Summary
På grund af det høje fedtindhold, har fedtvæv udfordrende for at visualisere ved hjælp af traditionelle histologiske metoder. Adipo-klar er et væv, clearing teknik, der giver mulighed for robust mærkning og høj opløsning volumetriske fluorescerende billeddannelse af fedtvæv. Her, beskriver vi metoder til prøveforberedelse, forbehandling, farvning, clearing og beslag til billedbehandling.
Abstract
Fedtvæv spiller en central rolle i energi homøostase og termoregulering. Det er sammensat af forskellige typer af adipocytter, samt adipocyt prækursorer, immun celler, fibroblaster, blodkar og nerve fremskrivninger. Selv om den molekylære kontrol af celle type specifikation og hvor disse celler interagere har været mere og mere afgrænset, kan en mere omfattende forståelse af cellernes fedt-resident opnås ved at visualisere deres distribution og arkitektur i hele den hele væv. Eksisterende Immunhistokemi og immunfluorescens tilgange til at analysere adipøst histologi stole på paraffin-embedded tyndslib. Men, tynde sektioner fange kun en lille del af væv; som et resultat, kan være partiske konklusioner af hvilken del af væv er analyseret. Vi har derfor udviklet en fedtvæv, clearing teknik, Adipo-klart, for at tillade omfattende tre-dimensionelle visualisering af molekylære og cellulære mønstre i hele fedtvæv. Adipo-klar var tilpasset fra iDISCO / iDISCO +, med specifikke ændringer lavet til helt at fjerne lipid gemt i vævet samtidig bevare indfødte væv morfologi. I kombination med lys-ark Fluorescens mikroskopi viser vi her brugen af Adipo-klar metode til at opnå høj opløsning volumetriske billeder af en hele fedtvæv.
Introduction
Indtil for nylig, blev fedtvæv udtænkt af som en amorf samling af fedtceller. I de seneste par årtier, er vores forståelse vokset mere sofistikeret, med fedt nu anerkendt for at være et komplekst organ som indeholder forskellige typer af adipocytter samt adipocyt prækursorer, immun celler, fibroblaster, vaskulatur og nerve fremskrivninger. Interaktioner blandt disse fedtholdigt-resident celler har udtalt effekter på fedtvæv og kropsligt fysiologi og patofysiologi1. Selv om nye undersøgelser har skilles ude vigtige molekylære mekanismer bag visse interaktioner, kræver en mere omfattende forståelse pålidelige strukturel profilering af hele væv i tre dimensioner (3D).
Vores nuværende viden om fedtvæv morfologi er hovedsagelig baseret på histologiske analyse af tyndslib (5 μm) med relativt høj forstørrelse imaging (mere end 10 X)2,3. Denne tilgang har dog flere betydelige begrænsninger. Første, indviklede trådformede strukturer som sympatiske nerver og kar, som er kendt for at spille en vigtig rolle i adipøst funktion4,5,6,7, er vanskeligt at vurdere gennem tynde sektioner. Andet, på grund af sin tilsyneladende amorf form og den manglende repræsentative strukturelle enheder til at fokusere på, det er svært at sætte pris på fedtvæv strukturer baseret kun på afsnit farvning. For det tredje har fedtvæv en meget høj lipid indhold, at skabe udfordringer i at opnå ensartet serie sektioner, der er egnet til 3D anatomiske genopbygning, en konventionel metode bruges til at undersøge hele hjernens morfologi8. I betragtning af disse faktorer, er der et stort behov for en hele-mount tilgang, der kan give 3D visualisering af en hel adipøst depot samtidig stadig opnå cellulære opløsning.
