Summary
Debido al contenido alto de lípidos, tejido adiposo ha estado desafiando a visualizar utilizando métodos histológicos tradicionales. Adipo-Clear es un tejido de limpieza técnica que permite etiquetado robusta y alta resolución volumétrica fluorescente la proyección de imagen del tejido adiposo. Aquí, describimos los métodos para la preparación de la muestra, tratamiento previo, tinción, limpieza y montaje para la proyección de imagen.
Abstract
El tejido adiposo juega un papel central en la homeostasis de la energía y la termorregulación. Se compone de diferentes tipos de adipocitos, como precursores de adipocitos, células inmunes, fibroblastos, vasos sanguíneos y las proyecciones del nervio. Aunque el control molecular de la especificación del tipo de la célula y cómo interactúan estas células han sido cada vez más delineados, se logra una comprensión más completa de estas células reside en el adiposo por visualizar su distribución y arquitectura a lo largo de todo tejido. Enfoques existentes de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia para analizar la histología adiposa confían en finas secciones parafina-encajadas. Sin embargo, secciones delgadas capturan sólo una pequeña porción de tejido; como resultado, las conclusiones pueden estar sesgadas por qué porción del tejido se analiza. Por lo tanto hemos desarrollado un limpieza técnica, Adipo-claro, para permitir la visualización tridimensional completa de patrones moleculares y celulares en todo los tejidos adiposo el tejido adiposo. Adipo-clara es una adaptación del iDISCO / iDISCO +, con modificaciones específicas a eliminar los lípidos almacenados en el tejido preservando morfología de tejido propio. En combinación con la microscopía de fluorescencia de luz de hoja, aquí demostramos el uso del método para obtener imágenes en alta resolución volumétricas de un tejido adiposo todo Adipo-claro.
Introduction
Hasta hace poco, el tejido adiposo fue concebido como una colección amorfa de células de grasa. En las últimas décadas, nuestra comprensión ha crecido más sofisticada, con grasas, ahora reconocido como un órgano complejo que contiene diferentes tipos de adipocitos, así como precursores de adipocitos, células inmunes, fibroblastos, vasculatura y proyecciones del nervio. Interacciones entre estas células reside en el adiposo han marcado efectos sobre el tejido adiposo y la fisiología y Fisiopatología1. Aunque estudios emergentes han desentrañando importantes mecanismos moleculares subyacentes a ciertas interacciones, una comprensión más integral requiere perfiles estructurales fiables del todo tejido en tres dimensiones (3D).
Nuestro actual conocimiento de la morfología del tejido adiposo en gran parte se basa en el análisis histológico de secciones delgadas (5 μm) con la proyección de imagen relativamente alta magnificación (más de 10 X)2,3. Sin embargo, este enfoque tiene varias limitaciones importantes. Primeras, intrincadas estructuras filamentosas como los nervios simpáticos y la vasculatura que se saben para desempeñar un papel importante en la función adiposo4,5,6,7, son difíciles de evaluar a través de secciones delgadas. En segundo lugar, debido a su forma aparentemente amorfa y la falta de unidades estructurales representativas centrarse, es difícil apreciar las estructuras de tejido adiposo basadas sólo en la sección coloración. En tercer lugar, el tejido adiposo tiene un contenido de lípidos muy alto, creando dificultades en la obtención de secciones seriadas consistente que son adecuadas para la reconstrucción anatómica 3D, un método convencional utilizado para el estudio de la morfología de todo el cerebro8. Teniendo en cuenta estos factores, hay una gran necesidad de un enfoque conjunto de montaje que permiten la visualización en 3D de un depósito adiposo todo mientras todavía lograr resolución celular.
