Summary
سبب المحتوى الدهني المرتفع، قد تم الطعن في الأنسجة الدهنية تصور استخدام الأساليب التقليدية في غذائها. أديبو--واضح هو منديل مسح تقنية تسمح العلامات قوية وعالية الدقة التصوير الفلورسنت الحجمي للأنسجة الدهنية. هنا، نحن تصف الأساليب لإعداد نموذج المعالجة المسبقة وتلطيخ والمقاصة، والمتصاعدة للتصوير.
Abstract
الأنسجة الدهنية يلعب دوراً مركزياً في التوازن الطاقة وثيرموريجوليشن. وهو يتألف من أنواع مختلفة من adipocytes، فضلا عن السلائف adipocyte والخلايا المناعية والليفية، والأوعية الدموية والعصب الإسقاطات. على الرغم من أن قد جرى تحديد السيطرة الجزيئية لتحديد نوع الخلية وكيف تتفاعل هذه الخلايا يزداد، فهم أكثر شمولاً لهذه الخلايا الدهنية-المقيم يمكن أن يتحقق بتصور التوزيع والهندسة المعمارية في جميع أنحاء النسيج كله. نهج إيمونوهيستوتشيميستري والفلوره الحالية لتحليل الأنسجة الدهنية تعتمد على مقاطع رقيقة جزءا لا يتجزأ من البارافين. ومع ذلك، التقاط المقاطع رقيقة سوى جزء صغير من النسيج؛ كنتيجة لذلك، يمكن أن يكون متحيزا الاستنتاجات التي توصل إليها بما هي جزء من الأنسجة ويتم تحليل. ولذلك وضعنا أنسجة الدهنية مسح تقنية، أديبو واضحة، للسماح التصور ثلاثي الأبعاد الشاملة لأنماط الجزيئية والخلوية في الأنسجة الدهنية كله. أديبو واضحة وقد تم تكييف من إيديسكو/إيديسكو +، مع التعديلات المحددة التي لإزالة الدهون المخزنة في الأنسجة مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة الأصلية تماما. بالاقتران مع ورقة الضوء الفلورية مجهرية، نبدي هنا استخدام الأسلوب أديبو واضحة للحصول على صور عالية الاستبانة الحجمي للأنسجة الدهنية أكملها.
Introduction
وحتى وقت قريب، كان تصور الأنسجة الدهنية كمجموعة غير متبلور من الخلايا الدهنية. على مدى العقود القليلة الماضية، نمت فهمنا أكثر تطورا، مع الدهون من المعترف به الآن أن يكون جهازا معقدة التي تحتوي على أنواع مختلفة من adipocytes، فضلا عن السلائف adipocyte والخلايا المناعية، والخلايا الليفية، والمفرج وإسقاطات العصب. التفاعلات بين هذه الخلايا الدهنية-المقيم وضوحاً آثار في الأنسجة الدهنية وفسيولوجيا العضوي والفيزيولوجيا المرضية1. على الرغم من أن الدراسات الناشئة قد متدهور أهمية الآليات الجزيئية الكامنة وراء بعض التفاعلات، يتطلب فهم أكثر شمولاً التنميط الهيكلية موثوقة من الأنسجة كاملة في الأبعاد الثلاثة (3D).
معرفتنا الحالية مورفولوجيا الأنسجة الدهنية يستند إلى حد كبير على التحليل النسيجي لأقسام رقيقة (5 ميكرومترات) مع تصوير نسبيا عالية التكبير (أكثر من 10 X)2،3. غير أن هذا النهج قد عدة قيود كبيرة. هياكل الخيطية أولاً، معقدة مثل الأعصاب متعاطفة والمفرج، التي من المعروف أن تلعب أدواراً هامة في الدالة الدهنية4،5،،من67، يصعب تقييمها من خلال أقسام رقيقة. ثانيا، بسبب شكله غير متبلور على ما يبدو وعدم وجود ممثل الوحدات الهيكلية للتركيز على، من الصعب نقدر هياكل الأنسجة الدهنية التي تستند فقط إلى تلطيخ الباب. وثالثاً، قد الأنسجة الدهنية محتوى دهني مرتفع جداً، يخلق تحديات في الحصول على مقاطع المسلسل متسقة مناسبة للتعمير تشريحية ثلاثية الأبعاد، طريقة تقليدية المستخدمة في دراسة مورفولوجية الدماغ كله8. ونظرا لهذه العوامل، وهناك حاجة كبيرة لاتباع نهج كل جبل يمكن تقديم التصور ثلاثي الأبعاد لمستودع الدهنية كاملة بينما لا يزال تحقيق القرار الخلوية.
