Summary
높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.
Abstract
지방 조직 에너지 항상성 및 체온 조절에 중심 역할을 한다. 그것은 다른 유형의 adipocytes, 뿐 아니라 체형 선구자, 면역 세포, 섬유 아 세포, 혈관 및 신경 예측 구성 됩니다. 셀 형식 지정의 분자 제어 하 고 이러한 세포의 상호 작용 점점 입각, 비록이 지방 주민 세포의 보다 포괄적인 이해 그들의 배포 아키텍처를 시각화 하 여 달성 될 수 있다 통해 전체 조직. 기존 immunohistochemistry 면역 형광 접근 지방 조직학 분석을 얇은 파라핀 포함 된 섹션에 의존 합니다. 그러나, 얇은 섹션 조직;의 작은 부분만 캡처 그 결과, 결론 조직의 어떤 부분을 분석 하 여 편견 수 있습니다. 따라서 전체 adipose 조직에 분자 및 세포 패턴의 포괄적인 3 차원 시각화를 허용 기법, Adipo-명확 하 고, 삭제 하는 지방 조직 개발 했습니다. Adipo 클리어 iDISCO에서 적응 / iDISCO +, 특정 수정에 게 완전히 제거 하는 기본 조직 형태를 유지 하면서 조직에 저장 된 지질. 함께 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 여기는 전체 지방 조직의 고해상도 체적 이미지를 Adipo Clear 메서드를 사용 하 여를 설명 합니다.
Introduction
최근까지, 지방이 많은 직물 지방 세포의 비정 질 컬렉션으로의 잉태 했다. 지난 몇 년간 우리의 이해 지금 adipocytes, 체형 선구자의 종류, 면역 세포, 섬유 아 세포, 맥 관 구조, 및 신경 예측을 포함 하는 복잡 한 기관 수를 인식 하는 지방으로 더 정교한 성장 했습니다. 이 지방 주민 세포 간의 상호 작용 효과 지방 조직 및 organismal 생리학 및 이상1발음 있다. 신흥 연구 기본 특정 상호 작용 하는 중요 한 분자 메커니즘 unraveled 있다, 하지만 더 포괄적인 이해 안정적인 구조 프로 파일링 3 차원 (3D)에 전체 조직의 필요 합니다.
지방이 많은 직물 형태학의 우리의 현재 지식은 기반 상대적으로 높은 확대 화상 진 찰 (10 X) 가진 얇은 단면도 (5 μ m)의 조직학 분석2,3. 그러나,이 방법은 몇 가지 중요 한 제한이 있다. 첫째, 복잡 한 등 교감 신경 맥 관 구조, 많은 기능4,5,,67에 중요 한 역할을 알려져 있습니다 filamentous 구조는 평가 하기 어려운 통해 얇은 섹션입니다. 둘째, 겉보기 무 조직 모양 및 대표적인 구조 단위에 초점의 부족, 그것은 지방 조직 구조 섹션 얼룩에 기반으로 감사 어렵다. 셋째, 지방 조직 취득 3D 해 부 재건, 전체 두뇌 형태학8을 연구 하는 데 사용 하는 기존의 방법에 대 한 적합 한 일관 된 직렬 섹션에 과제를 만드는 매우 높은 지질 내용을 있습니다. 이러한 요소를 감안할 때, 아직도 세포 해상도 달성 하면서 전체 지방 서비스 센터의 3D 시각화를 제공할 수 있는 전체-마운트 접근에 대 한 중대 한 필요가 있다.
