Summary
Yüksek lipid içeriği nedeniyle yağ dokusu geleneksel histolojik yöntemlerle görselleştirmek için zor oldu. Adipo-temiz sağlam etiketleme ve yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel floresan görüntüleme sağlayan tekniği temizleyerek bir dokudur. Burada, numune hazırlama, ön, boyama, takas ve montaj için görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır.
Abstract
Yağ dokusu enerji homeostazı ve termoregülasyon merkezi bir rol oynar. Adipositler, hem de adipocyte öncüleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, kan damarları ve sinir projeksiyonlar farklı türde oluşur. Her ne kadar hücre türü belirtimi moleküler kontrolü ve bu hücreler arasındaki etkileşimle giderek tarif, bu yağ yerleşik hücreler daha kapsamlı bir anlayış, kendi dağıtım ve mimari görselleştirme tarafından elde edilebilir Bütün doku. Adipose Histoloji analiz etmek için varolan immünhistokimya ve ayirt yaklaşımlar üzerinde ince parafin gömülü kısımlar dayanmaktadır. Ancak, ince kesitler doku yalnızca küçük bir bölümünü yakalamak; Sonuç olarak, sonuçları doku hangi bölümünü analiz tarafından önyargılı. Bu nedenle teknik, moleküler ve hücresel kalıplarının kapsamlı üç boyutlu görselleştirme içinde tüm yağ doku izin vermek için Adipo-temiz, takas bir yağ dokusu geliştirdik. Adipo-net iDISCO adapte / iDISCO +, belirli değişiklikler ile yapılan için tamamen doğal doku morfoloji koruyarak doku içinde depolanan lipid kaldırmak. Işık sayfalık floresans mikroskobu ile birlikte, biz burada tüm bir yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüler elde etmek için Adipo-Clear yöntemi kullanımını göstermektedir.
Introduction
Yakın zamana kadar yağ dokusu ve yağ hücrelerinin amorf bir topluluğu olarak tasarlandı. Son birkaç on yıl içinde anladığımız kadarıyla şimdi farklı türde adiposit yanı sıra adipocyte öncüleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, damarlara ve sinir projeksiyonlar içeren karmaşık bir organ olduğu kabul yağ ile daha sofistike büyüdü. Bu yağ yerleşik hücreler arasındaki etkileşimler yağ dokusu ve organizma fizyolojisi ve patofizyolojisi1etkileri belirgin. Her ne kadar ortaya çıkan çalışmalar bazı etkileşimler yatan önemli moleküler mekanizmaları sökülmüş, daha kapsamlı bir anlayış tüm doku üç boyutlu (3D) güvenilir yapısal profilleme gerektirir.
Geçerli bilgimizi yağ dokusu morfolojisi histolojik Analize ince kesitler (5 mikron) nispeten yüksek büyütme görüntüleme (daha--dan 10 X) ile büyük ölçüde dayalı2,3. Ancak, bu yaklaşım bazı önemli sınırlamaları vardır. İlk, karmaşık ipliksi yapılar adipose işlev4,5,6,7' önemli roller oynamak için bilinir, sempatik sinirler ve damarlara gibi değerlendirmek zordur ince kesitler. İkinci olarak, görünüşte amorf şeklini ve odaklanmak için temsilcisi yapısal birim eksikliği nedeniyle, yalnızca bölüm boyama temel yağ dokusu yapıları takdir etmek zordur. Üçüncü olarak, yağ dokusu 3D anatomik imar, tüm beyin morfoloji8çalışma için kullanılan geleneksel bir yöntem için uygun tutarlı seri bölümler elde etmek zorluklar oluşturma bir çok yüksek lipid içeriğe sahiptir. Bu faktörler göz önüne alındığında, hala hücresel çözünürlük elde ederken tüm yağ depo 3D görselleştirme sağlayabilir bir bütün-mount yaklaşım için büyük bir ihtiyaç var.