3D volumetriske billeddannelse af hele organ er udfordrende på grund af skyggende virkningerne af lysspredningen. En væsentlig kilde til lysspredningen i biologisk væv kommer fra lipid-vandig grænseflader. Selv om bestræbelserne på at fjerne scatter ved at fjerne lipider har stået på i over et århundrede, har der været et stort antal af de seneste innovationer9. En sådan nyudviklede væv-clearing metode er immunolabeling-aktiveret 3D imaging af opløsningsmiddel-ryddet organer (iDISCO / iDISCO +)10,11. Dog fedtvæv udgør en særlig udfordring givet sit høje niveau af lipider, og derfor, yderligere ændringer til iDISCO / iDISCO + protokollen er forpligtet til at fuldt uddrag af lipider samtidig beskytte væv fra kollapse. Den ændrede protokol, vi har udviklet, nu kaldet Adipo-klar, beskæftiger methanol/dichlormethan-baseret delipidation af fedtvæv til at opnå optimal gennemsigtighed egnet til høj opløsning volumetriske imaging12. Fordi delipidation trin i vid udstrækning slukker endogent udtrykt fluorescerende proteiner som normal god landbrugspraksis og RFP, skal visualisering af sådanne proteiner opnås ved immunolabeling. Samlet set denne enkel og robust protokol kan anvendes til at studere væv-niveau organisation af fedt-resident celler, afstamning sporingen af adipocyt stamceller og fedt morfogenese under udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrs pleje og eksperimenter blev udført efter procedurer, der er godkendt af det institutionelle dyrs pleje og brug udvalg ved Rockefeller University.
1. væv forberedelse
- Udføre standard intracardiac perfusion med ~ 20 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved 4 ° C, indtil blodet er helt fjernet fra vævet.
- Skifte perfusate til ~ 20 mL af Fikseringsvæske løsning (4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS) ved 4 ° C, indtil den hals og hale har betydeligt afstivet.
Forsigtig: PFA er giftigt. Undgå kontakt med hud, øjne og slimhinder. Løsninger bør foretages inde i et stinkskab. - Dissekere fedtpuder interesse omhyggeligt at fjerne det hele fedt pad uden at beskadige den. Bruge blunt-ended pincet til at undgå klemning eller klemme vævet. Undgå at forurene det dissekerede væv med nogen pels.
- Post løse væv i 4% PFA i 1 x PBS natten over ved 4 ° C. For hver fedt pad, efter rettelse med ~ 10 mL af fiksering løsning i en 15 mL konisk slange.
- Vask væv 3 gange (1 h) med 1 x PBS ved stuetemperatur (RT).
- Gemme væv for kortsigtede (op til 2 uger) i 1 x PBS ved 4 ° C og beskyttet mod lys. Til langtidsopbevaring (f.eks.1-2 år), skal du skifte bufferen til 1 x PBS med 0,05% natriumazid (som konserveringsmiddel).
Forsigtig: Natriumazid er meget giftig når indtages oralt eller optages gennem huden. Koncentreret natriumazid løsninger (på 5% eller større) skal håndteres i et stinkskab.
2. Delipidation og Permeabilization
Timing: 1-2 dage
- Forbered 20%, 40%, 60% og 80% methanol gradient med B1n buffer (tabel 1) (v/v), f.eks.for 20% methanol/B1n buffer, 20 mL methanol og 80 mL B1n buffer. Gemme alle buffere ved 4 ° C. Glycin krystaller vil bundfald fra 60% og 80% methanol/B1n buffere på grund af mætning. Undgå at fjerne krystaller; bruge den flydende løsning for de følgende skylninger.
Forsigtig: Methanol er flygtige, lokalirriterende og brandfarlige. Undgå hud eller øjenkontakt. - Forsigtigt fjerne håret fra prøve under et mikroskop for dissektion. Enhver hår, støv eller snavs knyttet til prøven vil medføre skygger under imaging. Overføre den rensede prøve ind i et nyt rør.
- Udfør alle følgende trin på is eller ved 4 ° C, medmindre andet er angivet. For små prøver (fx, posterior subkutan/perigonadal fedtpuder fra unge lean mus), skal du bruge 2 mL microcentrifuge rør med 1,6 mL af opløsningen. For store prøver eller prøver med højt fedtindhold (fx, fedtpuder fra overvægtige mus), skal du bruge 5 mL rør med 4 mL af opløsningen.
- Sted rør indeholdende prøver anbringes vandret på en orbitalryster indstillet på ~ 100 rpm. Kontroller, at prøverne kan bevæge sig frit inde i røret.
- Dehydrere prøven i en gradueret serie af 20%, 40%, 60%, 80% og 100% methanol/B1n buffer for den angivne tid (tabel 2). Minimere fremførsel løsning.
- Delipidate prøve med 100% dichlormethan (DCM) (3 gange), hver med inkubationstiden angivet i tabel 2. Prøven skal synke til bunden af røret i slutningen af de anden og tredje DCM vasker. Hvis ikke, udvide inkubationstiden at sikre fuld delipidation (fx, strækker sig fra 30 min. til 1-2 h).
