Summary
En raison de la teneur élevée en lipides, le tissu adipeux a été difficile à visualiser à l’aide des méthodes histologiques traditionnelles. Adipo-Clear est un tissu technique qui permet l’étiquetage robuste et une imagerie de fluorescence volumétrique du tissu adipeux de compensation. Nous décrivons ici les méthodes de préparation des échantillons, prétraitement, la coloration, la compensation et montage pour l’imagerie.
Abstract
Le tissu adipeux joue un rôle central dans l’homéostasie énergétique et la thermorégulation. Il est composé de différents types d’adipocytes, comme précurseurs adipocytaires, cellules immunitaires, fibroblastes, les vaisseaux sanguins et les projections nerveuses. Bien que le contrôle moléculaire de précision du type de cellule et de l’interaction de ces cellules ont été délimitées de plus en plus, une compréhension plus approfondie de ces cellules résidentes adipeux est possible en visualisant leur distribution et leur architecture tout au long du tissu entier. Approches existantes d’immunohistochimie et immunofluorescence pour analyser l’histologie adipeuse s’appuient sur des coupes minces de paraffine. Toutefois, des coupes minces ne capturent qu’une petite partie du tissu ; en conséquence, les conclusions peuvent être biaisées par quelle partie du tissu est analysée. Nous avons donc développé un technique de compensation Adipo-Clear, afin de permettre une visualisation en trois dimensions complète des modèles moléculaires et cellulaires dans les tissus adipeux tout le tissu adipeux. Adipo-Clear est une adaptation d’iDISCO / iDISCO +, avec des modifications spécifiques apportées à supprimer complètement les lipides stockés dans les tissus tout en préservant la morphologie tissulaire native. En combinaison avec la microscopie en fluorescence lumière-feuille, nous démontrons ici l’utilisation de la méthode Adipo-Clear pour obtenir des images haute résolution volumétriques d’un tissu adipeux ensemble.
Introduction
Jusqu'à tout récemment, le tissu adipeux a été conçu comme une collection amorphe de cellules graisseuses. Dans les dernières décennies, notre compréhension s’est développée plus sophistiquée, avec de la graisse, maintenant reconnue comme un organe complexe contenant différents types d’adipocytes, ainsi que les précurseurs adipocytaires, cellules immunitaires, les fibroblastes, la vascularisation et projections nerveuses. Interactions entre ces cellules résidentes adipeux ont des effets marqués sur le tissu adipeux et organismique physiologie et physiopathologie1. Bien que les nouvelles études ont démêlé importants mécanismes moléculaires de certaines interactions, une compréhension plus globale requiert un profilage structurelle fiable du tissu tout en trois dimensions (3D).
Nos connaissances actuelles de la morphologie du tissu adipeux est largement basée sur l’analyse histologique des sections minces (5 μm) avec l’imagerie relativement fort grossissement (plus de 10 X)2,3. Toutefois, cette approche présente plusieurs limites importantes. Tout d’abord, complexes de structures filamenteuses comme les nerfs sympathiques et le système vasculaire, qui sont connus pour jouer un rôle important dans le tissu adipeux fonction4,5,6,7, sont difficiles à évaluer par le biais de coupes minces. Deuxièmement, en raison de sa forme apparemment amorphe et le manque d’unités structurales représentatifs de se concentrer sur, il est difficile d’apprécier le tissu adipeux structures basées uniquement sur la section coloration. En troisième lieu, le tissu adipeux a une teneur très élevée en lipides, en créant des défis dans l’obtention des coupes sériées cohérentes qui se prêtent à une reconstruction anatomique 3D, une méthode conventionnelle utilisée pour étudier le cerveau entier morphologie8. Compte tenu de ces facteurs, il y a un grand besoin d’une approche toute monture qui peut fournir une visualisation 3D d’un dépôt de tissu adipeux ensemble tout en permettant la résolution cellulaire.
