Summary
Aufgrund der hohen Fettgehalt hat Fettgewebe herausgefordert, mit traditionellen histologischen Methoden zu visualisieren. Adipo-Clear ist ein Gewebe, Technik, robuste Kennzeichnung und hohe Volumetrische fluoreszierende Abbildungsleistung des Fettgewebes können, löschen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Probenvorbereitung, Vorbehandlung, Beizen, clearing und Montage für die Bildgebung.
Abstract
Fettgewebe spielt eine zentrale Rolle im Energie-Homöostase und Thermoregulation. Es besteht aus verschiedenen Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, Blutgefäße und Nerven Projektionen. Obwohl die molekularen Steuerung der Zelle Typspezifikation und wie diese Zellen interagieren zunehmend abgegrenzt, ein umfassenderes Verständnis dieser Fettgewebe-Resident-Zellen lässt sich durch die Visualisierung ihrer Verteilung und Architektur durch das ganze Gewebe. Bestehenden Immunohistochemistry und Immunfluoreszenz Ansätze für adipöse Histologie analysieren setzen auf Paraffin-eingebetteten Dünnschliffe. Dünnschliffe erfassen jedoch nur einen kleinen Teil des Gewebes; Infolgedessen können die Schlussfolgerungen voreingenommen sein, durch welchen Teil des Gewebes analysiert wird. Daher haben wir ein Fettgewebe, clearing-Technik, Adipo-Clear, um umfassende dreidimensionale Visualisierung der molekularen und zellulären Muster in ganze Fettgewebe zu ermöglichen. Adipo-Clear wurde von iDISCO / iDISCO +, mit spezifischen Änderungen gemacht, um vollständig zu entfernen die Lipid unter Beibehaltung der nativen Gewebe Morphologie im Gewebe gespeichert. In Kombination mit Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie zeigen wir hier die Verwendung von der Adipo-Clear-Methode, um hochauflösende volumetrischen Bilder von einer gesamten Fettgewebe zu erhalten.
Introduction
Bis vor kurzem war Fettgewebe als eine amorphe Sammlung von Fettzellen konzipiert. In den vergangenen Jahrzehnten hat unser Verständnis mit Fett jetzt erkannt, um ein komplexes Organ, enthält verschiedene Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, das Gefäßsystem und Nerv Projektionen werden anspruchsvoller, gewachsen. Interaktionen zwischen diesen Fettgewebe-Resident-Zellen haben Auswirkungen auf Fettgewebe und organismal Physiologie und Pathophysiologie1ausgesprochen. Obwohl neue Studien wichtigere molekularen Mechanismen, die bestimmte Interaktionen entwirrt haben, erfordert ein umfassenderes Verständnis zuverlässige strukturelle Profilierung des gesamten Gewebes in drei Dimensionen (3D).
Unseren derzeitigen Kenntnissen von Fettgewebe Morphologie basiert größtenteils auf histologische Analyse von Dünnschliffen (5 μm) mit relativ hoher Vergrößerung Bildgebung (mehr als 10 X)2,3. Dieser Ansatz hat jedoch einige erhebliche Einschränkungen. Erste, komplizierte faserigen Strukturen wie sympathischen Nerven und das Gefäßsystem, die bekanntermaßen die adipösen Funktion4,5,6,7eine wichtige Rolle spielen, sind schwer zu bewerten durch dünne Abschnitte. Zweitens aufgrund seiner scheinbar amorphe Form und das Fehlen von repräsentativen strukturelle Einheiten zu konzentrieren, ist es schwierig, Fettgewebe Strukturen basierend nur auf Abschnitt Färbung zu schätzen wissen. Drittens, Fettgewebe hat einen sehr hohen Fettgehalt, schaffen Herausforderungen bei der Beschaffung konsequent Serienschnitte, die geeignet sind für 3D anatomische Rekonstruktion, einer konventionellen Methode verwendet, um ganze Gehirn Morphologie8zu studieren. Angesichts dieser Faktoren gibt es ein großer Bedarf für einen ganzen-Mount-Ansatz, der 3D-Visualisierung eines gesamten Fettgewebe-Depots und noch eine zelluläre Auflösung bieten kann.
