Summary
På grund av den höga fetthalten, har fettvävnad utmanande för att visualisera med traditionella histologiska metoder. Adipo-Clear är en vävnad som clearing teknik som gör robusta märkning och högupplösta volymetriska fluorescerande avbildning av fettvävnad. Här, beskriver vi metoderna för provberedning, förbehandling, färgning, clearing och montering för avbildning.
Abstract
Fettvävnad spelar en central roll i energi homeostas och värmereglering. Den består av olika typer av adipocyter, liksom fettceller prekursorer, immunceller, fibroblaster, blodkärl och nerv prognoser. Även om molekylär kontroll av cell typ specifikation och hur dessa celler interagerar har varit alltmer avgränsas, kan en mer omfattande förståelse av dessa adipose boförälder celler uppnås genom att visualisera deras distribution och arkitektur hela hela vävnaden. Befintliga immunohistokemi och immunofluorescens metoder att analysera fett histologi lita på paraffin-inbäddat tunnslip. Tunnslip fångar dock endast en liten del vävnad; som ett resultat, kan slutsatser vara partisk av vilken del av vävnad analyseras. Därför har vi utvecklat en fettvävnad som clearing teknik, Adipo-klar, för att tillåta omfattande tredimensionell visualisering av molekylära och cellulära mönster i hela fettvävnad. Adipo-Clear var anpassad från iDISCO / iDISCO +, med särskilda modifikationer gjorts att helt ta bort den lipid lagras i vävnaden samtidigt som infödda vävnad morfologi. I kombination med ljus ark fluorescensmikroskopi visar vi här användningen av metoden Adipo-klar att få högupplösta volymetriska bilder av en hela fettvävnad.
Introduction
Tills nyligen, tänktes fettvävnad av som en amorf samling av fettceller. Under de senaste decennierna vuxit vår förståelse mer sofistikerade, med fett nu erkänts vara ett komplext organ som innehåller olika typer av adipocyter, liksom fettceller prekursorer, immunceller, fibroblaster, kärlsystemet och nerv prognoser. Interaktioner bland dessa adipose boförälder celler har uttalad påverkan på fettvävnad och organismers fysiologi och patofysiologi1. Även om nya studier har unraveled viktiga molekylära mekanismer bakom vissa interaktioner, kräver en mer omfattande förståelse tillförlitlig strukturella profilering av hela vävnad i tre dimensioner (3D).
Vår nuvarande kunskap om fettvävnad morfologi är till stor del baserad på histologisk analys av tunnslip (5 μm) med relativt hög förstoring bildhantering (mer än 10 X)2,3. Detta tillvägagångssätt har dock flera betydande begränsningar. Första, intrikata trådformiga strukturer såsom sympatiska nerver och kärlsystemet, som är känd för att spela viktiga roller i fett funktion4,5,6,7, är svårt att utvärdera genom tunna sektioner. Andra, på grund av dess till synes amorf form och avsaknaden av representativa strukturella enheter att fokusera på, det är svårt att uppskatta adipose vävnad strukturer utifrån endast avsnitt färgning. Tredje har fettvävnaden en mycket höga fetthalten, skapar utmaningar att få konsekvent seriell sektioner som är lämpliga för 3D anatomiska rekonstruktion, en konventionell metod som används för att studera hela hjärnan morfologi8. Tanke på dessa faktorer, finns det ett stort behov av en hela-mount-strategi som kan ge 3D visualisering av en hela fett depot samtidigt fortfarande uppnå cellulära upplösning.
3D volymetriska bildbehandling av hela organ är utmanande på grund av ljusspridning skymmande. En stor källa av ljusspridning i biologiska vävnader kommer från lipid-aqueous gränssnitt. Även om ansträngningar att eliminera scatter genom att ta bort lipider har pågått för över ett sekel, har förekommit ett stort antal senaste innovationer9. En sådan nyutvecklade vävnad-clearing metod är immunolabeling-aktiverade 3D imaging av lösningsmedel-godkänt organ (iDISCO / iDISCO +)10,11. Fettvävnad presenterar emellertid en särskild utmaning med tanke på dess höga lipider, och därför ytterligare ändringar i iDISCO / iDISCO + protokoll krävs fullt extrahera lipider samtidigt skydda vävnaden från att kollapsa. Det ändrade protokollet har vi utvecklat, nu kallas Adipo-klar, sysselsätter metanol/diklormetan-baserade delipidation av fettvävnad att uppnå optimal öppenhet lämplig för högupplösta volymetriska imaging12. Eftersom delipidation steg till stor del släcker endogenously uttryckt fluorescerande proteiner som GFP och RFP, måste visualisering av sådana proteiner uppnås genom immunolabeling. Övergripande, detta enkel och robust protokoll kan användas för att studera vävnad-nivå organisation av adipose boförälder celler, lineage tracing fettceller stamceller och fett morfogenes under utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård och experiment utfördes enligt förfaranden som godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid Rockefeller University.