3D hacimsel görüntüleme tüm bir organ ışık saçılım belirsiz etkileri nedeniyle meydan okuyor. Biyolojik dokuların içinde ışık saçılım önemli bir kaynağı lipid sulu arabirimlerden geliyor. Çabaları dağılım lipidler kaldırarak ortadan kaldırmak için bir yüzyıl boyunca devam edecek olmasına rağmen çok sayıda son yenilikleri9olmuştur. Bir tür yeni geliştirilen doku Temizleme immunolabeling etkin 3D görüntüleme solvent seçilmemiş organların yöntemidir (iDISCO / iDISCO +)10,11. Ancak, yağ dokusu lipidler, onun yüksek düzeyde verilen belirli bir meydan okuma sunuyor ve bu nedenle, iDISCO ek değişiklikler / iDISCO + Protokolü tamamen çöken gelen doku koruyarak lipidler ayıklamak için gereklidir. Geliştirdiğimiz, şimdi Adipo-temiz, adı değiştirilmiş Protokolü metanol/diklorometan tabanlı delipidation yağ dokusunun en iyi şeffaflık yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüleme12için uygun elde etmek için kullanır. Çünkü büyük ölçüde endogenously ifade quenches floresan proteinler GFP ve RFP gibi delipidation adım, görselleştirme gibi proteinlerin immunolabeling tarafından sağlanmalıdır. Genel olarak, bu basit ve sağlam iletişim kuralı yağ yerleşik hücre, doku düzeyinde organizasyon eğitim için uygulanabilir adipocyte progenitör hücrelerin ve yağ morfogenez soy izleme geliştirme sırasında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakımı ve deney hayvan Kurulusları ve Rockefeller Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış yordamlara göre yapıldı.
1. doku hazırlık
- Kan tamamen dokudan kaldırılana kadar standart intrakardiyak perfüzyon ile ~ 20 mL 1 x 4 ° C'de fosfat tamponlu tuz (PBS) gerçekleştirin.
- Boyun ve kuyruk önemli ölçüde kasıldı kadar perfusate ~ 20 mL sabitleştirici çözeltisi (% 4 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS içinde) 4 ° C'de geçin.
Dikkat: PFA zehirlidir. Cilt, göz ve müköz membran ile temasından sakının. Çözümleri bir duman başlık içinde yapılmalıdır. - Dikkatli bir şekilde zarar vermeden tüm yağ yastığı çıkarın ilgi yağ yastıkları incelemek. Künt uçlu forseps pinching veya doku sıkma önlemek için kullanın. Herhangi bir kürk ile disseke doku bulaşıcı kaçının.
- Dokuya %4 1 x PBS PFA gecede 4 ° C'de sonrası fix Her yağ yastığı, ~ 10 mL fiksasyon çözeltisi 15 mL konik tüp ile sonrası düzeltme için.
- Doku oda sıcaklığında (RT) 3 kez (1 h her) 1 x PBS ile yıkayın.
- Kısa süreli (en fazla 2 hafta) için doku 1 x PBS 4 ° C'de depolayın ve ışıktan korunan. (Örneğin, 1-2 yıl) uzun süreli depolama için arabellek 1 x PBS ile % 0.05 sodyum azid (koruyucu olarak) geçiş yapar.
Dikkat: Sodyum azid sözlü olarak yutulur veya deri yoluyla emilir çok zehirli. Sodyum azid çözümleri (% 5 ya da daha fazla) bir duman başlık altında ele alınmalıdır yoğunlaşmıştır.
2. Delipidation ve Permeabilization
Zamanlama: 1-2 gün
- % 20, % 40, % 60 ve % 80 metanol degradeyle B1n arabellek (Tablo 1) (v/v), Örneğin, % 20 metanol/B1n arabelleği için hazırlamak, mix 20 mL metanol ve B1n arabelleği 80 mL. Tüm arabellekleri 4 ° C'de depolayın Glisin kristalleri doygunluk nedeniyle % 60 ve % 80 metanol/B1n arabellekleri çökelti. Kristalleri kaldırma kaçının; sıvı çözüm için aşağıdaki yıkar kullanın.
Dikkat: Metanol uçucu, tahriş edici ve yanıcı. Cilt ve göz temasından kaçının. - Yavaşça saç örnek bir diseksiyon mikroskop altında kaldırın. Herhangi bir saç, tüysüz veya örneğe bağlı enkaz gölgeler görüntüleme sırasında neden olur. Temizlenmiş örnek yeni bir tüp içine aktarın.
- Aksi belirtilmedikçe buz veya 4 ° C'de tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Küçük örnekleri için (Örneğin, posterior subkutan/perigonadal yağ yastıkları genç yalın fareler üzerinden), 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri ya da yüksek lipid içerikli (Örneğin, obez farelerin gelen yağ yastıkları) örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın.