전체 장기의 3 차원 체적 영상 도전 가벼운 살포의 가려지는 효과 때문 이다. 생물 학적 조직의 빛 분산의 주요 원천이 지질 수성 인터페이스에서 온다. 지질을 제거 하 여 피해를 제거 하는 노력에 대 한 지속적인 세기 왔다, 하지만 많은 수의 최근 혁신9되었습니다. 하나 같은 새로 개발 조직-개간 방법은 용 매 허가 기관의 immunolabeling 기반 3D 이미징 (iDISCO / iDISCO +)10,11. 그러나 지방 조직 특정 도전 주어진 지질 높은 수준을 제공 하는, 따라서는 iDISCO 추가 수정 / iDISCO + 프로토콜 완전히 붕괴에서 조직을 보호 하면서 지질을 추출 하는 데 필요한. 수정된 프로토콜을 개발 했습니다, 지금은 Adipo 클리어 라는 고해상도 체적 영상12에 적합 최적의 투명도 달성 하기 위해 지방이 많은 직물의 메탄올/dichloromethane 기반 delipidation를 사용 합니다. delipidation 단계 크게 표현 endogenously 냉각 형광 단백질 GFP와 RFP, 때문에 immunolabeling에 의해 이러한 단백질의 시각화를 달성 해야 합니다. 전반적으로,이 간단 하 고 강력한 프로토콜 지방 주민 세포의 조직 수준 조직 연구에 적용할 수 있는 개발 하는 동안 체형 조상 세포, 그리고 지방 morphogenesis의 혈통 추적.
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Protocol
동물 관리 및 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 록펠러 대학에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.
1. 조직 준비
- 혈액은 조직에서 완전히 제거 될 때까지 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 ~ 20 mL와 함께 표준 intracardiac 관류를 수행 합니다.
- 목과 꼬리는 크게 굳 어 때까지 perfusate ~ 20 mL 통 솔루션 (4 %paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS에) 4 ° C에서의 전환.
주의: PFA 독성이 있다. 피부, 눈 및 점 막과의 접촉을 피하십시오. 솔루션은 증기 두건 안쪽 여야 한다. - 신중 하 게 그것을 손상 하지 않고 전체 지방 패드를 제거 하는 관심의 지방 패드를 해 부. 무뚝뚝한 끝난 집게를 사용 하 여 곤란 또는 조직을 압박을 피하기 위해. 모든 모피와 해 부 조직을 오염 하지 마십시오.
- 후 4% PFA 1 x PBS에 4 ° c.에서 하룻밤에 조직 수정 각 지방 패드 15 mL 원뿔 튜브에 고정 솔루션의 ~ 10 mL와 수정 후.
- 실 온 (RT)에서 조직 1 x PBS로 3 회 (각 1 시간)을 씻어.
- 단기 (최대 2 주)에 대 한 조직 4 ° C에서 1 x PBS에 저장 하 고 빛 으로부터 보호. 장기 저장 (예를 들어, 1-2 년)에 대 한 전환 버퍼 0.05% 나트륨 아 지 드와 1 x PBS (방부 제)로.
주의: 나트륨 아 지 드 구두로 섭취 또는 피부를 통해 흡수 하는 때 매우 독성이 있다. 나트륨 아 지 드 솔루션 (5% 이상) 증기 두건에서 처리 되어야 집중.
2. Delipidation 및 Permeabilization
타이밍: 1-2 일
- 20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올 그라데이션 B1n 버퍼 (표 1) (v/v), 예를 들어, 20% 메탄올/B1n 버퍼에 대 한 준비, 메탄올의 20 mL와 B1n 버퍼의 80 mL를 혼합. 4 ° c.에 모든 버퍼 저장 글리신 결정 채도 인해 60% 및 80% 메탄올/B1n 버퍼에서 침전 한다. 크리스탈;를 제거 하지 마십시오 액체 솔루션을 사용 하 여 다음 세척에 대 한.
주의: 메탄올은, 자극성, 휘발성 및 가연성. 피부 또는 눈 접촉을 피하십시오. - 부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 머리를 제거 합니다. 어떤 머리, 보풀, 또는 파편 샘플에 연결 된 이미징 동안 그림자를 발생 합니다. 새로운 튜브로 청소 샘플을 전송 합니다.
- 달리 명시 하지 않는 한 또는 얼음에 4 ° C에서 다음 단계를 모두 수행 합니다. (예를 들어, 젊은 마른 쥐에서 후부 피하/perigonadal 지방 패드) 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 (예를 들면, 비만 쥐에서 지방 패드) 높은 지질 콘텐츠로 샘플 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.