La proyección de imagen volumétrica 3D de un órgano completo es un reto debido a la ocultación de la dispersión de la luz. Una importante fuente de dispersión de la luz en los tejidos biológicos viene de interfaces lípido-acuoso. Aunque los esfuerzos para eliminar la dispersión mediante la eliminación de lípidos han sido permanente para más de un siglo, ha habido un gran número de innovaciones recientes9. Un tal método de remoción de tejido desarrollado recientemente es imágenes en 3D basados en la inmunomarcación de órganos despejó de solvente (iDISCO / iDISCO +)10,11. Sin embargo, el tejido adiposo presenta un desafío particular dado su alto nivel de lípidos y por lo tanto, modificaciones adicionales a la iDISCO iDISCO + protocolo son necesarios para extraer completamente los lípidos mientras que protege el tejido contra colapso. El protocolo modificado que hemos desarrollado, ahora se llama Adipo-claro, emplea delipidation basado en diclorometano/metanol de tejido adiposo para conseguir la óptima transparencia conveniente para la proyección de imagen volumétrica alta resolución12. Porque el delipidation paso en gran parte arrestina endógeno expresan proteínas fluorescentes GFP y RFP, visualización de tales proteínas debe lograrse por inmunomarcación. En general, este Protocolo simple y robusto se puede aplicar para estudiar la organización nivel de tejido adiposo residente células, rastreo de linaje de células progenitoras de adipocito y adiposo morfogénesis durante el desarrollo.
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Protocol
Experimentación y cuidado de los animales se realizaron según procedimientos aprobados por el Comité de uso de la Universidad de Rockefeller y atención institucional del Animal.
1. preparación de tejido
- Realizar perfusión intracardiaca estándar con 20 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C hasta que la sangre se extrae completamente el tejido.
- Cambiar la solución a 20 mL de solución fijadora (4% paraformaldehido (PFA) en PBS 1 x) a 4 ° C hasta que el cuello y la cola se refuerza significativamente.
PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Evite el contacto con la piel, ojos y mucosas. Soluciones deben hacerse dentro de una campana de humos. - Diseccionar las almohadillas grasas de interés cuidadosamente para quitar la almohadilla de grasa entera sin dañarlo. Use pinzas de punta Roma para evitar pellizcar o apretar el tejido. Evitar contaminar el tejido disecado con cualquier piel.
- -Fijar el tejido en 4% PFA en PBS 1 x durante la noche a 4 ° C. Para cada cojín gordo, después fije con ~ 10 mL de solución de fijación en un tubo cónico de 15 mL.
- Lavar el tejido 3 veces (1 h) con 1 x PBS a temperatura ambiente (RT).
- Guarde el tejido para a corto plazo (hasta 2 semanas) en PBS 1 x a 4 ° C y protegido de la luz. Para almacenamiento a largo plazo (p. ej., 1-2 años), cambiar el búfer a 1 x PBS con 0.05% de azida de sodio (como conservante).
PRECAUCIÓN: La azida sódica es altamente tóxica cuando se ingiere por vía oral o absorbe por la piel. Concentrado de azida de sodio soluciones (al 5% o mayor) deben ser manipuladas bajo una campana de humos.
2. Delipidation y permeabilización
Tiempo: 1-2 días
- Preparar 20%, 40%, 60% y 80% metanol gradiente con B1n tampón (tabla 1) (v/v), por ejemplo, para 20% metanol/B1n tampón, mezclan 20 mL de metanol y 80 mL de buffer B1n. Almacenar todos los búferes a 4 ° C. Cristales de glicina precipitará de 60% y 80% metanol/B1n buffers debido a la saturación. Evitar la eliminación de los cristales; Use el líquido para los lavados siguientes.
PRECAUCIÓN: El metanol es volátil, irritante e inflamable. Evite la piel o contacto con los ojos. - Retire suavemente el pelo de la muestra bajo un microscopio de disección. Los cabellos, pelusas o restos unido a la muestra hará sombras durante proyección de imagen. Transferir la muestra limpia en un tubo nuevo.
- Realizar todos los pasos siguientes en hielo o a 4 ° C a menos que se indique lo contrario. Para pequeñas muestras (por ejemplo, posteriores subcutáneo/perigonadal cojines gordos de ratones jóvenes lean), utiliza tubos de microcentrífuga de 2 mL con 1.6 mL de la solución. Para muestras grandes o las muestras con contenido alto de lípidos (por ejemplo, cojines gordos de ratones obesos), utiliza tubos de 5 mL con 4 mL de la solución.