Volumetrische 3D-Bildgebung eines ganzen Organs ist schwierig wegen der verhüllenden Auswirkungen der Lichtstreuung. Eine wichtige Quelle der Lichtstreuung in biologischen Geweben kommt von Lipid-wässrige Schnittstellen. Obwohl die Bemühungen um die Streuung zu beseitigen, indem Sie Lipide entfernen laufende für über ein Jahrhundert gewesen, gab es eine große Anzahl von jüngsten Innovationen9. Eine solche neu entwickelte Gewebe-Clearing-Methode ist Immunolabeling-fähigen 3D-Bildgebung Lösungsmittel geclearte Organe (iDISCO / iDISCO +)10,11. Fettgewebe stellt jedoch eine besondere Herausforderung dar, die aufgrund ihrer hohen Lipide, und daher zusätzliche Änderungen an der iDISCO / iDISCO + Protokoll sind erforderlich, um vollständig die Lipide extrahieren und schützt das Gewebe vor dem Kollaps. Das geänderte Protokoll, die, das wir entwickelt haben, jetzt genannt Adipo-Clear, beschäftigt Methanol/Dichlormethan-basierte delipidierung von Fettgewebe, geeignet für hochauflösende Volumetrische Bildverarbeitung12optimalen Transparenz zu erreichen. Da die delipidierung Schritt weitgehend Quenchen endogen ausgedrückt fluoreszierende Proteine wie GFP und RFP, muss Visualisierung solcher Proteine durch Immunolabeling erzielt werden. Insgesamt kann dieses einfache und robuste Protokoll angewendet werden, um Gewebe-Organisation von Fettgewebe ansässige Zellen untersuchen Abstammung Rückverfolgung Adipocyte Vorläuferzellen und adipösen Morphogenese während der Entwicklung.
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Protocol
Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren genehmigt durch die institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschuss an der Rockefeller University durchgeführt.
(1) Gewebe-Vorbereitung
- Führen Sie standard intrakardialen Perfusion mit ~ 20 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C, bis das Blut aus dem Gewebe vollständig entfernt wird.
- Wechseln Sie die Perfusat zu ~ 20 mL Fixativ Lösung (4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer) bei 4 ° C, bis der Hals und Schweif deutlich versteift haben.
Achtung: PFA ist giftig. Berührung mit Haut, Augen und Schleimhäute. Lösungen sollten in einem Abzug erfolgen. - Sezieren Sie die Fettpolster von Interesse sorgfältig, um die gesamte Fettpolster zu entfernen, ohne es zu beschädigen. Verwenden Sie stumpf endete Zangen um Kneifen oder Quetschen des Gewebes zu vermeiden. Vermeidung einer Kontamination der sezierten Gewebes mit jedem Fell.
- Nach dem Beheben des Gewebes bei 4 % PFA in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° c Für jedes Fettpolster Post-mit ~ 10 mL Fixierung-Lösung in einem 15 mL konische Rohr befestigen.
- Waschen Sie das Gewebe 3 mal (1 h) mit 1 X PBS bei Raumtemperatur (RT).
- Speichern Sie das Gewebe für kurzfristige (bis zu 2 Wochen) mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C und vor Licht geschützt werden. Für langfristige Lagerung (z.B.1-2 Jahre) wechseln Sie den Puffer zu 1 X PBS mit 0,05 % Natriumazid (als Konservierungsmittel).
Achtung: Natriumazid ist hochgiftig, wenn oral oder über die Haut aufgenommen. Konzentriert Natriumazid Lösungen (bei 5 % oder mehr) unter einer Abzugshaube behandelt werden sollte.
2. Delipidierung und Permeabilisierung
Timing: 1-2 Tage
- Bereiten Sie 20 %, 40 %, 60 % und 80 % Methanol Steigung mit B1n Puffer (Tabelle 1), (V/V), z. B.für 20 % Methanol/B1n Puffer, mischen Sie 20 mL Methanol und 80 mL B1n Puffer. Speichern Sie alle Puffer bei 4 ° C. Von 60 % und 80 % Methanol/B1n Puffer aufgrund der Sättigung werden Glycin Kristalle ausgefällt. Zu vermeiden, entfernen die Kristalle; Verwenden Sie die flüssige Lösung für folgenden Waschungen.
Achtung: Methanol ist flüchtig, reizend und brennbar. Vermeiden Sie Haut- oder Augenkontakt. - Entfernen Sie vorsichtig die Haare aus der Probe unter dem Mikroskop Dissektion. Haare, Flusen oder Fremdkörper befestigt zum Beispiel verursacht Schatten während der Bildgebung. Übertragen Sie die gereinigte Probe in einen neuen Schlauch.
- Führen Sie alle folgenden Schritte auf dem Eis oder bei 4 ° C, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie für kleine Proben (z.B. posterior subkutanen/Perigonadal Fettpolster von jungen schlanken Mäusen) 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben oder Proben mit hohem Fettgehalt (z.B., Fettpolster von fettleibigen Mäusen) 5 mL Röhrchen mit 4 mL der Lösung.