L’imagerie volumétrique 3D d’un organe entier est difficile en raison des effets masquant des nuages de points lumineux. Une source majeure de facteur de diffusion dans les tissus biologiques provient d’interfaces lipide aqueux. Bien que les efforts pour éliminer les nuages de points en supprimant les lipides ont été en cours pendant plus d’un siècle, on a un grand nombre de ces dernières innovations9. Une de ces méthodes nettoyage des tissus nouvellement développée est imagerie 3D compatible immunomarquage des organes cote de solvant (iDISCO / iDISCO +)10,11. Cependant, le tissu adipeux représente un défi particulier compte tenu de son niveau élevé de lipides et par conséquent, des modifications supplémentaires à l’iDISCO / iDISCO + protocole sont requis pour extraire complètement les lipides tout en protégeant le tissu de s’effondrer. Le protocole modifié, que nous avons mis au point, maintenant appelé Adipo-Clear, emploie méthanol/à base de dichlorométhane délipidation du tissu adipeux à une transparence optimale convenant à haute résolution d’imagerie volumétrique12. Parce que la délipidation étape désaltère exprimés en grande partie les protéines fluorescentes comme GFP et DP, visualisation de ces protéines doit être atteint par immunomarquage. Dans l’ensemble, ce protocole simple et robuste peut être appliqué pour étudier l’organisation tissulaire au niveau des cellules résidentes adipeux, traçage de la lignée de cellules progénitrices adipocytaire et morphogenèse adipeuse au cours du développement.
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Protocol
Expérimentation et protection des animaux ont été réalisés selon les procédures approuvées par la Commission institutionnelle animalerie et utilisation à l’Université Rockefeller.
1. préparation du tissu
- Effectuer une perfusion intracardiaque standard avec environ 20 mL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C jusqu'à ce que le sang est complètement retiré du tissu.
- Lancez le perfusat à ~ 20 mL de solution de fixation (4 % paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x) à 4 ° C jusqu'à ce que le cou et la queue ont considérablement durcie.
ATTENTION : PFA est toxique. Éviter tout contact avec la peau, des yeux et des muqueuses. Solutions se référera à l’intérieur d’une hotte aspirante. - Disséquer les coussinets adipeux d’intérêt soigneusement pour retirer le coussin de graisse entière sans l’endommager. Utiliser les pinces émoussé-terminée afin d’éviter le coincement ou l’écrasement le tissu. Éviter de contaminer le tissu découpé avec une fourrure.
- Fixer le tissu en 4 % PFA dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C. Pour chaque grosse garniture, fixer avec environ 10 mL de solution de fixation dans un tube conique de 15 mL.
- Laver le tissu 3 fois (1 h) avec du PBS 1 x à température ambiante (RT).
- Stocker les tissus pour à court terme (jusqu'à 2 semaines) dans du PBS 1 x à 4 ° C et l’abri de la lumière. Pour le stockage à long terme (p. ex., 1-2 ans), placez-vous dans la mémoire tampon 1 x PBS avec 0,05 % d’azide de sodium (comme agent de conservation).
ATTENTION : L’azoture de Sodium est très toxique si ingéré par voie orale ou absorbé par la peau. Concentré d’azide de sodium (à 5 % ou plus) des solutions doivent être manipulées sous une hotte aspirante.
2. délipidation et perméabilisation
Calendrier: 1-2 jours
- Préparer les 20 %, 40 %, 60 % et 80 % méthanol gradient avec tampon B1n (tableau 1) (v/v), par exemple, pour le tampon de 20 % de méthanol/B1n, mélangent 20 mL de méthanol et 80 mL de tampon B1n. Stocker tous les tampons à 4 ° C. Cristaux de glycine précipitera de tampons de méthanol/B1n 60 % et 80 % en raison de la saturation. Éviter de supprimer les cristaux ; utiliser la solution liquide pour les lavages suivants.
ATTENTION : Le méthanol est volatile, inflammable et irritant. Éviter le contact cutané ou oculaire. - Retirez doucement les cheveux de l’échantillon sous un microscope à dissection. Tout cheveux, peluches ou des débris, jointe à l’échantillon entraînera des ombres au cours de l’imagerie. Transférer l’échantillon nettoyé dans un nouveau tube.
- Exécutez toutes les étapes suivantes sur la glace ou à 4 ° C sauf indication contraire. Pour petits échantillons (par exemple, postérieurs coussinets adipeux sous-cutané/perigonadal des jeunes souris maigres), utiliser des tubes de microcentrifuge de 2 mL avec 1,6 mL de la solution. Pour les grands échantillons ou échantillons avec teneur élevée en lipides (par exemple, les coussinets adipeux chez des souris obèses), utiliser des tubes de 5 mL avec 4 mL de la solution.