- 가로로 설정 궤도 셰이 커에 샘플을 포함 하는 튜브를 놓고 ~ 100 rpm. 샘플 튜브 안에 자유롭게 이동할 수 있는지 확인 합니다.
- 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 20%, 40%, 60%, 80%, 및 100% 메탄올/B1n 버퍼의 등급된 시리즈에서 샘플을 탈수. 이어지기 솔루션을 최소화 합니다.
- Delipidate 100 %dichloromethane (DCM)와 샘플 (3 회), 부 화 시간에 각각 표 2에 표시. 샘플의 두 번째 및 세 번째 DCM 세척 끝 튜브의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우 전체 delipidation를 위해 보육 시간 연장 (예를 들어, 30 분에서 1-2 시간까지).
주의: DCM 연기 후드 안에 처리 되어야 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 튜브 외피에 대 한 폴 리 프로필 렌에서 만들어집니다. Microcentrifuge 튜브 DCM의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 serological 펫 폴리스 티 렌에서 DCM와 호환 되지 않습니다. DCM은 매우 휘발성 이다. 신속 하 게 건조를 방지 하기 위해 신선한 솔루션에는 샘플을 전송 합니다. - 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 100% 메탄올으로 두 번 세척.
- 옵션: 없으면 샘플 잘 perfused, 나머지 적혈구에서 헤모글로빈의 색 될 수 있습니다 강한 autofluorescence. 4 ° c.에 하룻밤 메탄올 (메탄올의 5 볼륨 30% H2O2 의 1 볼륨)에서 5% H2O2 와 표 백제
- 반전된 메탄올/B1n 버퍼 시리즈에서 샘플 rehydrate: 80%, 60%, 40%, 20% 메탄올/B1n, 및 100 %B1n 버퍼 (2 회) 지정 된 시간 (표 2).
- 실시간에서 PTxwH 버퍼 (표 1) 2 시간에 대 한 샘플을 씻어
- Delipidated 샘플 4 ° C (최대 1 년)에서 PTxwH 버퍼에 저장 하거나 immunostaining 단계로 바로 진행 합니다.
3. 전체 마운트 Immunostaining
타이밍: 8-10 일
참고: 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호, 언급 하지 않는 한. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다. 먼저 조직 또는 메탄올 처리 조직 단면도의 작은 조각에 항 체를 검사 하는 것이 좋습니다.
- 권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 1 차적인 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g에서 원심
- 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 1 차적인 항 체 솔루션 delipidated 샘플을 품 어.
- 일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 샘플을 세척: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.
- 권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 이차 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g 에서 원심
참고: 조직 autofluorescence에 의해 발생 하는 높은 백그라운드를 방지 하려면 fluorophores 빨간색과 빨강 영역에 빛을 방출로 활용 된 이차 항 체는 권장 됩니다. 현미경에 레이저 라인 수에 따라 최대 3-4 마커 수 수 몇 군데 동시에 하나의 샘플에. - 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 2 차 항 체 솔루션 샘플을 품 어.
- 일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 세척 샘플: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.
- 옵션: 조직 유형 연약한, 수정 얼룩진된 조직 4% PFA 1 x PBS에 조직 형태를 유지 하기 위해 4 ° C에서 하룻밤.
참고:이 단계는 이미징 배경을 증가할 수 있습니다. 지방 조직에 대 한이 단계를 수행할 필요는 없습니다. - 1 x PBS와 샘플 일련의 인큐베이션 단계에서 세척: 5 분, 10 분, 그리고 30 분.
- 부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 린 트를 제거 합니다.
4. 조직 개간
타이밍: 1-2 일
- 선택 사항: agarose 빛 시트 현미경 검사 법에 대 한 샘플 장착을 촉진 하기에 샘플을 포함 합니다.
참고:이 단계는 좋습니다 이미징 동안 모양을 안정화를 지방 조직에 대 한.- 1 x PBS (w/v)에서 1 %agarose 포함 솔루션을 준비 합니다. 포함 솔루션 쿨 ~ 40 ° C ~ 샘플 과도 한 열을 노출 하지 마십시오.