1. vävnad förberedelse
- Utför vanliga intrakardiellt perfusion med ~ 20 mL av 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ° C tills blodet bort helt från vävnaden.
- Växla i perfusatet ~ 20 ml av fixativ lösning (4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS) vid 4 ° C tills den hals och svans har betydligt stelnade.
Varning: PFA är giftiga. Undvik kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Lösningar bör göras i dragskåp. - Dissekera de fett kuddar sevärdheter noggrant för att ta bort hela fettet pad utan att skada den. Använd blunt-slutade pincett för att undvika nypa eller klämma vävnaden. Undvik att förorena dissekerade vävnaden med någon päls.
- Efter fixa vävnaden i 4% PFA i 1 x PBS över natten vid 4 ° C. För varje fett pad, efter korrigering med ~ 10 mL fixering lösning i en 15 mL koniska rör.
- Tvätta vävnaden 3 gånger (1 h varje) med 1 x PBS vid rumstemperatur (RT).
- Lagra vävnaden för kortsiktiga (upp till 2 veckor) i 1 x PBS vid 4 ° C och skyddas från ljus. För långsiktig lagring (t.ex., 1-2 år), byta bufferten till 1 x PBS med 0,05% natriumazid (som konserveringsmedel).
Varning: Natriumazid är mycket giftiga när intas oralt eller absorberas genom huden. Koncentrerad natriumazid lösningar (5% eller högre) bör hanteras i dragskåp.
2. Delipidation och permeabilisering
Timing: 1-2 dagar
- Förbereda 20%, 40%, 60% och 80% metanol övertoning med B1n buffert (tabell 1), (v/v), t.ex., för 20% metanol/B1n buffert, blanda 20 mL metanol och 80 mL B1n buffert. Lagra alla buffertar vid 4 ° C. Glycin kristaller kommer fällningen från 60% och 80% metanol/B1n buffertar på grund av mättnad. Undvika att ta bort kristaller; Använd flytande lösning för de följande tvättarna.
Varning: Metanol är flyktiga, irriterande och brandfarliga. Undvika hud- eller ögonkontakt. - Ta försiktigt bort håret från provet i Mikroskop för dissektion. Alla hår, ludd eller skräp som bifogas provet kommer att orsaka skuggor under imaging. Över rengjorda provet till en ny tub.
- Utför alla följande steg på is eller vid 4 ° C om inte annat anges. För små prover (t.ex., bakre subkutan/perigonadal fett kuddar från unga lean möss), Använd 2 mL mikrocentrifugrör med 1,6 mL av lösningen. Använd 5 mL rör med 4 mL av lösningen för stora prover eller prov med höga fetthalten (t.ex., fett kuddar från feta möss).
- Placera rören som innehåller proverna horisontellt i orbitalskak på ~ 100 rpm. Kontrollera att proverna kan röra sig fritt inuti röret.
- Torkar ut provet i en graderad serie 20%, 40%, 60%, 80% och 100% metanol/B1n buffert för den angivna tid (tabell 2). Minimera förädlingsstöd lösningen.
- Delipidate provet med 100% diklormetan (DCM) (3 gånger), vart med inkubationstiden anges i tabell 2. Provet bör sjunka till botten av röret i slutet av de andra och tredje DCM tvättarna. Om inte, förlänga inkubationstiden att säkerställa full delipidation (e.g., sträcker sig från 30 min till 1-2 h).