- Legen Sie die Rohre mit den Proben horizontal auf einem Orbitalschüttler festgesetzt ~ 100 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass die Proben im Inneren der Röhre frei bewegen können.
- Entwässern Sie die Probe in einer abgestuften Reihe von 20 %, 40 %, 60 %, 80 % und 100 % Methanol/B1n-Puffer für die angegebene Zeit (Tabelle 2). Minimieren Sie die Carry-over-Lösung.
- Delipidate der Probe mit 100 % Dichlormethan (DCM) (3 mal), jeweils mit der Inkubationszeit in Tabelle 2angegeben. Die Probe sollte auf den Boden des Röhrchens am Ende des zweiten und dritten DCM Waschungen sinken. Wenn nicht, erweitern die Inkubationszeit zu vollen delipidierung zu gewährleisten (z.B.reichen von 30 min bis 1-2 h).
Achtung: DCM sollte in einem Abzug gehandhabt werden. Verwenden Sie Glasbehälter für Lagerung und Microcentrifuge Röhren, die aus Polypropylen für Inkubationen. Die Mikrozentrifugenröhrchen sollte nicht für die langfristige Lagerung von DCM verwendet werden. Petrischalen und serologische Pipetten, die aus Polystyrol bestehen sind nicht kompatibel mit DCM. DCM ist sehr volatil. Übertragen Sie die Probe in frische Lösung schnell um Austrocknung zu verhindern. - Waschen Sie sich zweimal mit 100 % Methanol für die angegebene Zeit (Tabelle 2).
- Optional: Wenn die Probe nicht gut PERFUNDIERTEN ist, kann die Farbe des Hämoglobins aus den verbleibenden Erythrozyten stark Autofluoreszenz führen. Bleichen Sie mit 5 % H2O2 in Methanol (1 Volumen von 30 % H2O2 bis 5 Bände von Methanol) über Nacht bei 4 ° C.
- Die Probe in einer umgekehrten Methanol/B1n Puffer Serie rehydrieren: 80 %, 60 %, 40 %, 20 % Methanol/B1n und 100 % B1n Puffer (2 mal) für die angegebene Zeit (Tabelle 2).
- Waschen Sie die Probe mit PTxwH Puffer (Tabelle 1) für 2 h bei RT
- Die Delipidated Probe in PTxwH Puffer bei 4° C (bis zu 1 Jahr) speichern oder sofort mit dem Immunostaining Schritt fortfahren.
(3) ganze Mount Immunostaining
Timing: 8-10 Tage
Hinweis: Die folgenden Schritte sollten bei RT erfolgen soweit, mit schütteln und vor Licht geschützt. Verwenden Sie für kleine Proben 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben 5 mL Röhrchen mit 4 mL Lösung. Es empfiehlt sich, zuerst die Antikörper auf kleine Stücke des Gewebes oder Methanol behandelten Gewebeschnitte validieren.
- Den primäre Antikörper in PTxwH Puffer der empfohlenen Konzentration zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die verdünnte Antikörperlösung ~ 20.000 x g für 10 min Einführung Antikörper Ausscheidungen oder Aggregationen zu verhindern.
- Inkubieren Sie die Delipidated Probe mit dem primären Antikörper-Lösung für die angegebene Zeit (Tabelle 2).
- Waschen Sie die Probe mit PTxwH Puffer in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h und Übernachtung.
- Der Sekundärantikörper in PTxwH Puffer der empfohlenen Konzentration zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die verdünnte Antikörperlösung ~ 20.000 x g für 10 min Einführung Antikörper Ausscheidungen oder Aggregationen zu verhindern.
Hinweis: Zur Vermeidung von hohen Hintergrund verursacht durch Gewebe Autofluoreszenz sind mit Fluorophore, die Licht in den Regionen rote und dunkelrote emittieren konjugierten Sekundärantikörper empfohlen. Abhängig von der Anzahl der Laserlinien auf ein Mikroskop zur Verfügung kann bis zu 3-4 Marker in einer Probe gleichzeitig dargestellt werden. - Inkubieren Sie die Probe mit der Sekundärantikörper-Lösung für die angegebene Zeit (Tabelle 2).
- Waschen Probe mit PTxwH Puffer in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h und Übernachtung.
- Optional: Für Gewebetypen, die zerbrechlich sind, beheben Sie die gefärbte Gewebe mit 4 % PFA in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C zur Erhaltung der Gewebe Morphologie.
Hinweis: Dieser Schritt kann Bildgebung Hintergrund erhöhen. Es ist nicht notwendig, führen Sie diesen Schritt für Fettgewebe. - Waschen Sie die Probe mit 1 X PBS in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min und 30 min.