Forsigtig: DCM skal håndteres i et stinkskab. Bruge glasbeholdere til opbevaring og microcentrifuge rør, der er fremstillet af polypropylen for inkubationer. Microcentrifuge rør bør ikke anvendes til langtidsopbevaring af DCM. Petriskåle og serologiske pipetter, der er fremstillet af polystyren er ikke kompatible med DCM. DCM er meget svingende. Overføre prøven til frisk løsning for hurtigt at forhindre udtørring. - Vaskes to gange med 100% methanol for den angivne tid (tabel 2).
- Valgfrit: Hvis prøven ikke er godt perfused, farven på hæmoglobin fra de resterende røde blodlegemer kan forårsage stærke autofluorescence. Blegemiddel med 5% H2O2 i methanol (1 bind 30% H2O2 til 5 bind af methanol) natten over ved 4 ° C.
- Rehydrere prøven i en omvendt methanol/B1n buffer serie: 80%, 60%, 40%, 20% methanol/B1n og 100% B1n buffer (2 gange) for den angivne tid (tabel 2).
- Vaske eksemplet med PTxwH buffer (tabel 1) for 2 h på RT.
- Gemme delipidated prøven i PTxwH buffer ved 4° C (op til 1 år) eller gå straks til trinnet immunfarvning.
3. hele Mount immunfarvning
Timing: 8-10 dage
Bemærk: Alle de følgende trin skal udføres på RT medmindre andet, med rysten og beskyttelse mod lys. For små prøver, skal du bruge 2 mL microcentrifuge rør med 1,6 mL af opløsning. For store stikprøver, skal du bruge 5 mL rør med 4 mL af opløsning. Det anbefales, at første validere antistoffer på små stykker af væv eller methanol-behandlede væv sektioner.
- Fortynd den primære antistof i PTxwH buffer til den anbefalede koncentration. Der centrifugeres den fortyndede antistof løsning på ~ 20.000 x g i 10 min. at forhindre indførelse antistof bundfald eller sammenlægninger.
- Inkubér delipidated prøven med den primære antistof løsning for den angivne tid (tabel 2).
- Vask eksemplet med PTxwH buffer i en række inkubation trin: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h og overnatning.
- Fortynd den sekundær antistof i PTxwH buffer til den anbefalede koncentration. Der centrifugeres den fortyndede antistof løsning på ~ 20.000 x g i 10 min. at forhindre indførelse antistof bundfald eller sammenlægninger.
Bemærk: For at undgå høje baggrund forårsaget af væv autofluorescence, sekundære antistoffer konjugeret med fluorophores, der udsender lys i de røde og far-red regioner er anbefalet. Afhængigt af antallet af laser linier til rådighed på et mikroskop, kan op til 3-4 markører være afbildet samtidig i én prøve. - Inkuber prøve med sekundær antistof løsning for den angivne tid (tabel 2).
- Vask prøve med PTxwH buffer i en række inkubation trin: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h og overnatning.
- Valgfrit: For vævstyper, der er skrøbelige, fastsætte den farvede væv med 4% PFA i 1 x PBS natten over ved 4 ° C til at bevare vævet morfologi.
Bemærk: Dette trin kan øge imaging baggrund. Det er ikke nødvendigt at udføre dette trin til fedtvæv. - Vask prøve med 1 x PBS i en række inkubation trin: 5 min, 10 min og 30 min.
- Fjern forsigtigt fnug fra prøve under et mikroskop for dissektion.
4. væv Clearing
Timing: 1-2 dage
- Valgfrit: Integrere prøven i Agarosen at lette prøve montering til lys-ark mikroskopi.
Bemærk: Dette trin anbefales stærkt til fedtvæv til at stabilisere sin form under imaging.- Forberede den indlejring løsning med 1% Agarosen i 1 x PBS (w/v). Cool indlejring løsningen på ~ 40 ° C for at undgå at udsætte prøven til overdreven varme.
- Renset prøven anbringes i en støbeform (fx, petriskål eller vejer båden) og arrangere det til den ønskede position. Undgå enhver flydende fremførsel. Hæld forsigtigt indlejring løsningen over prøven. Undgå eventuelle luftbobler.
- Lad Agarosen fuldt størkne på RT. skåret ud af en blok, der indeholder eksemplet.
Bemærk: Alle de følgende trin, herunder overnight inkubationer bør udføres på RT, med rysten og beskyttelse mod lys. For små prøver, skal du bruge 2 mL microcentrifuge rør med 1,6 mL af opløsning. For store stikprøver, skal du bruge 5 mL rør med 4 mL af opløsning.
