Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Adipo-स्पष्ट: वसा ऊतक के तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक ऊतक समाशोधन विधि

doi: 10.3791/58271 Published: July 28, 2018

Summary

उच्च लिपिड सामग्री के कारण, वसा ऊतक पारंपरिक ऊतकवैज्ञानिक तरीकों का उपयोग कर कल्पना करने के लिए चुनौती दी गई है । Adipo-स्पष्ट एक ऊतक समाशोधन तकनीक है कि मजबूत लेबलिंग और उच्च संकल्प वसा ऊतक के volumetric फ्लोरोसेंट इमेजिंग की अनुमति देता है । यहां, हम नमूना तैयारी, उपचार, धुंधला, समाशोधन, और इमेजिंग के लिए बढ़ते के लिए तरीकों का वर्णन ।

Abstract

वसा ऊतक ऊर्जा homeostasis और thermoregulation में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है । यह विभिंन प्रकार के adipocytes से बना है, साथ ही adipocyte पुरोगामी, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, fibroblasts, रक्त वाहिकाओं, और तंत्रिका अनुमानों । हालांकि सेल प्रकार विनिर्देश के आणविक नियंत्रण और कैसे इन कोशिकाओं बातचीत तेजी से delineated किया गया है, इन वसा निवासी कोशिकाओं की एक अधिक व्यापक समझ उनके वितरण और वास्तुकला visualizing द्वारा प्राप्त किया जा सकता पूरे ऊतक के दौरान । मौजूदा immunohistochemistry और इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण वसा प्रोटोकॉल का विश्लेषण करने के लिए पतली तेल-एंबेडेड वर्गों पर भरोसा करते हैं । हालांकि, पतले वर्गों ऊतक के केवल एक छोटे से हिस्से पर कब्जा; नतीजतन, निष्कर्ष ऊतक के किस भाग से पक्षपातपूर्ण हो सकता है विश्लेषण किया है । इसलिए हम एक वसा ऊतक समाशोधन तकनीक, Adipo स्पष्ट विकसित की है, पूरे वसा ऊतकों में आणविक और सेलुलर पैटर्न के व्यापक तीन आयामी दृश्य की अनुमति है । Adipo-स्पष्ट iDISCO/iDISCO + से अनुकूलित किया गया था, विशिष्ट संशोधनों के साथ पूरी तरह से ऊतक में संग्रहीत लिपिड को हटाने के लिए बनाया है, जबकि देशी ऊतक आकृति विज्ञान के संरक्षण. प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में, हम यहां Adipo के उपयोग-स्पष्ट विधि एक पूरे वसा ऊतक के उच्च संकल्प volumetric छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन करते हैं ।

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

हाल ही में जब तक, वसा ऊतक वसा कोशिकाओं का एक अमली संग्रह के रूप में की कल्पना की थी । पिछले कुछ दशकों में, हमारी समझ और अधिक परिष्कृत हो गया है, वसा के साथ अब एक जटिल adipocytes के विभिंन प्रकार युक्त अंग होना मांयता प्राप्त है, साथ ही साथ adipocyte पुरोगामी, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, fibroblasts, vasculature, और तंत्रिका अनुमानों । इन वसा-निवासी कोशिकाओं के बीच बातचीत वसा ऊतक और जीव फिजियोलॉजी और pathophysiology1पर प्रभाव स्पष्ट किया है । हालांकि उभरते अध्ययन महत्वपूर्ण आणविक कुछ बातचीत अंतर्निहित तंत्र सुलझाया है, एक अधिक व्यापक समझ तीन आयामों (3 डी) में पूरे ऊतक के विश्वसनीय संरचनात्मक रूपरेखा की आवश्यकता है ।

वसा ऊतक आकृति विज्ञान के हमारे वर्तमान ज्ञान मोटे तौर पर अपेक्षाकृत उच्च आवर्धन इमेजिंग (10x से अधिक)2,3के साथ पतले वर्गों (5 माइक्रोन) के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण पर आधारित है । हालांकि, इस approach कई महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । पहला, ऐसी सहानुभूति तंत्रिकाओं और vasculature, जो वसा समारोह4,5,6,7में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है के रूप में जटिल रेशा संरचनाओं का मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल है पतले वर्गों के माध्यम से । दूसरा, अपनी प्रतीत होता है अमली आकार और प्रतिनिधि संरचनात्मक इकाइयों की कमी के कारण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, यह मुश्किल है वसा ऊतक संरचनाओं केवल अनुभाग धुंधला पर आधारित की सराहना करते हैं । तीसरा, वसा ऊतक एक बहुत ही उच्च लिपिड सामग्री है, लगातार धारावाहिक वर्गों है कि 3 डी संरचनात्मक पुनर्निर्माण, एक पारंपरिक पूरे मस्तिष्क आकृति विज्ञान8अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल के लिए उपयुक्त है प्राप्त करने में चुनौतियों का निर्माण । इन कारकों को देखते हुए, वहां एक पूरे माउंट दृष्टिकोण है कि एक पूरे वसा डिपो के 3 डी दृश्य प्रदान करते हुए अभी भी सेलुलर संकल्प प्राप्त कर सकते है के लिए एक बड़ी जरूरत है ।

