Summary
Leucemia linfocítica crônica (CLL) é a leucemia mais comum no mundo ocidental. Fatores de transcrição NFAT são importantes reguladores do desenvolvimento e ativação em numerosos tipos de células. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) em células humanas de CLL identificar genes alvo romance de NFAT2.
Abstract
Leucemia linfocítica crônica (CLL) é caracterizada pela expansão dos clones de células malignas de B e representa a leucemia mais comum em países ocidentais. A maioria dos pacientes CLL mostra um curso indolente da doença, bem como um fenótipo anérgicas das suas células de leucemia, referindo-se a um receptor de células B não responde a estímulos externos. Nós recentemente têm mostrado que o fator de transcrição NFAT2 é um regulador essencial de anergy em CLL. Um grande desafio na análise do papel do fator de transcrição em diferentes doenças é a identificação de seus genes-alvo específicos. Isto é de grande importância para a elucidação dos mecanismos moleculares e possíveis intervenções terapêuticas. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma técnica clássica para demonstrar as interações proteína-ADN e pode, portanto, ser usada para identificar genes-alvo direto de fatores de transcrição em células de mamíferos. Aqui, o ChIP foi usado para identificar LCK como um gene alvo direto de NFAT2 em células humanas de CLL. DNA e proteínas associadas são quitosana utilizando formaldeído e posteriormente cortado pelo sonication em fragmentos de DNA de cerca de 200-500 de pares de bases (bp). Reticulado fragmentos de DNA associados com NFAT2 então são seletivamente immunoprecipitated de detritos celulares usando um anticorpo αNFAT2. Após a purificação, fragmentos de DNA associados são detectados através de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Sequências de DNA, com evidente enriquecimento representam regiões do genoma que são alvo de NFAT2 na vivo. Corte adequado de DNA e a seleção do anticorpo necessário são particularmente crucial para o sucesso da aplicação desse método. Este protocolo é ideal para a manifestação de interações diretas de NFAT2 com genes-alvo. Sua principal limitação é a dificuldade de empregar o ChIP em ensaios em grande escala, analisando os genes alvo de múltiplos fatores de transcrição em organismos intactos.
Introduction
Leucemia linfocítica crônica (CLL) representa a leucemia mais comum em adultos nos países ocidentais, exibindo distinto acúmulo de CD5, CD23 e CD19 expressar B maduro células1. A maioria dos pacientes apresentam um curso de doença indolente, que não necessita tratamento específico por muitos anos. Pelo contrário, alguns pacientes mostram progressão rápida, que exigem intervenções terapêuticas imediatas com imune-quimioterapia ou outras terapias alvo2,3. Fator nuclear das células T ativadas (NFAT) é uma família de factores de transcrição, controlando vários no desenvolvimento e processos de ativação em numerosas células tipos4,5,6. Recentemente demonstramos superexpressão e ativação constitucional de NFAT2 nas células CLL de pacientes com doença indolente7. Aqui, regula um estado sem resposta à estimulação do receptor de células B chamado anergy7. Para demonstrar que o NFAT2 vincula-se à promotora linfócitos específicos da proteína tirosina quinase (LCK) e regula a expressão LCK em células humanas CLL, um ensaio de imunoprecipitação de cromatina específico (ChIP) foi desenvolvido e empregado.
ChIP é uma das várias técnicas para investigar o papel de factores de transcrição do gene expressão8. Expressão gênica é firmemente orquestrada de uma forma muito complexa por vários reguladores com fatores de transcrição, levando uma parte insubstituível deste processo9,10,11,12. Fatores de transcrição que regulam a expressão do gene em um contexto espacial e temporal foram identificadas em várias espécies (por exemplo, para o desenvolvimento e diferenciação)13,14,15, 16,17,18. Erros nos mecanismos de controle intrincadas envolvendo fatores de transcrição podem levar a uma variedade de processos patológicos, incluindo câncer19,20. Daí, identificação de fatores de transcrição e seus respectivos destinos pode oferecer novas avenidas terapêutico21,22. Para investigar este campo intrigante vários métodos estão disponíveis como ChIP, ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA), vários ensaios suspensos de DNA e repórter-ensaios de11,8,12, 23 , 24.
Para demonstrar que um determinado fator de transcrição interage com regiões específicas do genoma in vivo ChIP é uma técnica ideal25. Para este efeito, DNA e proteínas associadas em células vivas são reticuladas utilizando irradiação UV ou formaldeído (ChIP reticulado, XChIP). Esta etapa é omitida para obter melhor DNA e proteína recuperação em nativo chamado ChIP (NChIP)26. Os complexos DNA-proteína são posteriormente cortados pelo sonication em fragmentos de aproximadamente 200-500 pares de bases (bp) e immunoprecipitated a partir dos escombros de célula, usando um anticorpo específico contra o fator de transcrição de interesse. Os fragmentos de DNA associados são então purificados e caracterizados por PCR, clonagem molecular e sequenciamento. Técnicas alternativas usam microarrays (ChIP-on-Chip) ou o sequenciamento de nova geração (ChIP-Seq) para analisar o DNA de immunoprecipitated.