- Dehydrere prøven i methanol gradient med H2O: 25%, 50%, 75% og 100% (3 gange) for den angivne tid (tabel 2).
Bemærk: Prøven kan stå natten over på trinnet 100% methanol. - Inkuber prøven i 100% DCM for 1 h under omrystning (3 gange). Prøven skal synke til bunden af røret i slutningen af hver DCM vask. Hvis ikke, udvide inkubationstiden at sikre fuld fjernelse af methanol. Prøven kan stå natten over på 100% DCM trin.
- Inkuber prøven i dibenzyl ether (DBE) natten over med mild ryste for at opnå brydningsindeks matchende.
Bemærk: Prøven vil blive gennemsigtig i synligt lys.
Forsigtig: DBE er farlige. Undgå enhver kontakt med huden. Håndtere det inde i et stinkskab med dobbelt-lags handsker. Kassér handskerne, så snart det er forurenet med DBE. Bruge glasbeholdere til opbevaring og microcentrifuge rør (polypropylen) til inkubationer. Microcentrifuge rør bør ikke anvendes til langtidsopbevaring af DBE. Petriskåle og serologiske pipetter, der er fremstillet af polystyren er ikke kompatible med DBE. Rydde eventuelle spild med 100% ethanol. - Inkuber prøve med friske DBE med mild ryster for 2 h. Store prøve på RT i mørke eller fortsætte direkte til billedbehandling.
Bemærk: Prøver anbefales til afbildning inden for en måned. Selvom visse fluorophores er mere stabile end andre, anbefales langsigtet opbevaring af prøver på dette stadium ikke.
5. mikroskopi
- Billeddannelse med en lys-ark mikroskop, der er kompatibel med DBE.
Bemærk: Kun mål, der er godkendt til organisk opløsningsmiddel-baseret tænkelig og matches med brydningsindekset af DBE kan bruges som dypper mål i DBE-nedsænket billedbehandling.- Montere Agarosen indstøbte prøven på en holder, der kan forhindre bevægelse under imaging. Fordybe prøven i et DBE-fyldte kammer.
- Indsamle en z-stak der dækker hele prøven (f.eks., 1-2 X forstørrelse) at få hele-væv/distributionsstrukturen markering af interesse.
- Skifte til et mål med højere forstørrelse (fx, 4-12 X forstørrelse) til at zoome ind på områder af interesse for image detaljerede strukturer.
Bemærk: Kollagen er en stor bidragyder til den ekstracellulære matrix af fedtvæv, som omgiver alle fedtceller13. Kollagen er et typisk emission spektrum lige omkring 400 nm til 550 nm14. Imaging prøve med linjen 488 laser (grøn) og indsamling af det udsendte lys på en bølgelængdeområdet, der ligger inden for emission spektrum af kollagen (fx, 525-550 nm) vil give væv autofluorescence signal, som tidligere blev vist sig at afgrænse fedtcelle kontur og samlede væv arkitektur12.
- Billeddannelse med en inverteret Konfokal eller en to-foton mikroskop.
- Agarosen indstøbte prøven anbringes i et kammer dias med et glas bund uden at røre nogen plastic dele (eller andre DBE-kompatible imaging kammer, der kan forsegle). Sørg for DBE ikke sive ud.
- Vælg mål med længere arbejde afstande at opnå dybere penetration.
Bemærk: Imaging skal ske med en inverteret Konfokal eller to-foton mikroskop gennem glas bund af diasset kammer. Undgå direkte kontakt mellem prøven og dyppe mål, der ikke er foreslået for DBE-baseret tænkelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adipo-klar parat hele fedt puder kan være afbildet i 3D til at analysere, hvordan væv morfologi og cellulære vekselvirkninger påvirkes i de magre og fede stater. Denne metode kan nemt anvendes til at analysere generelle adipøst struktur ved at indsamle væv autofluorescence signal i den grønne kanal. Vi har tidligere vist, at autofluorescence signal i adipøst overlays positivt med perilipin farvning, et almindeligt anvendte markør til at skitsere modne adipocytter12. For eksempel, viser scanning en posterior subkutan fedt pad (psWAT) ved hjælp af en lys-ark mikroskop med lav forstørrelse (1,3 X) de dråbeformede organisation af adipocytter (figur 1A og B). Mere detaljerede oplysninger, såsom størrelsen på adipocytter, kan blive afsløret ved at zoome ind på områder af interesse med højere forstørrelse (4 X) (figur 1 c og D).
