Summary
Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) является наиболее распространенным лейкемии в западном мире. NFAT транскрипционные факторы являются важными регуляторами развития и активации в многочисленных типах клеток. Здесь мы представляем собой протокол для применения иммунопреципитации chromatin (обломока) в клетках человека CLL для выявления новых целевых генов NFAT2.
Abstract
Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) характеризуется расширением злокачественные клетки B клонов и представляет собой наиболее распространенных лейкемии в западных странах. Большинство пациентов ХЛЛ показывают праздного течения заболевания, а также anergic фенотип их лейкозных клеток, ссылаясь на B клеточных рецепторов, не реагируют на внешней стимуляции. Недавно мы показали, что фактор транскрипции NFAT2 является важным регулятором анергия в ХЛЛ. Одной из основных задач в анализе роли фактора транскрипции в различных заболеваний заключается в определении своих конкретных целевых генов. Это имеет большое значение для разяснения патогенетических механизмов и потенциальных терапевтических вмешательств. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является классический способ продемонстрировать взаимодействий протеин дна и может таким образом, использоваться для выявления прямых целевых генов факторов транскрипции в mammalian клетках. Здесь чип использовался для выявления LCK как прямой целевого гена NFAT2 в клетках человека ХЛЛ. Связанные белков и ДНК, сшитые с помощью формальдегида и впоследствии стриженый sonication на фрагменты ДНК приблизительно 200-500 пар оснований (ВР). Сшитых фрагментов ДНК, связанные с NFAT2, затем выборочно immunoprecipitated от мусора ячейки с помощью αNFAT2 антитела. После очистки связанные фрагменты ДНК обнаруживаются через Количественная ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР). Последовательности ДНК с очевидным обогащения представляют регионы генома, которые являются мишенью для NFAT2 в естественных условиях. Соответствующие стрижка ДНК и подбор необходимых антитела являются особенно важное значение для успешного применения этого метода. Этот протокол является идеальным для демонстрации прямого взаимодействия NFAT2 с генов-мишеней. Его основным ограничением является трудность использовать чип в крупномасштабных анализов, анализ генов-мишеней несколько факторов транскрипции в нетронутыми организмов.
Introduction
Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) представляет собой наиболее распространенных лейкемии у взрослых в западных странах, выставке собственный накопление CD19, CD23 и CD5 выражая зрелые B клетки1. Большинство пациентов выставку праздного течения, которые не требуют специального лечения для многих лет. Напротив некоторые пациенты показать быстрой прогрессии, требующих немедленного терапевтических вмешательств с иммунной химиотерапии или другие целевые терапии2,3. Ядерный фактор активированные Т-клеток (NFAT) — семейство контроля развития различных факторов транскрипции и активации процессов в многочисленных ячейка типы4,5,6. Недавно мы продемонстрировали гиперэкспрессия и конституционных активации NFAT2 в клетки CLL от пациентов с праздного болезни7. Здесь он регулирует отвечать государства для стимуляции рецепторов клетки B называется анергия7. Чтобы продемонстрировать, что NFAT2 связывается с лимфоцитов специфические белки тирозин киназы (LCK) промоутер и регулирует LCK выражение в клетках человека ХЛЛ, assay иммунопреципитации конкретные хроматина (чип) разработана и занятых.
Чип представляет один из нескольких методов для изучения роли факторов транскрипции гена выражение8. Экспрессия генов плотно делается очень сложным образом несколькими регуляторами с транскрипционными факторами незаменимой участвуя в этот процесс9,10,и11,12. В многочисленных видов (например, для развития и дифференциации)13,14,15, выявлены транскрипционные факторы, регулирующие экспрессии генов в пространственной и временной контекст 16,17,18. Ошибки в замысловатые контрольных механизмов с участием транскрипционных факторов может привести к различных патологических процессов, включая рак19,20. Следовательно выявление факторов транскрипции и их соответствующие цели может предложить роман терапевтических направлений21,22. Расследовать этот интригующий поле несколько методов доступны как чип, assay переноса электрофоретической подвижности (EMSA), различные ДНК выпадающее assays и репортер анализов8,11,12, 23 , 24.
Чтобы продемонстрировать, что определенные транскрипционный фактор взаимодействует с конкретными регионами генома в естественных условиях, чип является идеальной техникой25. Для этой цели ДНК и связанных белков в живых клетках сшиты с помощью УФ-облучения и формальдегид (сшитый чип, XChIP). Этот шаг пропускается, для получения лучшего ДНК и белка восстановления в так называемых родной чип (NChIP)26. Комплексы ДНК белок впоследствии стриженый, sonication на фрагменты примерно 200-500 пар оснований (ВР) и immunoprecipitated от мусора ячейки, используя специфическое антитело против транскрипционный фактор интереса. Связанные фрагменты ДНК затем очищенный и характеризуется PCR, молекулярное клонирование и секвенирование. Альтернативные методы использовать microarrays (чип на Chip) или секвенирование нового поколения (чип-Seq) для анализа immunoprecipitated ДНК.