- Placer les tubes contenant les échantillons horizontalement dans un agitateur orbital à ~ 100 tr/min. Veillez à ce que les échantillons peuvent circuler librement à l’intérieur du tube.
- Déshydrater l’échantillon dans une série graduée de 20 %, 40 %, 60 %, 80 % et 100 % méthanol/B1n tampon pour l’heure indiquée (tableau 2). Minimiser la solution de report.
- Delipidate l’échantillon avec 100 % de dichlorométhane (DCM) (3 fois), chacune avec le temps d’incubation indiqués dans le tableau 2. L’échantillon doit couler au fond du tube à la fin des deuxième et troisième DCM lavages. Si non, prolonger le temps d’incubation pour assurer la délipidation complet (par exemple, s’étendent de 30 min à 1-2 h).
ATTENTION : DCM devrait être manipulé à l’intérieur d’une hotte aspirante. Utilisez des récipients de verre pour tubes de microcentrifuge de stockage et de qui sont faits de polypropylène pour des incubations. Les tubes de microcentrifuge ne doivent pas être utilisés pour le stockage à long terme de DCM. Boîtes de Pétri et pipettes sérologiques qui sont faits de polystyrène ne sont pas compatibles avec du DCM. DCM est très volatil. Transférer l’échantillon dans une solution fraîche rapidement pour éviter la dessiccation. - Laver deux fois avec 100 % de méthanol pour l’heure indiquée (tableau 2).
- Facultatif : Si l’échantillon n’est pas bien irrigué, la couleur de l’hémoglobine des globules rouges restants risquent fort autofluorescence. Eau de Javel 5 % H2O2 dans le méthanol (1 volume de 30 % H2O2 à 5 volumes de méthanol) durant la nuit à 4 ° C.
- Réhydrater l’échantillon dans une série de tampons de méthanol/B1n inversé : 80 %, 60 %, 40 %, 20 % méthanol/B1n et 100 % B1n tampon (2 fois) pour l’heure indiquée (tableau 2).
- Laver l’échantillon avec tampon de PTxwH (tableau 1) pendant 2 h à température ambiante.
- Conserver l’échantillon délipidée dans PTxwH tampon à 4° C (jusqu'à 1 an) ou procéder immédiatement à l’étape de l’immunohistochimie.
3. toute monture Immunostaining
Calendrier: 8-10 jours
Remarque : Toutes les étapes suivantes devraient être effectué à ta sauf indication contraire, avec agitation et de la protection contre la lumière. Pour petits échantillons, utiliser des tubes de microcentrifuge de 2 mL avec 1,6 mL de solution. Pour les grands échantillons, utiliser des tubes de 5 mL avec 4 mL de solution. Il est recommandé de d’abord valider les anticorps sur des petits morceaux du tissu ou des sections de tissu imprégnées par le méthanol.
- Diluer l’anticorps primaire dans le tampon de PTxwH à la concentration recommandée. Centrifuger la solution d’anticorps dilué à ~ 20 000 x g pendant 10 min empêcher la présentation précipités anticorps ou agrégations.
- Incuber l’échantillon délipidée avec la solution d’anticorps primaire pour l’heure indiquée (tableau 2).
- Laver l’échantillon avec le tampon de PTxwH dans une série d’étapes d’incubation : 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h et Pendant la nuit.
- Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de PTxwH à la concentration recommandée. Centrifuger la solution d’anticorps dilué à ~ 20 000 x g pendant 10 min empêcher la présentation précipités anticorps ou agrégations.
Remarque : Pour éviter de fond élevé causé par autofluorescence tissu, Anticorps secondaires conjugués avec des fluorophores qui émettent de la lumière dans les régions rouges et rouge sombre sont recommandés. Selon le nombre de lignes laser disponibles sur un microscope, jusqu'à 3-4 marqueurs peut être photographiée simultanément sur un seul échantillon. - Incuber l’échantillon avec la solution d’anticorps secondaire pour l’heure indiquée (tableau 2).
- Échantillon de lavage avec PTxwH tampon non contrôlé dans une série d’étapes d’incubation : 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h et Pendant la nuit.