Microplaqueta foi introduzido pela primeira vez por Gilmour e Lis em 1984 quando usaram UV e luz covalentemente ligação transversal DNA e ligado a proteínas na vida bactérias27. Após a lise celular e imunoprecipitação de bacteriana RNA polimerase, sondas específicas de genes conhecidos foram usadas para mapear a distribuição na vivo e densidade da RNA polimerase. O método foi posteriormente usado pelos mesmos investigadores para analisar a distribuição dos eucariota RNA polimerase II em genes de proteínas de choque térmico em Drosophila28. O ensaio de XChIP aperfeiçoado por Varshavsky e colegas de trabalho que primeiro usou o cross-linking para estudar a associação de histona H4 com calor choque proteína genes29,30de formaldeído. A abordagem NChIP, que leva a vantagem de uma melhor recuperação de DNA e proteína devido a epitopos naturalmente intactas e, portanto, maior especificidade do anticorpo, foi primeiramente descrito por Hebbes e colegas em 198831.
A vantagem do ChIP em comparação com outras técnicas para analisar interações da ADN-proteína na verdade, é que a interação real de um factor de transcrição pode ser investigado in vivo e sem sondas ou condições artificiais criadas pelos buffers ou géis empregado de11,8,12. Combinando o ChIP com o sequenciamento de nova geração, podem ser identificados múltiplos alvos simultaneamente.
Principais limitações desta técnica são a sua aplicabilidade limitada para ensaios em grande escala em organismos intactos25. A análise de padrões de expressão diferencial do gene também pode ser desafiador, usando técnicas de ChIP, se as respectivas proteínas são expressas somente em níveis baixos ou durante as janelas de tempo estreita. Outro fator potencialmente limitante é a disponibilidade de um anticorpo adequado adequado para o ChIP11.
O protocolo de ChIP aqui apresentado pode ser empregado para identificação de genes-alvo de um fator de transcrição na vivo por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Especificamente, o objetivo era identificar genes alvo romance de NFAT2 em CLL. Microplaqueta foi escolhida devido ao seu potencial para demonstrar diretamente a vinculação de NFAT2 para as regiões de promotor dos genes-alvo diferente em condições naturais no pacientes células CLL.
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Protocol
Todos os experimentos realizados com material humano foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade de Tübingen e escrito consentimento informado foi obtido de todos os pacientes que contribuíram amostras para este estudo.
1. isolamento e estimulação de Jurkat células
Nota: Para otimizar o protocolo, use a linha de células Jurkat que é conhecida por expressar os altos níveis de NFAT2. Todas as etapas são executadas sob uma capa de fluxo laminar.
- Prepare 50 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% FCS e 1% penicilina/estreptomicina por aquecimento-37 ° c em banho-maria.
- Cultura de células Jurkat para 1-2-d em um frasco de cultura celular a 37 ° C e 5% CO2 em 20 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% FCS e 1% penicilina/estreptomicina para uma densidade de aproximadamente 2 x 106 células/mL (células são contadas com Trypan coloração azul e um Câmara de Neubauer ao microscópio) e colhê-las por centrifugação por 5 min a 200 x g.
- Remover o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender as células em 10 mL de RPMI 1640 suplementado com FCS de 10% e 1% penicilina/estreptomicina. Posteriormente, conte as células com uma coloração convencional trypan azul e uma câmara de Neubauer ao microscópio.
- Centrifugar as células da etapa 1.3 por 5 min a 200 x g e remover o sobrenadante por aspiração. Então, Ressuspender as células em uma densidade de 2 x 107 células/mL em RPMI 1640 suplementado com FCS de 10% e 1% penicilina/estreptomicina e transferência 1 mL em um novo tubo convencional de 5ml por pipetagem.
- Estimula as células, adicionando 32,4 nM phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) e ionomycin de 1 µM. Então, Incube as celulas para 16 h a 37 ° C e 5% CO2 com a tampa do tubo aberto (para evitar contaminação, um filme de vedação permeável ao ar pode ser usado).
2. isolamento e estimulação das células CLL primário de pacientes humanos
Nota: As amostras dos pacientes foram adquiridas e estimuladas como descrito anteriormente,7. Todas as etapas são executadas sob uma capa de fluxo laminar.
- Preparar o equipamento necessário para tirar o sangue dos pacientes e realizar uma separação de gradiente de densidade: 21-G agulhas, torniquete, NH4-heparina-sangue seringas de coleção (por exemplo, S-monovettes), 1X PBS e médio gradiente de densidade (densidade 1,077 g/mL) .