Чип был впервые введен Гилмор и лис в 1984 году, когда они использовали УФ света ковалентно перекрестных ссылок ДНК и связанных белков в живых бактерий27. После лизиса клеток и иммунопреципитации бактериальных РНК-полимеразы конкретных зонды известных генов были использованы для сопоставления в vivo распределения и плотности РНК-полимеразы. Для анализа распределения эукариот РНК-полимераза II на тепловой шок белок генов в дрозофилы28же следователей впоследствии использовался метод. XChIP проба была далее обогащена Варшавский и coworkers, которые впервые используется формальдегид cross-linking учиться ассоциации гистона H4 с тепловой шок белок генов29,30. NChIP подход, который несет в себе преимущества лучше восстановления ДНК и белка из-за естественно нетронутыми эпитопов и, следовательно, большей специфичности антитела, впервые был описан Hebbes и коллеги в 1988 году31.
Преимуществом чип по сравнению с другими методами для анализа ДНК белковых взаимодействий является на самом деле, что фактическое взаимодействие транскрипционный фактор может быть исследованы в естественных условиях и не зондов или искусственные условия, созданные буферов или гели работают8,,1112. Объединив чип с секвенирование нового поколения, одновременно могут быть определены несколько целей.
Основные ограничения этой техники являются его ограниченную применимость для крупномасштабных анализов в неповрежденной организмов25. Анализ картин выражения гена дифференциальных также может быть сложным, с использованием методов чип, если соответствующие белки выражаются только на низком уровне или в ходе узких временных окон. Еще одним потенциально ограничивающим фактором является наличие соответствующих антител, подходит для чипа11.
Протокол чип, представленные здесь может быть использован для идентификации генов-мишеней транскрипционного фактора в vivo Количественная ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР). В частности цель заключалась в выявлении новых целевых генов NFAT2 в ХЛЛ. Чип был выбран за его потенциал непосредственно продемонстрировать привязку NFAT2 промоутер регионам различных целевых генов в естественных условиях в клетках человека ХЛЛ пациента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с человеческого материала были утверждены Комитетом по этике университета Tübingen и письменное информированное согласие было получено от всех пациентов, которые внесли образцы для этого исследования.
1. изоляция и стимуляции Jurkat клетки
Примечание: Для оптимизации протокола, используйте линии клеток Jurkat, который известен выразить высокий уровень NFAT2. Все действия выполняются под капотом ламинарного потока.
- Подготовка 50 мл RPMI 1640 с 10% FCS и 1% пенициллина/стрептомицина дополнена потепления до 37 ° C на водяной бане.
- Культура клетки Jurkat для 1-2 d в колбе культуры клеток при 37 ° C и 5% CO2 в 20 мл RPMI 1640 дополнена 10% FCS и 1% пенициллина/стрептомицина плотность примерно 2 х 106 клеток/мл (ячейки отсчитываются с Трипановый синий окрашивание и Нойбауер палата под микроскопом) и собирать их центрифугированием на 5 минут при 200 x g.
- Удалить супернатант с пипетки и Ресуспензируйте клетки в 10 мл RPMI 1640, дополненная FCS 10% и 1% пенициллина/стрептомицина. Впоследствии подсчитать количество ячеек с обычными Трипановый синий окрашивание и Нойбауэр камеры под микроскопом.
- Центрифуга клетки от шага 1.3 для 5 минут при 200 x g и удалить супернатант путем аспирации. Затем Ресуспензируйте клетки на плотность 2 x 107 кл/мл в RPMI 1640 с FCS 10% и 1% пенициллина/стрептомицина и передачи 1 мл в новой обычных 5 мл трубки дополнена закупорить.
- Стимулируют клетки путем добавления 32.4 Нм phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) и ionomycin 1 мкм. Затем инкубации клеток для 16 ч при 37 ° C и 5% CO2 с крышкой трубки открыт (чтобы избежать загрязнения, могут использоваться герметизации фильм проницаем для воздуха).
2. изоляция и стимуляция клеток первичных ХЛЛ от человека пациентов
Примечание: Пациентов образцов были приобретены и стимулировали как описано выше7. Все действия выполняются под капотом ламинарного потока.
- Подготовьте необходимое нарисовать кровь от пациентов и выполнить разделение градиента плотности оборудование: 21-G иглы, жгут, NH4-гепарин-крови коллекции шприцы (например, S-monovettes), 1 x PBS и средний градиент плотности (плотность 1,077 г/мл) .