FÖRSIKTIGHET: DCM bör hanteras i dragskåp. Använd glasbehållare för lagring och mikrocentrifug rör som är gjorda av polypropylen för inkubationer. Mikrocentrifugrör bör inte användas för långsiktig lagring av DCM. Petriskålar och serologiska pipetter som är gjorda av polystyren är inte kompatibla med DCM. DCM är mycket volatila. Över provet till färsk lösning för snabbt för att förhindra uttorkning. - Tvätta två gånger med 100% metanol för den angivna tid (tabell 2).
- Valfritt: Om provet inte är väl perfunderade, färgen på hemoglobin från de kvarvarande röda blodkropparna kan orsaka stark autofluorescens. Blekmedel med 5% H2O2 i metanol (1 volym 30% H2O2 till 5 volymer metanol) över natten vid 4 ° C.
- Rehydrera provet i en omvänd metanol/B1n buffert serie: 80%, 60%, 40%, 20% metanol/B1n och 100% B1n buffert (2 tider) för den angivna tid (tabell 2).
- Tvätta provet med PTxwH buffert (tabell 1) för 2 h på RT.
- Lagra delipidated provet i PTxwH buffert vid 4° C (upp till 1 år) eller fortsätta direkt till immunfärgning steg.
3. hela Mount immunfärgning
Timing: 8-10 dagar
Obs: Alla följande steg bör utföras på RT om inget annat anges, med skakningar och skydd från ljus. För små prover, Använd 2 mL mikrocentrifugrör med 1,6 mL lösning. För stora prover, Använd 5 mL rör med 4 mL lösning. Det rekommenderas att först validera antikropparna på små bitar av vävnad eller metanol-behandlade vävnadssnitt.
- Späd den primär antikroppen i PTxwH buffert i rekommenderade koncentrationen. Centrifugera lösningen utspädd antikropp vid ~ 20 000 x g i 10 min till förhindra införande antikropp fällningar eller aggregeringar.
- Inkubera delipidated provet med primär antikropp lösningen för den angivna tid (tabell 2).
- Tvätta provet med PTxwH buffert i en serie av inkubationsstegen: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h och övernattning.
- Späd den sekundära antikroppen i PTxwH buffert i rekommenderade koncentrationen. Centrifugera lösningen utspädd antikropp vid ~ 20 000 x g i 10 min till förhindra införande antikropp fällningar eller aggregeringar.
Obs: För att undvika hög bakgrund orsakas av vävnad autofluorescens, sekundära antikroppar konjugerat med fluorophores som avger ljus i rött och mån regioner rekommenderas. Beroende på antalet laserlinjerna tillgänglig på ett mikroskop, kan upp till 3-4 markörer avbildas samtidigt i ett prov. - Inkubera provet med sekundär antikropp lösningen för den angivna tid (tabell 2).
- Tvätta provet med PTxwH buffert i en serie av inkubationsstegen: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h och övernattning.
- Valfritt: För vävnadstyper som är ömtåliga, fixa färgade vävnaden med 4% PFA i 1 x PBS övernattning på 4 ° C för att bevara vävnad morfologi.
Obs: Detta steg kan öka imaging bakgrund. Det är inte nödvändigt att utföra detta steg för fettvävnad. - Tvätta provet med 1 x PBS i en serie av inkubationsstegen: 5 min, 10 min och 30 min.
- Ta försiktigt bort ludd från provet i Mikroskop för dissektion.
4. vävnad Clearing
Timing: 1-2 dagar
- Valfritt: Bädda in provet i agaros att underlätta prov montering för ljus ark mikroskopi.
Obs: Detta steg rekommenderas starkt för fettväv att stabilisera sin form under imaging.- Bered den bädda med 1% agaros i 1 x PBS (w/v). Cool inbäddning lösningen på ~ 40 ° C att undvika att utsätta provet för överdriven värme.
- Placera rengjorda provet i en form(t expetriskål eller väger båten) och ordna den till önskad position. Undvik alla flytande överföring. Häll försiktigt inbäddning lösningen över provet. Undvika eventuella luftbubblor.
- Låt Agarens fullt stelna på RT. skära ut ett block som innehåller provet.
Obs: Alla följande steg inklusive övernattning inkubationer bör utföras på RT, med skakningar och skydd från ljus. För små prover, Använd 2 mL mikrocentrifugrör med 1,6 mL lösning. För stora prover, Använd 5 mL rör med 4 mL lösning.
- Torkar ut provet i metanol övertoning med H2O: 25%, 50%, 75% och 100% (3 gånger) för den angivna tid (tabell 2).
