Summary
På grunn av høy lipid innhold, har fettvev vært utfordrende for å visualisere bruke tradisjonelle histologiske metoder. Adipo-Clear er en vev fjerne teknikk som gjør at robust merking og høy oppløsning volumetriske fluorescerende avbilding av fettvev. Her beskriver vi metodene for eksempel forberedelse, forbehandling, flekker, fjerne og montering for bildebehandling.
Abstract
Fettvev spiller en sentral rolle i energi homeostasis og thermoregulation. Det består av ulike typer adipocytter, samt adipocyte forløpere, immunceller, fibroblaster, blod fartøy og nerve anslag. Selv om molekylære kontroll av cellen spesifikasjon og hvordan disse cellene samhandler har blitt mer avgrenset, kan en mer omfattende forståelse av disse liggende under adipose-resident cellene oppnås ved å visualisere deres distribusjon og arkitektur gjennom hele vevet. Eksisterende immunohistochemistry og immunofluorescence tilnærminger til å analysere adipose histology er avhengige av tynne parafin-embedded snitt. Men ta tynne snitt bare en liten del av vev; Derfor kan konklusjonene være partisk av hvilken del av vev er analysert. Derfor har vi utviklet en fettvev fjerne teknikk, Adipo-klare, for å gi omfattende tredimensjonale visualisering av molekylære og mobilnettet mønstre i hele liggende under adipose vev. Adipo-klare ble tilpasset fra iDISCO / iDISCO +, med endringer gjort å fjerne lipid lagret i vevet samtidig bevare opprinnelige vev morfologi. I kombinasjon med lys arks fluorescens mikroskopi viser vi her bruk av metoden Adipo-klare å få volumetriske oppløsning av en hel fettvev.
Introduction
Inntil nylig ble fettvev oppfattet som en amorf samling av fett celler. De siste tiårene vokst vår forståelse mer sofistikert, med fett nå anerkjent å være en kompleks organ som inneholder ulike typer adipocytter, samt adipocyte forløpere, immunceller, fibroblaster, blodkar og nerve anslag. Interaksjon mellom disse liggende under adipose-resident cellene har uttalt fettvev og organismebiologi fysiologi og patofysiologi1. Selv om nye studier har unraveled viktig molekylære mekanismer underliggende visse interaksjon, krever en mer omfattende forståelse pålitelig strukturelle profilering av hele vev i tre dimensjoner (3D).
Vår nåværende kunnskap om fettvev morfologi er hovedsakelig basert på histologiske analyse av tynne snitt (5 μm) med relativt høy forstørrelse imaging (mer enn 10 X)2,3. Denne tilnærmingen har imidlertid flere betydelige begrensninger. Første, intrikate trådformede strukturer som sympatiske nerver og blodkar, som er kjent for å spille en viktig rolle i adipose funksjonen4,5,6,7, er vanskelig å vurdere gjennom tynne snitt. Andre formen tilsynelatende amorfe og mangel på representant strukturell enhet å fokusere på, er det vanskelig å verdsette fettvev strukturer basert på delen flekker. Tredje har fettvev en svært høy lipid innhold, skape utfordringer i å få konsekvent føljetong deler som passer for 3D anatomiske rekonstruksjon, en tradisjonell metoden brukes til å studere hele hjernen morfologi8. Gitt disse faktorene, er det et stort behov for en hel-mount tilnærming som kan gi 3D visualisering av en hel adipose depot mens fortsatt oppnå mobilnettet oppløsning.
3D volumetriske avbildning av et hele organ er utfordrende på grunn av obscuring effektene av lys punkt. En viktig kilde til lys scatter i biologisk vev kommer fra lipid-vandig grensesnitt. Selv om arbeidet med å eliminere scatter ved å fjerne lipider har pågått for over et århundre, har det vært en rekke nyere innovasjoner9. En slik nyutviklet vev-clearing metode er immunolabeling-aktiverte 3D-bildebehandling løsemiddel klarert organer (iDISCO / iDISCO +)10,11. Imidlertid fettvev presenterer en spesiell utfordring gitt sin høye nivå av lipider, og derfor ytterligere modifiseringer å iDISCO / iDISCO + protokollen kreves for å trekke fullt av lipider samtidig beskytte vevet sammen. Endret protokollen har vi utviklet, nå kalt Adipo-klare, sysselsetter metanol/diklormetan-baserte delipidation av fettvev å oppnå optimal åpenhet egnet for høy oppløsning volumetriske tenkelig12. Fordi delipidation går hovedsakelig slukker endogenously uttrykt fluorescerende proteiner som GFP og RFP, må visualisering av slike proteiner oppnås ved immunolabeling. Total, denne enkel og robust protokollen kan brukes for å studere vev-nivå organiseringen av liggende under adipose-resident celler, avstamning sporing av adipocyte stamfar celler og adipose morphogenesis under utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr omsorg og eksperimentering ble utført i henhold til prosedyrer godkjent av dyr institusjon og bruk komiteen ved Rockefeller University.