3D التصوير الحجمي للجهاز أكمله يمثل تحديا بسبب آثار obscuring مبعثر الخفيفة. ويأتي مصدرا رئيسيا تشتت الضوء في الأنسجة البيولوجية من الواجهات المائية الدهنية. على الرغم من أن الجهود الرامية إلى القضاء على مبعثر بإزالة الدهون كانت مستمرة لأكثر من قرن، كانت هناك عدد كبير من الابتكارات الأخيرة9. أحد هذه الأساليب إزالة الأنسجة المطورة حديثا تصوير 3D إيمونولابيلينج-تمكين أجهزة مسح مذيب (إيديسكو/إيديسكو +)10،11. بيد أن الأنسجة الدهنية يمثل تحديا خاصا نظراً للمستوى المرتفع من الدهون، ومن ثم، تعديلات إضافية إيديسكو/إيديسكو + البروتوكول المطلوبة لاستخراج الدهون الكامل بينما تحمي الأنسجة من الانهيار. يستخدم بروتوكول تعديل وضعنا، وتسمى الآن أديبو-واضحة، ديليبيديشن على الميثانول/الميثان من الأنسجة الدهنية لتحقيق الشفافية المثلى المناسبة ل التصوير الحجمي عالية الدقة12. نظراً ديليبيديشن خطوة إلى حد كبير يروي اندوجينوسلي أعرب عن الفلورسنت البروتينات مثل التجارة والنقل وطلب تقديم العروض، ويجب تحقيق التصور هذه البروتينات قبل إيمونولابيلينج. عموما، يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسيطة وقوية لدراسة المنظمة مستوى الأنسجة من الخلايا الدهنية-المقيم، وتتبع نسب الخلايا السلف adipocyte، و morphogenesis الدهنية أثناء التطوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت وفقا للإجراءات التي أقرتها لجنة الاستخدام في جامعة روكفلر ورعاية الحيوان مؤسسية رعاية الحيوان والتجريب.
1-إعداد الأنسجة
- إجراء نضح intracardiac القياسية مع ~ 20 مل من 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية حتى تتم إزالة الدم تماما من الأنسجة.
- قم بالتبديل بيرفوساتي إلى ~ 20 مل محلول مثبت (بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني 1 x) عند 4 درجات مئوية حتى العنق والذيل يكون تشديد كبير.
تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة. تجنب ملامسة الجلد والعيون والأغشية المخاطية. وينبغي إيجاد حلول داخل غطاء دخان. - تشريح منصات الدهون ذات الاهتمام بعناية لإزالة لوحة الدهون كاملة دون الأضرار بها. استخدام الملقط انتهت بلانت لتجنب معسر أو الضغط على الأنسجة. تجنب تلويث تشريح الأنسجة مع أي الفراء.
- بعد إصلاح الأنسجة في 4% بين عشية وضحاها منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية. لكل لوحة الدهون، بعد الإصلاح مع ~ 10 مل من محلول التثبيت في أنبوب مخروطي 15 مل.
- أغسل 3 مرات (1 ح في كل) مع برنامج تلفزيوني 1 x الأنسجة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- تخزين الأنسجة لفترات قصيرة (تصل إلى 2 أسابيع) في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية ومحمية من الضوء. للتخزين طويل الأجل (مثلاً، 1-2 سنوات)، تبديل المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني x 1 مع أزيد الصوديوم 0.05% (كمادة حافظة).
تنبيه: أزيد الصوديوم شديد السمية عند بلعها شفويا أو امتصاصها من خلال الجلد. وتتركز أزيد الصوديوم ينبغي التعامل مع الحلول (5% أو أكبر) تحت غطاء دخان.
2-ديليبيديشن وبيرميبيليزيشن
التوقيت: 1-2 أيام
- إعداد 20%، 40%، 60%، و 80% ميثانول التدرج مع B1n المخزن المؤقت (الجدول 1) (v/v)، مثلاً، 20% من الميثانول/B1n المخزن المؤقت، مزيج 20 مل من الميثانول و 80 مل من B1n المخزن المؤقت. تخزين كافة المخازن المؤقتة في 4 درجات مئوية. وسوف يعجل بلورات جليكاين من مخازن الميثانول/B1n 60% و 80% بسبب التشبع. تجنب إزالة البلورات؛ استخدام حل السائل ليغسل التالية.
تنبيه: الميثانول متقلبة ومهيجة والقابلة للاشتعال. تجنب الاتصال بالعين أو الجلد. - إزالة الشعر بلطف من العينة تحت مجهر تشريح. سوف يسبب أي الشعر أو الوبر أو الحطام التي تعلق على العينة الظلال أثناء التصوير. نقل العينة تنظيفها في أنبوب جديد.
- تنفيذ كافة الخطوات التالية على الجليد أو عند 4 درجة مئوية، ما لم يبين خلاف ذلك. للحصول على عينات صغيرة (مثلاً، الخلفي منصات الدهون تحت الجلد/بيريجونادال من صغار الفئران الهزيل)، استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع 1.6 مل الحل. لعينات كبيرة أو عينات ذات المحتوى الدهني المرتفع (مثلاً، منصات الدهون من السمنة الفئران)، استخدام أنابيب 5 مل مع 4 مل الحل.