- При венепункции Нарисуйте кровь от ХЛЛ пациентов (ОК. 40 мл крови на пациента) в шприцы. Затем перенесите крови в 50 мл конические трубы. Вымойте шприц 10 мл PBS и бассейн крови PBS-подвеска в 50 мл трубки (отрегулировать количество трубок объемом крови).
- Подготовка 15 мл среды градиента плотности в свежий 50 мл Конические трубки. Впоследствии слой 35 мл крови PBS-подвеска тщательно на средний градиент плотности. Для этого держать трубку на плоский угол и медленно Пипетка крови PBS-подвеска к стене нижней конической трубки 50 мл. Как больше из крови PBS-подвеска накапливается в 50 мл Конические трубки, увеличьте угол трубки до прямого угла. Повторите этот шаг, по словам объем крови PBS-подвеска.
- Выполнять центрифугирования в 560 x g 20 мин (без тормозов), а затем извлечь этапа мононуклеарных клеток, который содержит мононуклеаров периферической крови (получения). Чтобы сделать это, собирать белые интерфаза разделения градиента плотности с 5 мл Серологические Пипетки и перенести его на новой 50 мл Конические трубки.
- Заполните до 50 мл суспензии клеток с PBS и центрифуги для 5 мин на 360 x g. Удалите супернатант аспирации. Повторите этот шаг с центрифугированием на 5 мин на 275 x g. Затем объединить клетки одного пациента в 5-10 мл PBS в 50 мл Конические трубки.
- Подсчет количества ячеек, как описано в разделе 1.3.
Примечание: Это зависит от доли клетки CLL в изолированных репликацию, если клетки могут быть использованы непосредственно для этой процедуры или изоляция клетки B должен проводиться, например, через магнитные ячейку Сортировка (ПДК). Изоляция клетки B рекомендуется, но может быть опущен, если доля клетки CLL выше 95% всего лимфоцитов (определяется через проточной цитометрии). CLL крови больных является фиксированной и анализироваться в соответствии с инструкциями производителя. Клетки анализируются через проточной цитометрии и затем окрашивание с CD19 FITC и CD5-PE антитела производится согласно инструкциям производителя. Один пациент образцовое показано на Рисунок 1, в котором доля клетки CLL 89.03%. Таким образом изоляция клетки B должна выполняться в этом пациента. Доля физиологических клетки B является незначительным (3,72% в примере). - Вымыть клетки с 10 мл подогретым (37 ° C) RPMI 1640 дополнены с 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина, 100 мм несущественные аминокислот, пируват натрия 1 мм и 50 мм β-меркаптоэтанол 5 минут при 200 x g и удалить супернатант стремлением.
- Отрегулируйте клетки 2 x 107 кл/мл в RPMI 1640 дополнена FCS 10%, 1% пенициллина/стрептомицина, 100 мм несущественные аминокислот, 1 мм натрия 50 мм и пирувата β-меркаптоэтанол (37 ° C) и заполнить 1 мл суспензии клеток в 5 мл трубку.
Примечание: ß меркаптоэтанол используется для противодействия оксидативного стресса. - Стимулируют клетки путем добавления 32.4 Нм PMA и ionomycin 1 мкм. Затем инкубации клеток для 16 ч при 37 ° C и 5% CO2 с крышкой трубки открыт (чтобы избежать загрязнения, могут использоваться герметизации фильм проницаем для воздуха).
Примечание: Чтобы уменьшить уровень стресса клетки можно отдыхал за 1 ч при 37 ° C и 5% CO2 в инкубаторе до 16 h стимуляции.
3. Фиксация, лизис клеток и Chromatin стрижка
Примечание: Пациентов образцов и Jurkat клетки фиксированной и анализироваться с комплектом коммерчески доступных чип согласно инструкциям производителя с изменениями, как описано выше7. Фиксация выполняется под капотом ламинарного потока.
- Подготовьте 1,5 мл с 1 мл 37% формальдегида, 1,5 мл с 1 мл 1,25 М глицин, 5 мл с 4 мл ПБС и коробку со льдом для фиксации клеток.
- После стимуляции клеток для соответствующих инкубации время на шаге 1.5 или 2.9 спина 5 мл пробирок на 200 x g 5 мин и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл PBS в 5 мл пробирок.
- Добавьте 340 мкм формальдегида (13,5 мкл 37% формальдегида) клетки. После краткого перемешивания, тщательно закупорить вверх и вниз Инкубируйте подвеска для 2,5 мин (клетки Jurkat) или 5 мин (пациент образец) при комнатной температуре.