- Yatay olarak ayarlanan bir orbital çalkalayıcı üzerinde örnekleri içeren tüpler yer ~ 100 rpm. Örnekleri tüp içinde özgürce hareket edebilirsiniz emin olun.
- % 20, % 40, %60, % 80 ve % 100 metanol/B1n arabellek kademeli bir dizi örnek belirtilen süre (Tablo 2) kurutmak. Etkilenmişimdir çözüm en aza indirmek.
- Delipidate ile % 100 diklorometan (DCM) örnek (3 kez), her kuluçka süresi ile Tablo 2' de belirtti. Örnek ikinci ve üçüncü DCM yıkar, sonundaki tüp altına lavabo. Aksi takdirde, tam delipidation emin olmak için kuluçka süresini uzatmak (Örneğin, 1-2 h 30 dk genişletmek).
Dikkat: DCM duman çuval içinde ele alınmalıdır. Polipropilen incubations için yapılmış depolama ve microcentrifuge tüpler için cam kaplar kullanın. Microcentrifuge tüpler DCM uzun süreli depolama için kullanılmamalıdır. Petri yemekler ve polistiren yapılan serolojik pipetler DCM ile uyumlu değildir. DCM çok kırılgandır. Örnek hızlı kuruma önlemek için taze çözüm aktarın. - İki kere % 100 metanol ile belirtilen süre (Tablo 2) yıkayın.
- İsteğe bağlı: örnek iyi perfused değilse, kalan kırmızı kan hücreleri hemoglobin rengini güçlü autofluorescence neden olabilir. Metanol (metanol, 5 cilt için % 30 H2O2 1 birim) içinde % 5 H2O2 ile gecede 4 ° C'de çamaşır suyu.
- Örnek bir ters metanol/B1n arabellek dizi rehydrate: %80, % 60, %40, % 20 metanol/B1n ve %100 B1n (2 kez) belirtilen süre (Tablo 2) arabellek.
- PTxwH arabellek (Tablo 1) için 2 h ile örnek RT. yıkama
- Delipidated örnek PTxwH arabellek 4 ° c (en fazla 1 yıl) depolamak veya hemen immunostaining adıma geçin.
3. bütün Dağı Immunostaining
Zamanlama: 8-10 gün
Not: Aşağıdaki adımların tümünü RT aksi, sallayarak ve ışık koruma ile belirtilmediği sürece yapılmalıdır. Küçük örnekleri için 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın. Bu ilk küçük parçalar halinde dokusu veya doku metanol tedavi bölümleri üzerinde antikorlar doğrulamak için tavsiye edilir.
- Önerilen konsantrasyonu PTxwH arabellekte birincil antikor sulandırmak. ~ 20.000 x g tanıtımı antikor precipitates veya toplamalardan önlemek 10 dk de seyreltilmiş antikor çözüm santrifüj kapasitesi.
- Delipidated örnek birincil antikor çözüm ile belirtilen süre (Tablo 2) için kuluçkaya.
- PTxwH arabellek ile örnek bir dizi kuluçka adımı yıkama: 5 dk, 10 dk, 15 dk, 20 dk, 1 h, 2 h, 4 h ve geceleme.
- Önerilen konsantrasyonu PTxwH arabellekte ikincil antikor sulandırmak. ~ 20.000 x g tanıtımı antikor precipitates veya toplamalardan önlemek 10 dk de seyreltilmiş antikor çözüm santrifüj kapasitesi.
Not: kırmızı ve far-red bölgelerinde ışık yayarlar fluorophores ile Birleşik ikincil antikorları yüksek arka plan doku autofluorescence tarafından neden önlemek için tavsiye edilir. Lazer bir mikroskobunun kullanılabilir hatları sayısına bağlı olarak en çok 3-4 işaretleri aynı anda bir örnek yansıma. - Örnek ikincil antikor çözüm ile belirtilen süre (Tablo 2) için kuluçkaya.
- PTxwH arabellek kuluçka adımları bir dizi ile yıkama örnek: 5 dk, 10 dk, 15 dk, 20 dk, 1 h, 2 h, 4 h ve geceleme.
- İsteğe bağlı: kırılgan doku türleri için %4 1 x PBS PFA gecede 4 ° C doku morfoloji korumaya yardımcı olmak ile lekeli doku düzeltmek.