- Colocar los tubos con las muestras horizontalmente en un agitador orbital a ~ 100 rpm. Asegúrese de que las muestras se pueden mover libremente dentro del tubo.
- Deshidratar la muestra en una serie gradual de 20%, 40%, 60%, 80% y 100% metanol/B1n tampón para el tiempo indicado (tabla 2). Reducir al mínimo la solución remanente.
- Delipidate la muestra con 100% diclorometano (DCM) (3 veces), cada uno con el tiempo de incubación indicado en la tabla 2. La muestra debe hundirse hasta el fondo del tubo en el extremo de los lavados de DCM de segunda y terceros. Si no, prolongar el tiempo de incubación para delipidation completo (p. ej., se extiende desde 30 min hasta 1-2 h).
PRECAUCIÓN: DCM debe manejarse dentro de una campana de humos. Utilizar envases de vidrio para tubos de microcentrífuga y almacenamiento que se hacen del polipropileno para incubaciones. Los tubos de microcentrífuga no deben utilizarse para el almacenamiento a largo plazo de DCM. Platos de Petri y pipetas que están hechas de poliestireno no son compatibles con DCM. DCM es altamente volátil. Transferir la muestra en solución fresca rápidamente para evitar la desecación. - Lavar dos veces con metanol al 100% para el tiempo indicado (tabla 2).
- Opcional: Si la muestra no es bien perfundida, el color de la hemoglobina de los glóbulos rojos restantes podría causar fuerte autofluorescencia. Bleach con 5% H2O2 en metanol (1 volumen de 30% H2O2 a 5 volúmenes de metanol) durante la noche a 4 ° C.
- Rehidratar la muestra en una serie de buffer metanol/B1n invertida: 80%, 60%, 40%, 20% metanol/B1n y 100% B1n tampón (2 veces) por el tiempo indicado (tabla 2).
- Lavar la muestra con buffer PTxwH (tabla 1) por 2 h a TA.
- Almacenar la muestra de delipidated en PTxwH buffer a 4° C (hasta 1 año) o proceder de inmediato con el paso de inmunotinción.
3. todo montaje inmunotinción
Tiempo: 8-10 días
Nota: Todos los pasos siguientes deben realizarse en RT si no se indica lo contrario, con agitación y protección de la luz. Para pequeñas muestras, utilice tubos de microcentrífuga de 2 mL con 1.6 mL de solución. Para muestras grandes, use tubos de 5 mL con 4 mL de solución. Se recomienda validar primero los anticuerpos en pequeños trozos de tejido o las secciones de tejido tratado con metanol.
- Diluir el anticuerpo primario en buffer de PTxwH a la concentración recomendada. Centrifugue la solución de anticuerpo diluido a ~ 20.000 x g durante 10 min evitar introducir anticuerpos precipitados o agregados.
- Incubar la muestra de delipidated con la solución de anticuerpo primario durante el tiempo indicado (tabla 2).
- Lavar la muestra con buffer de PTxwH en una serie de pasos de incubación: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h y durante la noche.
- Diluir el anticuerpo secundario en buffer de PTxwH a la concentración recomendada. Centrifugue la solución de anticuerpo diluido a ~ 20.000 x g durante 10 min evitar introducir anticuerpos precipitados o agregados.
Nota: Para evitar el alto fondo causada por tejido autofluorescencia, anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que emiten luz en las regiones rojizas y far-red se recomiendan. Dependiendo del número de líneas de láser disponibles en un microscopio, hasta marcadores de 3-4 puede ser reflejada al mismo tiempo en una muestra. - Incubar la muestra con la solución de anticuerpo secundario durante el tiempo indicado (tabla 2).
- Muestra lavado con tampón de PTxwH en una serie de pasos de incubación: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h y durante la noche.