एक पूरे अंग के 3 डी volumetric इमेजिंग प्रकाश बिखराव के अस्पष्ट प्रभाव के कारण चुनौतीपूर्ण है । जैविक ऊतकों में प्रकाश बिखराव का एक प्रमुख स्रोत लिपिड-जलीय इंटरफेस से आता है । हालांकि लिपिड को हटाने के द्वारा बिखराव को खत्म करने के प्रयास एक सदी से अधिक के लिए चल रहा है, वहां हाल ही में9नवाचारों की एक बड़ी संख्या में किया गया है । एक ऐसी नव विकसित ऊतक-समाशोधन विधि immunolabeling है-सक्षम 3d इमेजिंग विलायक मंजूरी दे दी अंगों (iDISCO/iDISCO +)10,11। हालांकि, वसा ऊतक एक विशेष अपने लिपिड के उच्च स्तर दिया चुनौती प्रस्तुत करता है, और इसलिए, iDISCO/iDISCO + प्रोटोकॉल के लिए अतिरिक्त संशोधनों को पूरी तरह से लिपिड निकालने जबकि टूट से ऊतक की रक्षा करने के लिए आवश्यक हैं । संशोधित प्रोटोकॉल हम विकसित किया है, अब Adipo कहा जाता है-स्पष्ट, उच्च संकल्प volumetric इमेजिंग12के लिए उपयुक्त इष्टतम पारदर्शिता को प्राप्त करने के लिए वसा ऊतक के मेथनॉल/dichloromethane आधारित लिपिड रोजगार । क्योंकि लिपिड कदम काफी हद तक बुझती endogenously ऐसे GFP और आरएफपी के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त की, ऐसे प्रोटीन के दृश्य immunolabeling द्वारा प्राप्त किया जाना चाहिए । कुल मिलाकर, यह सरल और मजबूत प्रोटोकॉल ऊतक के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है-वसा निवासी कोशिकाओं के स्तर संगठन, adipocyte जनक कोशिकाओं के वंश अनुरेखण, और विकास के दौरान वसा morphogenesis ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

पशु देखभाल और प्रयोग रॉकफेलर विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. टिशू वडा

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के ~ 20 मिलीलीटर के साथ मानक intracardiac छिड़काव प्रदर्शन जब तक रक्त पूरी तरह से ऊतक से हटा दिया है ।
  2. perfusate स्विच करने के लिए निर्धारण समाधान के ~ 20 मिलीलीटर (1x पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए)) 4 ° c पर जब तक गर्दन और पूंछ काफी stiffened है ।
    सावधानी: पीएफए विषाक्त है । त्वचा, आंखों, और श्लेष्मा झिल्ली के साथ संपर्क से बचें । समाधान एक धुएं हुड के अंदर किया जाना चाहिए ।
  3. काटना ब्याज की मोटी पैड ध्यान से इसे नुकसान पहुँचाए बिना पूरे वसा पैड को दूर करने के लिए । कुंद-समाप्त संदंश का प्रयोग करें चुटकी या ऊतक निचोड़ से बचने के लिए । किसी भी फर से विच्छेदित ऊतक को दूषित होने से बचें ।
  4. पोस्ट-4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1x पंजाब में 4% पीएफए में ऊतक ठीक । प्रत्येक वसा पैड के लिए, के साथ पोस्ट-फिक्स एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में निर्धारण समाधान के ~ 10 मिलीलीटर ।
  5. ऊतक धो 3 बार (1 एच प्रत्येक) 1x पंजाबियों के साथ कमरे के तापमान पर (आरटी) ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पंजाब में अल्पकालिक (2 सप्ताह) के लिए ऊतक की दुकान और प्रकाश से सुरक्षित । लंबी अवधि के भंडारण (जैसे, 1-2 वर्ष) के लिए, ०.०५% सोडियम azide के साथ 1x पंजाबियों के लिए बफर स्विच (एक परिरक्षक के रूप में) ।
    चेतावनी: सोडियम azide अत्यधिक विषाक्त जब मौखिक रूप से निगला या त्वचा के माध्यम से अवशोषित कर लेता है । केंद्रित सोडियम azide समाधान (5% या अधिक से कम) एक धुएं हुड के नीचे संभाला जाना चाहिए ।