- (예, 페 트리 접시 또는 보트 무게) 금형 청소 샘플을 배치 하 고 원하는 위치에 정렬. 어떤 액체의 carryover를 하지 마십시오. 부드럽게 샘플 포함 솔루션을 붓는 다. 어떤 공기 방울을 피하십시오.
- 완전 실시간 컷에 샘플을 포함 하는 블록을 공고히 하는 agarose를 하자.
참고: 하룻밤 외피를 포함 하 여 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.
- 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 H2소개할 25%, 50%, 75% 및 100% (3 회)와 메탄올에서에서 샘플을 탈수.
참고: 샘플 100% 메탄올 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다. - (3 회)을 떨고와 1 시간에 대 한 100 %DCM 샘플을 품 어. 샘플 각 DCM 세척의 끝에 관의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우에 메탄올의 완전 제거를 보장 하기 위해 보육 시간 연장. 샘플은 100 %DCM 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.
- 일치 하는 굴절률을 달성 하기 위해 가벼운 떨고와 dibenzyl 에테르 (DBE)에 샘플 밤새 품 어.
참고: 샘플 결국 가시 광선에 투명 하 게 될 것 이다.
주의: DBE 위험입니다. 피부와 접촉을 하지 마십시오. 두 계층 장갑 연기 후드 안에 그것을 처리 합니다. 최대한 빨리 그것은 DBE와 함께 오염 된 장갑을 삭제 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 관 (폴 리 프로필 렌) 외피에 대 한. Microcentrifuge 튜브 DBE의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 폴리스 티 렌에서 혈 청 학적인 펫 DBE와 호환 되지 않습니다. 100% 에탄올으로 어떤 유출 청소. - 어둠 속에서 RT에서 샘플 2 h. 저장소 떨고 가벼운와 신선한 DBE와 함께 샘플을 품 어 나 영상에 직접 진행.
참고: 샘플은 한 달 내 이미지를 권장 됩니다. 특정 fluorophores 다른 사람 들 보다 더 안정 되어 있지만,이 단계에서 샘플의 장기 보관 권장 하지 않습니다.
5입니다. 현미경
- 빛-시트 현미경 DBE와 호환 되는 이미지입니다.
참고: 유기 용 매 기반 이미징에 대 한 승인 되 고 DBE의 굴절률과 일치 하는 유일한 목표는 DBE 몰입 이미징에서 목표를 찍기로 사용할 수 있습니다.- Agarose 포함 샘플 영상 동안 움직임을 막을 수 있는 홀더에 탑재 합니다. DBE 채워진 챔버로 샘플을 담가.
- Z-스택 전체 샘플 (예를 들어, 1-2 배 확대) 전체 조직 유통/관심의 마커의 구조를 취재를 수집 합니다.
- (예를 들어, 4-12 배 확대) 자세한 구조를 이미지를 관심 영역을 확대 하려면 더 높은 확대와 함께 목표를 전환 합니다.
참고: 콜라겐 지방 조직, 주변 모든 지방 세포13의 기질에 큰 기여입니다. 콜라겐은 약 400에 이르기까지 일반적인 방출 스펙트럼 550 nm14nm. 488 레이저 선 (녹색)으로 샘플을 상상 하 고 내 콜라겐 (예를 들어, 525-550 nm)의 방출 스펙트럼 파장 범위에서 방출된 빛을 수집 이전에 보여 줬던 조직 autofluorescence 신호를 제공할 것입니다. 지방 세포 윤곽 및 전반적인 조직 아키텍처12를 나타냅니다.
- 거꾸로과 이미징 confocal 또는 두 광자 현미경.
- 모든 플라스틱 부품 (또는 인감 수 있습니다 기타 DBE 호환 이미징 챔버)을 건드리지 않고 agarose 포함 샘플 챔버 슬라이드 유리 바닥에 놓습니다. DBE 밖으로 누출 되지 않는 다는 것을 확인 하십시오.
- 더 깊은 침투를 달성 하 긴 작동 거리를 가진 목표를 선택 하십시오.
