeitos de crescimento podem ser cultivadas a 37 ° C (exceto quando transformada com pCP20).

O número de bactérias, usado para infecções pode ser variado em certa medida. A relação entre OD600 e uma contagem viável é aproximadamente linear entre um valor de600 OD de 0,1 e 1,0, onde a primeira corresponde a aproximadamente 108 UFC/mL e o último para ~ 109 UFC/mL. No entanto, esta relação pode variar até certo ponto, dependendo da estirpe em causa, o meio de crescimento e outros fatores. É recomendável que a relação entre OD600 e a contagem viável deve ser estabelecida para cada laboratório e estirpe, particularmente para calcular os valores MOI. O número de bactérias, usado em experimentos de infecção não é particularmente crítico e 109 UFC/mL representa a início fase estacionária, que é um compromisso razoável entre a densidade celular e a proporção de células viáveis na cultura. Se um menor número de bactérias viáveis é utilizado para a transdução, o número do fago simplesmente precisa ser ajustada em conformidade. O MOI em si também pode ser variado em certa medida. O protocolo chama um valor MOI de 0.5, embora nada entre 0,1 e 0,5 deve resultar em uma boa eficiência. Em um MOI de 0,5, a razão do fago para bactérias é 1:2 (ou seja, metade do número do fago em comparação com o número de bactérias). No exemplo no protocolo, o OD600 da cultura é 1.0, e 1 mL da cultura é usada para a transdução; assim, o número do fago exigido é de 5 x 108. Um valor MOI de 0,5 dá um nível elevado de infecção, mas reduz o número de bactérias que são duplamente infectados, o que reduziria a eficiência da transdução como os selvagem-tipo fago (infecciosos) longe superam os transducing fago. Uma infecção dupla com um phage transducing e um fago infeccioso seria levar a Lise, eliminando, assim, esta transductant do pool de sobreviventes da pilha. Portanto, não deve ser excedido um MOI de 0,5.

O protocolo também permite alguns atalhos. Ao invés de preparar lysates de placas, alguns autores defendem a preparar lysates do fago no líquido médio29. Isso pode poupar tempo, como uma etapa de incubação durante a noite não é necessário. Da mesma forma, titulada phage lisado pode não ser necessária. Conforme observado acima, o MOI não é muito crítico e eficiência razoável pode ser conseguida simplesmente assumindo um título de 1010 pfu/mL para um padrão lisado.

Apesar da facilidade da técnica, transdução P1 não é universalmente aplicável, e várias condições devem ser atendidas para que seja útil. Em primeiro lugar, uma estirpe de doador com um alelo selecionável de nocaute deve estar disponível. Isso geralmente é realizado por meio de uma exclusão onde uma gaveta de resistência aos antibióticos substituiu o gene de interesse. A coleção de Keio é particularmente útil a este respeito, pois dispõe de uma biblioteca de ready-to-use do gene antibiótico baseado em fita nocautes cobrindo quase todos os genes não essenciais em Escherichia coli K12. Esta coleção é particularmente útil para bater para fora conservados genes encontrados na maioria das cepas de Escherichia coli (ou seja, os componentes do genoma de núcleo de e. coli ). Para genes menos comuns, tais como fatores de virulência de patogenicidade de e. coli as estirpes ou genes da via metabólica rara, a mutação pode precisar ser criado de novo. Em tais casos, P1 transdução pode bem não ser o método de escolha. Além de genes essenciais, genes que são necessários para a infecção de P1, tais como galU, mutações do que levar para P1 resistência30, são pobres alvos para uma exclusão por transdução de P1. Outra nota quando usando a coleção de Keio, especificamente, é que algumas estirpes carregam uma duplicação do gene alvo, onde apenas uma cópia foi interrompida pela resistência Kan gaveta8. Em tais casos, o gene de interesse pode ser essencial; os investigadores são recomendados para verificar anotações atualizadas para tais genes8. No entanto, tendo em conta estas restrições, transdução P1 permite a exclusão da maioria dos genes em cepas de Escherichia coli de laboratório. Por exemplo, as diferenças entre BW25113 e BL21(DE3) são pequenas e afetam somente um punhado de genes codificantes de proteínas31.