Obs: Provet kan lämnas över natten vid 100% metanol steg. - Inkubera provet i 100% DCM för 1 h med skakningar (3 gånger). Provet bör sjunka till botten av röret i slutet av varje DCM tvätt. Om så inte är fallet, förlänga inkubationstiden att säkerställa fullständig borttagning av metanol. Prov lämnas över natten vid 100% DCM steg.
- Inkubera provet i dibensyl eter (DBE) över natten med mild skakar för att uppnå brytningsindex matchande.
Obs: Urvalet så småningom blir genomskinlig i synligt ljus.
Varning: DBE är farliga. Undvika kontakt med hud. Hantera det inuti ett dragskåp med dubbla lager handskar. Kasta handskarna så snart det är förorenat med DBE. Använd glasbehållare för lagring och mikrocentrifug rör (polypropen) för inkubationer. Mikrocentrifugrör bör inte användas för långsiktig lagring av DBE. Petriskålar och serologiska pipetter som är gjorda av polystyren är inte kompatibla med DBE. Ren eventuella spill med 100% etanol. - Inkubera provet med färska DBE med mild skakar för 2 h. Store provet vid RT i mörkret eller fortsätta direkt till imaging.
Obs: Prover rekommenderas att avbildas inom en månad. Även om vissa fluorophores är stabilare än andra, rekommenderas inte långsiktig lagring av proverna i detta skede.
5. mikroskopi
- Imaging med ljus ark Mikroskop som är kompatibel med DBE.
Obs: Endast mål som är godkända för organiska lösningsmedel-baserade imaging och matchas med brytningsindex för DBE kan användas som doppning mål i DBE-nedsänkt imaging.- Montera agaros-embedded provet på en hållare som kan förhindra rörelse under imaging. Fördjupa provet i en DBE-fyllda kammare.
- Samla en z-stack som täcker hela provet (t.ex., 1-2 X förstoring) att få hela-vävnad/distributionsstruktur markörens sevärdheter.
- Växla till ett objektiv med högre förstoring (t.ex., 4-12 X förstoring) zooma in på regionerna av intresse för bild detaljerade strukturer.
Obs: Kollagen är en stor bidragsgivare till den extracellular matrisen av fettvävnad, som omger alla fettceller13. Kollagen har en typisk emissionsspektrum som sträcker sig runt 400 nm till 550 nm14. Imaging provet med 488 laserlinjen (grön) och samla det utsända ljuset på ett våglängdsområde som ligger inom emissionsspektrum av kollagen (t.ex., 525-550 nm) kommer att ge signalen vävnad autofluorescens, vilken var tidigare visat att avgränsa fettceller kontur och övergripande vävnad arkitekturen12.
- Imaging med en inverterad confocal eller två-foton Mikroskop.
- Placera agaros-embedded provet i en kammare bild med glas botten utan att vidröra någon plast-delar (eller andra DBE-kompatibel imaging kammare som kan täta). Kontrollera DBE inte läcker.
- Välj syftet med längre arbeta avstånd att uppnå djupare penetration.
Obs: Imaging bör göras med en inverterad confocal eller två-foton Mikroskop genom glas botten av kammaren bilden. Undvik direkt kontakt mellan provet och doppa mål som inte föreslås för DBE-baserad avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adipo-Clear förberett hela fett kuddar kan avbildas i 3D för att analysera hur vävnad morfologi och cellulära interaktioner påverkas i lean- och överviktiga. Denna metod kan lätt användas för att analysera allmänna fett struktur genom att samla vävnad autofluorescens signalen i den gröna kanalen. Vi har tidigare visat att autofluorescens signal i fett överlägg gynnsamt med perilipin färgning, en vanligen Använd markör att beskriva mogen adipocyter12. Skanna en bakre subkutana fett pad (psWAT) med ljus ark Mikroskop med låg förstoring (1,3 X) visar exempelvis lobulär organisationen av adipocyter (figur 1A och B). Mer detaljerad information, exempelvis storleken på adipocyter, kan avslöjas genom att zooma in i regionerna av intresse med högre förstoring (4 X) (figur 1 c och D).