참고: 이미지는 챔버 슬라이드의 유리 바닥을 통해 거꾸로 또는 2 광자 공초점 현미경으로 행해져야 한다. 샘플 및 찍기 DBE 기반 이미징에 대 한 제안 하지 목표 사이의 직접 접촉을 하지 마십시오.
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Representative Results
Adipo 명확한 준비 전체 지방 패드 조직 형태 및 세포질 상호 작용 고 비만 상태에 영향을 분석 하는 차원에서 몇 군데 있습니다. 이 메서드는 녹색 채널에 조직 autofluorescence 신호를 수집 하 여 일반 지방 구조 분석에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리가 이전 것으로 나타났습니다는 autofluorescence 지방 오버레이 perilipin 얼룩, 성숙한 adipocytes12개요 일반적으로 사용 되는 마커와 호의에 신호. 예를 들어 후부 피하 지방 패드 (psWAT) 낮은 확대 (1.3 X)와 함께 빛 시트 현미경을 사용 하 여 스캔 (그림 1A 및 B) adipocytes의 lobular 조직 보여 줍니다. Adipocytes, 크기 등의 자세한 정보 (그림 1 c 와 D) 높은 확대 (4 배)와 함께 관심의 영역으로 확대 하 여 계시 될 수 있다.
Adipo 클리어 도전 캡처 또는 얇은 섹션에서 추적 하는 혈관, 신경 예측 등 filamentous 구조를 시각화에 대 한 특히 유용 합니다. 교감 신 경계 (SNS) lipolysis 및 지방 조직4,5thermogenesis에서 중요 한 역할을 한다. 티로신 hydroxylase (TH)로 얼룩진 psWAT 패드 이미징, SNS에 대 한 마커 큰 신경 번들, 혈관 신경 분포, 뿐만 아니라 조직 실질 (그림 2A-H)에 밀도 터미널 arborization로 표시 되는 구조를 보여준다. 또한, 일 + parenchymal 예측 (그림 2E-H; dorsolumbar 부분에 상대적으로 높은 밀도 데 사 타 구니 부분 psWAT, 내 지역 편차 표시 보충 영화 1)입니다. SNS 터미널 arborization 연산을 추적 될 수 있다 고 innervation12의 밀도 평가 하기 위해 Imaris 소프트웨어의 FilamentTracer 도구를 사용 하 여 재구성 된 우리의 이전 작품 시연 하고있다.
지방 조직 무 겁 게 나가도록 알려져 있다. 지방의 대사 요구에 변화는 종종 그것의 맥 관 구조6,7의 개장 하는 동적 연결 됩니다. 강력 하 고 빠른 전체 조직 맥 관 구조의 프로 파일링 혈관 개장에 대 한 추가 편견된 분석을 제공할 수 있습니다. 우리 모든 adipocytes 접촉 (그림 3A-H;의 전체 조직에 걸쳐 모세 혈관은 관찰 라벨 혈관을 표식으로 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 (PECAM-1, 일컬어 CD31)를 사용 하 여, 보충 영화 2) 지방에서 교환 효율적인 영양소와 산소에 대 한 높은 수요를 지 원하는.
면역 세포는 지방 조직의 또 다른 중요 한 구성 요소입니다. 비만 상태는 죽은 adipocytes15,16주변 "크라운-같은" 구조를 형성 하는 프로-염증 성 세포의 침투와 함께 지방 조직이 염증이 된다. 비만 동물에서 지방 패드는 특히 그들의 큰 크기 및 높은 지질 내용을 지우기 어렵다. 그러나, Adipo 클리어 (큰 조직 또는 높은 지방 콘텐츠 조직 표 2 에 설명 된)의 확장된 버전 전체 높은 지방 라덴 조직의 일관 된 청소를 얻을 수 있습니다. 예를 들어 높은 지방 다이어트의 16 주를 품고 마우스에서 epididymal 지방 밀도 "왕관 모양의 구조", (그림 4A 와 B) 전체 조직에 걸쳐 CD68에 의해 immunolabeled를 보여 줍니다. 중요 한 것은, 광학 섹션 전체 깊이 조직의 다양 한 위치에서 점령 (~ 4-5 m m) 보기 동일 하 게 선명한 이미지, 보여주는 조직 (그림 4C-F)의 완전 한 개간.