Em segundo lugar, é importante ressaltar que a estirpe do destinatário deve ser capaz de uma recombinação homóloga para a transdução de trabalhar. Uma cepa que falta a recombinase que Reca pode, portanto, não ser modificado por este método. Isto exclui todas as cepas de clonagem padrão, tais como DH5α, HB101, TOP10 e XL-1-azul. RecA pode mediar recombinações entre trechos idênticos tão curtos quanto 8 bp; no entanto, uma região mais alta similaridade irá aumentar significativamente a probabilidade de recombinação32,33. Outro problema, particularmente com a clínica de e. coli as tensões, é que cadeias de antígeno-O tempo podem mascarar o receptor para P1, que se encontra no oligossacarídeo núcleo de lipopolissacarídeo34. Além destes requisitos para o tipo de destinatário, a P1 as estirpes utilizadas transdução devem ser um mutante de vir ; esta mutação é necessária para uma infecção lítica completa35.

Uma terceira ressalva de P1 transdução é que o gene a ser nocauteado deve residir em uma região com alta similaridade nas regiões flanqueando entre o doador e o destinatários cepas. Se há uma falta de synteny entre as cepas, a substituição do gene alvo sequência com a gaveta de Kan de código bem pode falhar, devido às diferenças no conteúdo das regiões flanqueando. Portanto, antes de embarcar na supressão de genes mediada por P1, investigadores devem verificar as sequências das estirpes de dador e do receptor para certificar-se de que as sequências flanqueando são homólogas. Claro, isso só é possível se as cepas já foi sequenciadas. No caso de cepas com uma sequência desconhecida, P1 transdução pode falhar ou causar outros problemas, tais como uma conversão do gene nas regiões de flanqueamento. P1 pode transduce aproximadamente 90 mil pares de DNA; se existem diferenças no conteúdo do gene nas regiões em torno do gene-alvo (por exemplo, pequenas deleções ou inserções), é provável que estas serão revertidos para a sequência do doador. Isso pode ter consequências inesperadas sobre o fenótipo da estirpe destinatário. Portanto, sempre que possível, as sequências do dador e o receptor ao redor do gene de interesse sempre devem ser comparadas antes da transdução de P1.

Em conclusão, P1 transdução é uma maneira rápida de transferência de um gene específico knock-out para um número de estirpes uma vez que a mutação inicial de mata-mata foi gerada. Embora a técnica tem suas limitações, a facilidade e rapidez de sua implementação seja uma alternativa atraente para outros métodos de apagamento do gene. P1 só infecta Escherichia coli, que normalmente restringe seu uso para esta espécie. No entanto, algumas variantes de P1 foram desenvolvidos que tem uma ampla gama de hospedeiros e pode infectar outras espécies dentro da família Enterobacteriaceaee até mesmo algumas outras espécies de γ-proteobacterial, embora em reduzida eficiência36, 37. mesmo a transdução de DNA clonado de e. coli Myxococcus xanthus, um δ-Proteobacteria, tem sido relatado38. Em experimentos futuros, essas variantes podem ser aumentadas com a mutação de vir a ampliar a gama de destinatários estirpes usadas na supressão do gene antibiótico baseado na gaveta por transdução geral.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Cepas de coleção de Keio foram obtidas a partir do projeto nacional de BioResource (NIG, Japão): Escherichia coli. Agradecemos seu apoio contínuo Dirk Linke (departamento de Biociências, Universidade de Oslo). Este trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa da Noruega jovem pesquisador grant 249793 (Jack C. Leo).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGG
ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATT
CTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22

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Produzindo a deleção do Gene na <em>Escherichia coli</em> por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos
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Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).More

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).

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