2. लिपिड और Permeabilization

समय: 1-2 दिन

  1. 20%, ४०%, ६०%, और ८०% मेथनॉल ढाल B1n बफर (तालिका 1) (v/v) के साथ, जैसे, 20% मेथनॉल/B1n बफर के लिए तैयार, मेथनॉल के 20 मिलीलीटर और B1n बफर के एमएल मिलाएं । सभी बफ़र्स 4 ° c पर संग्रहीत है । Glycine क्रिस्टल ६०% और ८०% मेथनॉल/B1n बफ़र्स से संतृप्ति के कारण वेग होगा । क्रिस्टल को हटाने से बचें; निंनलिखित धोने के लिए तरल समाधान का उपयोग करें ।
    चेतावनी: मेथनॉल अस्थिर, अड़चन, और ज्वलनशील है । त्वचा या आंख के संपर्क से बचें ।
  2. धीरे से एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत नमूने से बालों को हटा दें । किसी भी बाल, एक प्रकार का वृक्ष, या नमूने से जुड़ा मलबे इमेजिंग के दौरान छाया का कारण होगा । एक नई ट्यूब में साफ नमूना स्थानांतरित ।
  3. बर्फ पर या 4 ° c पर सभी निंन चरणों का पालन जब तक अंयथा संकेत दिया । छोटे नमूनों के लिए (जैसे, पीछे उपचर्म/perigonadal वसा पैड युवा दुबला चूहों से), समाधान की १.६ मिलीलीटर के साथ 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग करें । बड़े नमूनों या उच्च लिपिड सामग्री (जैसे, मोटापे से ग्रस्त चूहों से वसा पैड) के साथ नमूनों के लिए, समाधान के 4 मिलीलीटर के साथ 5 मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग करें ।
    1. प्लेस नमूनों से युक्त ट्यूबों क्षैतिज एक कक्षीय शेखर पर सेट ~ १०० rpm पर । सुनिश्चित करें कि नमूने ट्यूब के अंदर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सकते हैं ।
  4. 20%, ४०%, ६०%, ८०%, और १००% मेथनॉल/B1n बफ़र के लिए संकेत दिया समय (तालिका 2) के एक वर्गीकृत श्रृंखला में नमूना निर्जलीकरण । ले-आउट समाधान को छोटा करें ।
  5. १००% dichloromethane (डीसीएम) (3 बार) के साथ नमूना Delipidate, प्रत्येक तालिका 2में दर्शाई गई मशीन समय के साथ । सैंपल को दूसरी और तीसरी डीसीएम बहाकर के अंत में ट्यूब के नीचे तक सिंक करना चाहिए । यदि नहीं, तो पूर्ण लिपिड को सुनिश्चित करने के लिए मशीन समय का विस्तार (उदाहरणके लिए, 30 मिनट से 1-2 घंटे तक का विस्तार) ।
    चेतावनी: डीसीएम को धुएं के हुड के अंदर संभालना चाहिए । भंडारण और microcentrifuge ट्यूबों कि मशीन के लिए के लिए कर रहे है से बना रहे है के लिए कांच कंटेनरों का प्रयोग करें । microcentrifuge ट्यूबों का इस्तेमाल डीसीएम के लंबी अवधि के भंडारण के लिए नहीं किया जाना चाहिए । पेट्री व्यंजन और सीरम वैज्ञानिक पिपेट कि polystyrene से बने हैं डीसीएम के साथ संगत नहीं हैं । डीसीएम अत्यधिक अस्थिर है । नमूना ताजा समाधान में जल्दी से सुखाना को रोकने के लिए स्थानांतरण ।
  6. दो बार संकेत समय (तालिका 2) के लिए १००% मेथनॉल के साथ धो लें ।
  7. वैकल्पिक: नमूना अच्छी तरह से perfused नहीं है, तो शेष लाल रक्त कोशिकाओं से हीमोग्लोबिन का रंग मजबूत autofluorescence कारण हो सकता है. मेथनॉल में 5% एच22 के साथ ब्लीच (30% एच2के 1 खंड हे2 मेथनॉल के 5 संस्करणों) 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ।
  8. rehydrat एक औंधा मेथनॉल/B1n बफ़र श्रृंखला में नमूना: ८०%, ६०%, ४०%, 20% मेथनॉल/B1n, और १००% B1n बफ़र (2 बार) के लिए संकेत दिया समय (तालिका 2) ।
  9. आर टी पर 2 एच के लिए PTxwH बफर (तालिका 1) के साथ नमूना धो लें ।
  10. delipidated नमूना PTxwH बफ़र में 4 ° C (1 वर्ष तक) पर संग्रहीत करें या immunostaining चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें ।

3. पूरे माउंट Immunostaining

समय: 8-10 दिन

नोट: निंनलिखित चरणों के सभी आरटी पर किया जाना चाहिए जब तक अंयथा नोट, मिलाते हुए और प्रकाश से सुरक्षा के साथ । छोटे नमूनों के लिए, समाधान की १.६ मिलीलीटर के साथ 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग करें । बड़े नमूनों के लिए, समाधान के 4 मिलीलीटर के साथ 5 मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग करें । यह पहले ऊतक या मेथनॉल-इलाज ऊतक वर्गों के छोटे टुकड़े पर एंटीबॉडी सत्यापित करने के लिए सिफारिश की है ।

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी PTxwH बफ़र में अनुशंसित एकाग्रता को पतला करें । एंटीबॉडी हाला या एग्रीगेट शुरू करने को रोकने के लिए 10 मिनट के लिए ~ २०,००० x g पर पतला एंटीबॉडी समाधान केंद्रापसारक ।
  2. (तालिका 2) संकेत दिया समय के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ delipidated नमूना मशीन ।
  3. 5 मिनट, 10 मिनट, 15 मिनट, 20 मिनट, 1 एच, 2 एच, 4 एच, और रात भर: गर्मी चरणों की एक श्रृंखला में PTxwH बफर के साथ नमूना धो लो ।
  4. द्वितीयक एंटीबॉडी PTxwH बफ़र में अनुशंसित एकाग्रता करने के लिए पतला है । एंटीबॉडी हाला या एग्रीगेट शुरू करने को रोकने के लिए 10 मिनट के लिए ~ २०,००० x g पर पतला एंटीबॉडी समाधान केंद्रापसारक ।
    नोट: ऊतक autofluorescence की वजह से उच्च पृष्ठभूमि से बचने के लिए, fluorophores के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित कि लाल और दूर लाल क्षेत्रों में प्रकाश का उत्सर्जन की सिफारिश कर रहे हैं. लेजर एक खुर्दबीन पर उपलब्ध लाइनों की संख्या पर निर्भर करता है, अप करने के लिए 3-4 मार्करों एक नमूना में एक साथ imaged किया जा सकता है.
  5. संकेत समय (तालिका 2) के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के साथ नमूना मशीन ।
  6. धोने का नमूना PTxwH बफर के साथ मशीन की एक श्रृंखला में कदम: 5 मिनट, 10 मिनट, 15 मिनट, 20 मिनट, 1 एच, 2 एच, 4 एच, और रात भर ।
  7. वैकल्पिक: नाजुक है कि ऊतक प्रकार के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1x पंजाब में 4% पीएफए के साथ दाग ऊतक ठीक ऊतक आकृति विज्ञान की रक्षा में मदद करने के लिए ।
    नोट: यह चरण इमेजिंग पृष्ठभूमि में वृद्धि हो सकती है । यह वसा ऊतक के लिए इस कदम का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक नहीं है ।
  8. 5 मिनट, 10 मिनट, और 30 मिनट: मशीन चरणों की एक श्रृंखला में 1x पंजाबियों के साथ नमूना धो लें ।
  9. धीरे एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत नमूना से एक प्रकार का वृक्ष निकालें ।

