Summary
Här presenterar vi ett protokoll för användning av befintlig antibiotika resistens-kassett radering konstruktioner som underlag för att göra strykningen mutanter i andra E. coli -stammar. Sådan radering mutationer kan mobiliseras och infogas i det motsvarande locus av en mottagare stam med P1 bacteriophage transduktion.
Abstract
En första metod att studera funktionen av en okänd gen hos bakterier är att skapa en knock-out av denna gen. Här beskriver vi en robust och snabb protokoll för att överföra genmutationer borttagning från en Escherichia coli stam till en annan med hjälp av generaliserad transduktion med bacteriophage P1. Denna metod kräver att mutationen kan väljas (t.ex. baserat på genen störningar med antibiotika kassett infogningar). Sådana antibiotika kassetter kan mobiliseras från en donator stam och införas till en mottagare stam av intresse för snabbt och generera enkelt en gen radering mutant. Antibiotikum kassetten kan utformas att inkludera flippase erkännande webbplatser som tillåter excision av kassetten genom en platsspecifik recombinase att producera en ren knock-out med endast en ~ 100-base-par-långa ärr sekvens i genomet. Vi visar protokollet genom att slå ut den tamA -gen som kodar en församling faktor inblandad i autotransporter biogenes och testa effekten av denna knock-out på biogenes och funktion av två trimeric autotransporter adhesiner. Även gen radering av P1 transduktion har sina begränsningar, gör den lätthet och snabbhet av dess genomförande det ett attraktivt alternativ till andra metoder för genterapi radering.
Introduction
En vanlig första metod att studera funktionen av en gen är att utföra knock-out mutagenes och observera den resulterande fenotypen. Detta kallas också omvänd genetik. Bakterien E. coli har varit arbetshästen i molekylärbiologi för de senaste 70 åren eller så, på grund av förenklar dess odling och dess föredragandens genmanipulation1. Flera metoder har utvecklats för att producera gen borttagningar i E. coli, inklusive markör exchange mutagenes2,3 och, mer nyligen, recombineering använder den λ röd eller Rac ET system4,5 , 6.
I ett allmänt använt system ersättas kodande sekvenser av enskilda gener med en antibiotikaresistens kassett som senare kan vara censurerade från kromosom5,7. De kodande sekvenserna byts ut, till exempel genom en kanamycin (Kan) motstånd kassett, som flankeras av flippase (FLP) erkännande mål (FRT) platser på vardera sidan. FRT platserna identifieras av recombinase FLP, som medlar platsspecifika rekombination mellan FRT platser leder till borttagningen av Kan kassett. På detta sätt kan en fullständig radering av en given genens kodande sekvens uppnås, lämnar efter sig endast en minimal ärr sekvens av ungefärligt 100 baspar (bp) (figur 1).
Drygt ett decennium sedan utvecklades den så kallade Keio-samlingen. Detta är en bakteriell bibliotek baserat på en standard laboratorium E. coli K12 stammen, där nästan alla icke-väsentliga gener ströks individuellt genom λ röd rekombination7,8. Klonerna inom denna samling varje har en kodande sekvens ersatts med en punktskattepliktiga Kan motstånd kassett. Keio samlingen har visat sig vara ett användbart verktyg för många applikationer9. En sådan ansökan är produktionen av radering mutanter i andra E. coli -stammar. Kan kassetten från en given radering klon kan mobiliseras av allmänt transducing bakteriofager, såsom P110,11,12,13,14. En fag lager beredd från sådan en stam kan sedan användas till infektera en mottagare E. coli stam av intresse, där en låg men pålitlig frekvens Kan kassett-innehållande regionen kan införlivas i mottagarens genomet av homolog rekombination (Figur 2). Transductants kan väljas för tillväxten på Kan-med mediet. Efter detta, om avlägsnandet av antibiotikaresistens kassetten önskas, kan den FLP recombinase levereras till transductant stam i trans. Efter härdning av FLP-innehållande plasmid, som bär en ampicillin (Amp) motstånd markör, Kan och Amp-känsliga kloner screenas för, och den rätta excision av vildtyp kodande sekvens och kassetten Kan verifieras av kolonin PCR.
Här presenteras ett detaljerat protokoll, som beskriver varje steg i att producera en knock-out E. coli stam baserat på den strategi som beskrivs ovan. Som ett exempel demonstreras en borttagning av tamA genen. tamA kodar en yttre membranprotein i β-fat, som är en del av Transport och montering modul (TAM), som är involverat i biogenes av vissa autotransporter proteiner och pili15,16,17. Denna knock-out stam användes sedan för att undersöka effekten av tamA borttagningen på biogenes av två trimeric autotransporter adhesiner (TAAs), den Yersinia adhesin YadA och den E. coli immunglobulin (Ig)-bindande TAA EibD 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stammar och plasmider
-
Bakteriestammar
- Använd det E. coli stammar BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20och BL21ΔABCF21. Se Tabell för material för ytterligare information.
-
Bakteriofager
- Använd phage P1vir för den allmänna transduktion. Lagra phage som en flytande lager med några droppar kloroform (se steg 2.2). För mer information, se Tabell för material.