- Fusseln entfernen Sie vorsichtig aus der Probe unter dem Mikroskop Dissektion.
(4) Gewebe Clearing
Timing: 1-2 Tage
- Optional: Einbetten der Probenmaterials in Agarose Probe Halterung für Licht-Blatt Mikroskopie zu erleichtern.
Hinweis: Dieser Schritt ist dringend empfohlen für Fettgewebe, seine Form während der Aufnahme zu stabilisieren.- Bereiten Sie die einbettende Lösung mit 1 % Agarose in 1 X PBS (w/V). Cool die einbettende Lösung für ~ 40 ° C zu vermeiden, dass die Probe übermäßiger Hitze.
- Legen Sie die gereinigte Probe in eine Form (z.B., Petrischale oder mit einem Gewicht von Boot) und ordnen sie in die gewünschte Position. Vermeiden Sie jede flüssige Übertragung. Die Einbettung Gemisch sanft über die Probe. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Lassen Sie die Agarose voll an RT. Schnitt aus einem Block mit der Probe zu festigen.
Hinweis: Die folgenden Schritte einschließlich Übernachtung Inkubationen sollte bei RT, mit schütteln und vor Licht geschützt erfolgen. Verwenden Sie für kleine Proben 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben 5 mL Röhrchen mit 4 mL Lösung.
- Entwässern Sie die Probe in Methanol Farbverlauf mit H2o: 25 %, 50 %, 75 % und 100 % (3 mal) für die angegebene Zeit (Tabelle 2).
Hinweis: Probe kann über Nacht bei 100 % Methanol Schritt gelassen werden. - Inkubation der Probe in 100 % DCM 1 h unter Schütteln (3 mal). Probe sollte auf der Unterseite des Rohres am Ende von jedem DCM waschen sinken. Wenn dies nicht der Fall ist, erweitern die Inkubationszeit zur vollständigen Entfernung von Methanol zu gewährleisten. Probe kann über Nacht bei 100 % DCM Schritt gelassen werden.
- Inkubieren Sie die Probe in Dibenzyl Äther (DBE) über Nacht mit leichten schütteln um Brechungsindex passend zu erreichen.
Hinweis: Probe wird schließlich im sichtbaren Licht transparent.
Achtung: DBE ist gefährlich. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Im Inneren einer Abzugshaube mit doppellagige Handschuhe damit umgehen. Verwerfen Sie die Handschuhe, sobald es mit DBE verunreinigt ist. Verwenden Sie Glasbehälter für Lagerung und Microcentrifuge Rohre (Polypropylen) für Inkubationen. Die Mikrozentrifugenröhrchen sollte nicht für die langfristige Lagerung von DBE verwendet werden. Petrischalen und serologische Pipetten, die aus Polystyrol bestehen sind nicht kompatibel mit DBE. Reinigen Sie alle Spill mit 100 % Ethanol. - Inkubation der Probe mit frischen DBE mit leichtem Schütteln für 2 h. Store die Probe bei RT im Dunkeln oder gehen Sie direkt zu Bildgebung.
Hinweis: Proben sollten innerhalb eines Monats abgebildet werden. Obwohl bestimmte Fluorophore stabiler als andere sind, ist langfristige Lagerung der Proben in diesem Stadium nicht empfohlen.
(5) Mikroskopie
- Bildgebung mit einem Licht-Blatt-Mikroskop, das mit DBE kompatibel ist.
Hinweis: Nur Ziele, die für organische Lösungsmittel Bildgebung zugelassen und abgestimmt mit dem Brechungsindex von DBE können verwendet werden, als Ziele in der DBE eingetaucht Bildgebung eintauchen.- Montieren Sie die Agarose eingebettet Probe auf eine Halterung, die Bewegung während der Bildgebung verhindern kann. Tauchen Sie die Probe in einer DBE-gefüllte Kammer.
- Sammeln Sie einen Z-Stack für die gesamte Probe (z.B. 1-2 X Vergrößerung), ganze-Verteilung/Gewebestruktur des Markers von Interesse zu erhalten.
- Wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (z.B. 4-12 X Vergrößerung) der Regionen von Interesse für feine Strukturen Bild vergrößern.