- Opcional: Para los tipos de tejido que son frágiles, fijar el tejido manchado con 4% PFA en 1 x PBS durante la noche a 4 ° C para ayudar a conservar la morfología del tejido.
Nota: Este paso puede aumentar la proyección de imagen de fondo. No es necesario realizar este paso para tejido adiposo. - Lavar la muestra con PBS 1 x en una serie de pasos de incubación: 5 min, 10 min y 30 min.
- Suavemente Quite la pelusa de la muestra bajo un microscopio de disección.
4. tejido claro
Tiempo: 1-2 días
- Opcional: Embeber la muestra en agarosa para facilitar el montaje de la muestra para microscopía de luz de hoja.
Nota: Este paso se recomienda para que el tejido adiposo estabilizar su forma durante la proyección de imagen.- Prepare la solución de empotrar con agarosa al 1% en PBS x 1 (w/v). Enfríe la solución de empotrar ~ 40 ° C para evitar exponer la muestra a un calor excesivo.
- Coloque la muestra limpia en un molde (p. ej., placa de Petri o peso barco) y colocar en la posición deseada. Evitar cualquier arrastre de líquido. Suavemente Vierta la solución empotrada sobre la muestra. Evitar burbujas de aire.
- Deje que la agarosa solidificar completamente en corte de ruta hacia fuera de un bloque que contiene la muestra.
Nota: Todos los pasos siguientes incluyendo incubaciones durante la noche deben llevarse a cabo en RT, con agitación y protección de la luz. Para pequeñas muestras, utilice tubos de microcentrífuga de 2 mL con 1.6 mL de solución. Para muestras grandes, use tubos de 5 mL con 4 mL de solución.
- Deshidratar la muestra en el gradiente metanol con H2O: 25%, 50%, 75% y 100% (3 veces) para el tiempo indicado (tabla 2).
Nota: Muestra puede dejarse toda la noche en el paso de metanol al 100%. - Incubar la muestra en DCM de 100% durante 1 h con agitación (3 veces). Muestra debe hundirse hasta el fondo del tubo al final de cada lavado de DCM. Si no, prolongar el tiempo de incubación para asegurar el retiro completo de metanol. Muestra se puede dejar toda la noche en el paso de DCM de 100%.
- Incubar la muestra en Éter dibencílico (DBE) durante una noche con suave agitación para lograr emparejar el índice de refracción.
Nota: Muestra eventualmente se volverá transparente en luz visible.
PRECAUCIÓN: El DBE es peligroso. Evitar cualquier contacto con la piel. Manejar dentro de una campana de humos con dos capas de guantes. Deseche los guantes tan pronto como se contamina con DBE. Utilizar envases de vidrio para tubos de microcentrífuga y almacenamiento (polipropileno) para incubaciones. Los tubos de microcentrífuga no deben utilizarse para el almacenamiento a largo plazo de DBE. Platos de Petri y pipetas que están hechas de poliestireno no son compatibles con DBE. Limpie cualquier derrame con etanol al 100%. - Incubar la muestra con DBE fresca con una leve agitación para tienda de 2 h. la muestra a temperatura ambiente en la oscuridad o vaya directamente a la proyección de imagen.
Nota: Las muestras se recomiendan ser reflejada dentro de un mes. Aunque algunos fluoróforos son más estables que otros, no se recomienda el almacenamiento a largo plazo de las muestras en esta etapa.
5. microscopía
- Proyección de imagen con un microscopio de luz de hoja que es compatible con DBE.
Nota: Sólo los objetivos que son aprobados para la proyección de imagen basados en solventes orgánica y con el índice de refracción de DBE pueden utilizarse como sumergir objetivos en proyección de imagen inmerso de DBE.- Montaje de la muestra de agarosa incrustada en un soporte que puede impedir el movimiento durante la proyección de imagen. Sumergir la muestra en una cámara llena de DBE.
- Recoger un z-stack que cubre toda la muestra (p. ej., aumentos de 1-2) para obtener tejido conjunto distribución/estructura del marcador de interés.