Примечание: Время длительной фиксации необходим для первичных элементов для обеспечения оптимального стрижки. - Добавить 125 мм глицин (57 мкл 1,25 М глицин) остановить фиксации и инкубировать еще 5 минут поставил клетки на льду сразу же после этого и центрифуги на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант аспирации.
- Вымыть клетки дважды с 1 мл ледяной PBS на 200 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант каждый раз путем аспирации.
Примечание: После фиксации, протокол может быть приостановлена. Фиксированные клетки должны храниться при температуре-80 ° C. Для проверки, если epitope антитела, предназначенных для использования в следующий протокол не маскируется через фиксацию, дополнительные образцы могут использоваться для анализа через электрофореза геля SDS-PAGE и западную помарку. Эти шаги выполняются с 100 мкг белка согласно инструкциям производителя. Все αNFAT2 антитела используются в разведении 1: 1000, GAPDH антител при разбавлении 1: 10000. Образцовое изображения фиксированной образцов от Jurkat клеток с соответствующими и неуместные антитела показан на рисунке 2. - Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл коммерчески доступных литического буфера 1, закупорить вверх и вниз. Затем поместите образцы на льда в шейкере и инкубировать их за 10 мин при встряхивании.
Примечание: Перед лизиса, клетки можно распался в 10 s в жидком азоте. Это полезно для Jurkat клеток, но следует избегать в первичных проб пациентов. Для распада, место 5 мл трубки для 5 s в 5-10 мл жидкого азота в определенном контейнере. Надевайте защитные очки и соответствующие защитные перчатки. - Впоследствии центрифуга трубы на 500 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант тщательно закупорить.
- Однородный клетки в 5 мл коммерчески доступных литического буфера 2, закупорить вверх и вниз и проинкубируйте втечение 10 мин на льду при встряхивании. Затем центрифуга трубы на 500 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант тщательно закупорить.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл (Jurkat клеток) или 140 мкл (пациентов образцов) стрижка буфера 1, содержащие 1 x ингибитор протеазы (5 мкл или 1.4 мкл, соответственно) и инкубировать смесь для 10 мин на льду.
- Для сдвига хроматина, перевести 140 мкл суспензии клеток с шагом 3,9 на sonicator трубы (избегайте производить воздушные пузыри и повторите этот шаг, при необходимости, из-за объема образца). Место труб в целенаправленной ультра sonicator при температуре 7 ° C и сдвига для 10 мин (клеточная линия) или 7,5 мин (пациентов образцов) мощностью средняя инцидента 9,375 W для получения фрагментов ДНК 200-500 bp.
- Наконец центрифуги на 15700 x g 10 мин при температуре 4 ° C в небольших центрифуг и собирать супернатант в новой 1,5 мл трубки.
- Для проверки размеров соответствующий фрагмент, анализировать 20 мкл стриженый хроматина через гель электрофореза в геле агарозы 1,5% КЭ. Образцовое образ стриженый хроматина из Jurkat клеток, хорошие и плохие качества показан на рисунке 3. На данный момент Протокол может быть потенциально приостановлена. Стриженый хроматина должны храниться при температуре-80 ° C.
4. chromatin иммунопреципитации
Примечание: Иммунопреципитации chromatin была выполнена с комплектом коммерчески доступных чип согласно инструкциям производителя с изменениями7.
- Рассчитать количество immunoprecipitations (70 мкл (Jurkat клеток) или 15 мкл (пациентов образцов) стриженый хроматина плюс одного антитела) и подготовить 20 мкл протеина A покрытием бусы за осадков в 1,5 мл. Мыть бисер в 40 мкл 1 x буфер 1 чип на осадки, закупорить вверх и вниз, пусть бусы отдых в магнитной стойке за 1 мин и удалить супернатант, закупорить. Выполните этот шаг четыре раза в общей сложности. В конце концов Ресуспензируйте бисер в исходный том с 1 x чип буфера 1.
- Для иммунопреципитации, сам используйте 10 мкг αNFAT2 антител (7A6) для захвата NFAT2 с его связанного целевого объекта последовательности. Используйте 2,5 мкг, антитела IgG кролика (DA1E) как элемент IgG. Подготовьте реакции в свежих 1.5 мл пробирок, как указано в таблице 1.
Примечание: Важно использовать моноклонального антитела с высоким сродством, чьи epitope не масках во время фиксации для этого протокола. Антитела Polyclonal ввести дополнительный уровень колебаний, что делает его значительно более трудным, чтобы надлежащим образом интерпретировать полученные результаты. - Инкубируйте смесь из шага 4.2 на ночь при 4 ° C на вращающееся колесо на 6 об/мин.