Adipo-klar er især nyttig til at visualisere trådformede strukturer såsom nerve fremskrivninger og blodkar, som er udfordrende at fange eller spor på tynde sektioner. Det sympatiske nervesystem (SNS) spiller en afgørende rolle i at kontrollere lipolyse og termogenese i fedtvæv4,5. Imaging en psWAT pad farves med tyrosin hydroxylase (TH), afslører en markør for SNS, de strukturer, der vises som store nerve bundter samt blodkar innervation og tætte terminal arborization i væv parenkym (figur 2A-H). Derudover viser TH + parenkymalt-fremskrivningerne regional variation inden for psWAT, med den lyskelymfeknuder del at have højere tæthed i forhold til dorsolumbar del (figur 2E-H; Supplerende Movie 1). Vores tidligere arbejde har vist, at SNS terminal arborization kan spores beregningsmæssigt og rekonstrueret ved hjælp af værktøjet FilamentTracer Imaris software til at vurdere tætheden af innervation12.
Fedtvæv er kendt for at være stærkt vaskulariserede. Ændringer i metaboliske krav af fedt er ofte forbundet med dynamiske remodellering af dens Vaskulaturen6,7. Robust og hurtig profilering af hele-væv Vaskulaturen kan give yderligere uvildig analyse til blodkar remodeling. Ved hjælp af trombocyt endotel celle vedhæftning molekyle (PECAM-1, også kendt som CD31) som en markør til etiketten blodkar, bemærkede vi, at alle adipocytter er i kontakt med kapillærerne i hele den hele væv (figur 3A-H; Supplerende Movie 2), støtte den høje efterspørgsel efter effektive næringsstoffer og ilt udveksle i fedtholdigt.
Immunceller er en anden afgørende komponent i fedtvæv. I fede staten, bliver fedtvæv betændt, som er ledsaget af infiltration af pro-inflammatoriske makrofager, der danner "crown-lignende" strukturer omkring døde adipocytter15,16. Fedtpuder fra fede dyr er særligt vanskeligt at klare på grund af deres store størrelse og højere indhold af lipid. Den udvidede version af Adipo-klar (beskrevet i tabel 2 for store væv eller væv med højt fedtindhold) kan dog opnå konsekvent clearing af hele høj-fedt-laden væv. For eksempel, viser epididymis fedt fra en mus fodret med 16 uger af højt fedtindhold kost tætte "crown-lignende strukturer", immunolabeled af CD68, i hele den hele væv (figur 4A og B). Vigtigere, optiske dele overtaget fra forskellige positioner hele dybden af væv (~ 4-5 mm) Vis lige så skarpe billeder, demonstrerer fuldstændig rydning af væv (figur 4 c-F).
Figur 1: analyse af fedtvæv morfologi ved hjælp af autofluorescence signal. Alle paneler er lys ark Fluorescens mikroskopi (LSFM) billeder af en Adipo-klar parat psWAT pad isoleret fra en 8-uge-forhenværende C57Bl/6J mandlige mus til huse på RT. Autofluorescence signal er indsamlet ved scanning ryddet prøven med den grønne kanal. Optiske dele (tværsnit fra midten af prøven) af dorsolumbar-regionen (A) og lyskebrok regionen (B) taget af 1,3 X mål. (C, D) Høj forstørrelse (4 X) optisk sektioner i regionerne boxed fra A og B. Lymfeknuder er angivet med en asterisk. Skala barer er angivet i hvert panel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: 3D imaging af sympatiske innervation i fedtvæv. Alle paneler er LSFM billeder af en psWAT, mærket med tyrosin hydroxylase (TH) (den samme prøve Figur1). Maksimale fremskrivninger af den rekonstruerede dorsolumbar region (A) og lyskebrok regionen (B) truffet af de 1,3 X mål. (C, D) Optiske dele fra midten af A og B. (E, F) Høj forstørrelse (4 X) optisk sektioner i regionerne boxed fra C og D. (G, H) Høj forstørrelse optisk sektioner af overlay mellem TH (grøn) og autofluorescence (magenta). Pilespidser angive forskellige mønstre af sympatiske innervation: (1) nerve bundt; (2) blodkar innervation; (3) parenkymalt arborization. Lymfeknuder er angivet med en asterisk. Skala barer er angivet i hvert panel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: 3D imaging af blodkar i fedtvæv. Alle paneler er LSFM billeder af en CD31, mærket psWAT (den samme prøve Figur1). (A, B) Maksimale fremskrivninger af den rekonstruerede dorsolumbar region (A) og lyskebrok regionen (B) truffet af de 1,3 X mål. (C, D) Optiske dele fra midten af A og B. (E, F) Høj