그림 1: 지방 조직 형태 autofluorescence 신호를 사용 하 여 분석. 모든 패널은 실시간에서 지 내게는 8 주 된 C57Bl/6J 남성 마우스에서 분리 한 Adipo 명확한 준비 psWAT 패드의 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 이미지 Autofluorescence 신호는 녹색 채널 삭제 샘플을 검색 하 여 수집 됩니다. Dorsolumbar 지역 (A) 와 (B) 1.3 X 목표에 의해 사 타 구니 지역의 광학 섹션 (샘플의 중간에서 횡단면)입니다. (C, D) 고배율 (4 배) 박스형된 지역 A 와 B에서 광학 섹션입니다. 림프절은 별표로 표시 됩니다. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 3D 지방 조직에 동 정적인 신경 분포의 이미징. 모든 패널은 티로신 hydroxylase (일) ( 그림 1과 같이 동일한 샘플)으로 표시 하는 psWAT의 LSFM 이미지입니다. 복원된 dorsolumbar 지역 (A) 와 사 타 구니 지역 (B) 1.3 X 목표에 의해 최대 예측 (C, D) A 와 B의 중간에서 광학 섹션입니다. (E, F) 고배율 (4 배)에서 C 와 D박스형된 지역의 광학 섹션입니다. (G, H) TH (녹색) 및 autofluorescence (마젠타) 사이의 오버레이의 고배율 광학 섹션입니다. 화살촉 표시 동 정적인 신경 분포의 뚜렷한 패턴: (1) 신경 번들; (2) 혈관 신경 분포; (3) parenchymal arborization입니다. 림프절은 별표로 표시 됩니다. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 지방 조직에서 혈관의 영상 3D. 모든 패널은 LSFM psWAT ( 그림 1과 같이 동일한 샘플) 라는 CD31의 이미지입니다. (A, B) 복원된 dorsolumbar 지역 (A) 와 사 타 구니 지역 (B) 1.3 X 목표에 의해 최대 예측 (C, D) A 와 B의 중간에서 광학 섹션입니다. (E, F) 고배율 (4 배)에서 C 와 D박스형된 지역의 광학 섹션입니다. (G, H) CD31 (빨간색)와 autofluorescence (사이안) 사이의 오버레이의 고배율 광학 섹션입니다. 림프절은 별표로 표시 됩니다. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: "왕관 모양의 구조" 지방 조직에서의 3D 영상. 모든 패널은 16 주 동안 높은 지방 다이어트를 먹이 하는 남성 마우스에서 분리 한 Adipo 명확한 준비 eWAT 패드의 LSFM 이미지입니다. 샘플은 CD31와 CD68 immunolabeled 했다. (A, B) 4. (A) X-Y 보기 보다는 더 많은 것의 총 깊이 가진 복원된 샘플의 최대 예측 (B) Y-Z 보기. (C-F) B에 표시 된 깊이에서 광학 섹션. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 버퍼 | 화학 | 최종 농도 |
| B1n 버퍼 | ||
| 글리신 | 0.3 M | |
| 트라이 톤 X-100 | 0.1% (v/v) | |
| H2O | 용 매 | |
| 나트륨 아 지 드 (방부, 옵션) | 0.01% (w/v) | |
| 7 NaOH로 pH를 조정 | ||
| PTxwH 버퍼 | ||
| 10 x PBS | 1 x | |
| 트라이 톤 X-100 | 0.1% (v/v) | |
| 트윈 20 | 0.05% (v/v) | |
| 헤 파 린 | 2 µ g/ml | |
| H2O | 용 매 | |
| 나트륨 아 지 드 (방부, 옵션) | 0.01% (w/v) |
표 1: 버퍼 솔루션의 목록. 이 표에서 Adipo 클리어에 사용 되는 버퍼에 대 한 요리법 합니다. 버퍼의 장기 저장을 위한 방부 제로 나트륨 아 지 드를 추가 하는 것이 좋습니다.