-
Plasmider
- Använda de följande plasmidsna i detta protokoll: pCP2022, pIBA2-YadA23och pEibD1024. Som kontroll plasmider, använda pASK-IBA2 och pET22b (se Tabell för material).
-
Tillväxt villkorar
- Sprida bakterier i en lysogeny buljong (LB) medium25 med kraftig skakning (180 – 200 rpm) vid 37 ° C eller 30 ° C när det gäller BL21ΔABCF och stammar som innehåller pCP20.
- Utföra plasmid härdning vid 43 ° C.
- För ett fast medium, komplettera LB med 1% agar (w/v).
- För övre agar, komplettera LB med 0,7% agar och 10 mM CaCl2 och autoklavera medium. Använd SOC medium för återhämtning efter elektroporation26.
- Använd följande koncentrationer för antibiotika: 100 μg/mL för Amp och 25 μg/mL för Kan.
2. förbereda en Phage Lysate
-
Infektion av givare stammen
- Växa givare stammen JW4197 i 5 mL LB medium kompletteras med 10 mM CaCl2 och eventuellt med Kan (25 µg/mL) till en optisk densitet på 600 nm (OD600) ~ 1.0. Mäta värdet OD600 med en spektrofotometer.
- Göra en utspädning serie av en befintlig P1 fag lager i LB medium: rekommenderade utspädningar är mellan 10-3 till 10-7.
- Blanda 200 μl av bakteriesuspensionen och 100 μL av en given phage utspädning i en 15 mL centrifugrör eller motsvarande. Förbereda så många rör som phage utspädningar. Inkubera rören under 20 minuter vid 37 ° C utan att skaka.
- Tillsätt ~ 3 mL smält topp agar (~ 50 ° C) kompletteras med 10 mM CaCl2 rören, blanda innehållet grundligt genom vortexa rören strax och Häll blandningen på förvärmd LB plattor att göra även lager.
- Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C.
-
Lysate beredning
- Följande dag välja en tallrik med en semi konfluenta tillväxt av phage plack. På en semi konfluenta platta, ungefär halva ytan av plattan är klart (figur 3).
- Skrapa det översta agar lagret från sådan en tallrik med en inympning loop eller ett liknande verktyg och placera den övre agar i ett centrifugrör. Tillsätt 1 – 2 mL LB och en droppe av kloroform och vortexa röret kraftigt i ~ 1 min. Lägg i kloroform i dragskåp.
- Centrifugera röret för 15 min vid 4000 x g eller snabbare till pellet den agar och bakterieceller.
- Flytta supernatanten till en färsk mikrocentrifug rör, undvika bära över eventuellt skräp från pelleten. Tillsätt 2 droppar kloroform och lagra den lysate i 4 – 10 ° C. Lägg till kloroform i dragskåp. Får inte frysas phage lysate eftersom detta kommer att resultera i en betydande minskning av antalet smittsamma partiklar.
-
Att fastställa lysate titern
- Odla BW25113 i LB kompletteras med 10 mM CaCl2 vid 37 ° C tills kulturen når en OD600 ~ 1.0.
- Förbereda en utspädning serie phage lysate i LB (t.ex., 10-6– 10-9).
Obs: Var noga med att Pipettera provet från toppen av den lysate att undvika att överföra kloroform till spädningarna. - Blanda 200 μl av bakteriesuspensionen och 100 μL av en given phage utspädning i en 15 mL centrifugrör eller motsvarande. Förbereda så många rör som phage utspädningar. Inkubera rören under 20 minuter vid 37 ° C utan att skaka.
- Tillsätt ~ 3 mL smält topp agar (~ 50 ° C) kompletteras med 10 mM CaCl2 rören, blanda innehållet grundligt genom vortexa rören strax och Häll blandningen på förvärmd LB plattor att göra även lager.
- Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C.
- Följande dag räkna antalet plack (tydliga regioner i bakteriell mattan) för varje platta och beräkna antikroppnivåns på den lysate med följande formel:
Exempel: På plattor med de utspädningar 10-7, 10-8och 10-9, 231 27, och finns 2 plack, respektive. 100 μL av varje utspädning användes för infektionen, och eftersom titern uttrycks som plaque-forming enheter (pfu) / mL, plätering faktorn är 10. Dessa nummer anges i formeln:
Titern är alltså cirka 2 x 1010 smittsamma phage partiklar/mL.
3. P1 transduktion
-
Förbereda de mottagande cellerna
- Växa i mottagarens stam BL21ΔABCF i LB kompletterades till en optisk densitet på 600 nm (OD600) ~ 1.0. Använd en spektrofotometer för att mäta värdet OD600 .
- Beräkna volymen av den lysate phage behövs för att uppnå en multiplicity av infektion (MOI) värdet 0,5. För att beräkna MOI, uppskatta antalet bakterier baserat på OD600 av kulturen. Anta att en OD600 värdet 1,0 motsvarar ~ 109 cfu/mL. Beräkna volymen krävs baserat på den kända titern för den lysate.