- وضع الأنابيب التي تحتوي على عينات أفقياً على شاكر مداري تعيين في ~ 100 لفة في الدقيقة. تأكد من أن العينات التي يمكن أن تتحرك بحرية داخل الأنبوب.
- يذوي العينة في سلسلة متدرجة من المخزن المؤقت الميثانول/B1n 20%، 40%، 60%، 80%، و 100% للوقت المشار إليه (الجدول 2). تصغير الحل المرحل.
- ديليبيداتي العينة بنسبة 100% الميثان (DCM) (3 مرات)، كل منها فترة حضانة المرض المشار إليها في الجدول 2. وينبغي أن تغرق العينة إلى الجزء السفلي من الأنبوب في نهاية يغسل DCM الثانية والثالثة. إذا لم يكن كذلك، تمديد فترة الحضانة لضمان ديليبيديشن كاملة (مثلاً، تمتد من 30 دقيقة إلى ح 1-2).
تنبيه: ينبغي التعامل مع DCM داخل غطاء دخان. استخدام حاويات زجاجية للتخزين وميكروسينتريفوجي أنابيب مصنوعة من مادة البولي بروبيلين إينكوبيشنز. لا يمكن استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي للتخزين على المدى الطويل من DCM. أطباق بتري والماصات المصلية مصنوعة من البوليسترين غير متوافقة مع DCM. • قرار مجلس الوزراء متقلبة للغاية. نقل العينة إلى حل جديد بسرعة لمنع جفاف. - تغسل مرتين مع 100 ٪ الميثانول للوقت المشار إليه (الجدول 2).
- اختياري: إذا كانت العينة غير perfused جيدا، لون الهيموغلوبين من خلايا الدم الحمراء المتبقية قد يسبب أوتوفلوريسسينسي قوية. بليتش مع 5 ٪ ح2س2 في الميثانول (المجلد 1 من 30 ٪ ح2س2 إلى 5 وحدات التخزين من الميثانول) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- ترطيب العينة في سلسلة عازلة عكس ميثانول/B1n: 80%، 60%، 40% و 20% ميثانول/B1n و 100% B1n المخزن المؤقت (2 مرات) للوقت المشار إليه (الجدول 2).
- تغسل العينة مع بتكسوه المخزن المؤقت (الجدول 1) لح 2 في الرايت
- تخزين العينة ديليبيداتيد في المخزن المؤقت بتكسوه عند 4 درجة مئوية (تصل إلى 1 سنة) أو انتقل مباشرة إلى الخطوة إيمونوستاينينج.
3-كله جبل إيمونوستينينج
التوقيت: 8-10 أيام
ملاحظة: جميع الخطوات التالية التي ينبغي أن يتم في الرايت إلا إذا ذكر خلاف ذلك، مع الهز والحماية من الضوء. لعينات صغيرة، استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع 1.6 مل من محلول. لعينات كبيرة، واستخدام أنابيب 5 مل مع 4 مل من محلول. من المستحسن أولاً التحقق من الأجسام المضادة على قطع صغيرة من الأنسجة أو أقسام الأنسجة المعالجة الميثانول.
- تضعف جسم الأولية في المخزن المؤقت بتكسوه لتركيز الموصى بها. الطرد المركزي حل جسم المخفف في ~ 20,000 x ز لمدة 10 دقيقة لمنع إدخال رواسب الأضداد أو تجميعات.
- احتضان العينة ديليبيداتيد مع الحل جسم الأولية للوقت المشار إليه (الجدول 2).
- تغسل العينة مع المخزن المؤقت بتكسوه في سلسلة من الخطوات الحضانة: 5 دقيقة، 10 دقيقة، 15 دقيقة، 20 دقيقة، ح 1، ح 2، ح 4، وبين عشية وضحاها.
- تضعف جسم الثانوية في المخزن المؤقت بتكسوه لتركيز الموصى بها. الطرد المركزي حل جسم المخفف في ~ 20,000 x ز لمدة 10 دقيقة لمنع إدخال رواسب الأضداد أو تجميعات.
ملاحظة: لتجنب الخلفية العالية الناجمة عن أوتوفلوريسسينسي الأنسجة، ينصح الثانوي الأجسام المضادة مترافق مع فلوروفوريس التي ينبعث منها الضوء في منطقتي البحر الأحمر واستعملنا. اعتماداً على عدد خطوط الليزر المتاحة في مجهر، يمكن تصويرها تصل إلى 3-4 علامات في وقت واحد في عينة واحدة. - احتضان العينة مع الحل جسم الثانوية للوقت المشار إليه (الجدول 2).
- أغسل عينة مع المخزن المؤقت بتكسوه في سلسلة من الخطوات الحضانة: 5 دقيقة، 10 دقيقة، 15 دقيقة، 20 دقيقة، ح 1، ح 2، ح 4، وبين عشية وضحاها.
- اختياري: لأنواع النسيج الهش، إصلاح النسيج الملون مع 4% بين عشية وضحاها منهاج العمل في برنامج تلفزيوني x 1 في 4 درجات مئوية المساعدة في الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة.