4. ऊतक समाशोधन

समय: 1-2 दिन

  1. वैकल्पिक: प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते नमूना की सुविधा के लिए agarose में नमूना एंबेड ।
    नोट: यह कदम दृढ़ता से इमेजिंग के दौरान इसके आकार को स्थिर करने के लिए वसा ऊतक के लिए सिफारिश की है ।
    1. 1x पंजाब (w/v) में 1% agarose के साथ एंबेडिंग समाधान तैयार करें । करने के लिए अत्यधिक गर्मी नमूना उजागर से बचने के लिए ~ ४० ° c के लिए embedding समाधान शांत ।
    2. एक सांचे में साफ नमूना प्लेस (जैसे, पेट्री पकवान या वजन नाव) और यह वांछित स्थिति में व्यवस्था । किसी भी तरल carryover से बचें । धीरे नमूना पर एंबेडिंग समाधान डालना । किसी भी हवाई बुलबुले से बचें ।
    3. agarose पूरी तरह से आर टी पर जमना चलो एक नमूना युक्त ब्लॉक काट ।
      ध्यान दें: रात भर की मशीन सहित निंनलिखित चरणों के सभी RT पर किया जाना चाहिए, मिलाते हुए और प्रकाश से सुरक्षा के साथ । छोटे नमूनों के लिए, समाधान की १.६ मिलीलीटर के साथ 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग करें । बड़े नमूनों के लिए, समाधान के 4 मिलीलीटर के साथ 5 मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग करें ।
  2. निर्जलीकरण एच2ओ के साथ मेथनॉल ढाल में नमूना: 25%, ५०%, ७५%, और १००% (3 बार) के लिए संकेत दिया समय (तालिका 2) ।
    नोट: नमूना १००% मेथनॉल कदम पर रातोंरात छोड़ दिया जा सकता है ।
  3. झटकों के साथ 1 घंटे के लिए १००% डीसीएम में नमूना मशीन (3 बार) । नमूना प्रत्येक डीसीएम धोने के अंत में ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक करना चाहिए । यदि नहीं, मेथनॉल की पूरी हटाने सुनिश्चित करने के लिए मशीन समय का विस्तार । सैंपल को १००% डीसीएम स्टेप पर रातोंरात छोड़ा जा सकता है ।
  4. अपवर्तन सूचकांक मिलान प्राप्त करने के लिए हल्के झटकों के साथ रातोंरात dibenzyl ईथर (DBE) में नमूना मशीन ।
    नोट: नमूना अंततः दृश्यमान प्रकाश में पारदर्शी हो जाएगा ।
    सावधानी: DBE खतरनाक है । त्वचा के साथ किसी भी संपर्क से बचें । यह डबल स्तरित दस्ताने के साथ एक धुएं हुड के अंदर संभाल । जैसे ही यह DBE के साथ प्रदूषित है दस्ताने त्यागें । भंडारण और microcentrifuge ट्यूबों के लिए ग्लास कंटेनरों का प्रयोग करें () मशीन के लिए । microcentrifuge ट्यूबों DBE के दीर्घकालिक भंडारण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए । पेट्री व्यंजन और सीरम वैज्ञानिक पिपेट जो polystyrene से बने हैं DBE के साथ संगत नहीं हैं । १००% इथेनॉल के साथ किसी भी फैल साफ ।
  5. 2 एच के लिए हल्के झटकों के साथ ताजा DBE के साथ नमूना मशीन अंधेरे में आर टी पर नमूना स्टोर या इमेजिंग करने के लिए सीधे आगे बढ़ना ।
    नोट: नमूने एक महीने के भीतर imaged किया जा करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. हालांकि कुछ fluorophores दूसरों की तुलना में अधिक स्थिर हैं, इस स्तर पर नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण की सिफारिश नहीं है ।

5. माइक्रोस्कोपी

  1. DBE के साथ संगत है कि एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग ।
    नोट: केवल उद्देश्य है कि कार्बनिक विलायक आधारित इमेजिंग के लिए अनुमोदित कर रहे है और DBE के अपवर्तन सूचकांक के साथ मिलान DBE-विसर्जित इमेजिंग में उद्देश्य सूई के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. agarose-एंबेडेड नमूना एक धारक है कि इमेजिंग के दौरान आंदोलन को रोका जा सकता है पर माउंट । नमूना एक DBE भरे चैंबर में विसर्जित कर दिया ।
    2. इकट्ठा एक z-ढेर पूरे नमूने को कवर (उदाहरणके लिए, 1-2x इज़ाफ़ा) पूरे ऊतक वितरण प्राप्त करने के लिए ब्याज की मार्कर की संरचना/।
    3. उच्च आवर्धन के साथ एक उद्देश्य के लिए स्विच (उदाहरणके लिए, 4-12X आवर्धन) छवि विस्तृत संरचनाओं के लिए ब्याज के क्षेत्रों पर में ज़ूम करने के लिए ।
      नोट: कोलेजन वसा ऊतक, जो सभी वसा कोशिकाओं13चारों ओर से घेरे के extracellular मैट्रिक्स के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता है । कोलेजन एक ठेठ उत्सर्जन ५५० एनएम14के लिए लगभग ४०० एनएम को लेकर स्पेक्ट्रम है । इमेजिंग ४८८ लेजर लाइन (ग्रीन) के साथ नमूना और एक तरंग दैर्ध्य रेंज है कि कोलेजन के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के भीतर झूठ पर उत्सर्जित प्रकाश इकट्ठा (जैसे, 525-550 एनएम) ऊतक autofluorescence संकेत है, जो पहले से दिखाया गया था प्रदान करेगा चित्रित वसा कोशिका समोच्च और समग्र ऊतक वास्तुकला12.
  2. एक औंधा फोकल या एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग ।
    1. किसी भी प्लास्टिक भागों (या सील कर सकते हैं कि अन्य DBE-संगत इमेजिंग चैंबर) को छूने के बिना एक गिलास नीचे के साथ एक चैंबर स्लाइड में agarose-एम्बेडेड नमूना रखें. सुनिश्चित करें कि DBE बाहर रिसाव नहीं है ।
    2. गहरी पैठ हासिल करने के लिए अब काम कर रहे दूरियों के साथ उद्देश्य चुनें ।
      नोट: इमेजिंग चैंबर स्लाइड के नीचे कांच के माध्यम से एक औंधा फोकल या दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ किया जाना चाहिए । नमूना और सूई उद्देश्यों कि DBE-आधारित इमेजिंग के लिए सुझाव नहीं है के बीच सीधा संपर्क से बचें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adipo-स्पष्ट तैयार पूरे वसा पैड कैसे ऊतक आकृति विज्ञान और सेलुलर बातचीत दुबला और मोटापे से ग्रस्त राज्यों में प्रभावित कर रहे हैं का विश्लेषण करने के लिए 3 डी में imaged किया जा सकता है । इस विधि को ग्रीन चैनल में टिशू autofluorescence संकेत एकत्रित करके जनरल वसा स्ट्रक्चर का विश्लेषण करने के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है । हम पहले से पता चला है कि वसा में autofluorescence संकेत perilipin धुंधला, एक सामांय रूप से इस्तेमाल मार्कर परिपक्व adipocytes12रूपरेखा के साथ एहसान ओवरले । उदाहरण के लिए, एक पीछे चमड़े के नीचे वसा पैड (psWAT) कम इज़ाफ़ा के साथ एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्कैनिंग (1.3 x) adipocytes के lobular संगठन (आंकड़ा 1a और बी) से पता चलता है । अधिक विस्तृत जानकारी, जैसे adipocytes के आकार, उच्च आवर्धन (4x) (चित्रा 1C और डी) के साथ ब्याज के क्षेत्रों में ज़ूम करके पता किया जा सकता है ।