| 버퍼 | 작은 조직 | 큰 조직 (또는 고 지방 내용) | 온도 |
| 20% 메탄올/B1n 버퍼 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| 40% 메탄올/B1n 버퍼 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| 60% 메탄올/B1n 버퍼 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| 80% 메탄올/B1n 버퍼 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| 100% 메탄올 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| DCM | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| DCM | 1 h | 2-3 h, 또는 하룻밤 | 4 ° C |
| DCM | 30 분 | 2 h | 4 ° C |
| 100% 메탄올 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| 100% 메탄올 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| 선택 사항: 5% H2O2/methanol | 하룻밤 | 하룻밤 | 4 ° C |
| 80% 메탄올/B1n 버퍼 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| 60% 메탄올/B1n 버퍼 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| 40% 메탄올/B1n 버퍼 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| 20% 메탄올/B1n 버퍼 | 30 분 | 1 h | 4 ° C |
| B1n 버퍼 | 30 분 | 1 h | RT |
| B1n 버퍼 | 하룻밤 | 하룻밤 | RT |
| PTxwH 버퍼 | 2 h | 2 h | RT |
| PTxwH 버퍼 | 스토리지 | 스토리지 | 4 ° C |
| 1 차적인 항 체 외피 | 3 일 | 4-5 일 | RT |
| 이차 항 체 외피 | 3 일 | 4-5 일 | RT |
표 2: 보육 시간 delipidation 및 immunostaining. 이 테이블에 대 한 프로토콜의 delipidation 및 immunostaining 단계 보육 시간을 포함 되어 있습니다. 작은 조직의 대략적인 무게 < 300 밀리 그램입니다.
보충 영화 1: 지방 조직에 동 정적인 신경 분포의 이미징 3D. (같은 그림 2)는 psWAT 샘플의 티로신 hydroxylase (일) immunostaining. 영화 플라이 쓰루 광학 섹션 (4 X는 dorsolumbar에서)와 psWAT의 사 타 구니 지역 보여줍니다 ~ 2 m m.의 총 깊이 일에에서 표시 됩니다 녹색. Autofluorescence는 자홍색으로 표시 됩니다. Dorsolumbar 부분에서 지역 SNS 저밀도 나타납니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 2: 3D 이미징의 지방 조직에서 맥 관 구조. CD31 (같은 그림 3) psWAT 샘플의 immunostaining. 영화 플라이 쓰루 광학 섹션 (4 X는 dorsolumbar에서)와 psWAT의 사 타 구니 지역 보여줍니다 ~ 2 m m.의 총 깊이 CD31 표시 됩니다 빨간색. Autofluorescence는 청록색에 표시 됩니다. 모든 adipocytes 밀접 하 게 모세 혈관으로 둘러싸여 나타납니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Adipo 명확한 지방 조직, 일반 랩 설치에서 쉽게 실행 될 수 있는 삭제 위한 간단 하 고 강력한 방법입니다. IDISCO 등 다른 용 매 기반 개간 방법 비교 / iDISCO +10,,1112, Adipo 클리어는 특히 지방 조직 및 다른 조직 높은 지방 콘텐츠를 지우기. Delipidation 단계 완전히 지방에서 지질을 제거 합니다 및 따라서 전체 조직에 걸쳐 immunolabeling를 용이 하 게 하 고 크게 XY 해상도의 손실 없이 엔드-투-엔드 이미징 수 있도록 가벼운 살포를 최소화 합니다. 형광 빛 시트 뿐만 아니라 현미경 confocal 큰 조직의 빠른 검색을 제공 하는 및 2 광자 현미경 사용할 수 있습니다 또한 높은 해상도 더 많은 정보를 얻기 위해.