- Após punção venosa, atrair o sangue de pacientes CLL (ca. 40 mL sangue por paciente) para as seringas. Depois, transferi o sangue em tubos de Erlenmeyer de 50 mL. Lave a seringa com 10 mL de PBS e piscina no sangue-PBS-suspensão em tubos de 50 mL (ajustar o número de tubos para o volume de sangue).
- Prepare-se 15 mL do meio de gradiente de densidade em um tubo de cónico de 50 mL. Posteriormente, camada 35 mL de sangue-PBS-suspensão com cuidado no meio de gradiente de densidade. Para este fim, segure o tubo em um ângulo plano e pipetar lentamente a sangue-PBS-suspensão contra a parede do fundo do tubo cónico de 50 mL. Como mais da sangue-PBS-suspensão é acumular no tubo cónico de 50 mL, aumente o ângulo do tubo até um ângulo reto. Repita este passo de acordo com o volume de sangue-PBS-suspensão.
- Realizar a centrifugação a 560 x g por 20 min (sem freio) e, em seguida, extrair a fase de células mononucleares que contém as células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Para isso, coletar a interfase branca da separação de gradiente de densidade com uma pipeta sorológica 5ml e transferi-lo para um novo tubo cónico de 50 mL.
- Enchem a suspensão de eritrócitos a 50 mL de PBS e centrifugar durante 5 min à 360 x g. Retire o sobrenadante por aspiração. Repita este passo com centrifugação por 5 min a 275 x g. Em seguida, juntar as células de um paciente em 5-10 mL de PBS em um tubo cónico de 50 mL.
- Conte as células conforme descrito no ponto 1.3.
Nota: Depende da proporção de células CLL os PBMCs isolados, se as células podem ser usadas diretamente para este procedimento ou um isolamento de célula B tem de ser realizado, por exemplo, através de célula magnética classificação (MACS). O isolamento de células B é recomendado, mas pode ser omitido se a proporção de células CLL é acima de 95% dos linfócitos totais (determinados através de citometria de fluxo). Pacientes de sangue de CLL é fixo e lysed de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, uma coloração com anticorpos CD19-FITC e CD5-PE é realizada de acordo com as instruções do fabricante e as células são analisadas através de citometria de fluxo. Uma paciente exemplar é mostrada na Figura 1, na qual a proporção de células CLL é 89.03%. Assim, um isolamento de célula B tem de ser realizada nesse paciente. A proporção de células de B fisiológicas é negligenciável (3.72% no exemplo). - Lavar as células com 10 mL de pré-aquecido (37 ° C) RPMI 1640 suplementado com FCS de 10%, 1% penicilina/estreptomicina, 100 mM não aminoácidos essenciais, piruvato de sódio 1 mM e 50 mM β-Mercaptoetanol durante 5 min à x 200 g e remover o sobrenadante por aspiração.
- Ajuste as células a 2 x 107 células/mL em RPMI 1640 suplementado com FCS de 10%, 1% penicilina/estreptomicina, 100 mM não aminoácidos essenciais, 1mm de sódio piruvato e 50mm β-mercaptoetanol (37 ° C) e 1 mL de suspensão de células de preenchimento para um tubo de 5 mL.
Nota: A ß-Mercaptoetanol é empregado para combater o stress oxidativo. - Estimula as células, adicionando 32,4 nM PMA e ionomycin de 1 µM. Então, Incube as celulas para 16 h a 37 ° C e 5% CO2 com a tampa do tubo aberto (para evitar contaminação, um filme de vedação permeável ao ar pode ser usado).
Nota: Para reduzir o nível de estresse, as células podem estar descansadas para 1 h a 37 ° C e 5% CO2 na incubadora antes a 16 h de estimulação.
3. fixação, lise celular e cromatina tosquia
Nota: As amostras dos pacientes e células Jurkat fixas e lysed com um kit de ChIP comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante com modificações conforme descrito anteriormente,7. A fixação é realizada sob uma capa de fluxo laminar.
- Prepare um tubo de 1,5 mL com 1 mL de formol 37%, um tubo de 1,5 mL com 1 mL de 1,25 M de glicina, um tubo de 5 mL com 4 mL de 1X PBS e uma caixa com gelo para a fixação das células.
- Após a estimulação das células para o tempo de incubação respectivos na etapa 1.5 ou 2.9, gire os tubos de 5ml a 200 x g por 5 min e ressuspender as células em 500 µ l de PBS em tubos de 5 mL.
- Adicione 340 formaldeído µM (13,5 µ l de 37% de formaldeído) para as células. Após a breve mistura cuidadosamente pipetando sobem e descem incube a suspensão para 2,5 min (células Jurkat) ou 5 min (amostra do paciente) à temperatura ambiente.