- Facultatif : Pour les types de tissus qui sont fragiles, fixez le tissu taché avec 4 % PFA en solution 1 PBS x nuit à 4 ° C pour aider à préserver la morphologie tissulaire.
Remarque : Cette étape peut augmenter fond d’imagerie. Il n’est pas nécessaire d’effectuer cette étape pour le tissu adipeux. - Laver l’échantillon avec du PBS 1 x dans une série d’étapes d’incubation : 5 min, 10 min et 30 min.
- Retirez délicatement les peluches de l’échantillon sous un microscope à dissection.
4. tissu Clearing
Calendrier: 1-2 jours
- Facultatif : Intégrer l’échantillon dans l’agarose pour faciliter le montage des échantillons pour la microscopie de lumière-feuille.
Remarque : Cette étape est fortement recommandée pour les tissus adipeux afin de stabiliser sa forme en imagerie.- Préparer la solution encastrement avec 1 % d’agarose dans 1 x PBS (p/v). Refroidir la solution encastrement à ~ 40 ° C pour éviter d’exposer l’échantillon à une chaleur excessive.
- Placer l’échantillon nettoyé dans un moule(par exemple, boîte de Pétri ou pesage bateau) et l’arranger dans la position souhaitée. Éviter tout report de liquide. Verser doucement la solution encastrement sur l’échantillon. Éviter les bulles d’air.
- Laissez l’agarose entièrement solidifier à RT. Cut out un bloc contenant l’échantillon.
Remarque : Toutes les étapes suivantes, y compris des incubations durant la nuit devraient être exécuté à RT, et à secouer et protection contre la lumière. Pour petits échantillons, utiliser des tubes de microcentrifuge de 2 mL avec 1,6 mL de solution. Pour les grands échantillons, utiliser des tubes de 5 mL avec 4 mL de solution.
- Déshydrater l’échantillon en gradient de méthanol avec H2o : 25 %, 50 %, 75 % et 100 % (3 fois) pour l’heure indiquée (tableau 2).
Remarque : Échantillon peut être laissé toute la nuit à l’étape de 100 % de méthanol. - Incuber l’échantillon dans DCM de 100 % pendant 1 h avec agitation (3 fois). Échantillon doit couler au fond du tube à la fin de chaque lavage de DCM. Si ce n’est pas le cas, prolonger le temps d’incubation pour assurer l’élimination complète du méthanol. Échantillon peut être laissé toute la nuit à l’étape de DCM 100 %.
- Incuber pendant la nuit l’échantillon dans l’éther de dibenzyle (DBE) sous agitation légère pour atteindre correspondant à l’indice de réfraction.
Remarque : Échantillon finira par devenir transparent de lumière visible.
ATTENTION : DBE est dangereux. Eviter tout contact avec la peau. Le manipuler à l’intérieur d’une hotte avec des gants double couche. Jeter les gants dès qu’il est contaminé par DBE. Utilisez des récipients de verre pour le stockage et microcentrifugeuse tubes (polypropylène) pour des incubations. Les tubes de microcentrifuge ne doivent pas être utilisés pour le stockage à long terme de la deb. Boîtes de Pétri et pipettes sérologiques qui sont faits de polystyrène ne sont pas compatibles avec deb. Nettoyer tout déversement avec 100 % d’éthanol. - Incuber l’échantillon avec DBE fraîche légère secousse pendant 2 h. magasin l’échantillon à la droite dans l’obscurité ou passer directement à l’imagerie.
Remarque : Les échantillons sont recommandés pour être photographié dans un mois. Bien que certains fluorophores sont plus stables que d’autres, un stockage à long terme des échantillons à ce stade n’est pas recommandé.
5. microscopie
- Création d’images avec un microscope de lumière-feuille qui est compatible avec deb.
Remarque : Seuls les objectifs qui sont approuvés pour l’imagerie à base de solvants organique et mis en correspondance avec l’indice de réfraction de la deb utilisable comme trempage objectifs en imagerie DBE immergés.- Monter l’échantillon d’agarose incorporés sur un support qui peut empêcher tout mouvement pendant la formation image. Plongez l’échantillon dans une chambre remplie de DBE.