- На следующий день спин трубы для 5 s на 7000 x g в небольших центрифуг, инкубировать их в магнитной стойке за 1 мин и удалить супернатант путем аспирации. Вымойте бусины с каждый из буферов мыть, 1, 2, 3 и 4 последовательно.
- Чтобы сделать это, Ресуспензируйте бисер в 350 мкл буфера мытья и проинкубируйте 5 мин при 4 ° C на вращающееся колесо на 6 об/мин.
- После этого, спин трубы для 5 s на 7000 x g в небольших центрифуг. Затем, место их за 1 мин в магнитной стойке, удалить супернатант и добавьте следующий буфер мыть.
- После последнего шага Стиральная удалить супернатант, дозирование, занимают бусины в 100 мкл Элюирующий буфер 1 и Инкубируйте 30 мин на вращающееся колесо на 6 об/мин.
- Вскоре спин трубы (5 s на 7000 x g в небольших центрифуг) и поместите их в магнитной стойке за 1 мин.
- Затем передача супернатант закупорить к новой 1,5 мл трубки и 4 мкл буфера 2.
- Чтобы создать элемент управления вводом, смешайте 1 мкл стриженый хроматина с 99 мкл Элюирующий буфер 1 и 4 мкл буфера 2 (в этом случае, существует три трубы одного пациента: один входной контроль, один IgG контроль и один образец αNFAT2).
- Проинкубируйте образцы для 4 ч при температуре 65 ° C и 1300 rpm в шейкере 1,5 мл трубки. Добавить 100 µL 100% изопропиловый спирт, вихрь и спин образцы для 5 s на 7000 x g в небольших центрифуг.
- Ресуспензируйте доступных магнитных шариков, тщательно vortexing, 10 мкл бисер для каждой выборки и инкубировать 1 час при комнатной температуре на вращающееся колесо на 6 об/мин.
- После инкубации, спин трубы для 5 s на 7000 x g в малых центрифуги и разместить их на 1 мин в магнитной стойке. Удалите супернатант аспирации.
- Ресуспензируйте бисер в 100 мкл мыть буфера 1. Инвертируйте трубы смешивать и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре на вращающееся колесо на 6 об/мин.
- Спин трубы для 5 s на 7000 x g в небольших центрифуг, разместите их за 1 мин в магнитной стойке и удалить супернатант, закупорить. Повторите шаги 4.13 и 4.14 с буфером 2 мыть.
- Впоследствии удалить буфер мыть стремлением, Ресуспензируйте бисер в 55 мкл буфера и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре на вращающееся колесо на 6 rpm элюировать осажденный ДНК. Наконец, спин трубы для 5 s на 7000 x g в небольших центрифуг, разместить их на 1 мин в магнитной стойке и передачи супернатант в новый 1,5 мл пробирок.
Примечание: Здесь протокол может быть потенциально приостановлена. Eluted дна затем должны храниться при температуре-20 ° C.
5. Обнаружение NFAT целевых генов в клетки CLL.
- Проведение реакции qRT-PCR в двух экземплярах для каждого образца, как указано в таблице 2.
Примечание: Для обнаружения генов-мишеней Количественная ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР) проводится с использованием смеси коммерчески доступных qRT ПЦР с в реальном масштабе времени PCR инструмент. - Используйте белый 96-луночных реакции пластины для реакции и ПЦР-инструмент. Велоспорт условия заключаются в следующем: 95 ° C за 30 сек, [95 ° C за 5 сек, 60 ° C за 30 s] x 40 циклов.
Примечание: Серийный разрежения ввода (неразбавленный или разбавленных 1:10, 1: 100 и 1: 1000 в свободной от нуклеиназы воды) используется для вычисления относительного обогащения. В Jurkat клетках Ил-2 был использован как положительный контроль32. CD40L, известных целевых NFAT2 в клетки B, был использован как позитивный элемент управления в клетки CLL и LCK в качестве примера для Роман целевого гена NFAT2 в CLL33,34. Праймеры для региона промоутер CD40L, IL-2 и LCK описаны в таблице конкретных реагенты и оборудование.
6. Нормализация и анализ данных
Примечание: Относительная обогащения для регионов промоутер интерес (IL-2, CD40L или LCK) рассчитывается с использованием IgG управления для нормализации.
- Во-первых определите значения (порог цикл) Ct для ввода серийного разрежения, IL-2, CD40L и LCK промоутер региона посредством оценки программного обеспечения от данных qRT-PCR.
- Определение стандартной кривой концентрации через последовательный разрежения входных данных. С этой стандартной кривой Рассчитайте концентрацию для Ил-2, CD40L и регионе промоутер LCK для каждого дубликата каждого образца.