1. vev forberedelse
- Utføre standard intracardiac perfusjon med ~ 20 mL 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) i 4 ° C til blodet er helt fjernet fra vevet.
- Bytt til perfusate til ~ 20 mL etappe, den stabiliserende løsning (4% paraformaldehyde (PFA) i 1 x PBS) på 4 ° C til halsen og halen har betydelig stivnet.
FORSIKTIG: PFA er giftig. Unngå kontakt med hud, øyne og slimhinner. Løsninger bør gjøres i avtrekksvifte. - Dissekere fett pads rundt nøye å fjerne hele fett pad uten å skade den. Bruke blunt endte tang for å unngå klemming eller klemme vevet. Unngå forurensende dissekert vevet med noen pels.
- Etter fikse vevet i 4% PFA i 1 x PBS overnatting på 4 ° C. For hver fett pad, etter-posisjonsavlesning med ~ 10 mL fiksering i et 15 mL konisk rør.
- Vask vevet 3 ganger (1 h hver) med 1 x PBS ved romtemperatur (RT).
- Lagre vev for kortsiktige (opp til 2 uker) i 1 x PBS på 4 ° C og beskyttet mot lyset. For langvarig lagring (f.eks1-2 år), bytte bufferen til 1 x PBS med 0,05% Natriumazid (som et konserveringsmiddel).
FORSIKTIG: Natriumazid er høylig giftig når inntatt muntlig eller absorberes gjennom huden. Konsentrert Natriumazid løsninger (på 5% eller større) skal håndteres under avtrekksvifte.
2. Delipidation og Permeabilization
Timing: 1-2 dager
- Forberede 20%, 40%, 60% og 80% metanol gradering med B1n buffer (tabell 1) (v/v), f.eksfor 20% metanol/B1n buffer, bland 20 mL av metanol og 80 mL B1n buffer. Lagre alle buffere på 4 ° C. Glysin krystaller vil utløse fra 60% og 80% metanol/B1n-buffere på grunn av metning. Unngå fjerne krystallene; bruke flytende løsningen for de følgende vasker.
FORSIKTIG: Metanol er flyktige, irriterende og brannfarlig. Unngå hud eller øyekontakt. - Forsiktig fjerne håret fra prøve under mikroskop disseksjon. Noen hår, lo eller rusk knyttet til prøven vil forårsake skygger under bildebehandling. Overføre renset prøven inn i et nytt rør.
- Utføre alle følgende på isen eller i 4 ° C med mindre annet er angitt. Bruk 2 mL microcentrifuge rør med 1,6 mL løsningen for små (f.eks, bakre subkutan/perigonadal fett pads fra små mager mus). Velg 5 mL rør med 4 mL løsningen for store prøver eller prøver med høye lipid innhold (f.eks, fett pads fra overvektige mus).
- Plassere rør som inneholder prøvene vannrett på en orbital shaker satt til ~ 100 rpm. Kontroller at prøvene kan bevege seg fritt inne i røret.
- Tørke eksemplet i en gradert rekke 20%, 40%, 60%, 80% og 100% metanol/B1n buffer for den angitte tid (tabell 2). Minimere bære-over løsningen.
- Delipidate prøven med 100% diklormetan (DCM) (3 ganger), hver med inkubering tiden angitt i tabell 2. Utvalget skal synke å bunnen av røret på slutten av de andre og tredje DCM vasker. Hvis ikke, forlenge inkubasjon tiden å sikre full delipidation (f.eksstrekker seg fra 30 minutter til 1-2 h).