ملاحظة: هذه الخطوة قد تزيد خلفية التصوير. فإنه ليس من الضروري القيام بهذه الخطوة للأنسجة الدهنية. - تغسل العينة مع برنامج تلفزيوني 1 x في سلسلة من الخطوات الحضانة: 5 دقيقة و 10 دقيقة و 30 دقيقة.
- بلطف بإزالة الوبر من العينة تحت مجهر تشريح.
4-الأنسجة المقاصة
التوقيت: 1-2 أيام
- اختياري: تضمين العينة في [اغروس] لتسهيل تركيب العينة للفحص المجهري الورقة الضوء.
ملاحظة: ينصح بشدة هذه الخطوة للأنسجة الدهنية لتحقيق الاستقرار في شكله أثناء التصوير.- إعداد الحل التضمين مع 1% [اغروس] في برنامج تلفزيوني 1 x (w/v). بارد حل التضمين ~ 40 درجة مئوية لتجنب تعريض العينة للحرارة المفرطة.
- ضع العينة تنظيفها إلى العفن (مثلاً، طبق بتري أو وزنها القارب) وترتيب ذلك إلى الموضع الذي تريده. تجنب أي ترحيل السائل. صب بلطف الحل تضمين أكثر من العينة. تجنب أي فقاعات الهواء.
- واسمحوا [اغروس] يصلب تماما في قطع الرايت خارج كتلة تحتوي على العينة.
ملاحظة: كافة الخطوات التالية بما في ذلك إينكوباتيونس بين عشية وضحاها وينبغي أن يتم على RT، مع الهز والحماية من الضوء. لعينات صغيرة، استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع 1.6 مل من محلول. لعينات كبيرة، واستخدام أنابيب 5 مل مع 4 مل من محلول.
- يذوي العينة في التدرج الميثانول مع H2o: 25%، 50%، 75%، و 100% (3 مرات) للوقت المشار إليه (الجدول 2).
ملاحظة: نموذج يمكن أن تترك بين عشية وضحاها في الخطوة الميثانول 100%. - احتضان العينة في DCM 100% ح 1 مع الهز (3 مرات). يجب أن تغرق عينة على الجزء السفلي من الأنبوب في نهاية كل غسل DCM. إذا لم يكن الأمر كذلك، تمديد فترة الحضانة لضمان الإزالة الكاملة من الميثانول. يمكن أن تترك العينة بين عشية وضحاها في الخطوة DCM 100%.
- احتضان العينة في ديبينزيل خماسي البروم ثنائي الفينيل (قسم تعزيز الحدود) بين عشية وضحاها مع الهز الخفيف لتحقيق مطابقة الانكسار.
ملاحظة: في نهاية المطاف سيصبح نموذج شفاف في الضوء المرئي.
تنبيه: قسم تعزيز الحدود خطرة. تجنب أي اتصال مع الجلد. التعامل معها داخل غطاء دخان مع قفازات مزدوج الطبقات. تجاهل القفازات بمجرد أنها ملوثة بقسم تعزيز الحدود. استخدام حاويات زجاجية لأنابيب التخزين وميكروسينتريفوجي (بولي بروبلين) لإينكوباتيونس. لا يمكن استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي للتخزين على المدى الطويل من قسم تعزيز الحدود. أطباق بتري والماصات المصلية مصنوعة من البوليسترين غير متوافقة مع قسم تعزيز الحدود. تنظيف أي انسكاب مع الإيثانول 100%. - احتضان العينة مع قسم تعزيز الحدود الطازجة مع خفيف تهتز لمخزن 2 حاء العينة في RT في الظلام أو الانتقال مباشرة إلى التصوير.
ملاحظة: ينصح عينات تصويرها في غضون شهر. على الرغم من أن بعض فلوروفوريس أكثر استقرارا من غيرها، لا ينصح بتخزين طويل الأجل من العينات في هذه المرحلة.
5-الفحص المجهري
- تصوير مع مجهر الضوء-ورقة متوافق مع قسم تعزيز الحدود.
ملاحظة: يمكن استخدام فقط الأهداف التي تتم الموافقة عليها للتصوير على أساس المذيبات العضوية ومطابقتها مع الانكسار من قسم تعزيز الحدود غمس الأهداف في تصوير مغمورة قسم تعزيز الحدود.- جبل العينة جزءا لا يتجزأ من [اغروس] على حامل يمكن منع حركة أثناء التصوير. تزج العينة في غرفة مملوءة بقسم تعزيز الحدود.
- جمع z-كومة تغطي العينة كاملة (مثلاً، 1-2 X التكبير) للحصول على كل الأنسجة/هيكل التوزيع علامة للفائدة.
- قم بالتبديل إلى هدف مع أعلى التكبير (مثلاً، 4-12 X التكبير) التكبير والتصغير في المناطق ذات الصلة بصورة مفصلة هياكل.