- Cambiar a un objetivo con aumento mayor (por ejemplo, aumento de X 4-12) a acercarse a las regiones de interés para obtener imágenes detalladas estructuras.
Nota: El colágeno es una importante contribución a la matriz extracelular del tejido adiposo, que rodea todas las células de grasa13. Colágeno tiene un espectro de emisión típico que van alrededor de 400 nm a 550 nm14. Proyección de imagen la muestra con la línea de 488 láser (verde) y que recoge la luz emitida en un rango de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro de emisión del colágeno (p. ej., 525-550 nm) proporcionará la señal de la autofluorescencia de tejido, que fue demostrada previamente para delinear el contorno de la célula grasa y general arquitectura de tejido12.
- La proyección de imagen con un invertido confocal o un microscopio de dos fotones.
- Coloque la muestra de agarosa-incrustado en una diapositiva de la cámara con un fondo de vidrio sin tocar ninguna parte de plástico (o de otra cámara de proyección de imagen de DBE-compatible que puede sellar). Asegúrese de que no salga DBE.
- Elegir los objetivos con largas distancias de trabajo para lograr una penetración más profunda.
Nota: la proyección de imagen se debe hacer con un microscopio confocal o dos fotones invertido a través del fondo de cristal de la diapositiva de la cámara. Evitar el contacto directo entre la muestra y sumergir objetivos que no son sugeridos para la proyección de imagen basada en DBE.
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Representative Results
Adipo-claro preparado toda grasa pastillas pueden ser reflejadas en 3D para analizar cómo interacciones de tejido celular y la morfología son afectadas en los Estados obesos y magros. Este método puede aplicarse fácilmente para analizar estructura adiposa general recogiendo la señal de la autofluorescencia de tejido en el canal verde. Previamente hemos demostrado que la autofluorescencia señal en recubrimientos adiposos favorablemente con perilipin coloración, un marcador utilizado para delinear adipocytes maduros12. Por ejemplo, escanear un cojín gordo subcutáneo posterior (psWAT) utilizando un microscopio de luz-hoja con baja magnificación (1.3 X) muestra la organización lobular de los adipocitos (figura 1A y B). Información más detallada, tales como el tamaño de los adipocitos, puede ser revelada por zoom en las regiones de interés con mayor aumento (4 X) (figura 1 y D).
Adipo-claro es particularmente útil para la visualización de estructuras filamentosas como proyecciones del nervio y los vasos sanguíneos, que son difíciles de capturar o traza en secciones delgadas. Sistema nervioso simpático (SNS) desempeña un papel crucial en el control de la lipólisis y la termogénesis en el tejido adiposo4,5. Proyección de imagen un pad de psWAT teñido con tirosina hidroxilasa (TH), un marcador para el SNS, revela las estructuras que aparecen como paquetes grandes del nervio, inervación de los vasos sanguíneos, así como densa arborización terminal en el parénquima del tejido (figura 2A-H). Además, el TH + parénquima las proyecciones muestran variaciones regionales dentro de psWAT, con la porción inguinal con mayor densidad en relación con la porción dorsolumbar (Figura 2E-H; Película adicional 1). Nuestro trabajo previo ha demostrado que la arborización terminal SNS puede rastrearse computacionalmente y reconstruido usando la herramienta FilamentTracer de Imaris software para evaluar la densidad de inervación12.
Tejido adiposo es conocido por ser muy vascularizado. Los cambios en las demandas metabólicas de adiposo son a menudo asociados con un remodelado dinámico de su vasculatura6,7. Robusto y rápido de perfiles de la vasculatura de todo tejido pueden proporcionar análisis imparcial adicional para la remodelación de los vasos sanguíneos. Usando la molécula de adhesión de células endoteliales plaquetas (PECAM-1, también conocido como CD31) como un marcador para vasos de etiqueta, observamos que los adipocitos están en contacto con los capilares en el tejido entero (Figura 3A-H; Adicional 2 de la película), apoyo a la alta demanda de eficiente de nutrientes y oxígeno intercambio en adiposo.