Not: Bu adım görüntüleme arka plan artabilir. Yağ dokusu için bu adımı gerçekleştirmek gerekli değildir. - 1 x PBS ile örnek bir dizi kuluçka adımı yıkama: 5 dk, 10 min ve 30 dak.
- Yavaşça tüysüz bir diseksiyon mikroskop altında örnek kaldırın.
4. doku takas
Zamanlama: 1-2 gün
- İsteğe bağlı: örnek örnek montaj ışık sayfalık Mikroskopi için kolaylaştırmak için özel katıştırın.
Not: Bu adımı sırasında görüntüleme şeklini dengelemeye yağ dokusu için önemle önerilir.- 1 x PBS (w/v) % 1'özel gömme çözümle hazırlayın. Gömme çözümü cool ~ 40 ° C arasında aşırı sıcağa örnek kullanılmasını önlemek için.
- Temizlenmiş örnek (Örneğin, Petri kabına veya tekne tartı) bir kalıp yerleştirin ve istediğiniz pozisyona düzenlemek. Herhangi bir sıvı ertelenmiş kaçının. Yavaşça gömme çözüm örnek dökün. Herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
- Tam olarak örnek içeren bir bloğun RT. keser kuvvetlendirmek özel izin.
Not: Tüm gece incubations de dahil olmak üzere aşağıdaki adımları RT, sallayarak ve ışık koruma ile yapılmalıdır. Küçük örnekleri için 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın.
- Metanol gradient H2O: % 25, % 50, % 75 ve % 100 (3 kere) örnekte belirtilen süre (Tablo 2) kurutmak.
Not: Örnek gecede %100 metanol adımda bırakılabilir. - % 100 DCM (3 kere) sallayarak ile 1 h için örnekte kuluçkaya. Örnek tüp her DCM yıkama sonunda altına lavabo. Eğer değilse, metanol tam kaldırılmasını sağlamak için kuluçka süresini uzatmak. Örnek bir gecede %100 DCM adımda bırakılabilir.
- Örnek dibenzyl eter (DBE) gecede kırılma indisi eşleştirme elde etmek için hafif sallayarak ile kuluçkaya.
Not: Örnek sonunda görünür ışık şeffaf olacak.
Dikkat: DBE zararlıdır. Herhangi bir cilt ile temasından sakının. Çift katmanlı eldiven ile duman örtünün içinde hallederim. En kısa zamanda DBE ile kontamine eldiven atma. Cam kaplar için depolama ve microcentrifuge tüpler (Polipropilen) incubations için kullanın. Microcentrifuge tüpler DBE uzun süreli depolama için kullanılmamalıdır. Petri yemekler ve polistiren yapılan serolojik pipetler DBE ile uyumlu değildir. Temiz bir % 100 etanol ile bile ziyan. - Taze ete ile örnek 2 h. deposu için örneği RT'karanlıkta sallayarak hafif kuluçkaya veya doğrudan görüntüleme için devam edin.
Not: Örnekleri bir ay içinde yansıması için tavsiye edilir. Bazı fluorophores diğerlerinden daha kararlıdır olmakla birlikte, bu aşamada örnekleri uzun süreli depolama tavsiye edilmez.
5. mikroskobu
- DBE ile uyumlu olan ışık sayfalık mikroskop ile görüntüleme.
Not: organik solvent bazlı görüntüleme için onaylanmış ve DBE kırılma indisi ile eşleşen tek amaçları hedefleri DBE dalmış görüntülemede daldırma olarak kullanılabilir.- Görüntüleme sırasında hareketi engelleyen bir tutucu üzerine özel katıştırılmış örnek bağlayın. Örnek DBE dolu bir odaya sokmak.
- Bir z-yığın (Örneğin, 1-2 X büyütme) Bütün doku dağıtım/yapısı işaretin ilgi elde etmek için tüm örnek kapsayan toplamak.
- Bir amaç (Örneğin, 4-12 X büyütme) faiz detaylı yapıları görüntü bölgelerinde yakınlaştırmak için daha yüksek büyütme ile geçin.
Not: Kollajen tüm yağ hücrelerinin13çevreleyen yağ dokusu hücre dışı matriks için büyük bir katkıda bulunuyor. Kolajen vardır yaklaşık 400 arasında değişen bir tipik emisyon spektrum nm 550 nm14. Örnek (yeşil) 488 lazer çizgi ile görüntüleme ve kollajen (Örneğin, 525-550 nm) emisyon spektrum içinde yatıyor bir dalga boyu aralığı verilmiş ışık toplama için daha önce gösterilen doku autofluorescence sinyal sağlayacak yağ hücre kontur ve genel doku mimari12betimlemek.