FORSIKTIG: DCM skal håndteres i avtrekksvifte. Bruk Glassbeholdere for lagring og microcentrifuge rør som er laget av polypropylen for incubations. Microcentrifuge rør bør ikke brukes til langsiktig lagring av DCM. Petri retter og serologisk Pipetter som er laget av polystyren er ikke kompatibel med DCM. DCM er svært ustabilt. Overføre prøven i frisk løsning raskt for å hindre uttørking. - Vask to ganger med 100% metanol for den angitte tid (tabell 2).
- Valgfritt: Hvis prøven ikke er godt perfused, fargen på hemoglobin fra de gjenværende røde blod cellene kan føre til sterk autofluorescence. Bleach med 5% H2O2 i metanol (1 volum av 30% H2O2 til 5 volumer av metanol) natten på 4 ° C.
- Rehydrate eksemplet i en tilbakeført metanol/B1n buffer serie: 80%, 60%, 40%, 20% metanol/B1n og 100% B1n buffer (2 ganger) for den angitte tid (tabell 2).
- Vask prøven med PTxwH buffer (tabell 1) 2 h på RT.
- Lagre delipidated prøven i PTxwH buffer på 4° C (opptil 1 år) eller videre umiddelbart til immunostai-trinn.
3. hele Mount immunostai-
Timing: 8-10 dager
Merk: Alle følgende trinn skal utføres på RT Hvis ingenting annet, med risting og beskyttelse mot lyset. For små bruk 2 mL microcentrifuge rør med 1,6 mL. For store prøver, bruk 5 mL rør med 4 mL. Det anbefales å validere antistoffer på små biter av vev eller metanol-behandlet vev deler.
- Fortynne det primære antistoffet PTxwH buffer anbefalte konsentrasjonen. Sentrifuge utvannet antistoff løsningen på ~ 20 000 x g i 10 min å forhindre introdusere antistoff precipitates eller samlinger.
- Inkuber delipidated prøven med den primære antistoff løsningen for den angitte tid (tabell 2).
- Vaske prøven med PTxwH buffer i en rekke inkubasjon trinn: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 time, 2 timer, 4 h og overnatting.
- Fortynne det sekundære antistoffet PTxwH buffer anbefalte konsentrasjonen. Sentrifuge utvannet antistoff løsningen på ~ 20 000 x g i 10 min å forhindre introdusere antistoff precipitates eller samlinger.
Merk: For å unngå høy bakgrunn forårsaket av vev autofluorescence, sekundær antistoffer konjugert med fluorophores som sender ut lys i de røde og langt rødt anbefales. Hvor mange laser linjer på et mikroskop, kan opptil 3-4 markører avbildes samtidig i ett utvalg. - Inkuber prøven med sekundær antistoff løsning for den angitte tid (tabell 2).
- Vask utvalg med PTxwH buffer i en rekke inkubasjon trinn: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 time, 2 timer, 4 h og overnatting.
- Valgfritt: For vev typer som er skjøre, fikse farget vevet med 4% PFA i 1 x PBS overnatting på 4 ° C for å bevare vev morfologi.
Merk: Dette trinnet kan øke tenkelig bakgrunn. Det er ikke nødvendig å utføre dette trinnet for fettvev. - Vaske prøven med 1 x PBS i en rekke inkubasjon trinn: 5 min, 10 min og 30 min.
- Forsiktig fjerne lo fra prøve under mikroskop disseksjon.
4. vev Clearing
Timing: 1-2 dager
- Valgfritt: Bygge inn prøven i agarose å lette eksempel montering for lys arks mikroskopi.
Merk: Dette trinnet er sterkt anbefalt for fettvev å stabilisere sin form under bildebehandling.- Forberede innebygging løsningen med 1% agarose i 1 x PBS (w/v). Cool innebygging løsningen ~ 40 ° C for å unngå å utsette prøven overdreven varme.
- Plasser renset prøven i mold (f.eks, Petriskål eller veier båt) og ordne det til ønsket plassering. Unngå alle flytende carryover. Forsiktig hell innebygging løsningen over utvalget. Unngå eventuelle luftbobler.
- La agarose fullt stivne RT. kutt ut en blokk med prøven.