Exempel (baserat på titern beräknas i exemplet efter steg 2.3.6):
- Lägg till CaCl2 till mottagarens stam kultur till 10 mM och blanda. Ta 1 mL av kulturen transduktion.
-
Utför transduktion
- Tillsätt lämplig mängd phage lysate 1 ml av mottagarens kultur (inklusive CaCl2 på 10 mM) som beräknas enligt steg 3.1.2 och blanda försiktigt.
Obs: Var noga med att Pipettera provet från toppen av den lysate att undvika att överföra kloroform till mixen. - Statiskt Inkubera mixen i 20 min vid 37 ° C.
- Stoppa infektionen genom att lägga till natriumcitrat, pH 5,5, 100 mM.
- Centrifugera bakterierna (5 000 x g i 2 min) och avlägsna supernatanten och återsuspendera dem i 1 mL av färska LB kompletteras med 100 mM natriumcitrat, pH 5,5.
- Tvätta cellerna två gånger mer som i steg 3.2.4 att säkerställa avlägsnande av gratis fagocyt och kalcium.
- Återsuspendera bakterierna i 1 mL av färska LB kompletteras med 100 mM natriumcitrat, pH 5,5. Inkubera bakterier vid 30 ° C för 1 h med skakningar (> 100 rpm).
- Samla in bakterierna genom centrifugering (5 000 x g i 2 min) och återsuspendera dem i ~ 100 μL av LB med 100 mM natriumcitrat, pH 5,5.
- Sprida bakterier på en LB plattan kompletteras med Kan på 25 µg/mL och 10 mM natriumcitrat, pH 5,5, och växa bakterier vid 30 ° C tills kolonierna visas (~ 24 h).
- Tillsätt lämplig mängd phage lysate 1 ml av mottagarens kultur (inklusive CaCl2 på 10 mM) som beräknas enligt steg 3.1.2 och blanda försiktigt.
-
Välja transductants
- När kolonierna har vuxit på urval plattan, restreak dem på LB + Kan för enstaka kolonier och växa vid 30 ° C tills enda kolonier visas.
4. excising Kan kassett
-
Omformningen med rekombination plasmid
- Göra den Kan-resistenta BL21ΔABCF stam electrocompetent.
- Öka belastningen från en enda koloni i färska LB (5 mL) kompletteras med Kan (25 µg/mL) vid 30 ° C tills den OD600 är ~0.5 – 0,7.
- Från och med nu, utföra följande steg vid 4 ° C eller på is. Centrifugera bakterierna (5 000 x g i 10 min) och avlägsna supernatanten.
- Tvätta cellpelleten med iskall destillerat vatten två gånger genom att upprepa föregående centrifugering steg och slutligen Återsuspendera cellpelleten i 100 µL av iskall 10% glycerol.
- Kyla ner 1 mm elektroporation kyvetter på is.
- Lägg 1 pg av plasmid DNA (pCP20) till cellsuspension, blanda suspensionen försiktigt och överföra den till ett kylt elektroporation kyvetten.
- Inställd electroporator på 1,8 kV och electroporate celler.
- Rädda transformerade celler genom att tillsätta 1 mL av SOC medium och växande dem för 1 h vid 30 ° C.
- Plåt 100 µL celler LB + Amp plattor och odla cellerna vid 30 ° C över natten.
- Göra den Kan-resistenta BL21ΔABCF stam electrocompetent.
-
Induktion av rekombination
- Plocka enstaka kolonier från LB + Amp tallrik och Inokulera färska LB utelämna alla antibiotika.
- Odla cellerna vid icke-tillåtande temperatur (43 ° C) över natten för att inducera uttrycket av FLP recombinase.
-
Att välja rekombinanter
- Gör seriespädningar och tallrik 50 µL av en 105-106 utspädning på icke-selektiva tallrikar och växa det över natten vid 30 ° C.
5. kontroll av genen borttagningen
-
Verifiering av Plasmiden förlust och framgångsrika rekombination
- Strimma enstaka kolonier från tallrikar som bereddes i steg 4.3.1 på Kan, LB, LB + Amp och LB plattor utan antibiotika, i denna ordning. För att underlätta de strimmor, använder ett rutnät på kolonin (se kompletterande fil 1). Odla plattorna vid 30 ° C tills kolonierna visas (~ 24 h).
- Plocka 10 – 20 kloner som har vuxit på den icke-selektiva plattan men misslyckades att växa på det selektiva mediet för ytterligare kontroll.
-
Ytterligare verifiering av kolonin PCR
- Utföra en koloni PCR med primers som flankerar den tamA kodande sekvens (se Tabell för material).
- Förbereda en master PCR-mix. Mängden mix som behövs beror på antalet kolonier som ska testas (se exemplet i tabell 1). Blanda reagenserna på is, tillsätt polymerasen senast.
- Blanda huvudmixen PCR och sedan fördela 20 µL i rör med en PCR-remsa. Plocka en liten mängd av varje koloni som skall kontrolleras med hjälp av en steril pipettspetsen och lägga till en tub. Kom ihåg att inkludera den ursprungliga mottagarens stammen för jämförelse. Eventuellt även givare stammen.
- Kör en PCR-reaktion (se tabell 2 för programmet används).