- Bir ters confocal görüntüleme veya iki fotonlu mikroskop.
- Özel katıştırılmış örnek cam alt odası slaytla herhangi bir plastik parçalar (veya mühürleyebilirsiniz diğer DBE uyumlu görüntüleme odası) dokunmadan yerleştirin. DBE kaçak değil emin olun.
- Objektif ile daha derin nüfuz elde etmek için daha uzun çalışma mesafeler seçin.
Not: Görüntüleme odası slayt cam alt aracılığıyla ters bir confocal veya iki fotonlu mikroskop ile yapılmalıdır. Örnek ve daldırma DBE tabanlı görüntüleme için önerilen değil hedefleri arasında doğrudan temastan kaçının.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adipo-Clear tüm Yağ yastıkları 3D doku Morfoloji ve hücresel etkileşimlerin yalın ve obez Amerika'da nasıl etkilendiğini analiz etmek için yansıma hazırladı. Bu yöntem doku autofluorescence sinyal yeşil kanal toplayarak genel yağ yapısı analiz etmek için kolayca uygulanabilir. Biz daha önce autofluorescence göstermiştir sinyal olumlu perilipin boyama, Olgun adiposit12anahat için yaygın olarak kullanılan bir marker ile yağ bindirmeleri. Örneğin, bir ışık sayfalık mikroskop ile düşük büyütme (1.3 X) kullanarak bir arka subkutan yağ yastığı (psWAT) tarama adiposit (Şekil 1A ve B) lobular organizasyonu gösterir. Daha ayrıntılı bilgi, adipositler, boyutu gibi bölgelere daha yüksek büyütme (4 X) ile ilgi (Şekil 1 c ve D) yakınlaştırma tarafından açığa çıkarılabilir.
Adipo-Clear sinir projeksiyonlar ve kan damarları, yakalama veya izleme ince bölümlerinde zorlu gibi ipliksi yapıların görüntülenmesi için özellikle yararlıdır. Sempatik sinir sistemi (SNS) lipoliz ve yağ dokusu4,5termojenezdeki denetlenmesinde önemli bir rol oynar. Tirozin hidroksilaz (TH) ile lekeli bir psWAT yastık Imaging, SNS, avans büyük sinir demetleri, kan damarı innervasyon yanı sıra doku parankimi (Şekil 2A-H) yoğun terminal arborization olarak görünen yapıları ortaya koymaktadır. Ayrıca, TH + parenkima projeksiyonları dorsolumbar bölümü (2E rakam-H; göre daha yüksek yoğunluğu olan kasık kısmı ile psWAT içinde bölgesel varyasyon göster Takıma giren film 1). Önceki çalışmalarımız SNS terminal arborization hesaplama açısından takip edilebilir ve innervasyon12yoğunluğu değerlendirmek için Imaris yazılımının FilamentTracer aracını kullanarak yeniden göstermiştir.
Yağ dokusu ağır skarların olduğu bilinmektedir. Yağ metabolik taleplerini değişimler çoğu kez onun damarlara6,7/ dinamik modelleme ile ilişkili. Sağlam ve hızlı bütün doku damarlara profil oluşturma ek tarafsız analiz kan damarı tadilat nedeniyle sağlar. Etiket kan damarları için işaretleyici olarak trombosit endotel hücre adezyon molekülü (PECAM-1, CD31 olarak da bilinir) kullanarak, biz tüm adiposit kılcal damarlar boyunca bütün doku (Şekil 3A-H; ile temas halinde olduğunu gözlenen Takıma giren film 2), yağ içinde Döviz çekmek için verimli besin ve oksijen yüksek istek.