ملاحظة: الكولاجين هو مساهم رئيسي في المصفوفة خارج الخلية في الأنسجة الدهنية التي تحيط بجميع الخلايا الدهنية13. الكولاجين وقد طيف انبعاث نموذجية تتراوح بين حوالي 400 نانومتر إلى 550 نانومتر14. التصوير العينة مع خط الليزر 488 (الأخضر) وجمع الضوء المنبعثة في نطاق الطول موجي التي تقع ضمن الطيف الانبعاث من الكولاجين (مثلاً، 525-550 نيوتن متر) سوف توفر إشارة أوتوفلوريسسينسي الأنسجة، التي عرضت سابقا على تحدد كفاف الدهون في الخلايا والأنسجة عموما العمارة12.
- تصوير مع المقلوب [كنفوكل] أو مجهر اثنين-فوتون.
- ضع العينة جزءا لا يتجزأ من [اغروس] إلى شريحة دائرة بأسفل زجاج دون لمس أي قطع بلاستيكية (أو الدائرة التصوير الأخرى المتوافقة مع قسم تعزيز الحدود التي يمكن ختم). تأكد من عدم تسرب قسم تعزيز الحدود.
- اختيار الأهداف بمسافات أطول في العمل لتحقيق اختراق أعمق.
ملاحظة: التصوير، وينبغي أن يتم مع مجهر [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مقلوب من خلال الزجاج أسفل الشريحة الدائرة. تجنب الاتصال المباشر بين العينة وغمس الأهداف التي لم يقترح التصوير القائم على قسم تعزيز الحدود.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أديبو--واضحة أعد الدهون كله يمكن تصويرها منصات في 3D لتحليل كيف تتأثر التفاعلات الخلوية ومورفولوجيا الأنسجة في الولايات الهزيل والسمنة. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسهولة تحليل هيكل الدهنية العامة بجمع الإشارات أوتوفلوريسسينسي الأنسجة في قناة الأخضر. أظهرنا سابقا أن أوتوفلوريسسينسي إشارة في التراكبات الدهنية إيجابيا مع بيريليبين تلطيخ، علامة شائعة لمخطط adipocytes ناضجة12. على سبيل المثال، يظهر المسح الضوئي لوحة الدهون تحت الجلد الخلفي (بسوات) باستخدام مجهر الضوء-ورقة مع تضخم منخفض (1.3 X) منظمة مفصص adipocytes (الشكل 1 أ وب). يمكن كشف معلومات أكثر تفصيلاً، مثل حجم adipocytes، قبل التكبير في مناطق الاهتمام مع أعلى التكبير (4 X) (الشكل 1 ود).
أديبو--واضح مفيدة بشكل خاص لتصور الهياكل الخيطية مثل إسقاطات الأعصاب والأوعية الدموية، والتي تشكل تحديا لالتقاط أو التتبع في أقسام رقيقة. الجهاز العصبي الودي (SNS) يلعب دوراً حاسما في السيطرة على lipolysis وثيرموغينيسيس في الأنسجة الدهنية4،5. التصوير بسوات وسادة ملطخة hydroxylase التيروزين (TH)، وعلامة لنظام الصحة الوطني، يكشف عن الهياكل التي تظهر كحزم العصب الكبيرة، وتعصيب الأوعية الدموية، فضلا عن أربوريزيشن الطرفية كثيفة في حمة النسيج (الشكل 2 أ-ح). وبالإضافة إلى ذلك، تبين التوقعات متني ال + التباين الإقليمي داخل بسوات، مع الجزء الآربي وجود كثافة أعلى بالنسبة للجزء دورسولومبار (الشكل 2E-ح؛ فيلم تكميلي 1). أعمالنا السابقة قد أثبتت أن أربوريزيشن محطة جوهرية يمكن أن تعزى حسابياً وأعيد بناؤها باستخدام أداة فيلامينتراسير من برنامج إيماريس لتقييم كثافة تعصيب12.
ومن المعروف الأنسجة الدهنية تكون فاسكولاريزيد بشكل كبير. التغييرات في المتطلبات الأيضية الدهنية غالباً ما تكون مرتبطة بإعادة عرض ديناميكي به المفرج6،7. يمكن أن توفر التنميط قوية وسريعة لكل الأنسجة المفرج إجراء تحليل إضافي غير منحازة لإعادة عرض الأوعية الدموية. استخدام الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء (بيكام-1، يعرف أيضا باسم CD31) كعلامة للأوعية الدموية التسمية، لاحظنا أن جميع adipocytes على اتصال مع الشعيرات الدموية في جميع أنحاء أنسجة كاملة (الشكل 3A-ح؛ دعم ارتفاع الطلب على الأوكسجين والمغذيات كفاءة تبادل التكميلية الفيلم 2)، في الدهنية.