Merk: Alle følgende inkludert overnatting incubations bør gjennomføres på RT, risting og beskyttelse mot lyset. For små bruk 2 mL microcentrifuge rør med 1,6 mL. For store prøver, bruk 5 mL rør med 4 mL.
- Tørke eksemplet i metanol gradering med H2O: 25%, 50%, 75% og 100% (3 ganger) for den angitte tid (tabell 2).
Merk: Utvalg kan stå over natten ved 100% metanol trinn. - Inkuber eksemplet i 100% DCM 1t med skjelvende (3 ganger). Eksempel skal synke å bunnen av røret på slutten av hver DCM vask. Hvis ikke, forlenge inkubasjon tiden å sikre fullstendig fjerning av metanol. Prøven kan stå over natten ved 100% DCM trinn.
- Inkuber eksemplet i dibenzyl Eter (DBE) over natten med mild risting for å oppnå brytningsindeks matchende.
Merk: Utvalg vil etterhvert bli gjennomsiktig i synlig lys.
FORSIKTIG: DBE er farlig. Unngå kontakt med hud. Håndtere det inne avtrekksvifte med dobbelt lag hansker. Kast hansker så snart det er forurenset med DBE. Bruk Glassbeholdere for lagring og microcentrifuge rør (polypropylen) for incubations. Microcentrifuge rør bør ikke brukes til langsiktig lagring av DBE. Petri retter og serologisk Pipetter som er laget av polystyren er ikke kompatibel med DBE. Rengjør alle søl med 100% etanol. - Inkuber prøven med fersk DBE med mild risting for 2 h. butikken utvalget på RT i mørket, eller gå direkte til bildebehandling.
Merk: Utvalg anbefales å avbildes innen en måned. Selv om visse fluorophores er mer stabile enn andre, anbefales ikke langtidsoppbevaring av eksemplene på dette stadiet.
5. mikroskopi
- Bildebehandling med lys arks mikroskop som er kompatibel med DBE.
Merk: Bare mål som er godkjent for organisk løsemiddelbaserte bildebehandling og matchet med brytningsindeks av DBE kan brukes som dipping mål i DBE-nedsenket bildebehandling.- Montere agarose-innebygd eksempler på en holder som kan hindre bevegelse under bildebehandling. Dyppe prøven i en DBE-fylte kammer.
- Samle en z-stabel dekker hele utvalget (f.eks, 1-2 X forstørrelse) å få hele-vev distribusjon/struktur av merket av interesse.
- Bytt til en objektiv med høyere forstørring (f.eks, 4-12 X forstørrelse) å zoome inn på områder av interesse for bilde detaljert strukturer.
Merk: Kollagen er en stor bidragsyter til den ekstracellulære matrisen av fettvev, som omgir alle fettceller13. Kollagen er et typisk utslipp spektrum alt rundt 400 nm 550 nm14. Imaging prøven med 488 laser linje (grønn) og samle slippes ut lyset på en bølgelengdeområde som ligger innenfor utslipp spektrum av kollagen (f.eks, 525-550 nm) vil gi vev autofluorescence signalet, som tidligere viste seg å avgrense fett celle kontur og generelle vev arkitektur12.
- Bildebehandling med en omvendt AC confocal eller to-fotonet mikroskop.
- Plass prøven agarose-innebygd i et kammer lysbilde med glass bunn uten å berøre noen plastdeler (eller andre DBE-kompatible tenkelig kammer som kan forsegle). Kontroller at DBE ikke lekke ut.
- Velg målene med lengre arbeide avstander å oppnå dypere penetrasjon.
Merk: Bildebehandling bør gjøres med en invertert AC confocal eller to-fotonet mikroskop gjennom glass bunnen av kammeret lysbildet. Unngå direkte kontakt mellom prøven og dyppe målene som ikke foreslås for DBE-basert bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adipo-klare forberedt hele fett pads kan avbildes i 3D analysere hvordan vev morfologi og cellular interaksjoner påvirkes i mager og overvektige statene. Denne metoden kan lett brukes for å analysere generelle adipose strukturen ved å samle vev autofluorescence signalet i den grønne kanalen. Vi har tidligere vist at autofluorescence signal i adipose overlegg gunstig med perilipin flekker, en vanlig markør skissere moden adipocytter12. Skanning en bakre subkutant fett pad (psWAT) bruker lys arks mikroskop med lav forstørrelse (1,3 X) viser for eksempel lobular organiseringen av adipocytter (figur 1A og B). Mer detaljert informasjon, for eksempel størrelsen på adipocytter, kan vises ved å zoome inn i regioner av interesse med høyere forstørrelse (4 X) (figur 1 c og D).