Las células inmunes son otro componente esencial del tejido adiposo. En el estado obeso, se inflama el tejido adiposo, que es acompañada por la infiltración de macrófagos pro-inflamatorias que forman estructuras de "tipo corona" que rodean adipocitos muertos15,16. Grasa de animales obesos son particularmente difíciles de eliminar debido a su gran tamaño y mayor contenido de lípidos. Sin embargo, la versión extendida del Adipo-claro (descrito en la tabla 2 para el grande del tejido o tejidos con alto contenido de grasa) puede lograr claro consistente de tejido toda grasa-cargados. Por ejemplo, grasa Epididimal de un ratón alimentado con 16 semanas de dieta alta en grasa muestra densas "corona-como las estructuras", immunolabeled por CD68, en todo el tejido entero (Figura 4A y B). Lo importante, secciones ópticas tomadas desde varias posiciones sobre la profundidad del tejido (~ 4-5 mm) Mostrar imágenes, demostrando la completa limpieza del tejido (figura 4-F) igualmente precisas.
Figura 1: Análisis de la morfología del tejido adiposo con la señal de autofluorescencia. Todos los paneles son hoja ligera fluorescencia microscopía (LSFM) imágenes de una almohadilla de psWAT preparado de Adipo-claro aislado de un ratón macho de 8 semanas de edad C57Bl/6J, ubicado a TA. La señal de la autofluorescencia se recoge mediante la exploración de la muestra hayan borrado con el canal verde. Secciones ópticas (perfiles de la mitad de la muestra) de la región dorsolumbar (A) y la región inguinal (B) tomadas por objetivo X 1.3. (C, D) Secciones ópticas de alta magnificación (4 X) de las regiones en caja de A y B. Los ganglios linfáticos se indican por asteriscos. Barras de escala se indican en cada panel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: 3D la proyección de imagen de la inervación simpática en el tejido adiposo. Todos los paneles son LSFM imágenes de un psWAT con tirosina hidroxilasa (TH) (la misma muestra en la figura 1). Máximo proyecciones de la dorsolumbar reconstruido región (A) y la región inguinal (B) tomadas por el objetivo X 1.3. (C, D) Secciones ópticas de la mitad de A y B. (E, F) Secciones ópticas de alta magnificación (4 X) de las regiones en caja de C y D. (G, H) Alta magnificación secciones ópticas de la superposición entre TH (verde) y Autofluorescencia (magenta). Puntas de flecha indican patrones distintos de inervación simpática: paquete del nervio (1); (2) vaso sanguíneo inervación; (3) parénquima arborización. Los ganglios linfáticos se indican por asteriscos. Barras de escala se indican en cada panel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: 3D proyección de imagen de los vasos sanguíneos en el tejido adiposo. Todos los paneles son LSFM imágenes de un CD31 con la etiqueta psWAT (la misma muestra en la figura 1). (A, B) Máximo proyecciones de la dorsolumbar reconstruido región (A) y la región inguinal (B) tomadas por el objetivo X 1.3. (C, D) Secciones ópticas de la mitad de A y B. (E, F) Secciones ópticas de alta magnificación (4 X) de las regiones en caja de C y D. (G, H) Alta magnificación secciones ópticas de la superposición entre CD31 (rojo) y Autofluorescencia (cian). Los ganglios linfáticos se indican por asteriscos. Barras de escala se indican en cada panel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: proyección de imagen 3D de las "corona-como las estructuras" en el tejido adiposo. Todos los paneles son LSFM imágenes de una almohadilla de Adipo-claro eWAT preparados aislados de un ratón macho alimentado con dieta alta en grasas durante 16 semanas. La muestra fue immunolabeled con CD31 y CD68. (A, B) Proyecciones de máxima de la muestra reconstruida con una profundidad total de más de 4 mm. (A) X-Y vista. (B) vista de Y-Z. (C-F) Secciones ópticas de las profundidades indicadas en B. Barras de escala se indican en cada panel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tampón de | Producto químico | Concentración final |
| Buffer de B1n | ||
| Glicina | 0,3 M | |
| Triton X-100 | 0,1% (v/v) | |
| H2O | Solvente | |
| Azida sódica (conservante, opcional) | 0.01% (p/v) | |
| Ajustar el pH a 7 con NaOH | ||
| Buffer PTxwH | ||
| 10 x PBS | 1 x | |
| Triton X-100 | 0,1% (v/v) | |
| Tween 20 | 0,05% (v/v) | |
| Heparina | 2 μg/ml | |
| H2O | Solvente | |
| Azida sódica (conservante, opcional) | 0.01% (p/v) |
Tabla 1: lista de buffers y soluciones. Esta tabla contiene recetas para los buffers usados en Adipo-claro. Para el almacenamiento a largo plazo de los búferes, se recomienda añadir azida sódica como conservante.