الخلايا المناعية عنصر حاسم آخر في الأنسجة الدهنية. في حالة السمنة المفرطة، يلتهب الأنسجة الدهنية، الذي يقترن بتسلل برو-التهابات الضامة التي تشكل "التاج" هياكل المحيطة adipocytes الميت15،16. منصات الدهون من الحيوانات يعانون من السمنة المفرطة صعبة للغاية لمسح بسبب حجمها الكبير وارتفاع محتوى الدهون. ومع ذلك، يمكن تحقيق نسخة موسعة من أديبو-واضحة (المبينة في الجدول 2 للأنسجة الكبيرة أو الأنسجة مع المحتوى العالي من الدهون) المقاصة متسقة من أسرة عالية الدهون-محملة بالانسجة. على سبيل المثال، يظهر الدهون البربخيه من ماوس التي تتغذى على 16 أسبوعا حمية عالية الدهون الكثيفة "هياكل تشبه التاج"، إيمونولابيليد من CD68، في جميع أنحاء الأنسجة كاملة (الشكل 4 أ و ب). الأهم من ذلك، بصري المقاطع مأخوذة من مواقع مختلفة على مدى عمق كامل للأنسجة (~ 4-5 ملم) على قدم المساواة حادة عرض الصور، مما يدل على إزالة كاملة من الأنسجة (الشكل 4-F).
رقم 1: تحليل مورفولوجيا الأنسجة الدهنية باستخدام الإشارات أوتوفلوريسسينسي. كل اللوحات هي الورقة الضوء الفلورية مجهرية () الصور من جهاز pad بسوات استعداد واضح أديبو المعزولة من عمرها 8 أسبوع C57Bl/6J ماوس ذكور مقره الرايت إشارة أوتوفلوريسسينسي يتم جمعها عن طريق فحص العينة المطهرة مع قناة الأخضر. أقسام الضوئية (المقاطع العرضية من وسط العينة) في منطقة دورسولومبار (A) والمنطقة الاربية (ب) اتخذها 1.3 X الهدف. (ج، د) أقسام الضوئية عالية التكبير (4 X) المناطق محاصر من A و B. يتم الإشارة إلى العقد الليمفاوية بعلامات نجمية. يتم الإشارة إلى أشرطة مقياس في كل فريق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: 3D التصوير من تعصيب متعاطفة في الأنسجة الدهنية. كل اللوحات صور لسفم بسوات المسمى مع hydroxylase التيروزين (ال) (نفس العينة كما في الشكل 1). الحد الأقصى من إسقاطات دورسولومبار أعيد بناؤها المنطقة (أ) والمنطقة الاربية (ب) اتخذت بهدف X 1.3. (ج، د) أقسام بصري من الوسط من A و B. (ه، و) أقسام الضوئية عالية التكبير (4 X) المناطق محاصر من ج ود. (ز، ح) أقسام عالية التكبير البصرية من التراكب بين ال (أخضر) وأوتوفلوريسسينسي (أرجواني). رؤوس الأسهم تشير إلى أنماط متميزة من تعصيب عين العطف: حزمة العصب (1)؛ (2) الأوعية الدموية تعصيب؛ (3) متني أربوريزيشن. يتم الإشارة إلى العقد الليمفاوية بعلامات نجمية. يتم الإشارة إلى أشرطة مقياس في كل فريق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: 3D تصوير الأوعية الدموية في الأنسجة الدهنية. كل اللوحات صور لسفم CD31 المسمى بسوات (نفس العينة كما في الشكل 1). (أ) (ب) الحد الأقصى من إسقاطات دورسولومبار أعيد بناؤها المنطقة (أ) والمنطقة الاربية (ب) اتخذت بهدف X 1.3. (ج، د) أقسام بصري من الوسط من A و B. (ه، و) أقسام الضوئية عالية التكبير (4 X) المناطق محاصر من ج ود. (ز، ح) المقاطع عالية التكبير البصرية من التراكب بين CD31 (أحمر) وأوتوفلوريسسينسي (سماوي). يتم الإشارة إلى العقد الليمفاوية بعلامات نجمية. يتم الإشارة إلى أشرطة مقياس في كل فريق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تصوير ثلاثي الأبعاد "هياكل مثل التاج" في الأنسجة الدهنية. كل اللوحات هي الصور لسفم لجهاز pad أوت استعداد واضح أديبو المعزولة من ماوس ذكور التي تتغذى على حمية عالية الدهون لمدة 16 أسبوعا. وكانت العينة إيمونولابيليد مع CD31 و CD68. (أ) (ب) الحد الأقصى من الإسقاطات من العينة التي أعيد بناؤها بعمق إجمالي أكثر من 4 مم. عرض X-Y (A) . (ب) عرض Y-Z. (ج-F) مقاطع بصرية من أعماق المشار إليها في ب. يتم الإشارة إلى أشرطة مقياس في كل فريق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المخزن المؤقت | المادة الكيميائية | التركيز النهائي |
| B1n المخزن المؤقت | ||
| جليكاين | 0.3 متر | |
| Triton X-100 | 0.1% (v/v) | |
| ح2س | المذيبات | |
| أزيد الصوديوم (حافظة، اختياري) | 0.01% (w/v) | |
| ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7 مع هيدروكسيد الصوديوم | ||
| المخزن المؤقت بتكسوه | ||
| برنامج تلفزيوني x 10 | س 1 | |
| Triton X-100 | 0.1% (v/v) | |
| 20 توين | 0.05% (v/v) | |
| الهيبارين | 2 ميكروغرام/مل | |
| ح2س | المذيبات | |
| أزيد الصوديوم (حافظة، اختياري) | 0.01% (w/v) |
الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة والحلول- يحتوي هذا الجدول على وصفات للمخازن المؤقتة المستخدمة في أديبو واضحة. للتخزين على المدى الطويل من المخازن المؤقتة، من المستحسن إضافة أزيد الصوديوم كمادة حافظة.