Adipo-klare er spesielt nyttig for å visualisere trådformede strukturer som nerve anslag og blodkar, noe som er vanskelig å fange eller spor på tynne snitt. Det sympatiske nervesystemet (SNS) spiller en avgjørende rolle i å kontrollere lipolyse og termogenesis i fettvev4,5. Imaging en psWAT blokk med tyrosin hydroksylase (TH), avslører en markør for SNS, strukturene som vises som store nerve bunter, blodkar gir, samt tett terminal arborization i vev parenchyma (figur 2A-H). I tillegg viser TH + parenchymal anslagene regionale variasjon innen psWAT, med lysken delen har høyere tetthet i forhold til den dorsolumbar delen (figur 2E-H; Sekvenser komplementære filmen 1). Våre tidligere arbeid har vist at SNS terminal arborization kan spores beregningsmessig og på nytt ved hjelp av verktøyet FilamentTracer Imaris programvare for å vurdere tettheten av innervering12.
Fettvev er kjent for å være sterkt Stangeriaceae. Endringene i metabolsk krav til liggende under adipose er ofte forbundet med dynamisk remodeling sin blodkar6,7. Robust og rapid profilering av hele-vev blodkar kan gi ytterligere objektiv analyse for blod fartøy remodeling. Bruker Platederivert endothelial celle vedheft molekyl (PECAM-1, også kjent som CD31) som en markør på etiketten blodkar, observerte vi at alle adipocytter er i kontakt med kapillærene gjennom hele vev (figur 3A-H; Supplerende Movie 2), støtter den høye etterspørselen etter effektiv næringsstoffet og oksygen utveksle i liggende under adipose.
Immunceller er en annen viktig del av fettvev. I overvektige staten, blir fettvev betent, som er ledsaget av infiltrasjon av pro-inflammatoriske makrofager som danner "kronen-like" strukturer rundt døde adipocytter15,16. Fett pads fra overvektige dyr er spesielt vanskelig å fjerne sine store og høyere lipid innhold. Den utvidede versjonen av Adipo-klare (beskrevet i tabell 2 store vev eller vev med høyt fettinnhold) kan imidlertid oppnå konsekvent clearing av hele høy-fett-laden vev. For eksempel viser epididymal fett fra mus fed med 16 uker av fettrikt kosthold tett "kronen-lignende strukturer", immunolabeled av CD68, gjennom hele vev (figur 4A og B). Viktigere, optisk seksjoner tatt fra ulike stillinger over hele dybden av vev (~ 4-5 mm) viser like skarpe bilder, demonstrere komplett clearing av vev (figur 4C-F).
Figur 1: analyse av fettvev morfologi bruker autofluorescence signalet. Alle paneler er lett ark fluorescens mikroskopi (LSFM) bilder av en Adipo-klar forberedt psWAT pad isolert fra en 8-uke-gamle C57Bl/6J mannlige mus plassert på RT. Autofluorescence signalet samles av skanning ryddet prøven med den grønne kanalen. Optisk deler (tverrsnitt fra midten av prøven) dorsolumbar regionen (A) og lysken regionen (B) tatt av 1,3 X mål. (C, D) Høy forstørrelse (4 X) optisk deler av innrammede områdene fra A og B. Lymfeknuter er angitt med stjerner. Skala barer angis i hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: 3D imaging av sympatiske gir i fettvev. Alle paneler er LSFM bilder av en psWAT merket med tyrosin hydroksylase (TH) (samme eksemplet i figur 1). Maksimal anslag rekonstruert dorsolumbar regionen (A) og lysken område (B) tatt av 1,3 X målet. (C, D) Optisk deler fra midten av A og B. (E, F) Høy forstørrelse (4 X) optisk deler av innrammede områdene fra C og D. (G, H) Høy forstørrelse optisk deler av overlappingen mellom TH (grønn) og autofluorescence (rosa). Pilspisser angi ulike mønstre for sympatisk innervering: (1) nerve bundle; (2) blod fartøy gir; (3) parenchymal arborization. Lymfeknuter er angitt med stjerner. Skala barer angis i hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: 3D imaging av blodårer i fettvev. Alle paneler er LSFM bilder av en CD31 kalt psWAT (samme eksemplet i figur 1). (A, B) Maksimal anslag rekonstruert dorsolumbar regionen (A) og lysken område (B) tatt av 1,3 X målet. (C, D) Optisk deler fra midten av A og B. (E, F) Høy forstørrelse (4 X) optisk deler av innrammede områdene fra C