| Tampón de | Pequeños de tejido | Grande del tejido (o con alto contenido de grasa) | Temperatura |
| 20% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 80% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| metanol al 100% | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 1 h | 2-3 h, o durante la noche | 4° C |
| DCM | 30 min | 2 h | 4° C |
| metanol al 100% | 30 min | 1 h | 4° C |
| metanol al 100% | 30 min | 1 h | 4° C |
| Opcional: 5% H2O2/methanol | Durante la noche | Durante la noche | 4° C |
| 80% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 20% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| Buffer de B1n | 30 min | 1 h | RT |
| Buffer de B1n | Durante la noche | Durante la noche | RT |
| Buffer PTxwH | 2 h | 2 h | RT |
| Buffer PTxwH | Almacenamiento de información | Almacenamiento de información | 4° C |
| Incubación del anticuerpo primario | 3 días | 4-5 días | RT |
| Incubación del anticuerpo secundario | 3 días | 4-5 días | RT |
Tabla 2: tiempos de incubación para delipidation y el immunostaining. Esta tabla contiene tiempos de incubación para los pasos delipidation y el immunostaining del protocolo. El peso aproximado de pequeños de tejido es < 300 mg.
Adicional 1 de la película: 3D proyección de imagen de inervación simpática en el tejido adiposo. Tirosina hidroxilasa (TH) immunostaining de una muestra de psWAT (igual que en la figura 2). La película muestra la mosca a través de secciones ópticas (4 X de la dorsolumbar) y regiones inguinales de psWAT, con una profundidad total de ~ 2 mm. TH aparece en verde. En magenta se muestra autofluorescencia. La región de la porción dorsolumbar parece tener una menor densidad SNS. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Adicional 2 de la película: 3D de imágenes de la vasculatura en tejido adiposo. Inmunotinción CD31 de una muestra de psWAT (igual que en la figura 3). La película muestra la mosca a través de secciones ópticas (4 X de la dorsolumbar) y regiones inguinales de psWAT, con una profundidad total de ~ 2 mm. CD31 se muestra en rojo. Autofluorescencia aparece en cian. Los adipocitos parecen estrechamente rodeado por capilares. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Adipo-Clear es un método sencillo y robusto para la eliminación de tejido adiposo, que puede realizarse fácilmente en una configuración de laboratorio regulares. En comparación con otros métodos de limpieza basados en solventes como iDISCO iDISCO +10,11,12, Adipo-clara es especialmente optimizadas para despejar el tejido adiposo y otros tejidos con alto contenido de grasa. El paso de delipidation completamente elimina lípidos de adiposo y por lo tanto facilita la inmunomarcación en todo el tejido entero y minimiza en gran medida la dispersión de la luz, permitiendo la proyección de imagen de extremo a extremo sin ninguna pérdida de resolución XY. Además de hoja de luz fluorescencia microscopios, que proporcionan análisis rápido del gran tejido, confocal y dos fotones microscopios pueden emplearse para obtener una mayor resolución y más detalles.