Başka bir önemli bileşeni olarak yağ dokusu bağışıklık hücreleridir. Obez durumda hangi ölü adiposit15,16çevreleyen "taç benzeri" yapıları oluşturmak pro-inflamatuar makrofaj infiltrasyonu tarafından eşlik ediyor yağ dokusu iltihaplanır. Obez hayvanlardan yağ yastıkları özellikle onların büyük boyutlu ve daha yüksek lipid içeriği nedeniyle temizlemek zordur. Ancak, Adipo-Clear (büyük dokusu veya doku yüksek yağ içeriği ile Tablo 2 ' de açıklanan) Genişletilmiş sürümü tüm yüksek-yağ yüklü doku tutarlı takas elde edebilirsiniz. Örneğin, yüksek yağlı diyet ile 16 hafta beslenen bir fare epididimal yağlardan yoğun "taç benzeri yapılar", CD68 tarafından immunolabeled bütün doku (Şekil 4A ve B) boyunca gösterir. Önemlisi, optik bölümleri üzerinde doku derinliği tüm çeşitli pozisyonlarda alınan (~ 4-5 mm) göstermek aynı derecede net görüntüler, (Şekil 4 c-F) dokusunun tam takas gösteren.
Şekil 1: autofluorescence sinyal kullanarak yağ dokusu morfoloji analizi. Hafif levha floresans mikroskobu (LSFM) görüntülerdir fareden RT. muhafaza bir 8 haftalık C57Bl/6J erkek izole bir Adipo-Clear hazır psWAT ped tüm panelleri Autofluorescence sinyal temizlenen örnek yeşil kanal ile tarama tarafından toplanır. Dorsolumbar bölge (A) ve inguinal bölge (B) 1.3 X objektif tarafından alınan optik bölümleri (örnek orta kesit). (C, D) Yüksek-büyütme (4 X) A ve Bkutulu bölgelerden optik bölümlerini. Lenf düğümleri yıldız tarafından belirtilir. Ölçek çubukları her panelinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: 3D, yağ dokusu içinde sempatik innervasyon Imaging. Tüm panelleri tirozin hidroksilaz (TH) ( resim 1olduğu gibi aynı örnek) etiketlenmiş bir psWAT LSFM görüntülerdir. Maksimum projeksiyonları yeniden dorsolumbar bölgesi (A) ve inguinal bölge 1.3 X objektif tarafından alınan (B) . (C, D) A ve Boptik bölümleri orta. (E, F) Yüksek-büyütme (4 X) C ve Dkutulu bölgelerden optik bölümlerini. (G, H) Yüksek büyütme optik bölümleri arasında TH (yeşil) ve autofluorescence (macenta) düzeninin. Ok uçları belirtmek sempatik innervasyon farklı desenler: (1) sinir demeti; (2) kan damarı innervasyon; (3) parenkima arborization. Lenf düğümleri yıldız tarafından belirtilir. Ölçek çubukları her panelinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: 3D yağ dokusu kan damarlarının Imaging. Tüm panelleri psWAT (aynı örnekte olduğu gibi Şekil 1) etiketli bir CD31 LSFM görüntülerdir. (a, B) Maksimum projeksiyonları yeniden dorsolumbar bölgesi (A) ve inguinal bölge 1.3 X objektif tarafından alınan (B) . (C, D) A ve Boptik bölümleri orta. (E, F) Yüksek-büyütme (4 X) C ve Dkutulu bölgelerden optik bölümlerini. (G, H) Yüksek büyütme optik bölümleri CD31 (kırmızı) ve autofluorescence (mavi) arasında düzeninin. Lenf düğümleri yıldız tarafından belirtilir. Ölçek çubukları her panelinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: yağ dokusu içinde "taç benzeri yapıları" 3D görüntüleme. Tüm panelleri 16 hafta boyunca yüksek yağlı diyet ile beslenen bir erkek fareden izole bir Adipo-Clear hazır eWAT pad LSFM görüntülerdir. Örnek CD31 ve CD68 ile immunolabeled oldu. (a, B) Daha fazla 4 mm. (A) X-Y görünümü toplam derinliği olan maksimum projeksiyonları yeniden örnek. (B) Y-Z görünümü. (C-F) Bbelirtilen derinliklerinde optik bölümleri. Ölçek çubukları her panelinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Arabellek | Kimyasal | Son konsantrasyonu |
| B1N arabellek | ||
| Glisin | 0,3 M | |
| Triton X-100 | %0,1 (v/v) | |
| H2O | Solvent | |
| Sodyum azid (koruyucu, isteğe bağlı) | %0.01 (w/v) | |
| PH 7 NaOH ile ayarlamak | ||
| PTxwH arabellek | ||
| 10 x PBS | 1 x | |
| Triton X-100 | %0,1 (v/v) | |
| Ara 20 | %0,05 (v/v) | |
| Heparin | 2 µg/ml | |
| H2O | Solvent | |
| Sodyum azid (koruyucu, isteğe bağlı) | %0.01 (w/v) |
Tablo 1: arabellekleri ve çözümleri listesi. Bu tablo Adipo-temiz kullanılan arabellekleri için yemek tarifleri içerir. Arabellekleri uzun süreli depolama için sodyum azid koruyucu olarak eklemek için tavsiye edilir.