- Далее Вычислите среднее дубликаты. Затем установите образца иммунопреципитации IgG как ссылка. Определение относительной обогащения для этого образца как 1.0 и сравнить другие образца (от NFAT2 иммунопреципитации) к этой ссылке.
- Наконец вычислить относительную обогащения путем деления концентрации образцов концентрацию IgG ссылки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 демонстрирует образцовую потока cytometry анализ ХЛЛ пациента после окрашивания с CD19 FITC и CD5-PE антител. Рисунок 1a показывает стробирования лимфоцитов, представляющие большинство клеток в крови пациентов ХЛЛ. Рисунок 1b показывает долю CD19+/CD5+ ХЛЛ клетки, которые представляют 89.03% лимфоцитов в этом примере. Доля CD19+/CD5– клетки B составляет 3,72% в соответствующих пациента.
На рисунке 2 приведены примеры антитела производительности в Jurkat клетках фиксированной для различных периодов времени по оценке SDS-PAGE и западной помарки. Были проанализированы различные антитела от разных производителей. Рисунок 2a показывает производительность αNFAT2-антитела (клон 7A6) от различных производителей с зеленым флуоресцентные антитела анти мышь обнаружены. Антитело производителя 1 показан привязки к его epitope без фиксации (Группа A) и даже когда Jurkat клетки были исправлены за 2,5 мин или 5 мин (Группа B или C, соответственно). ΑNFAT2-антитела (клон 7A6) от производителя 2, с другой стороны, показал слабее производительность даже в Jurkat клетках не зафиксировано (Группа D). После фиксации антитела этого производителя результаты даже слабее (группы Е (фиксация 2,5 мин) и F (5 мин фиксации)). Рисунок 2b показывает производительность αNFAT2-антитела (клон D15F1) от другого производителя с красным флуоресцентные антитела анти кролик обнаружены. Этот антитела также исполнил слабо в примерах нефиксированными (Группа A) и отсутствие группы указывает маскировки его epitope путем фиксации (группы B (фиксация 2,5 мин) и C (5 мин фиксации)).
Рисунок 3 показывает примеры из стриженого хроматина от Jurkat клеток, полученных после того, как различные фиксации и стрижка раз хорошего и плохого качества, как оцениваются электрофорез геля. Группы A и B (0 мин фиксации или 2,5 мин фиксации, соответственно) показать хорошее качество стриженый хроматина, который характеризуется ДНК фрагмента размером 200-500 bp, которые могут быть обнаружены на геле агарозы как типичный мазка. Стриженый хроматина низкого качества, с другой стороны, могут быть признаны почти полное или полное отсутствие ожидаемых ДНК мазка (Группа C), а также мазок в больше или меньше ожидаемого фрагмент размер диапазона (полосы D-F). Полное отсутствие мазке указывает на использование недостаточное количество исходного материала. Обнаружение мелких ДНК фрагментов подсказки для чрезмерного ДНК стрижка (Группа E) во время больших ДНК фрагментов намек недостаточно стрижки.
Рисунок 4 показывает результаты типичный эксперимента с Jurkat клетками. LCK был проанализирован как потенциальной мишенью NFAT2. Ил-2 , который является четко определенной целевой гена NFAT2 в клетки T был использован как позитивный элемент управления. Антитела IgG управления был использован для нормализации. На рисунке 4a показывает эксперимент с оптимальные результаты документально подтверждено значительное обогащение IL-2 позитивных элемента управления. Из этого эксперимента можно сделать вывод, что существует значительное обогащение LCK последовательностей в осажденный ДНК, демонстрируя, что LCK является прямой мишенью NFAT2 в Jurkat клетках. Рисунок 4b показывает эксперимент выполняется с плохим качеством ДНК из-за отсутствия фиксации или субоптимальные режа процедуры, вызывая низкую степень обогащения в Ил-2 положительный контроль.
Рисунок 5 показывает результаты эксперимента с первичной клетки CLL человека. CD40L , который является известным целевой NFAT2 в клетки B, служил в качестве позитивного управления и LCK был проанализирован как экспериментальный объект. Рисунок 5a показывает эксперимент с значительным уровнем обогащения CD40L ДНК в позитивных элемента управления. От еще сильнее обогащения LCK ДНК можно сделать вывод, что LCK также является прямой мишенью NFAT2 в первичных клеток человека ХЛЛ. Рисунок 5b показывает эксперимент выполняется с плохим качеством ДНК наиболее вероятно из-за неадекватной стрижки. Никакого существенного обогащения CD40L ДНК могут быть обнаружены в положительный контроль, выхолащивания экспериментальных данных.