- Förbereda en 1% agarosgel.
- För en 50 mL gel, mäta 0,5 g agaros och tillsätt 50 mL TAE buffert (40 mM Tris, 20 mM ättiksyra och 1 mM EDTA, pH 8,0). Värm blandningen i en mikrovågsugn tills alla agaros har upplöst.
- När Agarens är upplöst, svalka lösningen på cirka 50 ° C, och sedan Tillsätt 5 μl av DNA färgning färgämne. Blanda lösningen väl och häll det i en gel bricka i en casting kammare. Infoga en eller flera rader av väl kammar så att det finns tillräcklig brunnar för alla prover, samt molekylär storlek markörer. Låt gelen att ställa in i 30 min.
- När PCR-körningen är klar, tillsätt 4 µL 6 x DNA lastning färgämne i varje prov. Placera gelen i elektrofores kammaren och lägga till TAE buffert tills brunnarna är täckta.
- Applicera 10-15 µL av varje PCR-reaktion till en brunn i gelen. Även Tillsätt 5 µL molekylstorlek markör. Kör gelen i 30 min på 75 V.
- När körningen är klar bild gelen med en blå-ljus imager.
6. andra tekniker
-
Proteinuttryck
Märk: Uttrycket av test proteiner (YadA och EibD) har varit beskrivs i detalj på annan plats23,24. Detta är en kort sammanfattning av de viktigaste stegen.- Omvandla BL21ΔABCF ΔtamA with de nödvändiga plasmidsna (pIBA2-YadA och pEibD10 och de motsvarande kontroll plasmidsna) och välj för transformants på LB + Amp.
- Av protein uttryck, Inokulera 100 mL LB medium + Amp med 1 mL av en övernattning kultur av omvandlade bakterier och växa dessa vid 30 ° C tills mitten av log-fasen, vilken tid, inducera proteinproduktion med antingen anhydrotetracycline (vid 100 ng/mL) eller isopropyl thiogalactoside (vid 0,5 mM).
- Efter 2 h induktion vid 30 ° C, mäta grumligheten kulturer och samla ett antal celler motsvarar 50 mL på OD600 = 1.0 av centrifugering kulturerna för 15 min vid 4000 x g. Tvätta pelleten 1 x med 10 mM HEPES pH 7,4 och sedan antingen förvara den vid-20 ° C eller process det ytterligare som i steg 6,2.
-
Yttre membran utvinning
Obs: Yttre membran extraktionen utförs som beskrivs i detalj av Leo et al. 27. de huvudsakliga steg sammanfattas nedan.- Återsuspendera cellpelleten i 1 mL av 10 mM HEPES, pH 7,4, kompletterad med 10 mM MgCl2 MnCl2, lysozym (0,1 mg/mL) och en nypa DNAS jag.
- Lysera celler (t.ex., använder en pärla visp).
- Centrifugera cellerna inom kort (2 min vid 15,600 x g) för att ta bort cellfragment och flytta supernatanten till en frisk slang.
- Centrifugera cellerna för 30 min vid 16 000 x g, varefter, återsuspendera pelleten i 400 μL av 1% N-humle Sarkosin i 10 mM HEPES, pH 7,4.
- Inkubera cellerna med agitation för 30 min i rumstemperatur, varefter, Centrifugera dem i 30 min som ovan.
- Tvätta den genomskinliga pellet 1 x med 200 μL 10 mm HEPES, pH 7,4, och sedan blandas det i 30 μL 10 mm HEPES och tillsätt 10 μL av 4 x SDS-PAGE prov buffert.
-
Aktivitet-analyser
Obs: Utföra SDS-PAGE och aktivitet analyser för YadA och EibD som beskrivs28. De viktigaste stegen sammanfattas nedan. -
SDS-PAGE
- Värm proverna vid 50 ° C i 5 min innan du laddar dem på en polyakrylamidgel och att undvika denaturera proteiner.
- Efter avskiljandet i SDS-PAGE, överföra proteinerna till ett polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran.
- Efter överföringen, blockera membranet med 2% skummjölkspulver i PBS.
-
YadA-kollagen långt-western blot
- Efter blockering, lägga till bovint kollagen typ jag utspädd i blockerande buffert till en koncentration på 10 μg/mL och inkubera membranet för 1 h.
- Tvätta membranet 2 x med PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T).
- Tillsätt primär antikropp (monoklonal anti kollagen COL-1) till membranet, utspädda 1:2,000 i blockerande buffert.
- Efter inkubation membranet för 1 h, tvätta 2 x som nämns i steg 6.3.2.2 och Lägg sedan till den sekundära antikroppar [Get antimus IgG-(HRP) konjugat av pepparrotperoxidas], utspädda 1:10,000 i blockerande buffert.
- Inkubera membranet för 1 h och sedan tvätta det 2 x med PBS-T. Lägg en förstärkt kemiluminiscent substrat till membranet enligt tillverkarens anvisningar och upptäcka bandet använder en CCD-kamera.
-
EibD-IgG bindande assay
- Efter blockering, lägga till en sekundär antikropp (get anti kanin HRP), efter utspädning 1:2,000 i blockerande buffert.