| Arabellek | Küçük doku | Büyük doku (veya yüksek yağ içeriği ile) | Sıcaklık |
| % 20 metanol/B1n arabellek | 30 dk | 1 h | 4° C |
| % 40 metanol/B1n arabellek | 30 dk | 1 h | 4° C |
| % 60 metanol/B1n arabellek | 30 dk | 1 h | 4° C |
| % 80 metanol/B1n arabellek | 30 dk | 1 h | 4° C |
| % 100 metanol | 30 dk | 1 h | 4° C |
| DCM | 30 dk | 1 h | 4° C |
| DCM | 1 h | 2-3 saat veya gece boyunca | 4° C |
| DCM | 30 dk | 2 h | 4° C |
| % 100 metanol | 30 dk | 1 h | 4° C |
| % 100 metanol | 30 dk | 1 h | 4° C |
| İsteğe bağlı: %5 H2O2/methanol | Bir gecede | Bir gecede | 4° C |
| % 80 metanol/B1n arabellek | 30 dk | 1 h | 4° C |
| % 60 metanol/B1n arabellek | 30 dk | 1 h | 4° C |
| % 40 metanol/B1n arabellek | 30 dk | 1 h | 4° C |
| % 20 metanol/B1n arabellek | 30 dk | 1 h | 4° C |
| B1N arabellek | 30 dk | 1 h | RT |
| B1N arabellek | Bir gecede | Bir gecede | RT |
| PTxwH arabellek | 2 h | 2 h | RT |
| PTxwH arabellek | Depolama | Depolama | 4° C |
| Birincil antikor kuluçka | 3 gün | 4-5 gün | RT |
| İkincil antikor kuluçka | 3 gün | 4-5 gün | RT |
Tablo 2: kuluçka kez delipidation ve immunostaining. Bu tablo için belgili tanımlık delipidation ve immunostaining merdiven Protokolü'nün kuluçka kez içerir. Yaklaşık küçük doku < 300 mg ağırlığıdır.
Takıma giren film 1: 3D, yağ dokusu içinde sempatik innervasyon Imaging. Tirozin hidroksilaz (TH) immunostaining psWAT örneği (aynı Şekil 2). Sinek ile optik bölümleri (4 X dorsolumbar) ve psWAT, kasık bölgelerinde film gösterileri toplam derinliği olan ~ 2 mm. ile TH yeşille gösterilir. Autofluorescence kırmızı görüntülenir. Dorsolumbar bölümü bölgesinden alt SNS yoğunluğu gibi görünüyor. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Takıma giren film 2: 3D damarlara yağ dokusu içinde Imaging. CD31 immunostaining psWAT örneği (aynı Şekil 3). Sinek ile optik bölümleri (4 X dorsolumbar) ve psWAT, kasık bölgelerinde film gösterileri toplam derinliği olan ~ 2 mm. ile CD31 kırmızıyla gösterilir. Autofluorescence mavi içinde gösterilir. Tüm adiposit yakından kılcal tarafından çevrili olmak görünür. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipo-temiz yağ dokusu, normal laboratuar kurulumunda kolayca gerçekleştirilebilir temizlenmesi için bir basit ve sağlam yöntemdir. İDISCO gibi diğer solvent bazlı temizleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear özellikle yağ dokusu ve diğer doku yüksek yağ içeriği ile temizlenmesi için optimize edilmiştir. Delipidation adım lipitler yağ tamamen kaldırır ve bu nedenle immunolabeling tüm doku boyunca kolaylaştırır ve büyük ölçüde ışık saçılım, uçtan uca görüntüleme XY çözünürlük kaybı olmadan izin en aza indirir. Işık sayfalık floresans yanı sıra mikroskoplar, büyük doku, confocal hızlı tarama sağlayan ve iki fotonlu mikroskoplar de daha fazla çözünürlük ve daha fazla ayrıntı elde etmek için kullanılabilir.
Metanol/DCM-esaslı delipidation kritik bir adımdır. Yetersiz delipidation özellikle doku çekirdek doğru bulanık görüntüleri neden olabilir. Adipose örnekleri DCM batan gözlemleyerek lipidler tam kaldırılmasını sağlamak önemlidir. Doku türlerinin (Örneğin, epididimal fat epididim ve bağlı testis ile) bir karışımını içeren örnekleri tam olarak bile genişletilmiş DCM incubations ile batırmaya değil. Ancak, bu örnekler DCM geceleme kuluçka tam delipidation elde etmek. Bu organik çözücüler proteinler denatürasyon nedeniyle, belirli antikor delipidation adım ile uyumlu olmayabilir. Bu nedenle, uygun bir antikor seçerek bu iletişim kuralı için bir kritik adım olur. Bu ilk doku metanol tedavi bölümleri veya küçük parçalar halinde Adipo-Clear tarafından işlenen doku antikorlar doğrulamak için tavsiye edilir. Benzer şekilde, kimyasal boyalar uyumluluk metanol/DCM/DBE ile de uygulama önce test edilmelidir.
Bir protokol endogenously ifade floresan proteinlerin Şoklama kısıtlamasıdır. Organik solvent bazli delipidation ve temizleme adımları büyük ölçüde bu tür protein denatüre. Endojen floresan proteinler görselleştirmek için antikor etiketleme istihdam. Uygun antikor kombinasyonları kullanılabilirliğini son derece Imaging multiplexed yeteneğini sınırlar. Şu anki mevcut ışık sayfalık mikroskoplar yalnızca bize kadar 4 kanal görüntü için izin verin.
Adipo-Clear ipliksi yapılar ve nispeten düşük yoğunluklu yağ dokusu içinde var hücre popülasyonlarının görüntülenmesi için özellikle yararlıdır. Ancak, yoğun sinyaller Imaging bu yaklaşım ile sınırlı olur. Antikorlar yoğun sinyaller etiketlemek için kullanıldığında, onlar doku iç erişim engelleme örnek yüzeyinde bulunan epitopları tarafından tecrit. Bu nedenle, küçük kimyasal probları yoğun yapıları leke için tavsiye edilir. Aynı sorun nedeniyle, kahverengi yağ dokusu Adipo-Clear uygulamaya sınırlıdır. Kahverengi yağ yoğun yapıları ile yağ bir depo var. Yoğun kan damarları ve sinir innervasyon ek olarak, aynı zamanda sıkı bir şekilde çok sayıda mitokondri17içeren küçük adiposit ile doludur. CD31 ve TH uygularken ile aynı boyama (veri gösterilmez) kahverengi yağ, sadece yüzeysel örnek yukarıda açıklandığı gibi yordamı etiketli oldu. Ayrıca, kahverengi yağ düşük sinyal-gürültü oranı için görüntüleme sırasında önde gelen güçlü doku autofluoresence üretir. Bu kahverengi yağ daha küçük parçalar halinde kesilmiş ve kimyasal probları mümkün olduğunda kullanmak için tavsiye edilir.
Genel olarak, aynı anda birden fazla yapıları ile ilgi profil oluşturma Adipo-temiz sağlar tüm yağ dokusu içinde yüksek çözünürlüklü. Bu yaklaşımı kullanarak, bir sinir projeksiyonlar, damarlara, bağışıklık hücreleri ve adiposit gibi yapıların bütün yağ yastığı nasıl etkileşimde bulunduğunu analiz edebilirsiniz. Tarafsız görüntüleme veri kesit veya faiz bölgelerinde seçme kaçınarak sağlar. Adipo-Clear erken morfogenez yanı sıra soy izleme çalışmalarında adipocyte yaratıcı ve öncü hücrelerinin dağıtım sırasında olaylar gibi yağ geliştirme eğitim için uygulanabilir. Yağ ek olarak, Adipo-Clear da 3D bütün Dağı Analizi yüksek lipid içeriğin veya yağ, meme bezi ve yağlı lenf nodu gibi çevrili diğer dokuların kolaylaştırabilir. Bu yöntem aynı zamanda fizyolojik ve patolojik koşullarda insan adipose doku histolojisi çalışma olanağı sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Christina Pyrgaki, Tao Tong ve Bioimaging Kaynak Merkezi yardım için Rockefeller Üniversitesi'nde kuzeyden Alison teşekkür ediyoruz ve destek. Biz de Xiphias Ge Zhu film düzenleme için teşekkür ederiz. Bu eser insan sınır bilim programı organizasyonu (PC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