| المخزن المؤقت | الأنسجة الصغيرة | نسيج كبير (أو ذات المحتوى العالي من الدهون) | درجة الحرارة |
| 20 ٪ الميثانول/B1n المخزن المؤقت | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| 40 ٪ الميثانول/B1n المخزن المؤقت | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| 60 ٪ الميثانول/B1n المخزن المؤقت | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| المخزن المؤقت الميثانول/B1n 80% | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| 100% ميثانول | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| • قرار مجلس الوزراء | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| • قرار مجلس الوزراء | ح 1 | 2-3 ح، أو بين عشية وضحاها | 4 درجة مئوية |
| • قرار مجلس الوزراء | 30 دقيقة | ح 2 | 4 درجة مئوية |
| 100% ميثانول | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| 100% ميثانول | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| اختياري: 5 ٪ ح2س2/methanol | بين عشية وضحاها | بين عشية وضحاها | 4 درجة مئوية |
| المخزن المؤقت الميثانول/B1n 80% | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| 60 ٪ الميثانول/B1n المخزن المؤقت | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| 40 ٪ الميثانول/B1n المخزن المؤقت | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| 20 ٪ الميثانول/B1n المخزن المؤقت | 30 دقيقة | ح 1 | 4 درجة مئوية |
| B1n المخزن المؤقت | 30 دقيقة | ح 1 | RT |
| B1n المخزن المؤقت | بين عشية وضحاها | بين عشية وضحاها | RT |
| المخزن المؤقت بتكسوه | ح 2 | ح 2 | RT |
| المخزن المؤقت بتكسوه | تخزين | تخزين | 4 درجة مئوية |
| الاحتضان الابتدائي جسم | 3 أيام | 4-5 أيام | RT |
| حضانة جسم الثانوية | 3 أيام | 4-5 أيام | RT |
الجدول 2: حضانة مرات ديليبيديشن وإيمونوستينينج- يحتوي هذا الجدول على أوقات الاحتضان للخطوات التي ديليبيديشن وإيمونوستينينج من البروتوكول. الوزن التقريبي من الأنسجة الصغيرة < 300 ملغ.
التكميلية الفيلم 1: 3D التصوير من تعصيب متعاطفة في الأنسجة الدهنية. تيروزين immunostaining hydroxylase (ال) من عينة بسوات (نفسها كما في الشكل 2). يظهر الفيلم الطيران من خلال أقسام الضوئية (4 X من دورسولومبار) والمناطق الاربية من بسوات، مع عمق مجموع من ~ 2 مم. ال يبين الأخضر. ويبين أوتوفلوريسسينسي الأرجواني. المنطقة من الجزء دورسولومبار، على ما يبدو، أقل كثافة جوهرية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الفيلم 2: 3D التصوير للمفرج في الأنسجة الدهنية. CD31 إيمونوستاينينج من عينة بسوات (نفسها كما في الشكل 3). يظهر الفيلم الطيران من خلال أقسام الضوئية (4 X من دورسولومبار) والمناطق الاربية من بسوات، مع عمق مجموع من ~ 2 مم. CD31 يظهر باللون الأحمر. ويبين أوتوفلوريسسينسي السماوي. ويبدو adipocytes جميع عن كثب تكون محاطة بالشعيرات الدموية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أديبو--واضح هو أسلوب مباشر وقوى لإزالة الأنسجة الدهنية، والتي يمكن تنفيذها بسهولة في إعداد مختبر عادية. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى المقاصة على أساس مذيب مثل إيديسكو/11،إيديسكو +10،12، أديبو واضحة هو الأمثل خاصة لإزالة الأنسجة الدهنية والأنسجة الأخرى مع المحتوى العالي من الدهون. الخطوة ديليبيديشن يزيل الدهون تماما من الدهنية، ولذلك يسهل إيمونولابيلينج في جميع أنحاء النسيج كله ويقلل إلى حد كبير من مبعثر الخفيفة، مما يتيح التصوير نهاية إلى نهاية بدون أي خسارة في القرار س وص. بالإضافة إلى ورقة الضوء الفلورية يمكن أيضا استخدام المجاهر، الذي يوفر المسح السريع للأنسجة الكبيرة، [كنفوكل] ومجاهر اثنين-فوتون للحصول على دقة أكبر ومزيد من التفاصيل.