og D. (G, H) Høy forstørrelse optisk deler av overlappingen mellom CD31 (rød) og autofluorescence (cyan). Lymfeknuter er angitt med stjerner. Skala barer angis i hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: 3D-bildebehandling av "kronen-lignende strukturer" i fettvev. Alle paneler er LSFM bilder av en Adipo-klar forberedt eWAT pad isolert fra en mannlig mus matet med høyt fettinnhold i 16 uker. Utvalget var immunolabeled med CD31 og CD68. (A, B) Maksimal anslag på rekonstruert utvalget med en total dybde på mer enn 4 mm. (A) XY visning. (B) Y-Z-visningen. (C-F) Optisk deler fra angitte dypet i B. Skala barer angis i hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer | Kjemisk | Siste konsentrasjon |
| B1n buffer | ||
| Glysin | 0,3 M | |
| Triton X-100 | 0,1% (v/v) | |
| H2O | Løsemiddel | |
| Natriumazid (bevaring, valgfritt) | 0,01% (w/v) | |
| Justere pH 7 med NaOH | ||
| PTxwH buffer | ||
| 10 x PBS | 1 x | |
| Triton X-100 | 0,1% (v/v) | |
| Tween-20 | 0,05% (v/v) | |
| Heparin | 2 µg/ml | |
| H2O | Løsemiddel | |
| Natriumazid (bevaring, valgfritt) | 0,01% (w/v) |
Tabell 1: liste over buffere og løsninger. Denne tabellen inneholder oppskrifter for bufferne brukes i Adipo-klare. For langtidslagring av bufferne anbefales det å legge Natriumazid som et konserveringsmiddel.
| Buffer | Liten vev | Store vev (eller med høyt fettinnhold) | Temperatur |
| 20% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 80% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100% metanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 1 h | 2-3 h eller overnatting | 4° C |
| DCM | 30 min | 2 h | 4° C |
| 100% metanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100% metanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| Valgfritt: 5% H2O2/methanol | Overnatting | Overnatting | 4° C |
| 80% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 20% metanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| B1n buffer | 30 min | 1 h | RT |
| B1n buffer | Overnatting | Overnatting | RT |
| PTxwH buffer | 2 h | 2 h | RT |
| PTxwH buffer | Lagring | Lagring | 4° C |
| Primære antistoff inkubasjon | 3 dager | 4-5 dager | RT |
| Sekundær antistoff inkubasjon | 3 dager | 4-5 dager | RT |
Tabell 2: inkubasjon tider for delipidation og immunostai-. Denne tabellen inneholder inkubasjon ganger delipidation og immunostai-trinnene av protokollen. Omtrentlig vekten av liten vev er < 300 mg.
Supplerende film 1: 3D imaging av sympatiske gir i fettvev. Tyrosin hydroksylase (TH) immunostaining i en psWAT utvalg (samme som i figur 2). Filmen viser den gli gjennom optisk deler (4 X fra dorsolumbar) og lysken regioner av psWAT, med en total dybde på ~ 2 mm. TH vises i grønt. Autofluorescence vises i magenta. Regionen fra delen dorsolumbar synes å ha lavere SNS tetthet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Movie 2: 3D imaging av blodkar i fettvev. CD31 immunostaining i en psWAT utvalg (samme som i Figur 3). Filmen viser den gli gjennom optisk deler (4 X fra dorsolumbar) og lysken regioner av psWAT, med en total dybde på ~ 2 mm. CD31 vises i rødt. Autofluorescence vises i cyan. Alle adipocytter synes å være tett omgitt av kapillærer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipo-Clear er en enkel og robust metode for å fjerne fettvev, som lett kan utføres i en vanlig laboratorium setup. I forhold til andre løsemiddelbaserte clearing metoder som iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo klart er spesielt optimalisert for sletting av fettvev og andre vev med høyt fettinnhold. Delipidation trinnet fjerner fullstendig lipider fra liggende under adipose, og dermed muliggjør immunolabeling gjennom hele vevet og i stor grad reduserer lyse scatter, tillater ende-til-ende tenkelig uten tap av XY oppløsning. I tillegg til lys arks fluorescens kan mikroskoper, som gir rask skanning av store vev, AC confocal og to-fotonet mikroskoper også brukes til å få høyere oppløsning og mer.