- Recueillir une z-pile couvrant l’ensemble de l’échantillon (par exemple, un grossissement de X 1-2) pour obtenir l’ensemble des tissus/structure de distribution du marqueur d’intérêt.
- Basculer vers un objectif avec un grossissement supérieur (p. ex., un grossissement de X 4-12) pour zoomer sur les régions d’intérêt à l’image des structures détaillées.
Remarque : Le collagène est un contributeur majeur à la matrice extracellulaire du tissu adipeux, qui entoure les cellules graisseuses13. Collagène a un spectre d’émission typique allant vers 400 nm et 550 nm14. Imagerie de l’échantillon avec la ligne 488 laser (verte) et la collecte de la lumière émise à une plage de longueur d’onde qui se situe dans le spectre d’émission du collagène (p. ex., 525-550 nm) donnera le signal d’autofluorescence tissu, qui a déjà été démontré à délimiter le contour adipocyte et globale d’architecture tissulaire12.
- L’imagerie avec une inversée confocale ou un microscope biphotonique.
- Place l’échantillon d’agarose incorporé dans une diapositive de chambre avec un fond de verre sans toucher les pièces en plastique (ou autre chambre d’imagerie DBE-compatible qui peut sceller). Assurez-vous que DBE ne fuit pas.
- Choisissez des objectifs avec des distances de travail plus longues pour atteindre une pénétration plus profonde.
Remarque : Imagerie devrait être fait avec un microscope confocal ou deux photons inversé à travers le fond de verre de la diapositive de la chambre. Évitez tout contact direct entre l’échantillon et le trempage des objectifs qui ne sont pas suggérés pour imagerie DBE.
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Representative Results
Adipo-Clear préparé toute graisse tampons peuvent être photographiées en 3D pour analyser comment les interactions de tissu cellulaire et de morphologie sont affectées dans les États de maigres et obèses. Cette méthode peut être facilement appliquée pour analyser la structure adipeuse générale en recueillant le tissu autofluorescence signal dans le canal vert. Nous avons montré précédemment que l’autofluorescence signal en superpositions adipeuses favorablement avec perilipin coloration, un marqueur couramment utilisé pour décrire des adipocytes matures12. Par exemple, analyse un coussinets adipeux sous-cutané (psWAT) postérieure en utilisant un microscope à lumière-feuille avec faible grossissement (X 1,3) montre l’organisation lobulaire des adipocytes (Figure 1 a et B). Plus d’informations, telles que la taille des adipocytes, peuvent être révélées en zoomant dans les régions d’intérêt avec un grossissement supérieur (4 X) (Figure 1 et D).
Adipo-Clear est particulièrement utile pour la visualisation des structures filamenteuses comme projections de nerf et les vaisseaux sanguins, qui sont difficiles à capturer ou trace sur des coupes minces. Le système nerveux sympathique (SNS) joue un rôle crucial dans le contrôle de la lipolyse et la thermogenèse dans le tissu adipeux4,5. Imagerie d’un pad psWAT coloré avec la tyrosine hydroxylase (TH), un marqueur de SNS, révèle les structures qui apparaissent comme des faisceaux nerveux grand, innervation des vaisseaux sanguins, ainsi qu’une arborisation terminale dense dans le parenchyme de tissus (Figure 2 a-H). En outre, les projections TH + parenchymateuses montrent des variations régionales au sein de psWAT, avec la portion inguinale ayant une densité plus élevée par rapport à la partie dorso (Figure 2E-H; Film supplémentaire 1). Nos travaux antérieurs a démontré que les arborisation terminale SNS on peut retrouver par le calcul et reconstruit en utilisant l’outil FilamentTracer de Imaris logiciel pour évaluer la densité de l’innervation12.
Le tissu adipeux est connu pour être fortement vascularisé. Les changements dans les besoins métaboliques d’adipeux sont souvent associés à la dynamique de remodelage de son système vasculaire6,7. Profilage robuste et rapide du système vasculaire des tissus ensemble peut prévoir une analyse impartiale supplémentaire transformant le vaisseau sanguin. À l’aide de la molécule d’adhérence des cellules endothéliales plaquettaire (PECAM-1, également connu sous le nom de CD31) comme marqueurs pour l’étiquette des vaisseaux sanguins, nous avons observé que tous les adipocytes sont en contact avec les capillaires dans le tissu entier (Figure 3 a-H; Complémentaire Movie 2), soutenant la demande élevée pour efficace en éléments nutritifs et l’oxygène échanger dans adipeux.