forstørrelse (4 X) optisk sektioner i regionerne boxed fra C og D. (G, H) Høj forstørrelse optisk sektioner af overlay mellem CD31 (rød) og autofluorescence (cyan). Lymfeknuder er angivet med en asterisk. Skala barer er angivet i hvert panel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: 3D imaging "crown-lignende strukturer" i fedtvæv. Alle paneler er LSFM billeder af en Adipo-klar parat eWAT pad isoleret fra en mandlig mus fodret med høj fedt diæt for 16 uger. Prøven blev immunolabeled med CD31 og CD68. (A, B) Maksimale fremskrivninger af den rekonstruerede prøve med en total dybde på mere end 4 mm. (A) X-Y view. (B) Y-Z visning. (C-F) Optisk sektioner fra de angivne dybder i B. Skala barer er angivet i hvert panel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer | Kemiske | Endelig koncentration |
| B1n buffer | ||
| Glycin | 0,3 M | |
| Triton X-100 | 0,1% (v/v) | |
| H2O | Opløsningsmiddel | |
| Natriumazid (konserveringsmiddel, valgfri) | 0,01% (w/v) | |
| Justere pH 7 med NaOH | ||
| PTxwH buffer | ||
| 10 x PBS | 1 x | |
| Triton X-100 | 0,1% (v/v) | |
| Tween 20 | 0,05% (v/v) | |
| Heparin | 2 µg/ml | |
| H2O | Opløsningsmiddel | |
| Natriumazid (konserveringsmiddel, valgfri) | 0,01% (w/v) |
Tabel 1: liste over buffere og løsninger. Denne tabel indeholder opskrifter på buffere anvendes i Adipo-klar. For langtidsopbevaring af buffere anbefales det at tilføje natriumazid som konserveringsmiddel.
| Buffer | Lille væv | Stor væv (eller med højt fedtindhold) | Temperatur |
| 20% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 80% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100% methanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 1 h | 2-3 timer eller natten over | 4° C |
| DCM | 30 min | 2 h | 4° C |
| 100% methanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100% methanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| Valgfrit: 5% H2O2/methanol | Overnatning | Overnatning | 4° C |
| 80% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 20% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| B1n buffer | 30 min | 1 h | RT |
| B1n buffer | Overnatning | Overnatning | RT |
| PTxwH buffer | 2 h | 2 h | RT |
| PTxwH buffer | Opbevaring | Opbevaring | 4° C |
| Primære antistof inkubation | 3 dage | 4-5 dage | RT |
| Sekundær antistof inkubation | 3 dage | 4-5 dage | RT |
Tabel 2: inkubation gange for delipidation og immunfarvning. Denne tabel indeholder inkuberingstider for delipidation og immunfarvning trinene i protokollen. Omtrentlig vægt af små væv er < 300 mg.
Supplerende Movie 1: 3D imaging af sympatiske innervation i fedtvæv. Tyrosin hydroxylase (TH) immunfarvning af et psWAT udsnit, (samme som i figur 2). Filmen viser flyve-through af optiske dele (4 X fra dorsolumbar) og lyskelymfeknuder regioner i psWAT, med en total dybde af ~ 2 mm. TH er vist i grøn. Autofluorescence er vist i magenta. Regionen fra dorsolumbar del synes at have lavere SNS tæthed. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Movie 2: 3D imaging af Vaskulaturen i fedtvæv. CD31 immunfarvning af et psWAT udsnit, (samme som i figur 3). Filmen viser flyve-through af optiske dele (4 X fra dorsolumbar) og lyskelymfeknuder regioner i psWAT, med en total dybde af ~ 2 mm. CD31 er vist med rødt. Autofluorescence er vist i cyan. Alle adipocytter synes at være tæt omgivet af kapillærer. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipo-Clear er en enkel og robust metode til at rydde fedtvæv, som let kan udføres i en regelmæssig lab setup. I forhold til andre opløsningsmiddel-baserede clearing metoder som iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-klar er specielt optimeret til rydning af fedtvæv og andre væv med højt fedtindhold. Delipidation skridt fjerner helt lipider fra fedt, og derfor letter immunolabeling i hele den hele væv og i høj grad minimerer lysspredningen, så til slut tænkelig uden tab af XY-opløsning. Ud over lys-ark fluorescens kan mikroskoper, som giver hurtig scanning af store væv, Konfokal og to-foton mikroskoper også bruges til at opnå højere opløsning og flere detaljer.