Hinweis: Kollagen ist ein wesentlicher Faktor für die extrazelluläre Matrix des Fettgewebes, die alle Fettzellen13umgibt. Kollagen ist ein typisches Emissionsspektrum reichen rund 400 nm bis 550 nm14. Bildgebung der Probe mit 488 Laserlinie (grün) und sammeln das emittierte Licht in einem Wellenlängenbereich, der in das Emissionsspektrum von Kollagen (z.B. 525-550 nm) liegt liefern das Gewebe Autofluoreszenz Signal, die bisher gezeigt wurde Fettzelle Kontur und allgemeine Gewebe Architektur12abzugrenzen.
- Bildgebung mit einer invertierten konfokale oder ein zwei-Photonen-Mikroskop.
- Legen Sie die Probe Agarose eingebettet in eine Kammer-Folie mit einem Glasboden, ohne alle Kunststoffteile (oder andere DBE-kompatible bildgebende Kammer, die versiegeln kann). Stellen Sie sicher, DBE nicht austreten.
- Wählen Sie die Ziele mit längeren Arbeitsabstand, tieferes Eindringen zu erreichen.
Hinweis: Bildgebung sollte mit einem inversen konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskop durch den Glasboden der Kammer Folie erfolgen. Vermeiden Sie direkten Kontakt zwischen der Probe und Dippen Ziele, die nicht für die DBE-basierte Bildgebung vorgeschlagen werden.
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Representative Results
Adipo-Clear bereit ganze Fett Pads abgebildet werden können, in 3D zu analysieren, wie Gewebe Morphologie und zellulären Interaktionen in den mageren und fettleibigen Staaten betroffen sind. Diese Methode kann leicht angewendet werden, um allgemeine adipösen Struktur zu analysieren, durch das Sammeln von Gewebe Autofluoreszenz Signal in den grünen Kanal. Wir haben bereits gezeigt, dass die Autofluoreszenz Signal in adipösen Überlagerungen günstig mit Perilipin Färbung, eine häufig verwendete Markierung Reifen Adipozyten12zu skizzieren. Scannen einer posterioren subkutane Fettpolster (PsWAT) mit einem Licht-Blatt-Mikroskop mit geringer Vergrößerung (1.3 X) zeigt beispielsweise die lobuläre Organisation der Adipozyten (Abb. 1A und B). Weitere detaillierte Informationen, wie die Größe der Fettzellen, kann durch Zoomen in die Regionen von Interesse mit stärkerer Vergrößerung (4 X) (Abbildung 1 und D) aufgedeckt werden.
Adipo-Clear eignet sich besonders zur Visualisierung von faserigen Strukturen wie Nerven Projektionen und Blutgefäße, die schwierig zu erfassen oder auf Dünnschliffen Spur sind. Das sympathische Nervensystem (SNS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Lipolyse und Thermogenese im Fettgewebe4,5. Imaging eine PsWAT Pad gebeizt mit Tyrosin-Hydroxylase (TH), zeigt ein Marker für SNS, die Strukturen, die als große Nervenbündel sowie Blutgefäß Innervation und dichten terminal Arborization in das Gewebe Parenchym (Abbildung 2A-H) angezeigt. Darüber hinaus zeigen die TH + parenchymatösen Projektionen regionale Variation innerhalb PsWAT, mit der inguinalen Teil mit höherer Dichte im Verhältnis zu der Dorsolumbar Teil (Abbildung 2E-H; Ergänzende Film 1). Unsere bisherige Arbeit hat gezeigt, dass SNS terminal Arborization rechnerisch zurückverfolgt werden und mit dem FilamentTracer-Tool Imaris Software um zu beurteilen, die Dichte der Innervation12rekonstruiert.
Fettgewebe ist bekanntermaßen stark durchblutet werden. Die Veränderungen in metabolischen Anforderungen von Fettgewebe sind oft verbunden mit der dynamischen Umgestaltung von seinem Gefäßsystem6,7. Robuste und schnelle Profilierung des gesamten Gewebes Gefäßsystem bieten zusätzliche objektive Analyse für die Umgestaltung der Blutgefäße. Verwendung von Thrombozyten Endothelzellen Adhäsionsmolekül (PECAM-1, auch bekannt als CD31) als Marker für Label Blutgefäße, beobachteten wir, dass alle Fettzellen in Kontakt mit den Kapillaren durch das ganze Gewebe (Abbildung 3A-H sind; Ergänzende Movie 2), unterstützt die hohe Nachfrage nach effizienten Nährstoff und Sauerstoff im Fettgewebe auszutauschen.