ديليبيديشن الميثانول/DCM-تعتمد خطوة حاسمة. يمكن أن يؤدي ديليبيديشن غير كافية في الصور واضحة، لا سيما تجاه جوهر الأنسجة. من المهم ضمان الإزالة الكاملة من الدهون عن طريق مراقبة العينات الدهنية غرق في DCM. العينات التي تحتوي على خليط أنواع الأنسجة (مثلاً، البربخيه الدهون مع البربخ والخصية المرفقة) قد تغرق تماما حتى مع تمديد DCM إينكوبيشنز. ومع ذلك، ينبغي تحقيق تفرخ هذه العينات بين عشية وضحاها في DCM ديليبيديشن كاملة. نظراً تمسخ البروتينات في هذه المذيبات العضوية، قد لا تتوافق مع الخطوة ديليبيديشن بعض الأجسام المضادة. لذلك، يصبح اختيار جسم مناسب آخر خطوة حاسمة لهذا البروتوكول. من المستحسن أولاً التحقق من الأجسام المضادة في أقسام الأنسجة المعالجة الميثانول أو قطع صغيرة من الأنسجة معالجتها بواسطة أديبو واضحة. وبالمثل، ينبغي اختبار توافق الأصباغ الكيميائية مع الميثانول/DCM/قسم تعزيز الحدود قبل التطبيق.
واحد الحد من البروتوكول هو تبريد البروتينات الفلورية اندوجينوسلي المعرب عنها. ديليبيديشن على أساس المذيبات العضوية وإزالة الخطوات إلى حد كبير تؤذي هذه البروتينات. أن تصور البروتينات الفلورية الذاتية، احتياجات العاملين وسم جسم. توافر مجموعات جسم مناسب يحد من قدرة على أداء عاليا متعدد التصوير. مجاهر الورقة الضوء المتاحة حاليا فقط يسمح لنا بصورة تصل إلى 4 قنوات.
أديبو--واضح مفيدة بشكل خاص لتصور الهياكل الخيطية والسكان الخلية التي تحتوي على كثافة منخفضة نسبيا في الأنسجة الدهنية. ومع ذلك، التصوير إشارات كثيفة تصبح محدودة مع هذا النهج. عندما يتم استخدام الأجسام المضادة لتسمية إشارات كثيفة، أنهم يمكن عزلها من [ابيتوبس] يقع على سطح العينة، منعها من الوصول إلى الأنسجة الداخلية. ولذلك، يوصي بالمجسات الكيميائية الصغيرة لوصمة عار هياكل كثيفة. بسبب نفس القضية، يقتصر تطبيق واضحة أديبو للنسيج الدهني البنى. الدهون براون مستودع الدهنية مع هياكل كثيفة. بالإضافة إلى كثافة الأوعية الدموية والأعصاب تعصيب، أنها أيضا محكم معبأة adipocytes الصغيرة التي تحتوي على عدد كبير من الميتوكوندريا17. عند تطبيق CD31 وال تلطيخ بنفس الإجراء كما هو موضح أعلاه للدهون براون، فقط سطح العينة كان المسمى (البيانات لا تظهر). وعلاوة على ذلك، ينتج الدهون براون أوتوفلوريسينسي الأنسجة القوية، مما أدى إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء التصوير. من المستحسن لقطع الدهون براون إلى قطع أصغر واستخدام المجسات الكيميائية عندما يكون ذلك ممكناً.
عموما، أديبو واضحة تسمح التنميط المتزامن لهياكل متعددة للفائدة مع الاستبانة في الأنسجة الدهنية كاملة. باستخدام هذا النهج، واحد يمكن تحليل كيفية تفاعل هياكل مثل إسقاطات العصب، المفرج، والخلايا المناعية، و adipocytes في جميع أنحاء لوحة الدهون كلياً. ويوفر بيانات التصوير غير منحازة عن طريق تجنب تمزيقها أو اختيار المناطق ذات الاهتمام. يمكن أيضا تطبيق أديبو واضحة لدراسة التنمية الدهنية مثل الأحداث خلال morphogenesis المبكر، فضلا عن توزيع الخلايا adipocyte السلف والسلائف في دراسات تتبع النسب. وبالإضافة إلى الدهنية، قد أيضا تيسير واضحة أديبو 3D جبل كل تحليل للأنسجة الأخرى التي المحتوى الدهني المرتفع أو محاطة بالدهون، مثل الغدة الثديية والعقدة الليمفاوية الدهنية. هذا الأسلوب يوفر أيضا فرصة لدراسة علم الأنسجة البشرية الأنسجة الدهنية في الظروف الفسيولوجية والمرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر بيرجاكي كريستينا، تونغ تاو والشمال أليسون من مركز الموارد بيويماجينج في جامعة روكفلر للمساعدة والدعم. ونشكر أيضا إكسيفياس قة تشو لتحرير الفيلم. وأيد هذا العمل بالبشرية الحدود العلوم برنامج المنظمة (PC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