El delipidation basado en el metanol/DCM es un paso crítico. Delipidation insuficiente puede resultar en imágenes borrosas, especialmente hacia la base del tejido. Es importante asegurar el retiro completo de lípidos mediante la observación de muestras adiposas en DCM. Las muestras que contienen una mezcla de tipos de tejido (p. ej., grasa Epididimal con epidídimo y testículo conectado) no pueden hundirse totalmente incluso con incubaciones de DCM extendidas. Sin embargo, incubando las muestras durante la noche en DCM debería lograr delipidation completa. Debido a la desnaturalización de las proteínas en estos solventes orgánicos, ciertos anticuerpos pueden no ser compatibles con el paso de delipidation. Por lo tanto, elegir un anticuerpo adecuado se convierte en otro paso crítico de este protocolo. Se recomienda validar primero los anticuerpos en las secciones de tejido tratado con metanol o pequeñas porciones de tejido procesado por Adipo-claro. Asimismo, la compatibilidad de los tintes químicos con metanol/DCM/DBE también debe ser evaluada antes de la aplicación.
Una limitación del protocolo es el amortiguamiento de las proteínas fluorescentes endógeno expresadas. Los delipidation basados en solventes orgánico y los pasos claro en gran parte desnaturalizar tales proteínas. Para visualizar proteínas fluorescentes endógenas, anticuerpo etiquetado debe emplearse. La disponibilidad de combinaciones de anticuerpos adecuada limita la capacidad para realizar altamente multiplexado de la proyección de imagen. Los microscopios de luz-hoja disponibles actuales sólo nos permiten imagen hasta 4 canales.
Adipo-claro es particularmente útil para la visualización de las estructuras filamentosas y poblaciones celulares que tienen relativamente baja densidad en el tejido adiposo. Sin embargo, imagen densa señales llega a ser limitado con este enfoque. Cuando los anticuerpos se utilizan para etiquetar las señales densas, puede ser secuestrados por los epitopos situados en la superficie de la muestra, bloqueando el acceso al interior del tejido. Por lo tanto, se recomiendan pequeñas sondas químicas para teñir estructuras densas. Debido a la misma cuestión, la aplicación de Adipo-claro en tejido adiposo marrón es limitada. Grasa parda es un depósito adiposo con estructuras densas. Además densa vasos sanguíneos y de inervación del nervio, es también firmemente embalado con adipocitos pequeños que contienen un gran número de mitocondrias17. Aplicación de CD31 y TH de tinción con el mismo procedimiento como se describe arriba en grasa marrón, solamente la superficie de la muestra fue etiquetada (datos no mostrados). Además, la grasa marrón produce autofluoresence de tejido fuerte, llevando a la baja relación de señal a ruido durante proyección de imagen. Se recomienda para cortar grasa marrón en trozos más pequeños y utilizar sondas químicas siempre que sea posible.
En general, Adipo-Clear permite perfilado simultáneo de múltiples estructuras de interés, con alta resolución en todo el tejido adiposo. Usando este acercamiento, se puede analizar cómo interactúan las estructuras tales como proyecciones del nervio, la vasculatura, las células inmunes y adipocitos a través de la almohadilla de grasa todo. Proporciona datos de proyección de imagen imparciales, evitando seccionar o elegir las regiones de interés. Adipo-Clear puede aplicarse también para estudiar el desarrollo adiposo como eventos durante la morfogénesis temprana así como la distribución de células progenitoras y precursoras de adipocitos en estudios de seguimiento de linaje. Además de adiposo, Adipo-claro también puede facilitar análisis conjunto montaje 3D de otros tejidos que han contenido lipídico alto o están rodeados de grasa, como la glándula mamaria y grasa del nodo de linfa. Este método también ofrece una oportunidad para estudiar la histología del tejido adiposo humano en condiciones fisiológicas y patológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Christina Pyrgaki, Tao Tong y Alison North desde el centro de recursos de Bioimagen en la Universidad de Rockefeller para la asistencia y apoyo. También agradecemos a Xiphias Ge Zhu para la edición de la película. Este trabajo fue apoyado por el humano frontera ciencia programa organización (PC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
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