Immunzellen sind eine weitere wichtige Komponente des Fettgewebes. Im adipösen Zustand wird Fettgewebe entzündet, die durch das Eindringen von Pro-inflammatorischen Makrophagen begleitet wird, die "Krone" Strukturen rund um tote Adipozyten15,16bilden. Fettpolster von adipösen Tieren sind besonders schwierig, aufgrund ihrer Größe und höheren Lipidgehalt klar. Allerdings kann die erweiterte Version des Adipo-Clear (siehe Tabelle 2 für große Gewebe oder Gewebe mit hohem Fettgehalt) konsistent Räumung der ganz hohen Fett-beladenen Gewebe erreichen. Beispielsweise zeigt epididymal Fett von einer Maus mit 16 Wochen der fettreichen Diät gefüttert Dichte "Krone-ähnliche Strukturen", Immunolabeled durch CD68, durch das ganze Gewebe (Abb. 4A und B). Wichtig ist, optische Teile aus verschiedenen Positionen über die gesamte Tiefe des Gewebes genommen (~ 4-5 mm) zeigen ebenfalls gestochen scharfe Bilder, zeigen komplette Lichtung des Gewebes (Abbildung 4-F).
Abbildung 1: Analyse der Fettgewebe Morphologie der Autofluoreszenz-Signal verwendet. Alle Platten sind leichte Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Bilder von ein Adipo-Clear bereit PsWAT Pad isoliert von einem 8 Wochen alten C57Bl/6J männlichen Maus untergebracht bei RT Die Autofluoreszenz-Signal wird durch das Scannen der geräumten Probe mit den grün-Kanal gesammelt. Optische Teile (Querschnitte aus der Mitte der Probe) der Dorsolumbar Region (A) und der inguinalen Region (B) von 1,3 X Objektiv genommen. (C, D) Hoch-Vergrößerung (4 X) optischen Abschnitte der geschachtelten Regionen von A und B. Lymphknoten sind durch Sternchen angezeigt. Maßstabsleisten sind in jedem Panel angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: 3D imaging der sympathische Innervation im Fettgewebe. Alle Platten sind LSFM Bilder von einem PsWAT beschriftet mit Tyrosin-Hydroxylase (TH) (das gleiche Beispiel wie in Abbildung 1). Maximale Projektionen der rekonstruierten Dorsolumbar Region (A) und inguinalen Region (B) von 1,3 X Ziel getroffen. (C, D) Optische Teile aus der Mitte der A und B. (E, F) Hoch-Vergrößerung (4 X) optischen Abschnitte der geschachtelten Regionen von C und D. (G, H) Hohe Vergrößerung optischer Abschnitte der Überlagerung zwischen TH (grün) und Autofluoreszenz (Magenta). Pfeilspitzen zeigen unterschiedliche Muster der sympathische Innervation: (1) Nervenbündel; (2) Blutgefäß Innervation; (3) Parenchym Arborization. Lymphknoten sind durch Sternchen angezeigt. Maßstabsleisten sind in jedem Panel angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: 3D imaging der Blutgefäße im Fettgewebe. Alle Platten sind LSFM Bilder von einem CD31 mit der Bezeichnung PsWAT (das gleiche Beispiel wie in Abbildung 1). (A, B) Maximale Projektionen der rekonstruierten Dorsolumbar Region (A) und inguinalen Region (B) von 1,3 X Ziel getroffen. (C, D) Optische Teile aus der Mitte der A und B. (E, F) Hoch-Vergrößerung (4 X) optischen Abschnitte der geschachtelten Regionen von C und D. (G, H) Hohe Vergrößerung optischer Abschnitte der Überlagerung zwischen CD31 (rot) und Autofluoreszenz (Cyan). Lymphknoten sind durch Sternchen angezeigt. Maßstabsleisten sind in jedem Panel angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: 3D-Bildgebung der "Krone-ähnliche Strukturen" im Fettgewebe. Alle Platten sind LSFM Bilder von einer Adipo-Clear bereit eWAT Pad isoliert von einer männlichen Maus mit fettreichen Diät für 16 Wochen gefüttert. Die Probe war Immunolabeled mit CD31 und CD68. (A, B) Maximale Projektionen der rekonstruierten Probe mit einer Gesamttiefe von mehr als 4 mm. (A) -X-Y-Ansicht. (B) Y-Z-Ansicht. (C-F) Optische Teile aus der angegebenen Tiefe in B. Maßstabsleisten sind in jedem Panel angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Puffer | Chemische | Endkonzentration |
| B1N Puffer | ||
| Glycin | 0,3 M | |
| Triton x-100 | 0,1 % (V/V) | |
| H2O | Lösungsmittel | |
| Natriumazid (Konservierungsmittel, optional) | 0,01 % (w/V) | |
| Justieren Sie pH bis 7 mit NaOH | ||
| PTxwH Puffer | ||
| 10 X PBS | 1 x | |
| Triton x-100 | 0,1 % (V/V) | |
| Tween 20 | 0,05 % (V/V) | |
| Heparin | 2 µg/ml | |
| H2O | Lösungsmittel | |
| Natriumazid (Konservierungsmittel, optional) | 0,01 % (w/V) |
Tabelle 1: Liste der Puffer und Lösungen. Diese Tabelle enthält Rezepte für die Puffer in Adipo-Clear verwendet. Für die langfristige Speicherung der Puffer empfiehlt es sich, als Konservierungsmittel Natriumazid hinzufügen.