Adipo-स्पष्ट विशेष रूप से तंत्रिका अनुमानों और रक्त वाहिकाओं, जो पकड़ने या पतली वर्गों पर निशाना लगाने के लिए चुनौती दे रहे हैं के रूप में रेशा संरचनाओं visualizing के लिए उपयोगी है । सहानुभूति तंत्रिका तंत्र (एसएनएस) वसा ऊतक4,5में lipolysis और thermogenesis को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इमेजिंग एक psWAT tyrosine hydroxylase (गु), एसएनएस के लिए एक मार्कर के साथ दाग पैड, संरचनाओं कि बड़े तंत्रिका बंडलों, रक्त वाहिका इन्नेर्वतिओन, साथ ही घने टर्मिनल arborization ऊतक पैरेन्काइमा (चित्रा 2a-एच) के रूप में दिखाई देते हैं । इसके अलावा, गु + parenchymal अनुमानों psWAT के भीतर क्षेत्रीय भिंनता दिखाने के लिए, वंक्षण भाग dorsolumbar भाग के सापेक्ष उच्च घनत्व होने के साथ (चित्रा 2E-एच; अनुपूरक फिल्म 1) । हमारे पिछले काम का प्रदर्शन किया है कि एसएनएस टर्मिनल arborization गणना का पता लगाया जा सकता है और इन्नेर्वतिओन12के घनत्व का आकलन करने के लिए Imaris सॉफ्टवेयर के FilamentTracer उपकरण का उपयोग कर खंगाला ।

वसा ऊतक भारी संवहनी होने के लिए जाना जाता है । वसा की चयापचय मांगों में परिवर्तन अक्सर इसके vasculature6,7के गतिशील remodeling के साथ जुड़े रहे हैं । पूरे ऊतक vasculature के मजबूत और तेजी से रूपरेखा रक्त वाहिनियों remodeling के लिए अतिरिक्त निष्पक्ष विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं । प्लेटलेट endothelial कोशिका आसंजन अणु का उपयोग (PECAM-1, भी CD31 के रूप में जाना जाता है) के लिए एक मार्कर के रूप में रक्त वाहिकाओं लेबल, हमने देखा है कि सभी adipocytes पूरे ऊतक में केशिकाओं के साथ संपर्क में हैं (आंकड़ा 3-एच; अनुपूरक फिल्म 2), वसा में कुशल पोषक तत्व और ऑक्सीजन विनिमय के लिए उच्च मांग का समर्थन ।

प्रतिरक्षा कोशिकाओं वसा ऊतक का एक और महत्वपूर्ण घटक हैं । मोटापे से ग्रस्त राज्य में, वसा ऊतक सूजन हो जाता है, जो समर्थक भड़काऊ मैक्रोफेज की घुसपैठ के साथ है कि फार्म "मुकुट की तरह" मृत adipocytes15,16के आसपास संरचनाओं । मोटे जानवरों से वसा पैड विशेष रूप से उनके बड़े आकार और उच्च लिपिड सामग्री के कारण स्पष्ट करने के लिए मुश्किल हैं । हालांकि, Adipo के विस्तारित संस्करण-स्पष्ट ( तालिका 2 में बड़े ऊतक या उच्च वसा सामग्री के साथ ऊतक के लिए वर्णित) पूरे उच्च वसा से लदी ऊतक के लगातार समाशोधन प्राप्त कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, उच्च वसा वाले आहार के 16 हफ्तों के साथ खिलाया एक चूहे से epididymal वसा घने "मुकुट की तरह संरचनाओं से पता चलता है", CD68 द्वारा immunolabeled, पूरे ऊतक (चित्रा 4a और बी) भर में । महत्वपूर्ण बात, ऑप्टिकल ऊतक (~ 4-5 मिमी) की पूरी गहराई से अधिक विभिन्न पदों से लिया वर्गों समान रूप से तेज छवियों दिखाने के लिए, ऊतक के पूर्ण समाशोधन का प्रदर्शन (चित्र 4c-F).