Рисунок 1: Образцовый потока cytometry анализ ХЛЛ больных. () пробы в ХЛЛ пациентов были проанализированы через проточной цитометрии после окрашивания с CD19 FITC и CD5-PE антител и лимфоцитов были воротами. b впоследствии, доля CD19+/CD5+ ХЛЛ клетки и CD19+/CD5– клетки были определены. Здесь, CD19+/CD5+ ХЛЛ клетки приходится 89.03% лимфоцитов, тогда как CD19+/CD5– клетки B представляют 3,72% лимфоцитов. Показано одно образцовое пациента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: примеры производительности антител в фиксированных клетки Jurkat, SDS-PAGE и западной помарке оценку. () Jurkat клетки были исправлены для 0 мин (группы A и D), 2,5 мин (групп B и E), или 5 мин (C и F) и αNFAT2-антитела (клон 7A6) от различных производителей (группы A-C = производитель 1, полосы D-F = сравнивали производитель 2). Антитело производителя 1 показан более общую производительность, привязка с выше сродство даже для фиксированных выборок (Сравните полосы A-C и полосы D-F). (b αNFAT2-антитела (клон D15F1) от другого производителя был использован. Это антитело показали только плохой производительности в примерах нефиксированными (Группа A) и был замаскирован epitope после фиксации. Таким образом привязка не антитела могут быть обнаружены после фиксации (групп B и C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: примеры хроматина хорошей и плохой режа качества от Jurkat клеток, оценку электрофорезом геля. Jurkat клетки были исправлены и стриженый для различных периодов времени. Фиксация было сделано для 0 мин (группы A и D), 2,5 мин (групп B и E), или 5 мин (C и F). Стрижка была выполнена за 10 мин (группы A-C) или 20 мин (полосы D-F). Хроматин хорошего качества режа характеризуется ДНК фрагмента размером 200-500 bp, которые могут быть обнаружены как мазок в соответствующем регионе (группы A и B). Хроматин низкого качества может быть признано, что либо почти полное или полное отсутствие ДНК мазок из-за недостаточного объема исходного материала используется (Группа C) или мазок в регионе меньшего или большего размера из-за неуместным стрижка (условия группы D-F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: чип Jurkat клеток, оценены qRT ПЦР. () NFAT2 связывает LCK и промоутер Ил-2 в Jurkat клетках. Относительный обогащения LCK и IL-2 промоутер регионов, осажденный с NFAT2 антитела отображается как анализируемой qRT ПЦР. Три независимых чип эксперименты, отображаются как означает ± SEM (t критерия Стьюдента, * P < 0,05; ** P < 0.01 *** P < 0,001). (b) ДНК от образцов с плохим качеством, стриженый хроматина был использован. Не соответствующие привязки NFAT2 в последовательности целевого объекта могут быть обнаружены. Аналогичная картина может быть обнаружен, если там был без фиксации или время инкубации с NFAT2 антитело было недостаточно. Три независимых чип эксперименты, отображаются как означает ± SEM (t критерия Стьюдента, * P < 0,05; ** P < 0.01 *** P < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: чип первичных клеток человека ХЛЛ, оценены qRT ПЦР. (a) NFAT2 специфически связывается LCK и CD40L промоутеров в первичных клеток человека ХЛЛ от больных с праздного течения заболевания. На диаграмме показана относительная обогащения LCK и CD40L промоутер регионов, осажденный с NFAT2 антитела как анализируемой qRT ПЦР. Три независимых чип эксперименты, отображаются как означает ± SEM (t критерия Стьюдента, * P < 0,05; ** P < 0.01 *** P < 0,001). (b) ДНК пробах пациентов с плохим качеством, стриженый хроматина был использован. Привязка не NFAT2 для соответствующей последовательности можно наблюдать. Три независимых чип эксперименты, отображаются как означает ± SEM (t критерия Стьюдента, * P < 0,05; ** P < 0.01 *** P < 0,001) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| элемент | объем (мкл) на IP |
| 5% BSA | 6 |
| 100 x ингибитор протеазы | 3 |
| 5 x чип буфер 1 | 56 |
| стриженый хроматину | x (15 мкл или 70 мкл) |
| Белок А покрытием магнитные бусы | 20 |
| Чип seq класс воды | 185-x-y |
| антитела (αNFAT2 или IgG контроль) | y (1.09 мкл или 1 мкл) |
| Итого | 270 |
Таблица 1: расписание для пипетирования иммунопреципитации chromatin. Иммунопреципитации chromatin была выполнена путем подготовки реакции, как указано в таблице.