| Puffer | Kleine Gewebe | Großen Gewebe (oder mit hohem Fettgehalt) | Temperatur |
| 20 % Methanol/B1n Puffer | 30 min | 7. | 4° C |
| 40 % Methanol/B1n Puffer | 30 min | 7. | 4° C |
| 60 % Methanol/B1n Puffer | 30 min | 7. | 4° C |
| 80 % Methanol/B1n Puffer | 30 min | 7. | 4° C |
| 100 % methanol | 30 min | 7. | 4° C |
| DCM | 30 min | 7. | 4° C |
| DCM | 7. | 2-3 Stunden oder über Nacht | 4° C |
| DCM | 30 min | 2 h | 4° C |
| 100 % methanol | 30 min | 7. | 4° C |
| 100 % methanol | 30 min | 7. | 4° C |
| Optional: 5 % H2O2/methanol | Über Nacht | Über Nacht | 4° C |
| 80 % Methanol/B1n Puffer | 30 min | 7. | 4° C |
| 60 % Methanol/B1n Puffer | 30 min | 7. | 4° C |
| 40 % Methanol/B1n Puffer | 30 min | 7. | 4° C |
| 20 % Methanol/B1n Puffer | 30 min | 7. | 4° C |
| B1N Puffer | 30 min | 7. | RT |
| B1N Puffer | Über Nacht | Über Nacht | RT |
| PTxwH Puffer | 2 h | 2 h | RT |
| PTxwH Puffer | Lagerung | Lagerung | 4° C |
| Primärantikörper Inkubation | 3 Tage | 4-5 Tage | RT |
| Sekundärantikörper Inkubation | 3 Tage | 4-5 Tage | RT |
Tabelle 2: Inkubation Zeiten für delipidierung und Immunostaining. Diese Tabelle enthält die Inkubationszeiten für die delipidierung und Immunostaining Schritte des Protokolls. Das ungefähre Gewicht der kleinen Gewebe ist < 300 mg.
Ergänzende Film 1: 3D imaging der sympathische Innervation im Fettgewebe. Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Immunostaining eine PsWAT Probe (gleich wie in Abbildung 2). Der Film zeigt den Durchflug der optischen Abschnitte (4 X aus der Dorsolumbar) und inguinalen Regionen des PsWAT, wird mit einer Gesamttiefe von ~ 2 mm. TH in grün dargestellt. Autofluoreszenz ist in Magenta dargestellt. Die Region von den Dorsolumbar Teil scheint geringeren SNS Dichte haben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Movie 2: 3D Bildgebung des Gefäßsystems im Fettgewebe. CD31 Immunostaining eine PsWAT Probe (gleich wie in Abbildung 3). Der Film zeigt den Durchflug der optischen Abschnitte (4 X aus der Dorsolumbar) und inguinalen Regionen des PsWAT, wird mit einer Gesamttiefe von ~ 2 mm. CD31 in rot angezeigt. Autofluoreszenz wird in Cyan angezeigt. Alle Fettzellen scheinen eng von Kapillaren umgeben zu sein. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Adipo-Clear ist eine einfache und robuste Methode für das clearing von Fettgewebe, die leicht in eine reguläre Laboraufbau durchgeführt werden kann. Im Vergleich zu anderen lösemittelhaltigen Clearing-Methoden wie iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear ist besonders optimiert für das clearing von Fettgewebe und andere Gewebe mit hohem Fettgehalt. Der delipidierung Schritt vollständig entfernt Lipide aus Fettgewebe, und daher erleichtert Immunolabeling durch das ganze Gewebe und weitgehend minimiert Streulicht, End-to-End-Bildgebung ohne Verlust der XY-Auflösung ermöglicht. Neben Licht-Blatt Fluoreszenz Mikroskope, die bieten schnelle Scannen von großen Gewebe, konfokale und zwei-Photonen-Mikroskope auch einsetzbar, höhere Auflösung und mehr Details zu erhalten.