Les cellules immunitaires sont une autre composante essentielle du tissu adipeux. Dans l’État obèse, le tissu adipeux devient enflammé, qui est accompagné par l’infiltration de macrophages pro-inflammatoires qui forment des structures « Couronne-like » qui entourent les adipocytes morts15,16. Les coussinets adipeux des animaux obèses sont particulièrement difficiles à effacer en raison de leur grande taille et de la teneur plus élevée en lipides. Toutefois, la version étendue du Adipo-Clear (décrit dans le tableau 2 pour grand tissu ou tissu avec haute teneur en matières grasses) pouvez obtenir compensation cohérente du tissu entier haute-graisse-chargés. Par exemple, épididymal d’une souris nourrie avec 16 semaines d’alimentation riche en graisses montre denses « structures Couronne-like », immunomarquées par CD68, tout au long du tissu entier (Figure 4 a et B). Ce qui est important, les sections optiques repries depuis plusieurs endroits toute la profondeur du tissu (~ 4-5 mm) spectacle images, démontrant un dégagement complet du tissu (Figure 4-F) tout aussi nettes.
Figure 1 : analyse de la morphologie du tissu adipeux en utilisant le signal de l’autofluorescence. Tous les panneaux sont des images de microscopie (LSFM) de fluorescence de nappe de lumière d’une touche de psWAT préparée Adipo-Clear isolé d’une souris mâle de 8 semaines C57Bl/6J, logée à température ambiante. Le signal de l’autofluorescence est recueilli en balayant l’échantillon effacée avec la couche verte. Sections optiques (coupes au milieu de l’échantillon) de région de dorsolombaires (A) et la région inguinale (B) prises par 1,3 X, objectif. (C, D) Sections optiques à fort grossissement (X 4) des régions en boîte de A et B. Ganglions lymphatiques sont indiquées par des astérisques. Barreaux de l’échelle est indiqués dans chaque panneau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : 3D imaging d’une innervation sympathique dans le tissu adipeux. Tous les panneaux sont LSFM images un psWAT marquées avec la tyrosine hydroxylase (TH) (le même échantillon comme dans la Figure 1). Maximums du dorsolombaires reconstituées région (A) et la région inguinale (B) prise par l’objectif X 1,3. (C, D) Sections optiques du milieu de A et B. (E, F) Sections optiques à fort grossissement (X 4) des régions en boîte de C et D. (G, H) Fort grossissement sections optiques de la superposition entre TH (vert) et autofluorescence (magenta). Pointes de flèches indiquent des profils distincts de l’innervation sympathique : faisceau de nerfs (1) ; (2) innervation des vaisseaux sanguins ; (3) parenchymateuse arborisation. Ganglions lymphatiques sont indiquées par des astérisques. Barreaux de l’échelle est indiqués dans chaque panneau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : 3D imagerie des vaisseaux sanguins dans les tissus adipeux. Tous les panneaux sont LSFM images un CD31 étiqueté psWAT (le même échantillon comme dans la Figure 1). (A, B) Maximums du dorsolombaires reconstituées région (A) et la région inguinale (B) prise par l’objectif X 1,3. (C, D) Sections optiques du milieu de A et B. (E, F) Sections optiques à fort grossissement (X 4) des régions en boîte de C et D. (G, H) Fort grossissement sections optiques de la superposition entre CD31 (rouge) et l’autofluorescence (cyan). Ganglions lymphatiques sont indiquées par des astérisques. Barreaux de l’échelle est indiqués dans chaque panneau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : imagerie 3D des structures « Couronne-like » dans le tissu adipeux. Tous les panneaux sont LSFM images une touche d’eWAT préparés Adipo-Clear isolés de souris mâles nourri avec le régime riche en graisses pendant 16 semaines. L’échantillon a été immunomarquées avec CD31 et CD68. (A, B) Maximums de l’échantillon reconstruit avec une profondeur totale de plus de 4 mm. (A) X-Y voir. (B) vue de Y-Z. (C-F) Sections optiques des profondeurs indiquées dans B. Barreaux de l’échelle est indiqués dans chaque panneau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Mémoire tampon | Produit chimique | Concentration finale |
| B1n tampon | ||
| Glycine | 0,3 M | |
| Triton X-100 | 0,1 % (v/v) | |
| H2O | Solvant | |
| Azide de sodium (agent de conservation, en option) | 0,01 % (p/v) | |
| Ajuster le pH à 7 avec NaOH | ||
| PTxwH tampon | ||
| 10 x PBS | 1 x | |
| Triton X-100 | 0,1 % (v/v) | |
| Tween-20 | 0,05 % (v/v) | |
| Héparine | 2 µg/ml | |
| H2O | Solvant | |
| Azide de sodium (agent de conservation, en option) | 0,01 % (p/v) |
Tableau 1 : liste des mémoires tampons et solutions. Cette table contient des recettes pour les tampons utilisés en Adipo-clair. Pour le stockage à long terme des tampons, il est recommandé d’ajouter l’azoture de sodium comme agent de conservation.