Figure 1
चित्रा 1: autofluorescence संकेत का उपयोग वसा ऊतक आकृति विज्ञान का विश्लेषण. सभी पैनलों प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) एक Adipo-स्पष्ट तैयार psWAT एक 8 से अलग पैड की छवियां-सप्ताह पुराने C57Bl/6J पुरुष माउस आरटी पर स्थित हैं । autofluorescence संकेत ग्रीन चैनल के साथ मंजूरी दे दी नमूना स्कैनिंग द्वारा एकत्र की है. dorsolumbar क्षेत्र (A) और वंक्षण क्षेत्र ( बी) द्वारा लिए गए 1.3 x उद्देश्य के ऑप्टिकल सेक्शन (नमूने के मध्य से क्रॉस-सेक्शन) । (सी, डी) A और Bसे बॉक्स्ड क्षेत्रों के उच्च-आवर्धन (4x) ऑप्टिकल अनुभाग । लिम्फ नोड्स तारक द्वारा संकेत कर रहे हैं । प्रत्येक पैनल में स्केल पट्टियां दर्शाई गई हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: वसा ऊतक में सहानुभूति इन्नेर्वतिओन के 3 डी इमेजिंग । सभी पैनलों tyrosine hydroxylase (गु) ( चित्रा 1में के रूप में एक ही नमूना) के साथ लेबल एक psWAT के LSFM छवियों हैं । पुनर्निर्माण dorsolumbar क्षेत्र (क) और वंक्षण क्षेत्र (बी) के 1.3 x उद्देश्य द्वारा उठाए गए अधिकतम अनुमानों । (सी, डी) A और Bके मध्य से ऑप्टिकल अनुभाग । (ङ, च) सी और डीसे बॉक्स्ड क्षेत्रों के उच्च-आवर्धन (4x) ऑप्टिकल अनुभाग । (छ, ज) गु (हरा) और autofluorescence (रानी) के बीच ओवरले के उच्च आवर्धन ऑप्टिकल अनुभाग । ऐरोहेड सहानुभूति इन्नेर्वतिओन के अलग पैटर्न का संकेत: (1) तंत्रिका बंडल; (२) रक्त वाहिका इन्नेर्वतिओन; (३) parenchymal arborization. लिम्फ नोड्स तारक द्वारा संकेत कर रहे हैं । प्रत्येक पैनल में स्केल पट्टियां दर्शाई गई हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: वसा ऊतक में रक्त वाहिकाओं के 3 डी इमेजिंग । सभी पैनलों एक CD31 लेबल psWAT ( चित्र 1में के रूप में एक ही नमूना) के LSFM छवियों हैं । (A, B) पुनर्निर्माण dorsolumbar क्षेत्र (क) और वंक्षण क्षेत्र (बी) के 1.3 x उद्देश्य द्वारा उठाए गए अधिकतम अनुमानों । (सी, डी) A और Bके मध्य से ऑप्टिकल अनुभाग । (ङ, च) सी और डीसे बॉक्स्ड क्षेत्रों के उच्च-आवर्धन (4x) ऑप्टिकल अनुभाग । (छ, ज) CD31 (लाल) और autofluorescence (सियान) के बीच ओवरले के उच्च आवर्धन ऑप्टिकल वर्गों । लिम्फ नोड्स तारक द्वारा संकेत कर रहे हैं । प्रत्येक पैनल में स्केल पट्टियां दर्शाई गई हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: वसा ऊतक में "मुकुट की तरह संरचनाओं" के 3 डी इमेजिंग । सभी पैनलों एक Adipo-स्पष्ट तैयार eWAT एक पुरुष 16 सप्ताह के लिए उच्च वसा वाले आहार के साथ खिलाया माउस से अलग पैड के LSFM छवियों हैं । नमूना CD31 व CD68 के साथ immunolabeled गया । (A, B) 4 मिमी से अधिक की कुल गहराई के साथ खंगाला नमूना के अधिकतम अनुमानों (a) X-Y देखें । (B) Y-Z दृश् य । (सी-एफ) बीमें संकेत गहराई से ऑप्टिकल वर्गों । प्रत्येक पैनल में स्केल पट्टियां दर्शाई गई हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

बफ़र रासायनिक अंतिम एकाग्रता
B1n बफर
Glycine ०.३ मीटर
ट्राइटन एक्स-१०० ०.१% (वि. वि./
एच विलायक
सोडियम azide (परिरक्षक, वैकल्पिक) ०.०१% (डब्ल्यू/
NaOH के साथ 7 को पीएच समायोजित करें
PTxwH बफर
10x पंजाब 1x
ट्राइटन एक्स-१०० ०.१% (वि. वि./
20 के बीच ०.०५% (वि. वि./
हेपरिन 2 µ g/ml
एच विलायक
सोडियम azide (परिरक्षक, वैकल्पिक) ०.०१% (डब्ल्यू/

तालिका 1: बफ़र्स और समाधानों की सूची । इस तालिका में Adipo-Clear में प्रयुक्त बफ़र्स के लिए विधियां हैं । बफ़र्स की लंबी अवधि के भंडारण के लिए, यह एक परिरक्षक के रूप में सोडियम azide जोड़ने के लिए सिफारिश की है ।