- Inkubera membranet för 1 h och sedan tvätta det 2 x med PBS. Utföra kemiluminiscent detektion som nämns i steg 6.3.2.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generation av en tamA Knock-out av BL21ΔABCF:
Den strategi som beskrivs ovan har tidigare använts för att producera en härledda stam av BL21(DE3), en standard laboratorium stam används för produktion av proteiner, som är optimerade för yttre membran proteinproduktion och kallas BL21ΔABCF21. Denna stam saknar fyra gener som kodar för riklig yttre membranproteiner och, följaktligen är kunna producera mer heterologously uttryckta yttre membranproteiner än vildtyp stammen. För att testa om TAM är involverad i TAA biogenes, ströks den tamA -gen i denna bakgrund.
En P1 lysate var beredd från Keio samling stammen JW4179, där tamA genen (tidigare kallade yftM) kodande sekvens ersätts av en Kan motstånd kassett. Sedan utfördes ett transduktion experiment med BL21ΔABCF som den mottagande stammen. Flera Kan-resistenta kolonier erhölls, varefter två valdes för excision av Kan kassett. De plasmiden pCP20, kodning av FLP recombinase, infördes i dessa kloner och, därefter, botas genom att odla på 43 ° C i avsaknad av ett antibiotikum urval. Ett antal kloner som screenades för känslighet för både Amp (som är en markör för pCP20) och Kan, och flera kloner känsliga för både erhölls. Dessa kloner kontrollerades av kolonin PCR använder primers flankerar den tamA kodande sekvens och fann att den tamA genen framgångsrikt hade tagits bort (figur 4).
Tamas roll i TAA biogenes:
TamA har visat sig vara inblandade i biogenes av några klassiska autotransporters16 och inversa autotransporter intimin15. För att testa om TamA är viktigt för biogenes av TAAs, förvandlades BL21ΔABCF ΔtamA med plasmider kodning två test proteiner, de Yersinia adhesin YadA och E. coli Ig-bindande protein EibD. Dessa proteiner är kända för att uttrycka väl i E. coli och har använts som modeller för TAA biogenes i tidigare studier23,28.
Efter inducera produktion av proteiner, var de yttre membran fraktionerna av uttrycket kulturer isolerade och analyseras av SDS-PAGE. Proverna var inte kokas för att demonstrera trimerization av proteiner. Trimerer kör på storlekar över 100 kDa, medan monomersna har förväntade storlekar av 45 kDa (YadA) och 51 kDa (EibD). Inga större skillnader observerades mellan uttryck i BL21ΔABCF och BL21ΔABCF ΔtamA, även om YadA verkar framställas på något lägre nivåer i ΔtamA stam (figur 5A). Tvärtom tycks dock vara fallet för EibD.
För att undersöka huruvida avsaknaden av TamA kan påverka den rätta vikning eller transport av proteiner, testades deras förmåga att binda till ligander. För YadA, var detta åstadkoms genom en kollagen långt-western blot (figur 5B). YadA, bunden båda stammar, i kollagen på en liknande nivå, visar att proteinet är korrekt vikta och funktionella. Likaså IgG-bindande verksamhet EibD i de två stammarna korrelerade med uttrycket nivån (figur 4 c). Dessa resultat visar att strykningen av tamA inte har en betydande inverkan på TAA biogenes, åtminstone inte för dessa två modell TAAs.
Figur 1: Generation av knock-outs med punktskattepliktiga antibiotika kassetter. För att producera den gen knock-outs, ersätts en gen av intresse (genen B i det här exemplet) av en Kan motstånd kassett flankerad av FRT platser. FRT-Kan kassett, i sin tur ligger flankerad av kort (~ 50 bp) sträckor av sekvens homolog till regionerna uppströms och nedströms av genen B. Den kodande sekvensen av genen B är utbytta λ för FRT-Kan kassett röd rekombination. När detta sker, kan Kan kassetten själv tas bort genom att införa den FLP recombinase, som kommer att förmedla en sitespecifik rekombination mellan FRT platser. Detta punktskatter Kan kassett, lämnar en minimal (~ 100 bp) ärr sekvens i den B-locus. För fullständig information, se Baba m.fl. 7. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: gen radering av P1 transduktion. Donatorn stam (beige) bär en Kan-kassett som har ersatt gen av intresse (gul) på kromosomen (blå). Givaren är infekterad med P1 bacteriophage. Phage multiplicerar i givaren stam, producera ett stort antal avkommor. De flesta är vildtyp (röda genomet), men en bråkdel transducing fagocyt som har inkorporerat en del av givare stam kromosom snarare än phage DNA (blå genomet). En del av dessa kommer att innehålla Kan kassetten (gula genomet). Så småningom infektera värdcellen lyserar och frigör Fager i mediet. Dessa används för att förbereda en lysate. I transduktion experimentet, är mottagarens stammen (ljusblå) infekterad med den lysate beredd från givare stammen. I ett fåtal fall, är mottagaren infekterad av en transducing phage bär Kan kassetten (visas här). Om regionerna som gränsar till kassett Kan genomgå homolog rekombination, inkorporeras Kan kassetten i mottagarens kromosomen ersätter den endogena allelen, vilket resulterar i Kan-resistenta kloner som kan väljas för. Tillägg av FLP recombinase på en botas plasmid punktskatter Kan kassett, lämnar endast en kort ärr sekvens (visas här i gult), som återgår klonen till den Kan känsliga fenotypen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel på plattorna efter en P1 infektion. (A) denna panel visar en tallrik med enskilda plack. (B) denna panel visar en semi konfluenta tallrik. (C) i denna panel visas en alltför infekterad plattan, där nästan alla bakterier har varit lyserat av phage. Några resistenta kolonier har växt ur det översta agar lagret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Radering av de tamA kodande sekvens. Den tamA::kan radering allelen infördes i stammen BL21ΔABCF av P1 transduktion. Efter excision av Kan kassett, ett ärr sekvens (~ 100 bp) är allt som återstår på det tamA locus. Detta har verifierats med PCR, använda primers flankerande webbplatsen radering. I BL21ΔABCF och dess överordnade stam, BL21(DE3), ger PCR en produkt längden på den tamA kodande sekvens (den förväntade storleken är 1,7 kilobase par). I BL21ΔABCF, där Kan kassetten har varit censurerade, produkten motsvarar sekvensen förväntade ärr (145 bp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Uttryck för TAAs av en tamA radering stam. (A) denna panel visar SDS-sidan av yttre membran beredd från celler som uttrycker TAAs (YadA eller EibD) och vektor kontroller (pIBA2 och pET22). Stammar är BL21ΔABCF och dess derivat stam som saknar TamA (ΔtamA). (B) denna panel visar en kollagen långt-western blot YadA prover. YadA proverna och pIBA2 kontroller från panel A överfördes till ett PVDF membran och inkuberas med kollagen typ jag. De var sedan utforskad med en anti kollagen antikropp och upptäcks av ECL. (C), denna panel visar antikropp bindande test för EibD prover. EibD proverna och pET22 kontroller från sidopanelen A var överförs till ett PVDF membran och inkuberas med en sekundär HRP-konjugerad antikropp och sedan upptäcks av ECL. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | 1 x mix | 7 x mix |
| PCR-grade vatten | 17 ΜL | 119 ΜL |
| 10 x polymeras buffert | 2 ΜL | 14 ΜL |
| 10 mM deoxyribonucleotide mix | 0,4 ΜL | 2.8 ΜL |
| 100 µM framåt primer | 0.2 ΜL | 1.4 ΜL |
| 100 µM reverse primer | 0.2 ΜL | 1.4 ΜL |
| Taq-DNA-polymeras | 0.2 ΜL | 1.4 ΜL |
| Totalt | 20 ΜL | 140 ΜL |
Tabell 1: kolonin PCR master mix. Mängden mix beror på antalet kolonier som skall kontrolleras. Dessutom Förbered en kontroll reaktion (ursprungliga mottagarens stam). Exempelvis om screening fem kloner, behövs sex reaktioner, inklusive kontroll. Det är värt att förbereda en extra reaktion för att kontrollera att det finns tillräckligt PCR-mix för alla prover (upprepad pipettering förstärker små pipettering fel). Förbereda en 7 x mix (5 kolonier, 1 kontroll och 1 extra reaktion) i det här exemplet.
| Steg | Temperatur | Tid | Anteckningar |
| 1. | 94 ° C | 3 min | |
| 2. | 94 ° C | 30 s | |
| 3. | 50 ° C | 30 s | |
| 4. | 70 ° C | 2 min | 1 min/kb kan förstärkas, runda upp |
| Återgå till steg 2 24 gånger | |||
| 5. | 70 ° C | 5 min | |
| 6. | 12 ° C | För alltid | slutliga håll |
Tabell 2: Kolonin PCR program.
Kompletterande fil 1: ett exempel på kolonin rutnät. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
P1 transduktion är en snabb, robust och tillförlitlig metod för att generera gen borttagningar i E. coli. Detta framgår här av transducing en tamA radering mutant från en Keio givare stam till en BL21-derived mottagare. De stora stegen i signaltransduktion processen är produktionen av den transducing lysate, transduktion själv, excision av Kan motstånd kassetten och kontrollen av den knock-out med PCR. Totalt, processen tar cirka 1 vecka och kräver ingen molekylärbiologiska metoder användas, förutom sista PCR för verifiering. Således, P1 cellsignalering kan tävla i förbrukade ansträngning och tid med λ röd rekombination och är mycket snabbare än traditionella markör exchange mutagenes.
Presenterade protokollet är mycket robust och möjliggör ändringar av många av stegen. Det finns dock några kritiska parametrar. För P1 infektioner är det nödvändigt att lägga till kalciumjoner till medium. Kalcium behövs för adsorption av phage på bakterier, och underlåtenhet att lägga tillräckligt kalcium till medium kommer att avsevärt minska effektiviteten av infektionen. Vissa bakteriella stammar såsom BL21ΔABCF tenderar att aggregera i närvaro av CaCl221. I sådana fall kan bakterier odlas utan CaCl2, som kan läggas till suspensionen strax före infektionen. Dock för mer konventionella stammar, kan 10 mM CaCl2 inkluderas i odlingsmedium från början.
Däremot är det viktigt att ta bort det fritt kalciumet från medlet efter transduktion. Citrat är en kelator av kalciumjoner, och eftersom dessa behövs för adsorption av P1 till värdceller, ta bort det fritt kalciumet från medlet förhindrar ytterligare infektioner. Om kalcium inte tas bort, kommer fagocyt infektera ytterligare celler i hela kulturen, i bästa minska effektiviteten i transduktion och värst lyseringslösning hela kulturen, inklusive transductants.
Ett annat viktigt steg odling bakteriebärande de plasmiden pCP20. pCP20 är en villkorligt replikerande plasmid som inte replikerar vid temperaturer på 37 ° C eller högre; således för att införa plasmiden i cellerna, inkubationer med denna plasmid måste vara utförd vid 30 ° C (eller lägre), en temperatur som är tillåtande för replikering av pCP20. För att bota pCP20, används en hög temperatur (43 ° C). Vissa stammar växer inte väl vid denna temperatur. i sådana fall bör 37 ° C räcka, även om de plasmiden härdningen är något mindre effektiv vid denna temperatur.
När plätering bakterier att testa för antibiotika känslighet, är det viktigt att rätt ordning av plattan strimmor. Protokollet kräver kloner att vara strimmiga först på antibiotika-innehållande plattor och slutligen på icke-selektivt medium. På detta sätt utredaren kan vara säker på att någon brist på tillväxt på det selektiva mediet kommer att vara på grund av antibiotika känslighet och i stället för att potentiella brist på material överförs på plattorna. Efter protokollet, ingen tillväxt på LB + Kan plattan validerar excision av Kan motstånd kassett; ingen tillväxt på LB + Amp plattan validerar förlusten av den rekombination plasmiden pCP20; stammar som växer på LB plattan (som inte växer i samma strimmor experiment på urval plattorna) kommer att innehålla de positiva rekombinanter.
De flesta av de andra stegen möjliggör stort handlingsutrymme. I protokollet som presenteras, är BL21ΔABCF odlade vid 30 ° C, eftersom denna stam inte växer bra vid 37 ° C. E. coli -stammar utan tillväxt defekter kan dock vara odlade vid 37 ° C (utom när förvandlas med pCP20).
Antalet bakterier används för infektioner kan varieras i viss utsträckning. Förhållandet mellan OD600 och en bakterieräkning är ungefär linjär mellan en OD600 värde 0.1 och 1.0, där den förstnämnda motsvarar cirka 108 cfu/mL och den senare ~ 109 cfu/ml. Detta förhållande kan dock variera i viss utsträckning beroende på belastningen i fråga, odlingsmedium och andra faktorer. Det rekommenderas att förhållandet mellan OD600 och antalet livskraftiga bör fastställas för varje laboratorium och stam, särskilt för beräkning av MOI värden. Antalet bakterier används i infektion experiment är inte särskilt kritiska, och 109 cfu/mL representerar den tidiga stationära fasen, som är en rimlig kompromiss mellan cell densiteten och andelen viabla celler i kulturen. Om ett lägre antal livskraftiga bakterier används för transduktion, behöver antalet fagocyt helt enkelt justeras. MOI själv kan också varieras i viss utsträckning. Protokollet kräver en MOI värdet 0,5, även om allt mellan 0,1 och 0,5 bör resultera i en bra effektivitet. På en MOI 0,5 är förhållandet mellan Fager att bakterier 1:2 (dvs., hälften av fagocyt jämfört med antalet bakterier). I exemplet i protokollet, OD600 av kulturen är 1.0, och 1 mL av kulturen används för transduktion; Således är antalet fagocyt krävs 5 x 108. En MOI värdet 0,5 ger en hög nivå av infektion men minskar antalet bakterier som dubbelt smittade, vilket skulle minska effektiviteten i transduktion som de vildtyp (smittsamma) fagocyt långt fler än de transducing fagocyt. En dubbel infektion med en transducing phage och en infektiös phage skulle leda till cell lysis, vilket eliminerar detta transductant från poolen av överlevande. Därför bör en MOI 0,5 inte överskridas.
Protokollet tillåter också några genvägar. Snarare än förbereder lysates från plåtar, förespråkar vissa författare förbereder phage lysates i flytande medium29. Detta kan spara tid som en övernattning INKUBERINGSSTEGET behövs ej. Likaså kan titreringen phage lysate inte vara nödvändigt. Som nämnts ovan, MOI är inte mycket kritisk, och rimlig effektivitet kan uppnås genom att helt enkelt antar en titer på 1010 pfu/mL för en standard lysate.