| Mémoire tampon | Petit tissu | Gros tissu (ou à haute teneur en matières grasses) | Température |
| 20 % méthanol/B1n tampon | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40 % méthanol/B1n tampon | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60 % méthanol/B1n tampon | 30 min | 1 h | 4° C |
| 80 % méthanol/B1n tampon | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100 % de méthanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 1 h | 2-3 h, ou toute la nuit | 4° C |
| DCM | 30 min | 2 h | 4° C |
| 100 % de méthanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100 % de méthanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| En option : 5 % H2O2/methanol | Pendant la nuit | Pendant la nuit | 4° C |
| 80 % méthanol/B1n tampon | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60 % méthanol/B1n tampon | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40 % méthanol/B1n tampon | 30 min | 1 h | 4° C |
| 20 % méthanol/B1n tampon | 30 min | 1 h | 4° C |
| B1n tampon | 30 min | 1 h | RT |
| B1n tampon | Pendant la nuit | Pendant la nuit | RT |
| PTxwH tampon | 2 h | 2 h | RT |
| PTxwH tampon | Stockage | Stockage | 4° C |
| Incubation des anticorps primaires | 3 jours | 4-5 jours | RT |
| Incubation de l’anticorps secondaire | 3 jours | 4-5 jours | RT |
Tableau 2 : Incubation fois délipidation et immunostaining. Cette table contient les temps d’incubation des délipidation et immunostaining étapes du protocole. Le poids approximatif de petit tissu est < 300 mg.
Supplémentaire 1 film : 3D imaging d’une innervation sympathique dans le tissu adipeux. Tyrosine hydroxylase (TH) immunomarquage d’un échantillon de psWAT (identique à la Figure 2). Le film montre le survol des sections optiques (4 X de la dorsolombaires) et les régions inguinales de psWAT, avec une épaisseur totale d’environ 2 mm. TH s’affiche en vert. Autofluorescence est montré en magenta. La région de la partie dorso semble avoir une densité plus faible SNS. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Complémentaire 2 film : 3D imagerie du système vasculaire dans le tissu adipeux. Immunomarquage CD31 d’un échantillon de psWAT (identique à la Figure 3). Le film montre le survol des sections optiques (4 X de la dorsolombaires) et les régions inguinales de psWAT, avec une épaisseur totale d’environ 2 mm. CD31 apparaît en rouge. Autofluorescence est montré en cyan. Tous les adipocytes semblent être étroitement entourés de capillaires. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Adipo-Clear est une méthode simple et robuste pour dégager le tissu adipeux, qui peut être facilement effectué dans une configuration de laboratoire réguliers. En comparaison avec d’autres méthodes de nettoyage à base de solvants tels qu’iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear est particulièrement optimisé pour dégager le tissu adipeux et autres tissus à haute teneur en matières grasses. L’étape de délipidation supprime complètement les lipides d’adipeux et donc facilite l’immunomarquage dans le tissu tout et en grande partie minimise facteur de dispersion, permettant l’imagerie bout à bout sans perte de résolution XY. En plus de la fluorescence de la lumière-feuille microscopes, qui fournissent un balayage rapide du gros tissu, confocal et microscopes de deux photons aussi permet d’obtenir une plus grande résolution et plus de détails.