बफ़र छोटे ऊतक बड़े ऊतक (या उच्च वसा सामग्री के साथ) तापमान
20% मेथनॉल/B1n बफर 30 min 1 ज 4 ° c
४०% मेथनॉल/B1n बफर 30 min 1 ज 4 ° c
६०% मेथनॉल/B1n बफर 30 min 1 ज 4 ° c
८०% मेथनॉल/B1n बफर 30 min 1 ज 4 ° c
१००% मेथनॉल 30 min 1 ज 4 ° c
Dcm 30 min 1 ज 4 ° c
Dcm 1 ज 2-3 ज, या रातोंरात 4 ° c
Dcm 30 min 2 ज 4 ° c
१००% मेथनॉल 30 min 1 ज 4 ° c
१००% मेथनॉल 30 min 1 ज 4 ° c
वै: ५% ज/methanol रात भर रात भर 4 ° c
८०% मेथनॉल/B1n बफर 30 min 1 ज 4 ° c
६०% मेथनॉल/B1n बफर 30 min 1 ज 4 ° c
४०% मेथनॉल/B1n बफर 30 min 1 ज 4 ° c
20% मेथनॉल/B1n बफर 30 min 1 ज 4 ° c
B1n बफर 30 min 1 ज आरटी
B1n बफर रात भर रात भर आरटी
PTxwH बफर 2 ज 2 ज आरटी
PTxwH बफर भंडारण भंडारण 4 ° c
प्राथमिक एंटीबॉडी की मशीन 3 दिन 4-5 दिन आरटी
माध्यमिक एंटीबॉडी की मशीन 3 दिन 4-5 दिन आरटी

2 तालिका: लिपिड और immunostaining के लिए मशीन समय । इस तालिका में लिपिड और प्रोटोकॉल के immunostaining चरणों के लिए मशीन समय है । छोटे ऊतक के अनुमानित वजन < ३०० मिलीग्राम है ।

अनुपूरक मूवी 1: वसा ऊतक में सहानुभूति इन्नेर्वतिओन के 3 डी इमेजिंग । Tyrosine hydroxylase (गु) एक psWAT नमूना के immunostaining ( चित्रा 2में के रूप में ही) । फिल्म के फ्लाई ऑप्टिकल वर्गों के माध्यम से पता चलता है (4x) के dorsolumbar और वंक्षण क्षेत्रों से psWAT, की कुल गहराई के साथ ~ 2 mm. TH हरे रंग में दिखाया गया है । Autofluorescence को रानी में दिखाया गया है । dorsolumbar भाग से क्षेत्र के लिए कम एसएनएस घनत्व है प्रतीत होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक मूवी 2: वसा ऊतक में vasculature के 3 डी इमेजिंग । एक psWAT नमूना के CD31 immunostaining ( चित्रा 3में के रूप में ही) । फिल्म के फ्लाई ऑप्टिकल वर्गों के माध्यम से पता चलता है (4x) के dorsolumbar और वंक्षण क्षेत्रों से psWAT, की कुल गहराई के साथ ~ 2 mm. CD31 लाल रंग में दिखाया गया है । Autofluorescence सियान में दिखाया गया है । सभी adipocytes केशिकाओं से निकटता से घिरे दिखाई देते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adipo-स्पष्ट वसा ऊतक समाशोधन के लिए एक सरल और मजबूत तरीका है, जो आसानी से एक नियमित प्रयोगशाला सेटअप में किया जा सकता है । अंय विलायक आधारित समाशोधन विधियों की तुलना में जैसे iDISCO/iDISCO +10,11,12, Adipo-स्पष्ट विशेष रूप से वसा ऊतक और उच्च वसा सामग्री के साथ अंय ऊतक समाशोधन के लिए अनुकूलित है । लिपिड कदम पूरी तरह से वसा से लिपिड को हटा, और इसलिए पूरे ऊतक भर में immunolabeling की सुविधा और काफी हद तक प्रकाश बिखराव को कम करता है, XY संकल्प के किसी भी हानि के बिना अंत करने के लिए अंत इमेजिंग की अनुमति । प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, जो बड़े ऊतक, फोकल और दो फोटॉन माइक्रोस्कोप की तेजी से स्कैनिंग प्रदान करने के अलावा भी अधिक से अधिक संकल्प और अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

मेथनॉल/डीसीएम आधारित लिपिड एक महत्वपूर्ण कदम है । अपर्याप्त लिपिड विशेष रूप से ऊतक के कोर की ओर धुंधला छवियों में परिणाम कर सकते हैं । डीसीएम में डूब रहे वसा नमूनों को देख कर लिपिड का पूर्ण निकालना सुनिश्चित करना जरूरी है । नमूने है कि ऊतक प्रकार के एक मिश्रण शामिल (जैसे, अधिवृषण और वृषण संलग्न के साथ epididymal वसा) पूरी तरह से विस्तारित डीसीएम गर्मी के साथ भी सिंक नहीं हो सकता है । हालांकि, डीसीएम में रातोंरात इन नमूनों की मशीनिंग पूर्ण लिपिड प्राप्त करना चाहिए । इन कार्बनिक सॉल्वैंट्स में प्रोटीन के विकार के कारण, कुछ एंटीबॉडी लिपिड कदम के साथ संगत नहीं हो सकता है । इसलिए, एक उपयुक्त एंटीबॉडी का चयन इस प्रोटोकॉल के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम बन जाता है । यह पहले मेथनॉल पर एंटीबॉडी सत्यापित करने के लिए सिफारिश की है ऊतक वर्गों या Adipo द्वारा संसाधित ऊतक के छोटे टुकड़े-स्पष्ट. इसी प्रकार, मेथनॉल/डीसीएम/DBE के साथ रासायनिक रंगों की अनुकूलता भी आवेदन से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए ।

प्रोटोकॉल की एक सीमा फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त endogenously की शमन है । कार्बनिक विलायक आधारित लिपिड और समाशोधन कदम मोटे तौर पर ऐसे प्रोटीन स्वभाव । अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन कल्पना करने के लिए, एंटीबॉडी लेबलिंग की जरूरत है कार्यरत हैं । उपयुक्त एंटीबॉडी संयोजनों की उपलब्धता अत्यधिक मल्टीप्लेक्सेड इमेजिंग करने की क्षमता को सीमित करती है । वर्तमान उपलब्ध प्रकाश चादर सूक्ष्मदर्शी केवल हमें 4 चैनलों के लिए छवि के लिए अनुमति देते हैं ।