Metanol/DCM-baserte delipidation er en avgjørende skritt. Utilstrekkelig delipidation kan medføre uskarpe bilder, spesielt mot kjernen av vev. Det er viktig å sikre fullstendig fjerning av lipider ved å observere adipose prøver synker i DCM. Eksemplene inneholder en blanding av vev (f.eks, epididymal fett med bitestikkel og testikkel knyttet) kan ikke fullstendig synke selv med utvidet DCM incubations. Imidlertid skal rugende prøvene overnatter i DCM oppnå komplett delipidation. Denaturering av proteiner i disse organiske løsemidler, kanskje visse antistoffer ikke er kompatibelt med delipidation trinn. Derfor blir velger en passende antistoffer et avgjørende skritt for denne protokollen. Det anbefales å validere antistoffer metanol-behandlet vev deler eller små biter av vev behandles av Adipo-klare. På samme måte bør kompatibiliteten til kjemiske fargestoffer med metanol/DCM/DBE også testes før programmet.
En begrensning av protokollen er slukke av endogenously uttrykt fluorescerende proteiner. Organisk løsemiddelbaserte delipidation og clearing skritt denature i stor grad slike proteiner. For å visualisere endogene fluorescerende proteiner, må antistoff merking være ansatt. Tilgjengeligheten av egnet antistoff kombinasjoner begrenser muligheten til å utføre svært multiplekset imaging. De gjeldende tilgjengelige lys arks mikroskop bare tillater oss å bilde til 4 kanaler.
Adipo-klare er spesielt nyttig for å visualisere trådformede strukturer og celle populasjoner har relativt lav tetthet i fettvev. Men blir imaging tett signaler begrenset med denne tilnærmingen. Når antistoffer brukes til å merke tett signaler, kan de være sequestered av epitoper som ligger på overflaten av prøven, blokkerer tilgang til vev interiøret. Derfor anbefales liten kjemiske sonder stain tett strukturer. På grunn av det samme problemet begrenses bruken av Adipo-klare til brun fettvev. Brown fett er en adipose depot med tett strukturer. Kompakt blodfartøyer og nerve gir, er det også tett pakket med små adipocytter som inneholder et stort antall mitokondrier17. Når du bruker CD31 og TH var flekker med samme prosedyre som beskrevet ovenfor til brown fett, bare overflaten av prøven merket (data ikke vist). Videre produserer brown fett sterk vev autofluoresence, fører til lav signal-til-støy-forhold under bildebehandling. Det anbefales å kutte brown fett i mindre biter og bruke kjemiske sonder når mulig.
Samlet Adipo-klare tillater samtidig profilering av flere strukturer rundt med høy oppløsning i hele fettvev. Bruke denne metoden, kan en analysere hvordan strukturer som nerve anslag, blodkar, immunceller og adipocytter sammen i hele fat puten. Det gir upartisk bildebehandling data ved å unngå snittemetode eller velge områder av interesse. Adipo-klare kan også brukes for å studere adipose utvikling som hendelser tidlig morphogenesis i tillegg til distribusjon av adipocyte stamfar og forløper celler i avstamning sporing studier. I tillegg til liggende under adipose, kan Adipo klart også lette 3D hele-mount analyse av andre vev som har høy lipid innhold eller er omgitt av fett, som melkekjertlene og fet lymfeknute. Denne metoden tilbyr også en mulighet til å studere histology av menneskelig fettvev fysiologiske og patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Christina Pyrgaki Tao Tong og Alison North fra Ressurssenter Bioimaging ved Rockefeller University for hjelp og støtte. Vi takker også Xiphias Ge Zhu for film redigering. Dette arbeidet ble støttet av den menneskelige Frontier vitenskap Program organisasjon (PC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