La délipidation méthanol/à base de DCM est une étape cruciale. Délipidation insuffisante peut entraîner des images floues, surtout vers la base du tissu. Il est important d’assurer l’élimination complète des lipides en observant des échantillons de tissu adipeux naufrage dans du DCM. Les échantillons qui contiennent un mélange de types de tissus (p. ex., épididymal avec l’épididyme et les testicules attaché) ne peuvent pas entièrement couler même avec longues incubations de DCM. Cependant, en incubant ces échantillons jusqu’au lendemain au DCM devrait atteindre délipidation complete. En raison de la dénaturation des protéines dans ces solvants organiques, certains anticorps peut-être pas compatibles avec l’étape de délipidation. Choisir un anticorps approprié devient donc une autre étape critique pour ce protocole. Il est recommandé de d’abord valider les anticorps sur des sections de tissu imprégnées par le méthanol ou des petits morceaux de tissus traités par Adipo-Clear. De même, la compatibilité des teintures chimiques avec méthanol/DCM/DBE doit également être testée avant l’application.
Une des limitations du protocole est l’extinction des protéines fluorescentes endogène exprimées. La délipidation d’à base de solvants organique et des mesures de compensation en grande partie dénaturant de ces protéines. Pour visualiser les protéines fluorescentes endogènes, anticorps étiquetage doit être employé. La disponibilité de combinaison d’anticorps approprié limite la capacité d’exécuter hautement multiplexé d’imagerie. Les microscopes de lumière-feuille disponibles actuelles nous permettent seulement d’image jusqu'à 4 canaux.
Adipo-Clear est particulièrement utile pour la visualisation de structures filamenteuses et populations de cellules qui ont une densité relativement faible dans le tissu adipeux. Cependant, imagerie signaux denses devient limitée avec cette approche. Lorsque les anticorps sont utilisés pour étiqueter des signaux denses, ils peuvent être séquestrés par les épitopes situés sur la surface de l’échantillon, bloquant l’accès à l’intérieur des tissus. Par conséquent, petites sondes chimiques sont recommandés pour colorer les structures denses. En raison du même problème, l’application d’Adipo-Clear au tissu adipeux brun est limitée. La graisse brune est un dépôt de tissu adipeux avec des structures denses. En plus dense des vaisseaux sanguins et une innervation nerveuse, il est également étroitement emballé avec petits adipocytes qui contiennent un grand nombre de mitochondries,17. Lors de l’application CD31 et TH coloration avec la même procédure décrite ci-dessus pour la graisse brune, seule la surface de l’échantillon a été étiqueté (données non présentées). Par ailleurs, la graisse brune produit tissu fort autofluoresence, menant à faible rapport signal sur bruit en imagerie. Il est recommandé de couper le tissu adipeux brun en petits morceaux et d’utiliser des sondes chimiques lorsque cela est possible.
Dans l’ensemble, Adipo-clair permet le profilage simultanée de plusieurs structures d’intérêt avec haute résolution dans tout le tissu adipeux. En utilisant cette approche, on peut analyser l’interaction de structures telles que les projections nerveuses, le système vasculaire, les cellules immunitaires et les adipocytes tout au long de l’ensemble de la garniture. Il fournit des données d’imagerie non biaisées en évitant la découpe ou en choisissant des régions d’intérêt. Adipo-Clear peut également être appliquée à l’étude développement adipeux tels que les événements au cours de la morphogenèse début ainsi que la répartition des adipocytes cellules progénitrices et précurseur dans les études de suivi de lignée. Outre adipeux, Adipo-Clear peut également faciliter 3D analyse entier-montent des autres tissus qui ont la teneur élevée en lipides ou sont entourés de matières grasses, comme la glande mammaire et ganglion grasse. Cette méthode offre également la possibilité d’étudier l’histologie du tissu adipeux humain dans des conditions physiologiques et pathologiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Christina Pyrgaki, Tao Tong et Alison North de la Bioimaging Resource Center à l’Université Rockefeller pour assistance et soutien. Nous remercions également Xiphias Ge Zhu d’édition des films. Ce travail a été soutenu par le Human Frontier Science Program organisation (PC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
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