메탄올/DCM을 기반으로 delipidation는 중요 한 단계입니다. 부족 한 delipidation는 조직의 핵심으로 특히, 이미지를 흐려에 발생할 수 있습니다. DCM에서 침 몰 하는 많은 샘플을 관찰 하 여 지질의 완전 제거를 보장 하기 위해 중요 하다. 조직 유형 (예를 들어, epididymal 지방 epididymis와 연결 된 고환)의 혼합물을 포함 하는 샘플 확장된 DCM 외피와도 완벽 하 게 싱크 하지 않을 수 있습니다. 그러나, 이러한 샘플 DCM에서 하룻밤 배양 완전 한 delipidation를 달성 해야 합니다. 이 유기 용 매에 있는 단백질의 변성으로 인해 특정 항 체 delipidation 단계와 호환 되지 않을 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜에 대 한 또 다른 중요 한 단계 된다 적합 한 항 체를 선택. 먼저 메탄올 처리 조직 단면도 또는 조직 Adipo 클리어 처리의 작은 조각에 항 체를 검사 하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 메탄올/DCM/DBE와 화학 염료의 호환성도 응용 하기 전에 테스트 해야 합니다.
프로토콜의 한 가지 한계는 endogenously 표현된 형광 단백질의 냉각. 유기 용 매 기반 delipidation 및 개간 단계 크게 이러한 단백질 변성. 내 인 성 형광 단백질을 시각화 하기 위해 항 체 라벨를 채택 될 필요. 적합 한 항 체 조합의 가용성 높은 이미징 다중화 수행 기능을 제한 합니다. 현재 사용 가능한 빛 시트 현미경만 최대 4 채널 이미지를 우리을 허용합니다.
Adipo 명확한 filamentous 구조와 지방 조직에 상대적으로 낮은 밀도가지고 세포 인구를 시각화에 대 한 특히 유용 합니다. 그러나, 고밀도 신호 이미징이 접근으로 제한 된다. 항 체 밀도 신호를 사용 하는 조직 내부에 접근을 차단 하는 샘플의 표면에 있는 epitopes에 의해 격리 될 수 있습니다. 따라서, 작은 화학 프로브는 조밀한 구조를 얼룩 것이 좋습니다. 같은 문제로 Adipo 클리어의 갈색 지방 조직에 응용 프로그램 제한 됩니다. 갈색 지방이 조밀한 구조를 가진 지방 창 고 이다. 조밀한 혈관 및 신경 신경 분포, 그것은 또한 밀접 하 게 작은 adipocytes 미토 콘 드리 아17의 많은 수를 포함 하는 포장. CD31와 일을 적용할 때 같은 얼룩 갈색 지방, 샘플의 표면에만 위에서 설명한 절차 분류 됐다 (데이터 표시 되지 않음). 또한, 갈색 지방 강한 조직 autofluoresence, 이미징 동안 낮은 신호 대 잡음 비율에 지도 생성 합니다. 갈색 지방이 더 작은 조각으로 잘라 하 고 가능 하면 화학 프로브를 사용 하는 것이 좋습니다.
전반적으로, Adipo 지우기 관심의 여러 구조의 동시 프로 파일링 수 전체 지방 조직에서 고해상도. 이 방법을 사용 하 여, 하나의 신경 예측, 맥 관 구조, 면역 세포, adipocytes 등 구조 전체 지방 패드를 통해 작용 하는 방법을 분석할 수 있습니다. 그것은 방지 단면 또는 관심 영역을 선택 하 여 편견된 이미징 데이터를 제공 합니다. Adipo 명확한 계보 추적 연구에서 체형 시 조 및 전조 세포의 분포 뿐만 아니라 초기 morphogenesis 이벤트 등 많은 개발 연구에 적용할 수 있습니다. 지방, 뿐만 아니라 Adipo 명확한 수 있습니다 또한 높은 지질 콘텐츠 또는 지방, 유선, 지방 림프절 등으로 둘러싸인 다른 조직의 3D 전체 산 분석을 촉진 한다. 이 메서드는 또한 생리 및 병 적인 조건에서 인간의 지방 조직 조직학을 공부 하는 기회를 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 크리스티나 Pyrgaki, 타오 통, 앨리슨 북쪽에 록펠러 대학 Bioimaging 리소스 센터에서 감사 하 고 지원 합니다. 우리는 또한 영화 편집: Xiphias Ge Zhu 감사합니다. 이 작품에서 인간 프론티어 과학 프로그램 조직 (PC)를 지원 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
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