Methanol/DCM-basierten delipidierung ist ein entscheidender Schritt. Unzureichende delipidierung kann zu unscharfen Bildern, vor allem gegen den Kern des Gewebes führen. Es ist wichtig, die vollständige Entfernung von Lipiden zu gewährleisten, durch die Beobachtung von adipöser Proben im DCM versinken. Die Proben, die eine Mischung aus Gewebetypen (z.B. epididymal Fett mit Nebenhoden und Hoden befestigt) enthalten können nicht vollständig selbst mit erweiterten DCM Inkubationen sinken. Jedoch sollten Bebrüten diese Proben über Nacht in DCM komplette delipidierung erreichen. Aufgrund der Denaturierung von Proteinen in diesen organischen Lösungsmitteln möglicherweise bestimmte Antikörper nicht kompatibel mit der delipidierung Schritt. Daher wird die Auswahl eines geeigneten Antikörpers ein weiterer wichtiger Schritt für dieses Protokoll. Es empfiehlt sich, zuerst die Antikörper auf Methanol behandelten Gewebeschnitte oder kleine Stücke des Gewebes durch Adipo-Clear verarbeitet zu validieren. Ebenso sollte die Kompatibilität von chemischen Farbstoffen mit Methanol/DCM/DBE auch vor der Anwendung getestet werden.
Eine Einschränkung des Protokolls ist das abschrecken der endogen ausgedrückten fluoreszierende Proteine. Die organischen Lösungsmittel basierenden delipidierung und Clearing Schritte denaturieren weitgehend solcher Proteine. Um endogene fluoreszierende Proteine zu visualisieren, braucht Antikörper Kennzeichnung eingesetzt werden. Die Verfügbarkeit von geeigneten Antikörper Kombinationen schränkt die Fähigkeit, führen hoch gemultiplext imaging. Die aktuelle verfügbare Licht-Blatt Mikroskope erlauben uns nur Bild bis zu 4 Kanäle.
Adipo-Clear eignet sich besonders zur Visualisierung von faserigen Strukturen und Zell-Populationen, die relativ geringen Dichte im Fettgewebe haben. Imaging-dichten Signale wird jedoch mit diesem Ansatz beschränkt. Wenn Antikörper verwendet werden, um dichten Signale zu beschriften, können sie durch die Epitope befindet sich auf der Oberfläche der Probe, blockiert den Zugriff auf das innere Gewebe abgesondert werden. Daher sind kleine chemische Sonden empfohlen, Dichte Strukturen zu beflecken. Aufgrund der gleichen Ausgabe beschränkt sich die Anwendung der Adipo-Clear auf braunen Fettgewebe. Braune Fett ist ein adipöser Depot mit dichten Strukturen. Neben dichten Blutgefäße und Nerven Innervation ist es auch mit kleinen Fettzellen dicht, die eine große Anzahl von Mitochondrien17enthalten. Bei der Anwendung CD31 und TH war Färbung mit dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben, braune Fett, nur die Oberfläche der Probe (Daten nicht gezeigt) bezeichnet. Darüber hinaus produziert braune Fett starken Gewebe Autofluoreszenz, führt zu niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis während der Bildgebung. Es wird empfohlen, braune Fett in kleinere Stücke schneiden und chemische Sonden wenn möglich verwenden.
Insgesamt Adipo-Clear ermöglicht gleichzeitige profiling von mehreren Strukturen mit hoher Auflösung im gesamten Fettgewebe. Mit diesem Ansatz kann man analysieren, wie Strukturen wie Nerven Projektionen, Gefäßsystem, Immunzellen und Adipozyten während der gesamten fettlappen interagieren. Freuen Sie sich auf unvoreingenommene Bilddaten durch Schneiden oder Auswahl der Regionen von Interesse zu vermeiden. Adipo-Clear kann auch angewendet werden, um adipöse Entwicklung z. B. Ereignisse während der frühen Morphogenese sowie die Verteilung der Adipocyte Vorläuferzellen und Vorläufer Zellen in Linie Ablaufverfolgung Studien zu studieren. Neben Fettgewebe kann Adipo-Clear auch 3D vollständig-hängen Analyse anderer Gewebe erleichtern, die hohen Fettgehalt oder sind umgeben von Fett, wie Brustdrüse und fetthaltige Lymphknoten. Diese Methode bietet auch die Möglichkeit, die Histologie der menschlichen Fettgewebe unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Christina Pyrgaki, Tao Tong und Alison North aus Bioimaging Resource Center an der Rockefeller University für Hilfe und Unterstützung. Wir danken auch Xiphias Ge Zhu zum Film bearbeiten. Diese Arbeit wurde von Human Frontier Science Programm Organisation (PC) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
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