Nota: Tempo de fixação prolongado é necessário para as células primárias assegurar o corte ideal. - Adicionar glicina 125mm (57 µ l de 1,25 M glicina) para parar a fixação e incube por mais 5 min. Coloque as pilhas no gelo imediatamente depois e centrifugar 500 x g por 5 min a 4 ° C. Retire o sobrenadante por aspiração.
- Lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS gelado a 200 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante de cada vez por aspiração.
Nota: Após a fixação, o protocolo pode ser pausado. Células fixas devem ser armazenadas a-80 ° C. Para testar, se o epítopo do anticorpo a intenção de usar o protocolo a seguir não é mascarado através de fixação, as amostras adicionais podem ser usadas para análise através de electroforese do gel de SDS-PAGE e Western blot. Essas etapas são executadas com 100 µ g de proteína de acordo com as instruções do fabricante. Todos os αNFAT2 de anticorpos são utilizados numa diluição de 1: 1000, o anticorpo GAPDH numa diluição de 1: 10000. Uma imagem exemplar de fixas amostras de células Jurkat com anticorpos adequados e inadequados é mostrada na Figura 2. - Ressuspender as células em 5 mL de tampão de Lise comercialmente disponível 1 pipetando para cima e para baixo. Em seguida, colocar as amostras no gelo em uma coqueteleira e incube-os por 10 minutos agitando.
Nota: Antes da lise, as células podem ser desintegradas por 10 s em nitrogênio líquido. Isto é útil para células Jurkat, mas deve ser evitado em amostras de pacientes primárias. Para a desintegração, coloque os tubos de 5 mL por 5 s em 5-10 mL de nitrogênio líquido em um recipiente específico. Use óculos de segurança e luvas de segurança adequadas. - Posteriormente, centrifugar os tubos a 500 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante cuidadosamente por pipetagem.
- Homogeneizar as células em 5 mL de tampão de Lise comercialmente disponível 2 pipetando para cima e para baixo e incubar durante 10 min no gelo e agitando. Em seguida centrifugar os tubos a 500 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante cuidadosamente por pipetagem.
- Ressuspender as células em 500 µ l (células Jurkat) ou µ l 140 (amostras) de cisalhamento buffer 1 contendo 1 x inibidor da protease (5 µ l ou 1,4 µ l, respectivamente) e incubar a mistura durante 10 minutos no gelo.
- Para a tosquia de cromatina, transferi 140 µ l de suspensão de células da etapa 3,9 para tubos de sonicador (evitar produzir bolhas de ar e repita este passo se necessário devido ao volume de amostra). Coloque os tubos no ultrasonicador focado a uma temperatura de 7 ° C e de cisalhamento por 10 min (linha de celular) ou 7,5 min (amostras) com uma potência média de incidente de 9.375 W para obter fragmentos de DNA 200-500 bp.
- Finalmente, centrifugar a 15700 x g durante 10 minutos a 4 ° C, na pequena centrífuga e recolher o sobrenadante em um novo tubo de 1,5 mL.
- Para testar o tamanho do fragmento apropriado, analise 20 µ l da cromatina cortada através do gel-eletroforese em gel de agarose 1,5% TBE. Uma imagem exemplar da cromatina distorcida de células Jurkat de boa e má qualidade é mostrada na Figura 3. Neste ponto, o protocolo pode ser potencialmente pausado. Cromatina cortada deve ser armazenada a-80 ° C.
4. imunoprecipitação da cromatina
Nota: A imunoprecipitação da cromatina foi realizada com um kit de ChIP comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante com modificações7.
- Calcular o número de moleculas (70 µ l (células Jurkat) ou 15 µ l (amostras) de cromatina cortada mais um anticorpo) e prepare-se 20 µ l de grânulos de proteína A revestido por precipitação em um tubo de 1,5 mL. Lave os grânulos em 40 µ l de tampão de ChIP 1 por precipitação 1x pipetando para cima e para baixo, deixe os grânulos descansar em um rack magnético para 1 min e retire o sobrenadante por pipetagem. Execute esta etapa quatro vezes no total. Eventualmente, resuspenda os grânulos do volume original com buffer de ChIP 1 x 1.
- Para a imunoprecipitação em si, use 10 µ g do anticorpo αNFAT2 (7A6) para capturar NFAT2 com suas sequências de destino vinculado. Use 2,5 µ g de um anticorpo de IgG de coelho (DA1E) como um controle de IgG. Prepare as reações em tubos fresca 1,5 mL conforme indicado na tabela 1.
Nota: É importante o uso de um anticorpo monoclonal com alta afinidade cujo epítopo não é mascarado durante a fixação para este protocolo. Anticorpos policlonais de introduzir um nível adicional de variação tornando significativamente mais difícil interpretar adequadamente os resultados recebidos. - Incube a mistura da etapa 4.2 durante a noite a 4 ° C em uma roda rotativa a 6 rpm.