Trots lätthet av tekniken, P1 transduktion är inte allmängiltiga, och flera villkor måste uppfyllas att vara användbar. För det första finnas en givare stam med en valbar knock-out-allel. Detta sker oftast genom att använda en borttagning där en antibiotikaresistens kassett har ersatt gen av intresse. Samlingen Keio är särskilt användbart i detta avseende, eftersom den erbjuder en klar att använda bibliotek med antibiotika kassett-baserade gen knock-outs som täcker nästan alla icke-väsentliga gener i E. coli K12. Denna samling är särskilt användbart för att knacka ut bevarade gener i de flesta E. coli -stammar (dvs, beståndsdelar av E. coli core genomet). För mindre vanliga gener, såsom virulensfaktorer av patogena E. coli stammar eller sällsynta metaboliska väg gener, mutationen kan behöva skapas de novo. I sådana fall kanske väl inte P1 transduktion vald analysmetod. Förutom viktiga gener är gener som krävs för P1 infektion, såsom galU, mutationer som leder till P1 motstånd30, dålig mål för en borttagning av P1 transduktion. En annan notering när använda samlingen Keio, specifikt är att några stammar bär en dubblering av riktade genen, där endast en kopia stördes av den Kan motstånd kassett8. I sådana fall kan genen av intresse vara avgörande. utredarna rekommenderas att kontrollera uppdaterade anteckningar för sådana gener8. Men tillåter med tanke på dessa begränsningar, P1 transduktion borttagningen av de flesta gener i laboratoriet E. coli -stammar. Till exempel skillnaderna mellan BW25113 och BL21(DE3) är små och påverkar endast en handfull protein-kodande gener31.
För det andra är det viktigt att betona att mottagarens stammen måste kunna en homolog rekombination för den transduktion att arbeta. En stam som saknar den recombinase RecA kan därför ändras inte genom denna metod. Detta utesluter alla standard kloning stammar, såsom DH5α, HB101, TOP10 och XL-1 blå. RecA kan medla recombinations mellan identiska sträckor så kort som 8 bp; dock en längre region av hög likhet kommer att öka sannolikheten för rekombination avsevärt32,33. Ett annat problem, särskilt med kliniska E. coli stammar, är att långa O-antigen kedjor kan maskera receptorn för P1, som ligger i den core oligosackarid lipopolysackarid34. Utöver dessa krav för de mottagande stammen, bör P1 stammen används för transduktion vara en vir mutant; Denna mutation krävs för en fullständig lytisk infektion35.
En tredje varning av P1 transduktion är att genen att vara utslagen ska finnas i en region med hög likheten i de kompletterande regionerna mellan givare och mottagare stammar. Om det finns en brist på synteny mellan stammarna, misslyckas byte av målgenen kodande sekvens med kassetten Kan väl, på grund av skillnader i innehållet i de kompletterande regionerna. Innan man påbörjar P1-medierad gen radering, bör utredare Kontrollera därför sekvenserna av givare och mottagare stammar så att flankera sekvenser är homologa. Naturligtvis, är detta endast möjligt om stammarna har varit sekvenserade. När det gäller stammar med en okänd sekvens, kan P1 transduktion antingen misslyckas eller orsaka andra problem, såsom en gen konvertering i kompletterande regioner. P1 kan transduce ungefärligt 90 kilobase par DNA; om det finns skillnader i gen innehållet i regionerna runt målgenen (t.ex., små deletioner eller infogningar), är det sannolikt att dessa kommer att återgå till sekvensen givare. Detta kan ha oavsiktliga konsekvenser på fenotypen av mottagarens stammen. Därför, om möjligt sekvenserna av givare och mottagare runt genen av intresse bör alltid jämföras före P1 transduktion.
Sammanfattningsvis, är P1 transduktion ett snabbt sätt att överföra en specifik gen knock-out till ett antal stammar när de första knock-out-mutationen har genererats. Även om tekniken har sina begränsningar, gör den lätthet och snabbhet av dess genomförande det ett attraktivt alternativ till andra metoder för genterapi radering. P1 infekterar endast E. coli, som normalt begränsar dess användning till denna art. Dock vissa varianter av P1 har utvecklats som har ett bredare spektrum och kan infektera andra arter inom familjen Enterobacteriaceae, och även några andra arter av γ-proteobacterial, om än i minskad effektivitet36, 37. även transduktion klonade DNA från E. coli till Myxococcus xanthus, en δ-proteobacterium, har varit rapporterade38. I framtida experiment, kunde dessa varianter kompletteras med vir mutationen att bredda utbudet av mottagarens stammar används i antibiotiska kassett-baserade gen radering av allmänna transduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Keio samling stammar erhölls från det nationella BioResource-projektet (NIG, Japan): E. coli. Vi tackar Dirk Linke (Institutionen för biovetenskaper, universitetet i Oslo) för hans fortsatta stöd. Detta arbete finansierades av Vetenskapsrådet Norge ung forskare bidrag 249793 (till Jack C. Leo).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
References
- Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
- Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
- Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
- Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
- Baba, T., Huan, H. -C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, Clifton, NJ. 183-194 (2008).
- Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
- Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
- Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
- Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
- Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
- Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
- Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
- Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
- Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
- Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
- Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
- Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), London, UK. 1021-1030 (1993).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 157-167 (2015).
- Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
- Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., et al. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 1, Unit 1.17 (2007).
- Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
- Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
- Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
- Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
- Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
- Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
- Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
- Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
- O'Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).