| элемент | объем (мкл) за qRT-PCR |
| immunoprecipitated ДНК | 9 |
| Mix qRT-PCR | 10 |
| Грунтовка вперед (LCK/CD40L/IL-2) | 0.5 |
| Грунтовка обратный (LCK/CD40L/IL-2) | 0.5 |
| Итого | 20 |
Таблица 2: график для пипетирования qRT ПЦР. QRT ПЦР была выполнена путем подготовки реакции, как указано в таблице.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие шаги выполнения успешно пробирного чип являются выбор соответствующей антитела и оптимизации хроматина, стрижка процесса25. Выбор αNFAT2 антитела оказалось особенно сложным во время разработки этого протокола. Хотя есть несколько αNFAT2 антител коммерчески доступных и большинство этих отлично работает для западный blotting и других приложений, клон 7A6 был только антитела, которые могут быть успешно использованы для чип7. Даже якобы идентичные 7A6 антитела у разных производителей выставлены существенных различий в отношении их производительности в чипе. Серьезной проблемой является потенциальные нарушения целевого белка epitopes в процессе фиксации, используемых в XChIP протоколы25.
Хроматина, стрижка процедура также имеет решающее значение для получения соответствующих результатов в XChIP. Размер фрагмента 200-500 bp как оценку электрофорезом геля агарозы был найден оптимальным в этой NFAT2 чип протокола7. Неуместным режа условия, что привело к нехватке ДНК, начиная материал или фрагменты ДНК меньшего или большего размера обычно приводят к субоптимальные результаты при выполнении этот assay. Неоптимальный стрижка было также отмечено при использовании замороженных и rethawed получения. Следовательно, оттаивания получения привело к снижению урожайности дна от клеток, а также увеличение чрезмерного сдвига ДНК-фрагментов.
Наличие широкий ассортимент комплектов микросхем и чип класс антител является сложной задачей, но также предоставляет возможность использовать технику в более широком контексте. Таким образом разнообразие факторов транскрипции могут быть исследованы в различных типов клеток. Например другие члены семьи NFAT (NFAT1 и NFAT4) были исследованы недавно с помощью чипа35,,3637.
В комплект чип используется здесь также пришлось быть изменены для удовлетворения наших потребностей. Во-первых время фиксации была скорректирована во избежание маскировки эпитоп, признанные используемые антитела и обеспечить оптимальный наклон. Количество буферов, используемых для лизиса и стрижка было также изменено для уменьшения потери клеток во время стирки различных шагов. Кроме того режа условия были оптимизированы для получения фрагментов ДНК в диапазоне 200-500 bp. Ингибитор протеазы и антитела IgG управления были обмен с другими коммерчески доступных реагентов как они оказались сопоставимыми и более экономически эффективным. Шаг, с участием перевозчика, предоставляемых производителем был опущен как он мешал осадков ДНК. В конце концов количество буфера, используемого для элюировать ДНК была адаптирована к дают достаточный объем для использования в qRT-PCR.
Есть несколько других комплекты доступны от различных компаний, и есть также возможность для выполнения чип без комплекта. Однако тестирование и создание очень сложно, поскольку есть много факторов, чтобы рассмотреть, как совместимость анализируемого клетки и белки с различными фиксации и стрижка методы. Упомянутые комплект был использован как устоявшихся в нашей лаборатории.
Основных ограничение этого метода является его ограниченную применимость для крупномасштабных расследований в неповрежденной модельных организмов, поскольку соответствующие антитела должны быть определены или генерируется для каждого индивидуального транскрипционный фактор. Анализ генов, которые выражаются только при низких уровнях, в небольшом количестве клеток или в течение ограниченного времени окно также может быть сложным с помощью чипа.
В то время как чип является золотым стандартом для демонстрации прямое взаимодействие данного транскрипционного фактора с его соответствующих целевых генов в нетронутыми эукариотических клеток25, существует ряд других методов для изучения взаимодействия белков и ДНК . EMSA является полезным методом для обнаружения низкого изобилие протеины дна binding в ячейке lystates24. Он также может использоваться для характеристики сродство определенного белка путем систематического анализа мутационного зонд ДНК. Основным преимуществом EMSA по сравнению с чип является тот факт, что это обычно существенно меньше времени для установления соответствующих assay. Другие методы для анализа ДНК белковых взаимодействий23ДНК выпадающее assays, Гонав захвата и обнаружения анализов и репортер анализов.
Более недавние события сделали возможным применять чип assay генома общесекторальных подходов его сочетание с microarray технологии (чип на chip)38,,3940 или секвенирование нового поколения (чип-Seq )41,42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана DFG Грант му 3340/1-1 и Deutsche Krebshilfe Грант 111134 (оба присуждена M.R.M.). Мы благодарим Elke Malenke за отличную техническую помощь).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
References
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. , Wiley & sons. (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), author reply 832-833 831-832 (2007).