- No próximo dia girar os tubos para 5 s a 7.000 x g na pequena centrífuga, incube-os em um rack magnético por 1 min e retire o sobrenadante por aspiração. Lave os grânulos uma vez com cada um dos buffers de lavagem 1, 2, 3 e 4, consecutivamente.
- Para fazer isso, resuspenda os grânulos em 350 µ l de tampão de lavagem e incube-os por 5 min a 4 ° C em uma roda rotativa a 6 rpm.
- Depois, gire os tubos para 5 s a 7000 x g na pequena centrífuga. Em seguida, colocá-los por 1 min em um rack magnético, remover o sobrenadante e adicionar o seguinte tampão de lavagem.
- Após a última etapa de lavagem, remover o sobrenadante por pipetagem, ocupam os grânulos em 100 µ l de tampão de eluição 1 e incube-os por 30 min em uma roda rotativa a 6 rpm.
- Girar os tubos em breve (5 s a 7000 x g na pequena centrífuga) e colocá-los em um rack magnético por 1 min.
- Em seguida, transferir o sobrenadante pipetando para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 4 µ l de tampão de eluição 2.
- Para criar o controle de entrada, misture 1 µ l da cromatina cortada com 99 µ l de eluição buffer 1 e 4 µ l de tampão de eluição 2 (nesta instalação, existem três tubos por paciente: uma entrada de controle, um controle de IgG e uma amostra de αNFAT2).
- Incube as amostras por 4 h a 65 ° C e 1300 rpm em um agitador de tubo de 1,5 mL. Adicionar 100 µ l de isopropanol 100%, vórtice e girar as amostras para 5 s a 7000 x g na pequena centrífuga.
- Resuspenda as esferas magnéticas disponíveis completamente vortexing, adicionar 10 µ l dos grânulos para cada amostra e incubar por 1h à temperatura ambiente em uma roda rotativa a 6 rpm.
- Após a incubação, girar os tubos para 5 s a 7000 x g em pequenas centrifugue e colocá-los por 1 min em um rack magnético. Retire o sobrenadante por aspiração.
- Resuspenda as contas em 100 µ l de tampão de lavagem 1. Inverta os tubos para misturar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente em uma roda rotativa a 6 rpm.
- Girar os tubos para 5 s a 7000 x g na pequena centrífuga, colocá-los por 1 min em um rack magnético e remover o sobrenadante por pipetagem. Repita as etapas 4.13-4.14 com tampão de lavagem 2.
- Posteriormente, remova o tampão de lavagem por aspiração, resuspenda os grânulos em 55 µ l de tampão de eluição e incube por 15 min à temperatura ambiente na roda rotativa a 6 rpm para Eluir o DNA precipitado. Finalmente, gire os tubos para 5 s a 7000 x g na pequena centrífuga, colocá-los por 1 min em um rack magnético e transferir o sobrenadante para novos tubos de 1,5 mL.
Nota: Aqui o protocolo pode ser potencialmente pausado. O DNA eluted então deve ser armazenado a-20 ° C.
5. detecção de genes-alvo NFAT nas células CLL.
- Realizar a reação de qRT-PCR em duplicado para cada amostra, conforme indicado na tabela 2.
Nota: Para a detecção de genes-alvo um PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) é realizado usando uma mistura de qRT-PCR comercialmente disponíveis com um instrumento de PCR em tempo real. - Placas de 96 poços reação uso branco para as reações e o instrumento de RT-PCR. As condições de ciclismo são os seguintes: 95 ° C por 30 s, [95 ° C por 5 s, 60 ° C por 30 s] x 40 ciclos.
Nota: Uma diluição serial da entrada (não diluído ou diluído 01:10, 1: 100 e 1: 1000 em água livre de nuclease) é usada para calcular o enriquecimento relativo. Nas células Jurkat, IL-2 foi usado como um controle positivo32. CD40L, um destino bem conhecido de NFAT2 nas células B, foi usado como controle positivo em células CLL e LCK como exemplo para um gene alvo romance de NFAT2 em CLL33,34. Os primers para região promotora CD40L, o Il-2 e LCK são descritos na tabela de equipamentos e reagentes específicos.
6. normalização e análise de dados
Nota: Enriquecimento relativo para as regiões de promotor de interesse (IL-2, CD40L ou LCK) é calculado usando o IgG-controle para normalização.
- Primeiro, determine valores de Ct (ciclo de limiar) para a diluição de entrada serial, o IL-2, CD40L e região promotora LCK através do software de avaliação de dados qRT-PCR.
- Defina uma curva padrão para as concentrações através da diluição serial da entrada. Com esta curva padrão Calcule a concentração para o IL-2, CD40L e região promotora LCK para cada duplicata de cada amostra.
- Em seguida, calcule a média das duplicatas. Em seguida, defina a amostra de imunoprecipitação de IgG como referência. Definir o enriquecimento relativo para esta amostra como 1.0 e comparar a outra amostra (a partir da imunoprecipitação de NFAT2) para essa referência.
- Finalmente, calcule o enriquecimento relativo dividindo a concentração das amostras pela concentração de referência IgG.
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Representative Results
A Figura 1 mostra uma análise de citometria de fluxo exemplar de um paciente CLL realizada após coloração com anticorpos CD19-FITC e CD5-PE. Figura 1a mostra a retenção dos linfócitos, que representa a maioria das células no sangue de pacientes CLL. A Figura 1b mostra a proporção de CD19+/CD5+ CLL células, que representam 89.03% dos linfócitos, neste exemplo. A proporção de CD19+/CD5– de células B é 3.72% no respectivo paciente.
A Figura 2 mostra exemplos de desempenho anticorpo nas células Jurkat fixadas por períodos de tempo diferentes, avaliadas por SDS-PAGE e Western Blot. Analisaram-se anticorpos diferentes de diferentes fabricantes. Figura 2a mostra o desempenho do αNFAT2-anticorpo (clone 7A6) de diferentes fabricantes detectados com anticorpo antirato verde fluorescente. O anticorpo do fabricante 1 mostrou vinculando a sua epítopo sem fixação (grupo A) e até mesmo quando as células Jurkat foram fixadas para 2,5 min ou 5 min (banda B ou C, respectivamente). O αNFAT2-anticorpo (clone 7A6) fabricante 2, por outro lado, mostrou um desempenho mais fraco mesmo em células Jurkat não fixa (banda D). Após a fixação, o anticorpo deste fabricante resultados ainda mais fraco (bandas E (fixação de 2,5 min) e F (fixação de 5 min)). Figura 2b mostra o desempenho do αNFAT2-anticorpo (clone D15F1) de um fabricante diferente detectado com anticorpo anticoelho vermelho fluorescente. Este anticorpo também fracamente realizada em amostras não fixadas (grupo A) e a ausência de uma banda indica o mascaramento de sua epítopo pela fixação (bandas B (fixação de 2,5 min) e C (fixação de 5 min)).
A Figura 3 mostra exemplos de cromatina distorcida de células Jurkat obtidos após fixação diferente e tempos de boa e má qualidade de corte, avaliadas por electroforese do gel. Bandas A e B (0 min fixação ou fixação de 2,5 min, respectivamente) mostrar boa qualidade cortado da cromatina, que é caracterizada por um tamanho do fragmento de DNA de 200-500 bp, que pode ser detectado em um gel de agarose como um típico smear. Cromatina distorcida de má qualidade, por outro lado, pode ser reconhecida por quase completa ou completa ausência do esperado esfregaço de ADN (banda C), bem como uma mancha em uma maior ou menor do que a faixa de tamanho de fragmento esperado (bandas D-F). A completa ausência de manchar a imagem indica o uso de quantidades insuficientes de material começar. A detecção de DNA menor fragmentos dicas para excessiva DNA corte (banda E) enquanto maior dica de fragmentos de DNA de cisalhamento insuficiente.
A Figura 4 mostra os resultados de um experimento típico com células Jurkat. LCK foi analisado como um potencial alvo de NFAT2. IL-2 que é um gene alvo bem definido de NFAT2 em células T foi usado como controle positivo. Um anticorpo IgG-controle foi utilizado para normalização. A figura 4a mostra um experimento com óptimos resultados documentados pelo enriquecimento significativo do controle positivo IL-2 . Neste experimento, pode concluir-se que há um enriquecimento significativo da LCK sequências no DNA precipitado demonstrando que LCK é um alvo direto de NFAT2 nas células Jurkat. Figura 4b mostra um experimento realizado com má qualidade DNA devido a falta de fixação ou um procedimento de corte suboptimal causando um baixo grau de enriquecimento no controle positivo IL-2 .
A Figura 5 mostra os resultados de um experimento realizado com células CLL primárias. CD40L , que é um conhecido destino NFAT2 em células B servida como controle positivo e LCK foi analisado como o destino experimental. Figura 5a mostra um experimento com um nível considerável de enriquecimento de CD40L DNA no controle positivo. Do enriquecimento ainda mais forte do DNA de LCK , poder concluir-se que LCK é também um alvo NFAT2 direto nas células de LLC humanos primários. Figura 5b mostra um experimento realizado com má qualidade DNA provavelmente devido ao cisalhamento inadequada. Sem enriquecimento substancial de CD40L DNA pode ser detectado no controle positivo tornando os dados experimentais sem sentido.
Figura 1: análise de citometria fluxo exemplar dos pacientes CLL. (a) amostras de pacientes CLL foram analisadas através de citometria de fluxo após coloração com anticorpos CD19-FITC e CD5-PE e linfócitos foram bloqueados. (b) em seguida, a proporção de CD19+/CD5+ CLL células e CD19+/CD5– de células B que foram determinadas. Aqui, CD19+/CD5+ CLL células representam 89.03% de linfócitos, Considerando que CD19+/CD5– de células B representam 3.72% de linfócitos. Uma paciente exemplar é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: exemplos de desempenho de anticorpo em fixos células Jurkat, avaliadas por SDS-PAGE e Western-Blot. (a) células Jurkat foram corrigidas para 0 min (bandas A e D), 2,5 min (bandas B e E), ou 5 min (C e F) e o αNFAT2-anticorpo (clone 7A6) de diferentes fabricantes (bandas A C = fabricante 1, bandas D-F = fabricante 2) foi comparado. O anticorpo do fabricante 1 mostrou um melhor desempenho global, a ligação com a maior afinidade mesmo com amostras fixas (comparar bandas A C e bandas D-F). (b) o αNFAT2-anticorpo (clone D15F1) de um fabricante diferente foi usado. Este anticorpo mostrou apenas um fraco desempenho em amostras não fixadas (grupo A) e o epítopo foi mascarado com fixação. Portanto, nenhuma ligação do anticorpo pode ser detectada após a fixação (bandas B e C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exemplos de cromatina de boa e má qualidade de corte de células Jurkat avaliados por eletroforese em gel. As células Jurkat eram fixas e cortadas por períodos de tempo diferentes. Fixação foi feita para min 0 (bandas A e D), 2,5 min (bandas B e E), ou 5 min (C e F). Corte foi realizada por 10 min (bandas de A-C) ou 20 min (bandas D-F). Cromatina de boa qualidade de corte é caracterizada por um tamanho do fragmento de DNA de 200-500 bp, que pode ser detectado como uma mancha na respectiva região (bandas A e B). Cromatina de má qualidade pode ser reconhecida por uma ausência quase completa ou completa do DNA manchar devido a uma quantidade insuficiente de começar o material utilizado (banda C) ou por um esfregaço em uma região de tamanho menor ou maior por causa de corte inadequado condições ( bandas D-F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ChIP de células Jurkat avaliado por qRT-PCR. (a) NFAT2 vincula a LCK e o promotor de IL-2 nas células Jurkat. O enriquecimento relativo das regiões do promotor LCK e IL-2 precipitadas com o anticorpo NFAT2 é mostrado como analisado por qRT-PCR. Três ChIP independentes-experimentos são apresentados como média ± SEM (teste t de Student, * P < 0,05; * * P < 0,01 * * * P < 0,001). (b) DNA das amostras com má qualidade cortada cromatina foi usado. Nenhuma ligação relevante de NFAT2 para as sequências de destino poderia ser detectada. Um quadro semelhante pode ser detectado se não havia nenhuma fixação ou o tempo de incubação com o anticorpo NFAT2 era insuficiente. Três ChIP independentes-experimentos são apresentados como média ± SEM (teste t de Student, * P < 0,05; * * P < 0,01 * * * P < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: ChIP de primárias células CLL avaliado por qRT-PCR de. (a) NFAT2 vincula especificamente os promotores LCK e CD40L em células CLL primários de pacientes com um curso indolente da doença. O diagrama mostra o enriquecimento relativo das regiões do promotor LCK e CD40L precipitadas com o anticorpo NFAT2 como analisado por qRT-PCR. Três ChIP independentes-experimentos são apresentados como média ± SEM (teste t de Student, * P < 0,05; * * P < 0,01 * * * P < 0,001). (b) DNA de amostras de pacientes com má qualidade cortada cromatina foi usado. Foi observada nenhuma ligação de NFAT2 para as sequências de destino correspondente. Três ChIP independentes-experimentos são apresentados como média ± SEM (teste t de Student, * P < 0,05; * * P < 0,01 * * * P < 0,001) clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| item de | volume (µ l) por IP |
| 5% BSA | 6 |
| 100 x inibidor da protease | 3 |
| 5 x tampão ChIP 1 | 56 |
| cromatina cortada | x (15 µ l ou 70 µ l) |
| Proteína A revestido grânulos magnéticos | 20 |
| Microplaqueta seq série água | 185-x-y |
| anticorpo (αNFAT2 ou IgG-controle) | y (1,09 µ l ou 1 µ l) |
| total | 270 |
Tabela 1: cronograma para pipetar a imunoprecipitação da cromatina. A imunoprecipitação da cromatina foi realizada por preparar as reações conforme indicado na tabela.
| item de | volume (µ l) por qRT-PCR |
| Immunoprecipitated DNA | 9 |
| qRT-PCR Mix | 10 |
| cartilha para a frente (LCK/CD40L/IL-2) | 0,5 |
| primeira demão reversa (LCK/CD40L/IL-2) | 0,5 |
| total | 20 |
Tabela 2: cronograma para pipetar o qRT-PCR. QRT-PCR foi realizada por preparar as reações conforme indicado na tabela.
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Discussion
Os passos críticos da realização de um ensaio da microplaqueta bem-sucedida estão a seleção de um anticorpo adequado e a otimização da tosquia processo25a cromatina. A seleção do anticorpo αNFAT2 provou para ser particularmente desafiador durante o desenvolvimento do presente protocolo. Embora existam vários anticorpos αNFAT2 comercialmente disponíveis e a maioria destes funciona bem para a mancha ocidental e outras aplicações, clone 7A6 foi o único anticorpo que pode ser usado com sucesso para o ChIP7. Mesmo supostamente 7A6 idênticos anticorpos de diferentes fabricantes exibiram diferenças significativas em relação ao seu desempenho no ChIP. Um grande desafio é a perturbação potencial de epitopos de proteína alvo pelo processo de fixação usado em XChIP protocolos25.
A cromatina procedimento de corte também é fundamental para a aquisição de resultados adequados em XChIP. Um tamanho de fragmento de 200-500 bp avaliada por eletroforese em gel de agarose foi encontrado para ser ideal neste ChIP NFAT2 protocolo7. Condições de corte inadequadas, resultando em falta de DNA a partir de material ou fragmentos de DNA de tamanho menor ou maior normalmente conduzem a resultados suboptimal ao executar este ensaio. Qualidade inferior de corte também foi observado ao usar congelados e rethawed PBMCs. daí, descongelamento de PBMC resultou em um menor rendimento do DNA de células, bem como um aumento excessivo de corte de fragmentos de DNA.
A disponibilidade de uma ampla variedade de kits de ChIP e ChIP-grau anticorpos é desafiador, mas também oferece a possibilidade de usar a técnica em um contexto amplo. Assim, uma diversidade de factores de transcrição pode ser investigada em diferentes tipos de células. Por exemplo, outros membros da família NFAT (NFAT1 e NFAT4) foram investigados recentemente usando ChIP35,36,37.
O kit de ChIP usado aqui também teve que ser modificado para atender nossas necessidades. Em primeiro lugar, o tempo de fixação foi ajustado para evitar o mascaramento do epítopo reconhecido pelo anticorpo utilizado e para permitir o corte ideal. O volume de buffers usados para Lise e distorção também foi mudado para reduzir a perda de células durante as etapas de lavagem diferente. Além disso, as condições de corte foram otimizadas para obter fragmentos de DNA na faixa de 200-500 bp. O inibidor de protease e o anticorpo IgG-controle foram trocadas com outros reagentes disponíveis comercialmente como provaram ser comparáveis e mais cost-effective. A etapa que envolve a transportadora fornecida pelo fabricante foi omitida como interferiu a precipitação do DNA. No final, a quantidade de buffer usado para Eluir o DNA foi adaptada para produzir um volume suficiente para ser usado em qRT-PCR.
Há vários outros kits disponíveis de várias empresas e há também a possibilidade de realizar o ChIP sem um kit. No entanto, testes e estabelecimento são muito desafiadoras, pois há muitos fatores a serem considerados, como a compatibilidade das células analisadas e proteínas com fixação diferente e métodos de corte. O kit mencionado foi usado como estava bem estabelecida no nosso laboratório.
Uma restrição importante desse método é sua aplicabilidade limitada às investigações em grande escala em organismos-modelo intacto porque anticorpos apropriados têm que ser identificados ou gerados para cada factor de transcrição individuais. A análise de genes que são expressos apenas em níveis baixos, em um pequeno número de células ou durante uma janela de tempo restrito pode também ser um desafio usando o ChIP.
Enquanto o ChIP é o padrão ouro para demonstrar uma interação direta de um fator de transcrição determinado com seus genes alvo respectivos em células eucarióticas intacta25, há uma série de outras técnicas para investigar uma interação entre proteínas e DNA . EMSA é um método útil para detectar proteínas obrigatórias do baixo-abundância DNA na célula lystates24. Ele também pode ser usado para caracterizar a afinidade de ligação de uma proteína em particular através de uma análise mutacional de sonda de DNA sistemática. Uma grande vantagem da EMSA em comparação com o ChIP é o fato de que é geralmente substancialmente menos demorado para estabelecer o respectivo ensaio. Ensaios de pull-down de DNA, captura de microplacas e ensaios de deteção e repórter ensaios são outras técnicas para analisar de interações proteína-ADN23.
Os desenvolvimentos mais recentes, foi possível aplicar o ensaio da microplaqueta para todo o genoma abordagens pela sua combinação com microarray tecnologia (ChIP-on-chip)38,39,40 ou sequenciamento de próxima geração (ChIP-Seq )41,42,43.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo DFG conceder MU 3340/1-1 e a Deutsche Krebshilfe concedem 111134 (ambos premiados para M.R.M.). Agradecemos Elke Malenke pela excelente assistência técnica).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
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