Methanol/DCM-baserede delipidation er et afgørende skridt. Utilstrækkelig delipidation kan resultere i slørede billeder, især mod kernen af væv. Det er vigtigt at sikre fuld fjernelse af lipider ved at observere adipøst prøver synker i DCM. De prøver, der indeholder en blanding af vævstyper (fx, epididymis fedt med epididymis og testiklerne knyttet) kan ikke fuldt synke selv med udvidet DCM inkubationer. Dog bør inkubere disse prøver overnatning i DCM opnå komplet delipidation. På grund af denaturering af proteiner i disse organiske opløsningsmidler, visse antistoffer muligvis ikke kompatible med delipidation trin. Derfor, at vælge en passende antistof bliver endnu et kritisk skridt for denne protokol. Det anbefales, at første validere antistoffer på methanol-behandlede væv sektioner eller små stykker af væv behandlet af Adipo klar. Kemiske farvestoffer forenelighed med DCM-methanol-DBE skal ligeledes også testes før anvendelsen.
En begrænsning af protokollen er quenching af endogent udtrykt fluorescerende proteiner. Organisk opløsningsmiddel-baserede delipidation og clearing trin denaturere i vid udstrækning sådanne proteiner. For at visualisere endogene fluorescerende proteiner, skal antistof mærkning være ansat. Tilgængeligheden af egnede antistof kombinationer begrænser muligheden for at udføre meget multipleksede imaging. De aktuelle tilgængelige lys-ark mikroskoper kun tillade os at billedet op til 4 kanaler.
Adipo-klar er især nyttig til at visualisere trådformede strukturer og cellepopulationer, der har relativt lav tæthed i fedtvæv. Men imaging tætte signaler bliver begrænset med denne tilgang. Når antistoffer bruges til at mærke tætte signaler, kan de være afsondret af epitoper beliggende på overfladen af prøven, blokerer adgang til kraterets væv. Derfor, lille kemiske sonder anbefales at plette tætte strukturer. På grund af det samme emne er anvendelse af Adipo-klar til brunt fedtvæv begrænset. Brun fedtstoffet er et fedt depot med tætte strukturer. Ud over tætte blodkar og nerve innervation, er det også tæt pakket med små adipocytter, der indeholder et stort antal mitochondrier17. Anvendelsen af CD31 og TH var farvning med samme procedure som beskrevet ovenfor til brunt fedt, kun overfladen af prøven mærket (data ikke vist). Derudover producerer Brun fedtstoffet stærk væv autofluoresence, fører til lavt signal / støj-forhold under imaging. Det anbefales at skære Brun fedtstoffet i mindre stykker og bruge kemiske sonder når det er muligt.
Samlet set Adipo-klart giver mulighed for samtidige profilering af flere strukturer af interesse med høj opløsning i hele fedtvæv. Brug denne fremgangsmåde, kan man analysere, hvordan strukturer såsom nerve fremskrivninger, vaskulatur, immunceller og adipocytter interagere i hele den hele fedt pad. Det giver uvildig billeddiagnostiske data ved at undgå skæring eller vælge regioner af interesse. Adipo-klar kan også anvendes til at studere adipøst udvikling såsom begivenheder under tidlige morfogenese samt fordelingen af adipocyt Stamform og forløber celler i afstamning sporingen undersøgelser. Ud over fedtholdigt, kan Adipo-klar også lette 3D hele-mount analyse af andre væv, der har højt fedtindhold eller er omgivet af fedt, som mælkekirtlen og fede lymfeknude. Denne metode giver også mulighed for at studere histologi af menneskers fedtvæv i fysiologiske og patologiske betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Christina Pyrgaki, Tao Tong og Alison North fra Bioimaging Resource Center på Rockefeller University for at få hjælp og støtte. Vi takker også Xiphias Ge Zhu for film redigering. Dette arbejde blev støttet af Human Frontier Science Program organisation (PC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