Adipo-Clear är särskilt användbart för att visualisera trådformiga strukturer såsom nerv prognoser och blodkärl, som är utmanande att fånga eller spårning på tunnslip. Det sympatiska nervsystemet (SNS) spelar en avgörande roll i att kontrollera lipolys och thermogenesis i fettvävnad4,5. Imaging en psWAT pad färgas med tyrosin hydroxylas (TH), avslöjar en markör för SNS, de strukturer som visas som stora nerv buntar, blodkärl innervation samt tät terminal arborization i parenkymet vävnad (figur 2A-H). Dessutom visar de TH + parenkymal prognoserna regionala variationer inom psWAT, med inguinal portion med högre densitet i förhållande till den dorsolumbar delen (figur 2E-H; Kompletterande Movie 1). Vårt tidigare arbete har visat att SNS terminal arborization kan spåras beräkningsmässigt och rekonstrueras med verktyget FilamentTracer Imaris programvara för att bedöma tätheten av innervation12.
Fettvävnad är känt för att vara kraftigt vaskulariserad. Förändringar i metabola krav adipose förknippas ofta med dynamisk omdaning av dess vaskulatur6,7. Stabil och snabb profilering av hela-vävnad vaskulatur kan ge ytterligare opartisk analys för blodkärl remodeling. Där trombocyter endotelceller vidhäftning molekyl (PECAM-1, även känd som CD31) som markör på etiketten blodkärl, konstaterade vi att alla adipocyter är i kontakt med kapillärerna i hela hela vävnaden (figur 3A-H; Kompletterande Movie 2), stödja den höga efterfrågan på effektiva näringsämnen och syre utbyte i adipose.
Immunceller är en annan viktig del av fettvävnad. Feta skick, blir fettvävnad inflammerad, som medföljs av infiltrationen av pro-inflammatoriska makrofager som bildar ”crown-liknande” strukturer kring döda adipocyter15,16. Fett kuddar från feta djur är särskilt svåra att rensa tack vare sin stora storlek och högre fettinnehållet. Men, den utökade versionen av Adipo-Clear (beskrivs i tabell 2 för stor vävnad eller vävnad med hög fetthalt) kan uppnå konsekvent clearing av hela hög-fett-lastad vävnad. Epididymal fett från en mus som utfodrats med 16 veckor av fettrik kost visar exempelvis tät ”crown-liknande strukturer”, immunolabeled av CD68, hela hela vävnaden (figur 4A och B). Ännu viktigare, optiska delar tas från olika positioner över hela djupet av vävnaden (~ 4-5 mm) Visa lika skarpa bilder, visar komplett clearing av vävnad (figur 4 c-F).
Figur 1: analys av fettvävnad morfologi med av autofluorescens. Alla paneler är lätta blad fluorescence mikroskopi (LSFM) bilder av en Adipo-Clear beredda psWAT pad isolerade från en 8-vecka-gammal C57Bl/6J manliga mus inrymt på RT. Autofluorescens signalen samlas genom att skanna clearade provet med den gröna kanalen. Optiska delar (tvärsnitt från mitten av provet) av den dorsolumbar regionen (A) och regionen inguinal (B) fattas av 1,3 X-objektiv. (C, D) Hög förstoring (4 X) optiska delar av Regionkommittén boxed från A och B. Lymfkörtlar är markerade med asterisker. Skala barer anges i varje panel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: 3D imaging av sympatiska innervation i fettväv. Alla paneler är LSFM bilder av en psWAT märkt med tyrosin hydroxylas (TH) (samma prov enligt figur 1). Maximala projektioner av den rekonstruerade dorsolumbar regionen (A) och inguinal region (B) fattas av 1,3 X målet. (C, D) Optiska delar från mitten av A och B. (E, F) Hög förstoring (4 X) optiska delar av Regionkommittén boxed från C och D. (G, H) Hög förstoring optiska delar av överlägget mellan TH (grön) och autofluorescens (magenta). Pilspetsar visar distinkta mönster av sympatiska innervation: (1) nerv bunt; (2) blodkärl innervation; (3) parenkymal arborization. Lymfkörtlar är markerade med asterisker. Skala barer anges i varje panel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: 3D imaging av blodkärl i fettvävnaden. Alla paneler är LSFM bilder av en CD31 märkt psWAT (samma prov enligt figur 1). (A, B) Maximala projektioner av den rekonstruerade dorsolumbar regionen (A) och inguinal region (B) fattas av 1,3 X målet. (C, D) Optiska delar från mitten av A och B. (E, F) Hög förstoring (4 X) optiska delar av Regionkommittén boxed från C och D. (G, H) Hög förstoring optiska delar av överlägget mellan CD31 (röd) och autofluorescens (cyan). Lymfkörtlar är markerade med asterisker. Skala barer anges i varje panel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: 3D imaging ”crown-liknande strukturer” i fettväv. Alla paneler är LSFM bilder av en Adipo-Clear beredda eWAT pad isolerade från en manlig mus som matas med hög fett diet i 16 veckor. Provet var immunolabeled med CD31 och CD68. (A, B) Maximal prognoser av rekonstruerade provet med ett djup på mer än 4 mm. (A) X-Y Visa. (B) Y-Z view. (C-F) Optiska sektioner från angivna djupet i B. Skala barer anges i varje panel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert | Kemiska | Slutlig koncentration |
| B1N buffert | ||
| Glycin | 0,3 M | |
| Triton x-100 | 0,1% (v/v) | |
| H2O | Lösningsmedel | |
| Natriumazid (konserveringsmedel, tillval) | 0,01% (w/v) | |
| Justera pH till 7 med NaOH | ||
| PTxwH buffert | ||
| 10 x PBS | 1 x | |
| Triton x-100 | 0,1% (v/v) | |
| Tween-20 | 0,05% (v/v) | |
| Heparin | 2 µg/ml | |
| H2O | Lösningsmedel | |
| Natriumazid (konserveringsmedel, tillval) | 0,01% (w/v) |
Tabell 1: lista över buffrar och lösningar. Den här tabellen innehåller recept för buffertar används i Adipo-klart. För långsiktig lagring av buffertar rekommenderas det att lägga till natriumazid som konserveringsmedel.
| Buffert | Liten vävnad | Stor vävnad (eller med hög fetthalt) | Temperatur |
| 20% metanol/B1n buffert | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40% metanol/B1n buffert | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60% metanol/B1n buffert | 30 min | 1 h | 4° C |
| 80% metanol/B1n buffert | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100% metanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 1 h | 2-3 h, eller över natten | 4° C |
| DCM | 30 min | 2 h | 4° C |
| 100% metanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100% metanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| Tillval: 5% H2O2/methanol | Övernattning | Övernattning | 4° C |
| 80% metanol/B1n buffert | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60% metanol/B1n buffert | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40% metanol/B1n buffert | 30 min | 1 h | 4° C |
| 20% metanol/B1n buffert | 30 min | 1 h | 4° C |
| B1N buffert | 30 min | 1 h | RT |
| B1N buffert | Övernattning | Övernattning | RT |
| PTxwH buffert | 2 h | 2 h | RT |
| PTxwH buffert | Förvaring | Förvaring | 4° C |
| Primär antikropp inkubation | 3 dagar | 4-5 dagar | RT |
| Sekundära antikroppar inkubation | 3 dagar | 4-5 dagar | RT |
Tabell 2: inkubation gånger för delipidation och immunfärgning. Den här tabellen innehåller inkubationstider anvisningar om delipidation och immunfärgning av protokollet. Ungefärlig vikt små vävnad är < 300 mg.
Kompletterande film 1: 3D imaging av sympatiska innervation i fettväv. Tyrosin hydroxylas (TH) immunfärgning av ett psWAT prov (samma som i figur 2). Filmen visar den fly-through av optiska delar (4 X från dorsolumbar) och inguinal regioner av psWAT, med ett djup av ~ 2 mm. TH visas i grönt. Autofluorescens visas i magenta. Regionen från den dorsolumbar delen verkar ha lägre SNS densitet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Movie 2: 3D imaging av kärlsystemet i fettväv. CD31 immunfärgning av ett psWAT prov (samma som i figur 3). Filmen visar den fly-through av optiska delar (4 X från dorsolumbar) och inguinal regioner av psWAT, med ett djup av ~ 2 mm. CD31 visas i rött. Autofluorescens visas i cyan. Alla adipocyter verkar vara nära omgiven av kapillärer. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipo-Clear är en enkel och robust metod för clearing fettvävnad, som enkelt kan utföras i en vanlig labbet setup. I jämförelse med andra lösningsmedel-baserade röjningmetoder såsom iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear är särskilt optimerad för clearing fettvävnad och annan vävnad med hög fetthalt. Det delipidation steget tar bort helt lipider från adipose, och därför underlättar immunolabeling i hela hela vävnaden och i stor utsträckning minimerar ljusspridning, ger end-to-end imaging utan förlust av XY upplösning. Förutom ljus ark fluorescens kan Mikroskop, som ger snabb skanning av stora vävnad, confocal och två-foton Mikroskop också användas att få högre upplösning och mer detaljer.
Den metanol/DCM-baserade delipidation är ett viktigt steg. Otillräcklig delipidation kan resultera i suddiga bilder, särskilt mot kärnan i vävnaden. Det är viktigt att säkerställa fullständig borttagning av lipider genom att observera fett prover sjunka i DCM. De prover som innehåller en blandning av vävnadstyper (t.ex., spermamotilitet fett med bitestiklarna och testiklarna bifogas) kan inte helt sjunka även med utökade DCM inkubationer. Men bör ruvning dessa prover övernattning i DCM uppnå komplett delipidation. På grund av denaturering av proteinerna i dessa organiska lösningsmedel, kan vissa antikroppar inte är kompatibel med delipidation steg. Att välja en lämplig antikropp blir därför ett kritiskt steg för detta protokoll. Det rekommenderas att först validera antikropparna på metanol-behandlade vävnadssnitt eller små bitar av vävnad behandlas av Adipo-Clear. Likaså, kemiska färgämnen förenlighet med metanol/DCM/DBE bör också testas före applicering.
En begränsning i protokollet är den snabbkylning av endogent uttryckt fluorescerande proteiner. I organiska lösningsmedel-baserade delipidation och röjning steg denature till stor del sådana proteiner. För att visualisera endogena fluorescerande proteiner, måste antikroppar märkning vara anställd. Tillgången på lämpliga antikropp kombinationer begränsar förmågan att utföra mycket multiplexed imaging. Nuvarande tillgängliga ljus ark Mikroskopen endast tillåta oss till bild upp till 4 kanaler.
Adipo-Clear är särskilt användbart för att visualisera trådformiga strukturer och cellpopulationer som har relativt låg densitet i fettvävnad. Men blir imaging tät signaler begränsad med detta synsätt. När antikroppar används för att märka tät signaler, kan de vara binds av de epitoper som ligger på ytan av urvalet, blockering tillgång till vävnad interiören. Därför rekommenderas små kemiska sonder att färga täta strukturer. På grund av samma fråga begränsas tillämpningen av Adipo-Clear Brun fettvävnad. Brunt fett är ett fett depå med täta strukturer. Förutom tät blodkärl och nerver innervation, är den också tätt packad med små adipocyter som innehåller ett stort antal mitokondrier17. Vid tillämpningen av CD31 och TH var färgning med samma procedur som beskrivs ovan till brunt fett, bara ytan på provet märkt (inga data anges). Brunt fett producerar dessutom stark vävnad autofluoresence, leder till låg signal-brus-förhållande under imaging. Det rekommenderas att skära brunt fett i mindre bitar och använda kemiska sonder när det är möjligt.
Sammantaget Adipo-Clear tillåter samtidiga profilering av flera strukturer av intresse med högupplösta i hela fettvävnad. Med denna metod kan man analysera hur strukturer såsom nerv prognoser, kärlsystemet, immunceller och adipocyter interagera i hela fettet pad. Det ger opartisk imaging data genom att undvika snittning eller välja regioner av intresse. Adipo-Clear kan också användas för att studera fett utveckling såsom händelser under tidig morfogenes samt fördelningen av fettceller stamceller och föregångare celler i lineage tracing studier. Förutom fett, kan Adipo-Clear också underlätta 3D hela-mount analys av andra vävnader som har höga fetthalten eller omges av fett, såsom bröstkörteln och feta lymfkörtel. Denna metod erbjuder också en möjlighet att studera histologin av mänsklig fettvävnad i fysiologiska och patologiska förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Christina Pyrgaki, Tao Tong och Alison North från Bioimaging Resource Center på Rockefeller University för hjälp och stöd. Vi tackar också Xiphias Ge Zhu för filmredigering. Detta arbete stöds av Human Frontier Science Program organisation (PC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