Adipo-स्पष्ट रेशा संरचनाओं और कोशिका आबादी है कि वसा ऊतक में अपेक्षाकृत कम घनत्व है visualizing के लिए विशेष रूप से उपयोगी है । हालांकि, इमेजिंग घने संकेतों इस दृष्टिकोण के साथ सीमित हो जाता है । जब एंटीबॉडी को घने संकेतों लेबल इस्तेमाल किया जाता है, वे epitopes नमूना की सतह पर स्थित द्वारा तनहा किया जा सकता है, ऊतक इंटीरियर के लिए उपयोग को अवरुद्ध. इसलिए, छोटे रासायनिक जांच घने संरचनाओं दाग करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं । इसी मुद्दे के कारण, Adipo के आवेदन-स्पष्ट करने के लिए ब्राउन वसा ऊतक सीमित है । ब्राउन फैट घने संरचनाओं के साथ एक वसा डिपो है । घने रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका इन्नेर्वतिओन के अलावा, यह भी कसकर mitochondria17की एक बड़ी संख्या में शामिल है कि छोटे adipocytes के साथ पैक किया जाता है । जब CD31 और गु एक ही प्रक्रिया के साथ दाग के रूप में भूरे रंग के वसा के लिए ऊपर वर्णित लागू है, केवल नमूना की सतह (नहीं दिखाया डेटा) लेबल किया गया था । इसके अलावा, ब्राउन फैट मजबूत ऊतक autofluoresence, इमेजिंग के दौरान कम संकेत करने वाली शोर अनुपात करने के लिए अग्रणी पैदा करता है । यह छोटे टुकड़ों में भूरे रंग के वसा में कटौती और जब संभव हो रासायनिक जांच का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ।

कुल मिलाकर, Adipo-स्पष्ट पूरे वसा ऊतक में उच्च संकल्प के साथ ब्याज की कई संरचनाओं की एक साथ की रूपरेखा की अनुमति देता है । इस दृष्टिकोण का प्रयोग, एक कैसे ऐसी तंत्रिका अनुमानों के रूप में संरचनाओं का विश्लेषण कर सकते हैं, vasculature, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और adipocytes पूरे वसा पैड भर में बातचीत । यह अनुभागीकरण या ब्याज के क्षेत्रों को चुनने से परहेज द्वारा निष्पक्ष इमेजिंग डेटा प्रदान करता है । Adipo-स्पष्ट भी जल्दी morphogenesis के दौरान के रूप में अच्छी तरह से adipocyte जनक और वंश पता लगाने के अध्ययन में अग्रदूत कोशिकाओं के वितरण के दौरान घटनाओं के रूप में वसा विकास का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । वसा के अलावा, Adipo-स्पष्ट भी अन्य ऊतकों कि उच्च लिपिड सामग्री है के 3 डी पूरे माउंट विश्लेषण की सुविधा हो सकती है या ऐसे स्तन ग्रंथि और फैटी लिम्फ नोड के रूप में वसा से घिरा हुआ है । इस विधि भी शारीरिक और रोग की स्थिति में मानव वसा ऊतक के प्रोटोकॉल अध्ययन करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सहायता और समर्थन के लिए रॉकफेलर विश्वविद्यालय में सी इमेजिंग संसाधन केंद्र से क्रिस्टीना Pyrgaki, ताओ टोंग, और एलिसन उत्तर धंयवाद । हम भी फिल्म संपादन के लिए Xiphias जीई झू धंयवाद । इस काम को मानव सीमांत विज्ञान कार्यक्रम संगठन (पीसी) ने समर्थन दिया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x phosphate buffered saline Corning 21-040-CV
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148-1KG
Methanol Fisher Scientific A412SK-4
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-500ML
Tween 20 Sigma Aldrich P2287-500ML
Heparin Sigma Aldrich H3393-100KU
Dichloromethane Sigma Aldrich 270991
Hydrogen peroxide 30% Fisher Scientific 325-100
Benzyl ether Sigma Aldrich 108014
Agarose Invitrogen 16500500
Sodium azide Sigma Aldrich 71289-5G
Glycine Fisher Scientific BP381-1
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase Millipore AB152 1:200 dilution
Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 R&D Systems AF3628 Final concentration of 2 µg/mL
Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 Bio-Rad MCA1957 Final concentration of 2 µg/mL
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 711-605-152 Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 Invitrogen A11077 Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 712-605-153 Final concentration of 5-10 µg/mL
Imaging chamber ibidi 80287
Light sheet microscope LaVision BioTec Ultramicroscope II
Imaging software LaVision BioTec Imspector software
Microscopy visualization software Bitplane Imaris

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156, (1-2), 20-44 (2014).
  2. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298, (6), E1244-E1253 (2010).
  3. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19, (10), 1338-1344 (2013).
  4. Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35, (4), 473-493 (2014).
  5. Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19, (5), 741-756 (2014).
  6. Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9, (1), 99-109 (2009).
  7. Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124, (5), 2099-2112 (2014).
  8. Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159, (4), 896-910 (2014).
  11. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165, (7), 1789-1802 (2016).
  12. Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27, (1), 226-236 (2018).
  13. Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29, (6), 1575-1591 (2009).
  14. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58, (4), (2014).
  15. Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61, (2), 346-354 (2012).
  16. Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46, (11), 2347-2355 (2005).
  17. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, (11), 691-702 (2016).
Adipo-स्पष्ट: वसा ऊतक के तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक ऊतक समाशोधन विधि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58271, doi:10.3791/58271 (2018).More

Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58271, doi:10.3791/58271 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter